CN108623671A - 一种抗肿瘤多肽及其血液检测抗体和试剂盒 - Google Patents

一种抗肿瘤多肽及其血液检测抗体和试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN108623671A
CN108623671A CN201810624933.6A CN201810624933A CN108623671A CN 108623671 A CN108623671 A CN 108623671A CN 201810624933 A CN201810624933 A CN 201810624933A CN 108623671 A CN108623671 A CN 108623671A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ala
gln
lys
gly
tyr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810624933.6A
Other languages
English (en)
Inventor
李兴国
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN201810624933.6A priority Critical patent/CN108623671A/zh
Publication of CN108623671A publication Critical patent/CN108623671A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了一种抗肿瘤多肽，为计算机辅助设计并且人工合成的由51个氨基酸组成的多肽，在抗肿瘤多肽优化过程中，不仅采用了氨基酸选择性替换和增删的常规多肽设计策略，还将氨基酸侧链改构策略融合到设计理念中，在更大程度上得到理想的多肽结构。本发明抗肿瘤多肽肽链长度短，采用常规的Fmoc法固相合成即可得到，为PD‑1抑制剂，对肿瘤具有较好的抑制活性。在抗肿瘤多肽的基础上进一步地得到单克隆抗体和试剂盒，在药物开发过程中用于检测血液中抗肿瘤多肽的含量。

Description

一种抗肿瘤多肽及其血液检测抗体和试剂盒
技术领域
本发明属于多肽设计与固相合成、抗体制备与检测和药理活性研究领域，具体涉及一种抗肿瘤多肽及其血液检测抗体和试剂盒。
技术背景
恶性肿瘤是一种严重损害人类健康的疾病，我国肿瘤造成的死亡占全部死亡的四分之一。据统计，2011年全国每10万人中就有250人患恶性肿瘤。近几十年，我国恶性肿瘤的发病率每年都有提高，发病率的上升趋势趋向于直线。据估计，在2049年我国每10万人中将有400人患癌症。目前肿瘤的治疗手段在很大程度上仍是以药物治疗为主。因而，研究以及开发新型的高效、低毒抗肿瘤药物具有非常重要的意义。其中，氨基酸导向的小肽化合物具有非常好的抗肿瘤活性。除此之外，氨基酸载体具备非常好的生物亲和性和生物相容性。在一些抗肿瘤药物分子中，引入氨基酸，能够提高药物的选择性和生物相容性，并且能降低其对正常细胞的毒性。另一方面，肽类是全能型的生物活性分子之一，假肽和伪肽类化合物以及其衍生物的生物活性非常多，例如抗菌，抗病毒和抗癌等活性。
机体T细胞免疫在控制肿瘤的发生、发展过程中起到了重要作用。其中肿瘤局部浸润性CD8+T淋巴细胞在机体抗肿瘤免疫应答中发挥了关键作用。近年来发现，肿瘤患者体内存在免疫抑制机制，妨碍机体对肿瘤的清除，导致肿瘤长期定植，表现为T淋巴细胞功能障碍与增殖能力减弱。PD-1已被公认为是衰竭性T淋巴细胞的表面标志。阻断PD-1/PD-L1通路可以部分恢复衰竭性T细胞的功能。已知PD-1(programmed death 1)程序性死亡受体1，是一种重要的免疫抑制分子。以PD-1为靶点的免疫调节对抗肿瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病及器官移植存活等均有重要的意义。其配体PD-L1也可作为靶点，相应的抗体也可以起到相同的作用。
程序性细胞死亡蛋白-1(programmed death-1，PD-1)及其配体(PD-L1)抑制剂是免疫哨点单抗药物，其应答之广度、深度、和持久性均十分罕见，是近年来肿瘤免疫疗法研究的热点。已上市的尼伏单抗(nivolumab)和潘利珠单抗(pembrolizumab)属于PD-1抑制剂，主要用于黑素瘤和非小细胞肺癌的治疗，对肾细胞癌、膀胱癌、霍奇金淋巴瘤等的疗效也较好。
根据蛋白的空间结构设计多肽，从而在三维结构上抑制蛋白的功能是目前研究的热点，并且也有多个产品已经上市。基于PD-1抗体研究的高投入和不确定性，针对PD-1的特异性多肽的研究也是一个新的研究方向。
