JPH11514240A - 飼料酵素調製品 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 例えば動物飼料組成物の製造において利用するのに適する粒状酵素含有調製品であって、全体の１重量％以上の１又は複数種の疎水性物質と、この疎水性物質を含む全体の75重量％以上の１又は複数種の水不溶性物質とを含んで成る調製品。

Description

【発明の詳細な説明】 飼料酵素調製品 発明の分野 本発明は粒状酵素含有調製品（例えば顆粒形態の調製品：以降ひんぱんに「顆 粒」と呼ぶ）に関する。これは注目の酵素が動物用まぐさの１又は複数種の成分 と関連している場合、動物飼料組成物、特にペレットとして配合（「ペレット化 」）された動物飼料組成物等の中に組込むのによく適する。このタイプの組成物 のための業界において往々にして好適とされる製造条件を利用するとき、本発明 は酵素活性の非常に高度な保持性を有する組成物の製造を可能にする。 発明の背景 動物飼料（まぐさ）組成物中への一定のタイプの酵素、例えばβ−グルカナー ゼ、キシラナーゼ又はフィターゼの組込みは注目の動物によるまぐさからの栄養 分又はミネラル分の摂取の向上に関して著しく有利な効果を有しうることがよく 確立されている。まぐさ製造業界において、ペレット形態の動物飼料組成物の配 合は様々な理由、例えば取り扱い及び投与のし易さ；取り扱いの際のダスト生成 のレベルの低さ；並びに動物による消化のし易さ等のために好適とされる。 ペレット製剤がなぜ好適であるかの別の且つ重要な理由はペレット化工程自体 が、病原性微生物、例えばサルモネラ（Salmonella）種、リステリア（Listeria ）種、カンピロバクター（Campylobacter）種等を根絶する等の目的のために飼 料の熱処理を促進することに ある。かくして、例えば、サルモネラ種を効率的に根絶するため、飼料はペレッ ト化工程の際に少なくとも約81℃の温度で加熱処理しなくてはならない。この加 熱処理はペレット化工程の際の飼料のスチーム処理の如き手段により非常に適切 に成し遂げられる。 飼料の熱処理は上記の理由のために重要であるが、かかる処理、特にスチーム の利用を包括する処理であって、飼料成分を熱及び水分の双方に曝露する処理は 一般に処理する組成物に存在する酵素に対して有害な（不活性化又は変性）効果 を及ぼすものと予測されるであろう。例えば以下の文献が関連しうる： （ｉ）組成物のペレット化のための酵素安定性データーを供するNovo Nordisk公 開番号Ａ−06293（Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，Denmark より入手可能）。そ れにおいては、酵素はヒュミコラ・インソレンス(Humicola insolens)由来のキ シラナーゼ及びβ−グルカナーゼ、バチルス・スブチリス(Bacillus subtilis) 由来のアミラーゼ、並びにバチルス・リシェニホルミス（B．licheniformis）由 来のプロテアーゼを含むコート化顆粒の形態にある。85℃までのスチーム加熱が 各ケースにおいて当初の酵素活性の約25％の損失をもたらすことが報告されてい る。 （ii）Novo Nordisk Product Sheet No．B402e−GB（Novo Nordisk A/S Bagsvae rd，Denmarkより入手可能）。これは、Bio−Feed（商標）Plus CT として知られ るコート化酵素顆粒〔ヒュミコラ・インソレンスの浸漬発酵により製造されるカ ルボヒドラーゼ調製品(Bio−Feed（商標）Plus)が、飼料成分（酵素顆粒を含ん で成る）を83℃にまで加熱する飼料ペレット化工程においてその活性の75％以上 を保持するであろうことを報告する。 （iii）EP 0,569,468 B1。