假肽（pseudo-peptide）与肽的差别仅在肽段中部分片段的改变。假肽的获取和结构确证方法与一般肽的合成方法相似，仅在于原料氨基酸的改变。假肽具有耐受酶解、稳定性好、生物利用度高等优点，假肽研究作为多肽类药物结构优化的重要手段已成为药物研发中非常活跃的领域。
发明内容
本发明提供一种抗肿瘤多肽，为计算机辅助设计并且人工合成的由51个氨基酸组成的多肽，所述计算机辅助设计的软件为申请人团队自主开发，工作原理为：具有一定长度的随机短肽使其在PD-1蛋白分子表面游走，计算该短肽上各个原子和PD-1蛋白表面相邻原子的作用力，以及移动、扭转肽段产生的能量变化，反复优化比较各种可能的结合方式，选择能量最低的，做为定构象。在抗肿瘤多肽优化过程中，不仅采用了氨基酸选择性替换和增删的常规多肽设计策略，还将氨基酸侧链改构策略融合到设计理念中，在更大程度上得到理想的多肽结构。本发明抗肿瘤多肽肽链长度短，采用常规的Fmoc法固相合成即可得到，而且对肿瘤具有较好的抑制活性。
本发明一方面公开一种抗肿瘤多肽，其序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明另一方面公开一种抗肿瘤多肽，通过序列如SEQ ID NO：1所示的多肽链中的少数氨基酸侧链结构改造设计而成，序列中第18位的氨基酸His、第32位的氨基酸Tyr、第50位的氨基酸Tyr至少有一个替换为（本专利中简称Paa，CAS：161088-71-7）。Paa在肽链中与前后氨基酸的羟基和氨基缩合成为肽键的形式存在。
进一步的，所述抗肿瘤多肽中氨基酸均为L型，即绝对构型为S型。
在本发明优选的技术方案中，所述的抗肿瘤多肽序列为：
SEQ ID SEQ
NO：1 Lys-Gln-Glu-Gly-Gln-Ala-Ile-Tyr-Gly-Ala-His-Leu-Met-Phe-Ile-Ser-His-His-Trp-Cys-Leu-Pro-Gln-Ala-Tyr-Lys-Pro-Ala-Lys-Thr-Gly-Tyr-Ala-Gly-Val-Gln-Val-Ile-Gln-Val-Lys-Arg-Ala-Arg-Glu-Asn-Glu-Thr-Pro-Tyr-Ala
NO：2 Lys-Gln-Glu-Gly-Gln-Ala-Ile-Tyr-Gly-Ala-His-Leu-Met-Phe-Ile-Ser-His-Paa-Trp-Cys-Leu-Pro-Gln-Ala-Tyr-Lys-Pro-Ala-Lys-Thr-Gly-Tyr-Ala-Gly-Val-Gln-Val-Ile-Gln-Val-Lys-Arg-Ala-Arg-Glu-Asn-Glu-Thr-Pro-Tyr-Ala
NO：3 Lys-Gln-Glu-Gly-Gln-Ala-Ile-Tyr-Gly-Ala-His-Leu-Met-Phe-Ile-Ser-His-His-Trp-Cys-Leu-Pro-Gln-Ala-Tyr-Lys-Pro-Ala-Lys-Thr-Gly-Paa-Ala-Gly-Val-Gln-Val-Ile-Gln-Val-Lys-Arg-Ala-Arg-Glu-Asn-Glu-Thr-Pro-Tyr-Ala
NO：4 Lys-Gln-Glu-Gly-Gln-Ala-Ile-Tyr-Gly-Ala-His-Leu-Met-Phe-Ile-Ser-His-His-Trp-Cys-Leu-Pro-Gln-Ala-Tyr-Lys-Pro-Ala-Lys-Thr-Gly-Tyr-Ala-Gly-Val-Gln-Val-Ile-Gln-Val-Lys-Arg-Ala-Arg-Glu-Asn-Glu-Thr-Pro-Paa-Ala
NO：5 Lys-Gln-Glu-Gly-Gln-Ala-Ile-Tyr-Gly-Ala-His-Leu-Met-Phe-Ile-Ser-His-Paa-Trp-Cys-Leu-Pro-Gln-Ala-Tyr-Lys-Pro-Ala-Lys-Thr-Gly-Paa-Ala-Gly-Val-Gln-Val-Ile-Gln-Val-Lys-Arg-Ala-Arg-Glu-Asn-Glu-Thr-Pro-Tyr-Ala
NO：6 Lys-Gln-Glu-Gly-Gln-Ala-Ile-Tyr-Gly-Ala-His-Leu-Met-Phe-Ile-Ser-His-Paa-Trp-Cys-Leu-Pro-Gln-Ala-Tyr-Lys-Pro-Ala-Lys-Thr-Gly-Tyr-Ala-Gly-Val-Gln-Val-Ile-Gln-Val-Lys-Arg-Ala-Arg-Glu-Asn-Glu-Thr-Pro-Paa-Ala
NO：7 Lys-Gln-Glu-Gly-Gln-Ala-Ile-Tyr-Gly-Ala-His-Leu-Met-Phe-Ile-Ser-His-His-Trp-Cys-Leu-Pro-Gln-Ala-Tyr-Lys-Pro-Ala-Lys-Thr-Gly-Paa-Ala-Gly-Val-Gln-Val-Ile-Gln-Val-Lys-Arg-Ala-Arg-Glu-Asn-Glu-Thr-Pro-Paa-Ala
NO：8 Lys-Gln-Glu-Gly-Gln-Ala-Ile-Tyr-Gly-Ala-His-Leu-Met-Phe-Ile-Ser-His-Paa-Trp-Cys-Leu-Pro-Gln-Ala-Tyr-Lys-Pro-Ala-Lys-Thr-Gly-Paa-Ala-Gly-Val-Gln-Val-Ile-Gln-Val-Lys-Arg-Ala-Arg-Glu-Asn-Glu-Thr-Pro-Paa-Ala
本发明所述的抗肿瘤多肽为人工合成法制备得到，具体的为Fmoc法固相合成得到。本领域技术人员知晓在已知多肽序列后，可以采用多种方法进行制备，仅以人工合成方法而言就有很多不同种类。本发明采用高效液相色谱法进行纯化，本领域技术人员也可采用其他已知的方法进行纯化，例如：免疫吸附法。此外，由于生物领域的多肽的特殊性，本领域技术人员所熟知的是采用序列测定（Edman降解法、串联质谱）、质谱和核磁有机结合来实现方便、准确的结构确证。
本发明另一方面公开一种抗肿瘤多肽为PD-1抑制剂，在试验例部分本发明的抗肿瘤多肽对PD-1的亲合力测定中表现优秀，提示对PD-1阳性癌症患者可能有积极的治疗作用，尤其是肺癌和黑色素瘤患者。在异体移植瘤实验中发现试验组小鼠肿瘤终点的到达时间明显增加，进一步证实本发明抗肿瘤多肽对癌症的治疗作用。
经过细胞学毒性试验发现本发明抗肿瘤多肽具有很好的药物安全性，经昆明小鼠腹腔单次给药急性毒性试验发现最高给药剂量2000mg/kg时未见任何毒性反应。
本发明另一方面公开一种抗肿瘤多肽的单克隆抗体及其制备方法，并进一步的公开了一种包含抗肿瘤多肽的单克隆抗体的试剂盒，此抗体和试剂盒可以用于检测血液中抗肿瘤多肽的含量。单克隆抗体的制备目前已是较为成熟的技术，在抗原已知的情况下，可以直接由试剂公司套用单克隆抗体的制备流程获得。
在抗肿瘤多肽体内代谢和临床应用中，血液中含量都是重要的观测指标，血液检测标准试剂盒的制备至关重要，试剂盒中的样品均采用统一工艺获得，质量稳定，检测结果可靠。
本发明所述的试剂盒为酶联免疫（ELISA）试剂盒，包含抗肿瘤多肽单克隆抗体，进一步地，包括以下试剂：
（1）标准抗肿瘤多肽：抗肿瘤多肽以确定的量溶解在常用的缓冲液中冻存，为了保证多肽质量可以以母液的形式保存，为了避免反复冻融造成破坏和浓度变化尽量采用多个单次使用包装。
（2）抗肿瘤多肽单克隆抗体（一抗）。
（3）酶标抗体（二抗）：用酶标记能够与一抗结合的抗体，通过显色来放大一抗的信号，实现定量检测。本领域技术人员也可以通过其他手段来实现二抗标记，不在本发明中一一列举，酶标记的方式也有多种，本发明使用方法中以辣根过氧化物酶酶标山羊抗小鼠抗体为例。
具体实施方式
实施例1：抗肿瘤多肽固相合成、纯化及结构确证
本发明所述的抗肿瘤多肽均采用Fmoc固相合成法获得，高效液相色谱纯化并通过序列分析和质谱验证。其具体操作如下：
1、抗肿瘤多肽的固相合成
1）以DMF为溶剂，各种α-氨基被Fmoc保护的氨基酸溶液的浓度为0.25M，HBTU溶液、HOBt溶液的浓度为0.33M，哌啶溶液的浓度为200ml/L，DIEA溶液的浓度为174.2ml/L。
2）称取0.05mmol Fmoc-Ala-Wang树脂（官能团含量0.33mmol/g）置于固相反应器中，加8ml DCM溶胀过夜，减压抽去溶剂。加入浓度为200ml/L的哌啶溶液8ml，室温下反应5min，抽干；再加入浓度为200ml/L的哌啶溶液8ml，室温下反应20min，抽干；依次用8ml的DMF洗涤3次，每次1min。准确量取0.2mmol的α-氨基被Fmoc保护的氨基酸溶液、0.2mmol的HBTU溶液、0.195mmol的HOBt溶液加入固相反应器中，反应5min后加入0.4mmol的DIEA，室温下氮气气泡振荡反应2h。依次用8ml的DMF洗涤3次，每次1min。加入浓度为200ml/L的哌啶溶液8ml，室温下反应5min，抽干；再加入浓度为200ml/L的哌啶溶液8ml，室温下反应20min，抽干；依次以8ml的DMF洗涤3次，每次1min。按照如上步骤从肽链的C端到N端逐一连续合成本发明的抗肿瘤多肽。
本发明涉及的氨基酸的Fmoc保护策略具体为：Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Cys(Trt)-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-His(Trt)-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Met-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Trp(Boc)-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Paa-OH。