これはその中で「Bio−Feed Plus T」と称されている 顆粒化酵素調製品のコート化形態（これはいわゆる 「Ｔ−顆粒」型の顆粒、即ち、米国特許US 4,106,991号に従って製造され、そし て酵素の他に、とりわけ、２〜40重量％の微細に分割されたセルロースファイバ ーを含んで成る顆粒である）が、25〜30秒に及ぶ、且つ70℃の温度及び直接スチ ーム射出を包括するペレット化手順に委ねられるまぐさ組成物の中の成分として 組込まれたときにその本来の真菌β−グルカナーゼ活性の90〜100 ％を保持する ことを開示する（その中のExample １を参照のこと）。対して、未コート化Ｔ− 顆粒、及びＴ−顆粒型でないコート化「Bio−Feed Plus」顆粒は共に低めの真菌 β−グルカナーゼ活性保持（75％）を示した。 様々な酵素が多種多様な特性、特にその熱安定性に関する特性、例えば比較的 高温に耐久する能力を有しうることがよく知られる。更に、コート化Ｔ−顆粒型 （前掲）の酵素含有顆粒が、顆粒の非酵素構成成分の種類及び量に応じて多種多 様な安定性（特に熱的安定性、例えばペレット化工程の際の安定性）を発揮しう ることを本発明者は経験しており、そしてこのことはコート化Ｔ−顆粒型以外の タイプの酵素含有顆粒にも適用される。 それ故本発明の基礎となる研究の目的は、例えば動物飼料製造業界において採 用される工程（例えばペレット化工程）において遭遇するような（簡単に上述） 熱及び水分条件下で、顆粒形態、例えば酵素含有顆粒の酵素調製品の高められた 安定性を達成することにある。 発明の説明 本発明者は驚くべきことに、上記のペレット化条件下での粒状酵素含有調製品 （例えば顆粒）の酵素活性の有意に高まった保持性が、適当な比率の下記の材料 をこの粒状酵素含有製剤の中に含ませる ことにより成し遂げることができることを見い出した：（ｉ）疎水性材料、特に 疎水性材料（これは、例えば、ワキシー材料、又は脂肪材料、例えば獣脂）が粒 子の酵素含有コアを封入するコーティング層の中に存在しているときのこの材料 ；並びに（ii）水不溶性材料（上記の疎水性材料を含む）。 即ち、本発明の第一の観点は全体の１重量（ｗ／ｗ）％以上の１又は複数種の 疎水性物質と；疎水性物質を含む全体の75重量％以上の１又は複数種の水不溶性 物質とも含んで成る粒状酵素含有調製品（例えば顆粒）に関する。 この疎水性物質は酵素含有調製品の５重量％以上、より好ましくは往々にして 約８重量％以上を構成するのが好ましい。この水不溶性物質は好ましくは酵素含 有調製品の80重量％以上、より好ましくは85重量％以上、例えば90重量％以上を 構成するのが好ましい。 重量％は最終調製品（即ち、例えば存在しうる任意のコーティング層を含む） の総重量に基づいて称している。 本発明に係る未コート化調製品においては、この疎水性物質は当該調製品の粒 子材料全体（又は少なくともこの調製品から得た典型的な粒子材料全体）にわた って実質的に均一に分散されているのが一般に好ましい。かかる調製品中の疎水 性物質の含有量は適切には５〜95重量％に範囲しうる。一定のケースにおいて、 約98重量％ほどの高い疎水性物質含有量がこのタイプの粒状酵素含有調製品にと って適切であることさえもある。 ある程度前述した通り、本発明の好適な粒状酵素含有調製品は（ａ）酵素含有 コア及び（ｂ）疎水性物質を含み、且つこの酵素含有コアを覆う又は封入するコ ーティング層を含んで成る。かかる調製品において、この疎水性物質は適切には この調製品の１〜50重量％、往々にしてその５〜25重量％、そしてより典型的に はその５〜15 重量％を構成するであろう。 本発明に係る酵素含有調製品に関連して用いる語「粒状」とは、任意の形態又 は形状の粒子、例えば本質的に規則的な（例えば球状）の幾何学形態を有する粒 子、又は規則的もしくは不規則なフレーク形状の粒子、並びに様々な形態又は形 状を有する粒子の混合物（例えば前述のタイプの粒子の混合物）を包括すること を意図する。 