3）待合成完毕后，分别用DMF和DCM先后清洗连有多肽链的树脂，后将树脂至于真空干燥箱内干燥备用。
需要着重说明的是，本发明所述的抗肿瘤多肽的一些技术方案中涉及氨基酸R基团被修饰的特殊的氨基酸类型，Baa和Paa的R基团均为较为稳定的基团，没有巯基、羟基和额外的氨基需要保护，仅需要使用Fmoc保护氨基即可，在一定程度上保证固相合成的准确率，降低纯化难度，提高合成效率。
2、抗肿瘤多肽的切割
1）待树脂干燥后，用刮刀将树脂尽量打散，转移至鸡心瓶中，加入磁子，在冰水浴下缓慢加入用于脱除树脂的切割液10ml（切割液中TFA：纯水：苯甲硫醚：苯酚：乙二硫醇比例为82.5:5:5:5:2.5），冰水浴下反应2h。
2）待反应完成，将反应液连同树脂一同转移至过滤器中，用水泵抽滤，将得到的滤液置于圆底烧瓶中，并在氮气流下吹干。
3）待圆底烧瓶中的样品吹至粘稠，撤下氮气管，在圆底烧瓶中倒入约20ml的4℃冰乙醚，混合后充分打散，然后于冷冻离心机内，4℃下8000r/min离心15min，弃上清，再于20ml的4℃冰乙醚中打散，离心；如此重复操作3次，将沉淀再次真空干燥，即得抗肿瘤多肽粗品。
3、抗肿瘤多肽的纯化及鉴定
采用反向高效液相色谱法对抗肿瘤多肽进行纯化鉴定。采用C18半制备柱，流动相：A相（水相）：去离子水（含0.1% TFA(m/v)）；B相（有机相）：80%乙腈水溶液（含0.1% TFA(m/v)）；流速：5ml/min；洗脱梯度：A相以每分钟1%的变化从50%降到10%，B相以每分钟1%的变化从50%升到90%。根据高效液相色谱图分段收集洗脱液，主峰所对应的洗脱液旋蒸除有机相，然后冷冻结冰后得固体粉末，经序列测定序列无误，质谱验证存在与理论分子量对应的特征峰。
实施例2：抗肿瘤多肽单克隆抗体的制备
单克隆抗体的制备目前已是较为成熟的技术，可直接提供抗肿瘤多肽由试剂公司制备，或者由下述方法制得，下述操作步骤只作简述，未述及之处均采用现有技术中的技术手段或本领域技术人员的常规技术手段。
（1）免疫动物获得B淋巴细胞
将多肽使用弗氏佐剂乳化，对小鼠做三次免疫，并在取其脾脏的前三天做一次加强免疫，可使得到的抗体亲和力较好。
（2）细胞融合
取与免疫小鼠同系的小鼠的骨髓瘤细胞，可用不分泌型和酶缺陷型，本实施例采用酶缺陷型，缺乏TK（胸腺嘧啶核苷激酶）和HGPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）。
细胞融合可用化学融合法和电融合法等。本实施例采用化学融合法，所用的化学融合剂为PEG（聚乙二醇），其分子量越大，融合率越高，但同时毒性也越强，故本实施例的PEG选用分子量为≤4000的，在pH8.0～pH8.8左右的碱性环境中进行。
（3）细胞筛选
细胞筛选即为细胞的选择性培养，目的是筛选融合的杂交瘤细胞，采用HAT选择性培养基（培养基中加次黄嘌呤HyPoxanthine H，氨基蝶呤Aminoopterin A及胸腺嘧啶ThymidineT）。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏TK和HGPRT，不能利用补救途径合成DNA，而只能利用谷酰胺与尿核苷酸单磷酸合成DNA，这一途径又被氨基蝶呤所阻断，故不可避免的要死亡。停用HAT培养基后，用HT培养基。未融合的B细胞和T细胞在正常培养的情况下都会自然消亡。这样，只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了TK和HGPRT，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能增殖。
在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此必须进行筛选。采用酶联免疫吸附测定（ELISA），筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞。
（4）克隆化
对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制。克隆化方法采用有限稀释法或FACS（荧光激活分选仪）分离法。
（5）大量繁殖
单克隆抗体的大量制备可用体外培养法和腹水法。本发明采用腹水法。克隆化的细胞可以在体外进行大量培养，收集上清液而获得大量的单一的克隆化抗体。不过体外培养法得到的单克隆抗体有限，其不能超过特定的细胞浓度，且每天要换培养液。而体内杂交瘤细胞繁殖可以克服这些限制，取同系小鼠，先在其腹腔注入降植烷进行预处理，1～2周后腹腔注入杂交瘤细胞，一周后有明显腹水产生。用这种方法制备的腹水抗体含量高，腹水中的杂蛋白也较少，便于抗体的纯化。
（6）抗体纯化
在单抗纯化之前，使用二氧化硅吸附法或过滤离心法对腹水进行预处理，然后进行单抗的粗提，粗提方法选用硫酸铵沉淀法、辛酸-硫酸铵沉淀法或优球蛋白沉淀法，采用DEAE离子交换层析柱、凝胶过滤法或亲和层析法进行单抗的最后纯化，效价测定，分装冻存。
实施例3：血液检测用酶联免疫试剂盒
在抗肿瘤多肽体内代谢和临床应用中，血液中含量都是重要的观测指标，血液检测标准试剂盒的制备至关重要，试剂盒中的样品均采用统一工艺获得，质量稳定，检测结果可靠。
本发明所述的试剂盒为酶联免疫试剂盒，包括以下试剂：
（1）标准抗肿瘤多肽：抗肿瘤多肽以确定的量溶解在常用的缓冲液中冻存，为了保证多肽质量可以以母液的形式保存，为了避免反复冻融造成破坏和浓度变化尽量采用多个单次使用包装。
（2）抗肿瘤多肽单克隆抗体（一抗）：制备方法如实施例2所述。
（3）酶标抗体（二抗）：用酶标记能够与一抗结合的抗体，通过显色来放大一抗的信号，实现定量检测。本领域技术人员也可以通过其他手段来实现二抗标记，不在本发明中一一列举，酶标记的方式也有多种，本发明使用方法中以辣根过氧化物酶酶标山羊抗小鼠抗体为例。
实施例4：酶联免疫试剂盒使用方法
1、标准组：标准抗肿瘤多肽溶液用PBS稀释至多个浓度，向96孔酶标板中每孔加入50μl。试验组：取血清稀释用PBS稀释100倍，向96孔酶标板中每孔加入50μl。室温条件下孵育过夜蒸干水分完成包被过程。
2、将酶标板放入温箱中60℃加热30min。
3、每孔200μl封闭液，37℃恒温箱中孵育3小时封闭。封闭液为浓度3%（质量体积浓度）的脱脂奶粉PBS溶液。
4、倒出封闭液，每孔200μl PBST，洗板4次。PBST为浓度1‰（体积浓度）的Tween 20的PBS溶液。
5、加入抗肿瘤多肽单克隆抗体，每孔50μl，4℃孵育4h。
6、倒出液体，每孔200μl PBST，洗板4次。
7、加入辣根过氧化物酶酶标山羊抗小鼠抗体，每孔50μl，4℃孵育2h。
8、倒出液体，每孔200μl PBST，洗板4次。
9、加入临时配制的底物显色液，每孔75μl，一般37℃恒温箱中孵育30min即会出现明显的颜色变化。底物显色液（2.57ml 0.2mol/L的NaHPO4溶液与2.43ml 0.1mol/L的柠檬酸溶液混合后调整PH至5.0，使用前加入15μl 3%的双氧水，4mg OPD，加双蒸水至10ml）。
10、加入终止液（2mol/L的H2SO4）终止反应，每孔25μl。
11、酶标仪测定492处的吸收值。
12、标准组根据吸收值绘制标准曲线，并计算血清中本发明所述的抗肿瘤多肽的浓度。
试验例1：抗肿瘤多肽对PD-1的亲合力的测定
（1）将抗肿瘤多肽用1×PBS配制成浓度为1mg/mL的溶液，进一步用1×PBS配制成浓度为100μg/mL的溶液，取2.5μL将其滴在羧基化的SPR芯片（购自Plexera公司，K×5型SPR标配基底）上，通过链霉亲合素和生物素的特异性反应将多肽固定在SPR芯片上。而后依次将浓度为0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL、50μg/mL的PD-1溶液（1×PBS稀释）作为流动相通过芯片表面，结合时间150s，解离时间130s，重生时间200s。以1×PBS作为解离溶液，以0.5%磷酸作为重生液。在K×5型SPR仪（Plexera）上记录多肽与TNF-α的结合解离曲线。
（2）以Langmuir公式拟合所述多肽与PD-1的SPR曲线。经计算可以获得平衡结合/解离常数。多肽与PD-1的平衡解离常数KD值见下表：
SEQ ID KD值（nM）
NO：1 9.8×10-3
NO：2 5.8×10-3
NO：5 6.7×10-3
NO：6 3.6×10-3
NO：7 4.9×10-3
NO：8 5.1×10-3
由上表可知，本发明的抗肿瘤多肽对PD-1的具有很好的亲合力，提示对PD-1阳性癌症患者可能有积极的治疗作用，尤其是肺癌和黑色素瘤患者。
试验例2：异体移植瘤小鼠模型药效试验
根据体重将6-8周龄之间的雌性AJ小鼠随机分组，每组10只。在第0天将溶于200μlDMEM培养基的2×106个SA1/N纤维肉瘤细胞在右腋皮下植入小鼠。在第4、8和11天通过腹膜内注射给药，对照组给予PBS，试验组给予1mg/kg的多肽。对小鼠每周两次监测肿瘤生长，持续大约10周。使用电子测径器对肿瘤进行三维测量（高度×宽度×长度）并计算肿瘤体积。当肿瘤达到肿瘤终点（1500mm3）或显示大于15%的体重减少时将小鼠处死。不同组别达到肿瘤终点的平均时间见下表：