酵素 本明細書及び請求の範囲において言及している酵素分類番号（EC番号）はReco mmendations （1992）of the Nomenclature Committee of the International Un ion of Biochemistry and Molecular Biology，Academic Press Inc.，1992 に従 う。 本発明に係る粒状酵素含有調製品中の酵素は任意のタイプの酵素、特に動物飼 料組成物に関連する任意のタイプの酵素であってよい。即ち、例えば、この酵素 はフィターゼ〔詳しくは３−フィターゼ（即ち、ミオ−イノシトール−ヘキサキ スホスフェート３−ホスホヒドロラーゼ；EC 3.1.3.8に分類）又は６−フィター ゼ（即ち、ミオ−イノシトール−ヘキサキスホスフェート６−ホスホヒドロラー ゼ；EC 3.1.3.26に分類）〕；ホスファターゼ（例えばEC 3.1.3.1又はEC 3.1.3. 2に分類される酵素）、キシラナーゼ（例えばEC 3.2.18又はEC 3.2.1.32に分類 される酵素）、β−グルカナーゼ（例えば、EC 3.2.1.75，EC 3.2.1.71 ，EC 3. 2.1.59の又はEC 3.2.1.39に分類される酵素）、β−ガラクタナーゼ〔EC 3.2.1. 89（エンド−１，４−β−ガラクタナーゼ）又はEC 3.2.1.90（エンド−１，３ −β−ガラクタナーゼ）に分類される酵素〕、α−ガラクトシダーゼ（例えばEC 3.2.1.22に分類される酵素）、β−ガラクトシダーゼ〔例えば、EC 3.2.1.23（ 「ラクターゼ」）に分類される酵素〕、α−アミラーゼ（EC 3.2.1.1）、β−ア ミラーゼ（EC 3.2 .1.2）、セルラーゼ（例えばEC 3.2.1.4に分類される酵素）、ペクチナーゼ（例 えば、EC 3.2.1.15に分類される酵素、並びにペプチダーゼ（EC 3.4）、例えばE C 3.4.21に分類される酵素の如き「プロティナーゼ」又は「プロテアーゼ」であ ってよい。 以上から既に明らかな通り、本発明に係る粒状酵素含有調製品の中に１又は複 数種の酵素を含ませてよい。粒子内に本発明の酵素含有調製品の粒子の酵素内容 物を分散させる態様は重要でないと思える。酵素内容物は従って所定の材料に均 一又は不均一に分散させてよい。 コート化粒子の場合、当該粒子の酵素内容物は粒子のコアに実質的に拘束され うるか、又はこの酵素内容物の少なくとも一部がコーティング層の中に存在して いてよいことが理解される。 本発明の粒状酵素含有調製品中の酵素タンパク質の含有量は一般に当該調製品 の0.01〜10重量％の範囲、例えば0.1〜10重量％、より典型的には0.2〜５重量％ 、往々にして0.3〜2.5重量％であろう。酵素の含有量は粒状調製品中に存在する 酵素の種類にかなり依存するであろう。この粒状調製品は酵素製造工程に由来す るその他の材料も含んでよく、その点で一般に粒状調製品の中に組込むのに完璧 に精製されていない酵素調製品を採用することは業界において好適である。 粒子 本発明の粒状酵素含有調製品は、ある程度前述した通り（前掲）、非常に適切 には顆粒（即ち、顆粒形状）、例えば「Ｔ−顆粒」（前掲）又は何通りかのその 他のタイプの顆粒であってよい。他方、本発明の粒状酵素含有調製品の粒子は、 例えば適当な比率の溶融性成分、例えばパーム油（及び／又はその他の溶融性植 物油もしくは脂肪）、水素化パーム油（及び／又はその他の水素化植物油）、獣 脂、水素化獣脂又はワックスであって、酵素及びその他の成分のためのマトリッ クスを担うものを含んで成る。このタイプの粒子の製造において、酵素及び当該 調製品のその他の関連成分を溶融した溶融性成分の中に導入し、そしてその溶融 物を粒子形成条件下で固化させる。 本発明の粒状酵素含有調製品中の粒子のサイズに関し、飼料のその他の成分と の適正な混合を促進する及び最終飼料製品内での分散の具合いの適当な均一性を 確保する観点から、飼料組成物の中に組込む調製品中の大半の粒子の粒子サイズ の実用的な上限値は通常約２mmであろう。 