SEQ ID 肿瘤终点（天）
对照组 24
NO：1 51
NO：2 49
NO：5 56
NO：6 57
NO：7 55
NO：8 61
由上表可以发现试验组小鼠肿瘤终点的到达时间明显增加，其中SEQ ID NO：8肿瘤终点达到了61天，每周两次监测肿瘤生长的过程中，对照组肿瘤持续生长增大，而各实验组在给药期间未发现肿瘤的明显生长，证实本发明抗肿瘤多肽对癌症的治疗作用。
序列表
<110> 李兴国
<120> 一种抗肿瘤多肽及其血液检测抗体和试剂盒
<141> 2018-06-17
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 51
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Lys Gln Glu Gly Gln Ala Ile Tyr Gly Ala His Leu Met Phe Ile Ser
1 5 10 15
His His Trp Cys Leu Pro Gln Ala Tyr Lys Pro Ala Lys Thr Gly Tyr
20 25 30
Ala Gly Val Gln Val Ile Gln Val Lys Arg Ala Arg Glu Asn Glu Thr
35 40 45
Pro Tyr Ala
50

Claims (7)

1.一种抗肿瘤多肽，其序列如SEQ ID NO：1所示，
Lys-Gln-Glu-Gly-Gln-Ala-Ile-Tyr-Gly-Ala-His-Leu-Met-Phe-Ile-Ser-His-His-Trp-Cys-Leu-Pro-Gln-Ala-Tyr-Lys-Pro-Ala-Lys-Thr-Gly-Tyr-Ala-Gly-Val-Gln-Val-Ile-Gln-Val-Lys-Arg-Ala-Arg-Glu-Asn-Glu-Thr-Pro-Tyr-Ala。
2.如权利要求1所述的抗肿瘤多肽，其特征是，序列中第18位的氨基酸His、第32位的氨基酸Tyr、第50位的氨基酸Tyr至少有一个替换为。
3.如权利要求2所述的抗肿瘤多肽，选自：
Lys-Gln-Glu-Gly-Gln-Ala-Ile-Tyr-Gly-Ala-His-Leu-Met-Phe-Ile-Ser-His-Paa-Trp-Cys-Leu-Pro-Gln-Ala-Tyr-Lys-Pro-Ala-Lys-Thr-Gly-Tyr-Ala-Gly-Val-Gln-Val-Ile-Gln-Val-Lys-Arg-Ala-Arg-Glu-Asn-Glu-Thr-Pro-Tyr-Ala；
Lys-Gln-Glu-Gly-Gln-Ala-Ile-Tyr-Gly-Ala-His-Leu-Met-Phe-Ile-Ser-His-His-Trp-Cys-Leu-Pro-Gln-Ala-Tyr-Lys-Pro-Ala-Lys-Thr-Gly-Paa-Ala-Gly-Val-Gln-Val-Ile-Gln-Val-Lys-Arg-Ala-Arg-Glu-Asn-Glu-Thr-Pro-Tyr-Ala；
Lys-Gln-Glu-Gly-Gln-Ala-Ile-Tyr-Gly-Ala-His-Leu-Met-Phe-Ile-Ser-His-His-Trp-Cys-Leu-Pro-Gln-Ala-Tyr-Lys-Pro-Ala-Lys-Thr-Gly-Tyr-Ala-Gly-Val-Gln-Val-Ile-Gln-Val-Lys-Arg-Ala-Arg-Glu-Asn-Glu-Thr-Pro-Paa-Ala；
Lys-Gln-Glu-Gly-Gln-Ala-Ile-Tyr-Gly-Ala-His-Leu-Met-Phe-Ile-Ser-His-Paa-Trp-Cys-Leu-Pro-Gln-Ala-Tyr-Lys-Pro-Ala-Lys-Thr-Gly-Paa-Ala-Gly-Val-Gln-Val-Ile-Gln-Val-Lys-Arg-Ala-Arg-Glu-Asn-Glu-Thr-Pro-Tyr-Ala；
Lys-Gln-Glu-Gly-Gln-Ala-Ile-Tyr-Gly-Ala-His-Leu-Met-Phe-Ile-Ser-His-Paa-Trp-Cys-Leu-Pro-Gln-Ala-Tyr-Lys-Pro-Ala-Lys-Thr-Gly-Tyr-Ala-Gly-Val-Gln-Val-Ile-Gln-Val-Lys-Arg-Ala-Arg-Glu-Asn-Glu-Thr-Pro-Paa-Ala；
Lys-Gln-Glu-Gly-Gln-Ala-Ile-Tyr-Gly-Ala-His-Leu-Met-Phe-Ile-Ser-His-His-Trp-Cys-Leu-Pro-Gln-Ala-Tyr-Lys-Pro-Ala-Lys-Thr-Gly-Paa-Ala-Gly-Val-Gln-Val-Ile-Gln-Val-Lys-Arg-Ala-Arg-Glu-Asn-Glu-Thr-Pro-Paa-Ala；
Lys-Gln-Glu-Gly-Gln-Ala-Ile-Tyr-Gly-Ala-His-Leu-Met-Phe-Ile-Ser-His-Paa-Trp-Cys-Leu-Pro-Gln-Ala-Tyr-Lys-Pro-Ala-Lys-Thr-Gly-Paa-Ala-Gly-Val-Gln-Val-Ile-Gln-Val-Lys-Arg-Ala-Arg-Glu-Asn-Glu-Thr-Pro-Paa-Ala。
4.如权利要求1-3所述的抗肿瘤多肽作为PD-1抑制剂的应用。
5.如权利要求1-3所述的抗肿瘤多肽在抗肿瘤药物中的应用。
6.包含权利要求1-3所述的抗肿瘤多肽的单克隆抗体。
7.包含权利要求6所述单克隆抗体的血液检测用试剂盒。
CN201810624933.6A 2018-06-17 2018-06-17 一种抗肿瘤多肽及其血液检测抗体和试剂盒 Pending CN108623671A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810624933.6A CN108623671A (zh) 2018-06-17 2018-06-17 一种抗肿瘤多肽及其血液检测抗体和试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810624933.6A CN108623671A (zh) 2018-06-17 2018-06-17 一种抗肿瘤多肽及其血液检测抗体和试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108623671A true CN108623671A (zh) 2018-10-09

Family

ID=63691782

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810624933.6A Pending CN108623671A (zh) 2018-06-17 2018-06-17 一种抗肿瘤多肽及其血液检测抗体和试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108623671A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109265533A (zh) * 2018-10-30 2019-01-25 苏州立豪生物科技有限公司 一种改进的能与pd-1特异性结合的肿瘤抑制肽及其用途

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103159828A (zh) * 2011-12-14 2013-06-19 首都医科大学 1-(4-羟基-3-甲氧羰基)-β-咔啉-3-甲酰色氨酰氨基酸苄酯、其合成及应用
CN104159911A (zh) * 2012-03-07 2014-11-19 奥瑞基尼探索技术有限公司 作为免疫调节剂的模拟肽化合物

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103159828A (zh) * 2011-12-14 2013-06-19 首都医科大学 1-(4-羟基-3-甲氧羰基)-β-咔啉-3-甲酰色氨酰氨基酸苄酯、其合成及应用
CN104159911A (zh) * 2012-03-07 2014-11-19 奥瑞基尼探索技术有限公司 作为免疫调节剂的模拟肽化合物

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HAO-NAN CHANG等: "Blocking of the PD-1/PD-L1 Interaction by a d-Peptide Antagonist for Cancer Immunotherapy", 《ANGEW. CHEM. INT. ED.》 *
QIAO LI等: "Discovery of peptide inhibitors targeting human programmed death 1 (PD-1) receptor", 《ONCOTARGET》 *
SHENG-HUNG WANG等: "Structure-based design for binding peptides in anti-cancer therapy", 《BIOMATERIALS》 *