尚、粒子のサイズは粒子の最大線形寸法として設定されうる。即ち、例えば実 質的に球状の粒子（例えば実質的に球状の顆粒粒子）の場合、注目の粒子サイズ は粒子の直径であろう。 本発明の粒状酵素含有調製品中の粒子のサイズの下限値は通常製造の際のダス ト生成の回避及び調製品の取り扱いによる所望により主に設定されるであろう。 かかる粒子のサイズについての実用的な下限値は往々にして約0.1mmであろう。 疎水性物質 本発明との関連で利用する語「疎水性物質」とは、水で容易に濡れない物質、 即ち、水をはじく傾向の物質を意味する。かかる物質、例えば油、脂肪、炭化水 素ワックス及び数多くのタイプの樹脂が一般に水の中で本質的に完璧に不溶性で ある。 本発明に特に関連する疎水性物質は通常炭化水素型の有機溶媒（例えばヘキサ ン、ヘプタン等）又は塩素炭化水素型の有機溶媒（例えばジクロロメタン、クロ ロホルム等）の中で可溶性である物質である。その適当な例には様々なグリセリ ド脂質（即ち、モノ−、ジ−又はトリ−グリセリド）、例えば獣脂（例えば牛又 は羊脂）、及 び植物油、並びにそれらの所定の誘導体が含まれる。 特によく適する疎水性物質は周囲温度で固体であり、そして約40℃以上の融点 を有するものである。その例には一定の天然又は硬化（水素化）植物油又は脂肪 、例えば水素化パーム油、水素化パームケルネル油又は水素化ダイズ油の如き物 質、並びに水素化獣脂（例えば水素化牛脂又は羊脂）の如き材料が含まれる。 本発明に係る粒状酵素含有調製品における疎水性物質の総含有量（本明細書に 定義）を決定するのに一般に適当であり、そしてジクロロメタン及びｎ−ヘキサ ンによる抽出を利用するアッセイ手順は本明細書における材料と方法の章に記載 してある（後述）。 水不溶性物質 本発明との関連で利用する語「水不溶性物質」とは、水に本質的に完璧に不溶 性なものから、非常に低い水溶解度（例えば、即ち、100mlの純水当り最大で約 １ｇの溶解度）を示すものに範囲する物質を包括する。即ち、本発明との関連に おける水不溶性物質は、限定することなく、上記の疎水性物質を含む。本発明に 関連するその他のタイプの水不溶性物質には様々な無機塩（例えば炭酸カルシウ ム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム又は炭酸マグネシウム）、珪酸アル ミニウムを含む鉱物材料（例えば粘土、例えばカオリン、ベントナイト又は白土 ）、不活性金属酸化物（例えば二酸化チタン又は酸化マグネシウム）、様々な巨 大分子物質〔例えば多糖類、例えばセルロース又は所定のタイプのデンプン、並 びに粉砕穀類又は穀粉（例えば小麦、大麦又はライ麦の如き穀類より調製）又は ダイズ（例えばダイズミール又はダイズ粉）〕並びに活性化炭素が含まれる。 本発明に係る粒状酵素含有調製品中の水不溶性物質（本明細書において定義） の総含有量の決定のために一般に適するアッセイ手順 は本明細書の材料と方法の章に記載してある。 本発明の更なる観点 本発明は更に酵素含有動物飼料組成物の製造のための方法に関連し、この方法 においては、最終飼料組成物のその他の構成成分と混合した本発明に係る酵素含 有調製品をスチーム加熱段階（例えば、往々にして、最終飼料組成物をペレット 化する前述のペレット化手順に包括される段階）における。 本発明の更なる観点は酵素含有動物飼料組成物の製造における本発明に係る粒 状酵素含有調製品の利用に関する。 尚、本発明は以下も包括する： 酵素含有出発材料として、本発明に係る粒状酵素含有調製品を用いて製造した 酵素含有飼料組成物；及び 本発明に係る製造工程（前述）により得られた又は得られる酵素含有動物飼料 組成物。 本発明に従って配合した酵素含有粒状調製品は、その製造が本明細書に概略し た加熱処理を包括するその他の（非飼料）酵素含有組成物の製造においても利用 されうる。 本発明の原理は酵素含有調製品の加熱処理（例えばスチーム処理）に関連する 酵素活性の保持性を向上させるだけでなく、例えば、ビタミン、補助ビタミン、 アミノ酸、医薬（例えば抗生物質又は成長調節剤）、鉱物添加剤の向上した安定 性又は微生物（例えば細菌又は真菌）の向上した生存率を、これらを組込んだ粒 状調製品の加熱処理（例えば熱処理）を経て達成されるよう、似たように利用さ れうる。 本発明を下記の材料と方法の章に記載の実施例により、限定することなく説明 する。 材料と方法Ｔ−顆粒の調製の一般的な説明 上記した通り、「Ｔ−顆粒」型の顆粒は米国特許US 4,106,991号に特性決定さ れている。 下記の実施例１及び２（全て必須の疎水性物質がコーティングの中に組込まれ ている顆粒の実施例）に記載のコート化Ｔ−顆粒は以下に記載の一般手順により 、下記の出発材料を利用して調製した： １）セルロースファイバー(Arbocel（商標）BC200) ２）微細に粉砕した「充填剤」（本発明に係る調製品の場合、本発明の範囲内の １又は複数種の水不溶性物質を含んで成る） ３）デキストリン（TACKIDEX（商標）GM155又はAVIDEX（商標）28LA21）及び／ 又はその他の炭水化物型バインダー、並びに ４）水性酵素溶液。「更なる詳細については、実施例１及び２（後述）を参照の こと。 実施した。 セルロースファイバーを充填剤及びバインダーの一部とよく混合したら、酵素 及び残りのバインダーを含む水性溶液をミキサーの中にスプレーし、回転刃の作 用を介して顆粒粒子の形成をもたらした。 次いでこの顆粒を乾燥のために流動層ドライヤーに移し、そして乾燥顆粒を冷 却し、そしてふるい分けした。 得られるＴ−顆粒粒子の疎水性物質を含んで成るコーティングに 乾燥顆粒粒子を約70〜85℃、通常は75〜85℃の範囲の温度に加熱した（利用す る疎水性成分の溶融特性に依存して）。疎水性成分を溶融させ、そしてミキサー の中で顆粒粒子の上に均一にスプレーし た。第二充填剤はEP 0,569,468 B1に記載の通りにして組込んだ。疎水性成分及 び充填剤の適用後、得られるＴ−顆粒を周囲温度にまで冷却し、そしてふるいに かけて非常に微細な粒子及び不要な大粒子を除去した。 以下の実施例において利用したＴ−顆粒は全て0.3〜1.2mmの範囲の主粒子サイ ズ（直径）を有していた。本発明の調製品中の疎水性物質の総含有量を決定するためのアッセイ 注目の調製品約10ｇ（正確な重量Wg）を密閉槽の中で50mlのジクロロメタン中 で約４時間20〜25℃で断続的に撹拌する。ｎ−ヘキサンの50mlのアリコートを加 え、そしてこの槽を再密閉し、撹拌し、そして液相の上部が透明となるまで数時 間放置する。透明な液相のサンプル10mlを既知重量（小数点４位まで）の50mlの ガラスビーカーに移し、そして溶媒を完璧に蒸発させる。次いでそのビーカーを 再秤量し（ここでも小数点４位まで）、蒸発後に残っている残渣の重量（Ｒ，ｇ ）を決定する。 次いで疎水性物質の％総含有量を下記の通りにして計算する： 〔（Ｒ×10）／Ｗ〕×100本発明の調製品中の水不溶性物質の総含有量を決定するためのアッセイ 注目の調製品約10ｇ（正確な重量Wg）を密閉槽の中で50mlの脱イオン水中で２ 時間20〜25℃で撹拌する。得られる懸濁物／スラリーのサンプルを遠心し、そし て透明上清液の％乾燥固体含有量Ｓを^OBrixスケールを利用し、0.1％近くまで屈 折率決定する。 水不溶性物質の％総含有量は下記の通りに計算する： 100−〔（Ｓ×50）／Ｗ〕 実施例１フィターゼ含有顆粒調製品の調製： ５種類のフィターゼ含有顆粒をＴ−顆粒化手 順により調製した（前掲）。顆粒化に利用したフィターゼ溶液は製品フィターゼ Novo Lの製造に開いたものと同一の起源に由来する（Novo Nordisk A/S，Bagsva erd Denmarkより注文に応じて入手できるNovo Nordisk Product Sheet B−722a 参照）。