姚金凤等: "多肽类药物代谢研究进展", 《中国药理学通报》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109265533A (zh) * 2018-10-30 2019-01-25 苏州立豪生物科技有限公司 一种改进的能与pd-1特异性结合的肿瘤抑制肽及其用途
CN111548407A (zh) * 2018-10-30 2020-08-18 苏州立豪生物科技有限公司 一种改进的能与pd-1特异性结合的肿瘤抑制肽及其用途
CN109265533B (zh) * 2018-10-30 2020-11-17 广东赛尔生物科技有限公司 一种改进的能与pd-1特异性结合的肿瘤抑制肽及其用途

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6201104B1 (en) Angiogenesis—inhibiting protein binding peptides and proteins and methods of use
Murthy et al. RETRACTED: Crystal Structure of a Complement Control Protein that Regulates Both Pathways of Complement Activation and Binds Heparan Sulfate Proteoglycans
AU649019B2 (en) Anabolic activity modulator and uses thereof
US5854206A (en) Compounds and methods for treatment and diagnosis of prostate cancer
US5705398A (en) Methods for identifying inhibitors of LPS-mediated LBP binding
KR20020007362A (ko) 유방암의 면역요법 및 진단용 화합물 및 이의 사용 방법
CN108623671A (zh) 一种抗肿瘤多肽及其血液检测抗体和试剂盒
CN108752432A (zh) 一种抗肿瘤多肽及其单克隆抗体和elisa试剂盒
Ankenbauer et al. Proteins regulating actin assembly in oogenesis and early embryogenesis of Xenopus laevis: gelsolin is the major cytoplasmic actin-binding protein.
Mahanta et al. Primary structure of a Thomsen-Friedenreich-antigen-specific lectin, jacalin [Artocarpus integrifolia (jack fruit) agglutinin]. Evidence for the presence of an internal repeat
CN108727476A (zh) 一种抗肿瘤多肽及其血液检测抗体和试剂盒
CN108732361A (zh) 一种抗肿瘤多肽及其血液检测elisa试剂盒
JP3497504B2 (ja) 細胞増殖阻害剤
CN106928335A (zh) 用于肿瘤的Her-2多肽、组合物及制备方法和应用
KR101334207B1 (ko) 복합 막횡단 단백질의 세포막외 펩타이드 항원 및 그의 용도
Koutrafouri et al. Synthesis and angiogenetic activity in the chick chorioallantoic membrane model of thymosin beta-15
CN110478494B (zh) 一种转铁蛋白受体靶向多肽类似物－阿霉素偶联物、其制备方法与用途
CN107082799B (zh) 一种抗肿瘤多肽husp-48及其应用
CN106754805B (zh) 一种抗肿瘤多肽及其制备方法和用途
CN101161283A (zh) CMTM1-v17的新应用及其拮抗剂
CN117720621B (zh) α-淀粉酶抑制肽及其应用
KR101782623B1 (ko) 복합 막횡단 단백질의 세포막외 펩타이드 항원 및 그의 용도
CN108676095A (zh) 一种重组免疫毒素及其制备方法和应用
CN107589261B (zh) 一种用于检测乳腺癌的试剂盒
CN107589262B (zh) 用于检测乳腺癌的试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20181009