フィターゼNovo.Lは標準化フィターゼ活性を有する液体酵素製剤である 。 PA，PB，PC，PD及びPEと称する５種類の顆粒を下記の成分を表示の量（乾燥重 量ベース）で開いて調製した：顆粒PA（コート化） 上記の表から明らかな通り、顆粒PA内で利用される主要充填剤は水溶性塩化ナ トリウムであり、そして疎水性物質（水素化牛脂）及び水不溶性物質（水素化牛 脂＋カオリン＋セルロース＋炭酸カルシウム）の総含有量はそれぞれ９重量％及 び39重量％であった。後者の値は前述のアッセイ手順を利用して決定した値（そ れぞれ８重量％及び37重量％）とよく一致した。顆粒PAのフィターゼ活性はNovo Nordisk分析法KAL−SM−0403.01/01を利用し、2400FYT／ｇと決 定された（Novo Nordisk A/Sより注文に応じて入手できる）。顆粒PB（未コート化） 上記の表から明らかな通り、顆粒PB内で利用される主要充填剤は水不溶性炭酸 カルシウムであり、そして水不溶性物質の総含有量は84重量％であった。この値 は水不溶性物質についての前述のアッセイ手順を利用して決定した値（84重量％ ）と非常によく一致した。疎水性物質（本明細書において定義）は使用せず、こ れは疎水性物質についての前述のアッセイを用いての＜１重量％の疎水性物質の 認定と一貫する。顆粒PBのフィターゼ活性はNovo Nordisk分析法KAL−SM−0403. 01/01を利用し、1760FYT／ｇと決定された（前掲）。顆粒PC（コート化） 上記の表から明らかな通り、顆粒PC内で利用される主要充填剤は水不溶性炭酸 カルシウムであり、そして疎水性物質（水素化牛脂） 及び水不溶性物質（水素化牛脂＋カオリン＋セルロース＋炭酸カルシウム）の総 含有量はそれぞれ11重量％及び87重量％であった。後者の値は前述のアッセイ手 順を利用して決定した値（それぞれ10重量％及び87重量％）とよく一致した。顆 粒PCのフィターゼ活性はNovo Nordisk分析法KAL−SM−0403.01/01を利用し、950 FYT／ｇと決定された（前掲）。顆粒PD（コート化） 上記の表から明らかな通り、顆粒PD内で利用される主要充填剤は水不溶性リン 酸水素カルシウム（CaHPO₄）であり、そして疎水性物質（水素化パーム油）及び 水不溶性物質（水素化パーム油＋カオリン＋セルロース＋炭酸カルシウム＋リン 酸水素カルシウム）の総含有量はそれぞれ5.5重量％及び79.8重量％であった。 顆粒PDのフィターゼ活性はNovo Nordisk分析法KAL−SM−0403.01/01を利用し、1 430FYT／ｇと決定された（前掲）。顆粒PE（コート化） 上記の表から明らかな通り、顆粒PE内で利用される主要充填剤は水溶性硫酸ナ トリウムであり、そして疎水性物質（水素化パーム油）及び水不溶性物質（水素 化パーム油＋カオリン＋セルロース＋炭酸カルシウム）の総含有量はそれぞれ8. 5重量％及び40.1重量％であった。顆粒PEのフィターゼ活性はNovo Nordisk分析 法KAL−SM−0403.01/01を利用し、2400FYT／ｇと決定された（前掲）。 実施例２キシラナーゼ含有顆粒調製品の調製： ５種類のキシラナーゼ含有顆粒をＴ−顆粒 化手順（前掲）により調製した。顆粒化において使用したキシラナーゼ溶液は製 品Bio−Feed（商標）Wheat Lの製造において用いたものと同一の起源に由来する （例えば、Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，Denmarkより注文に応じて入手できる Novo Nordisk出版物B−854aを参照のこと）。Bio−Feed（商標）Wheat Lは標準 化キシラナーゼ活性を有する液体酵素製剤である。 XA，XB，XC，XD及びXEのそれぞれと表示する５種の顆粒を下記の成分を用いて 表示の量（乾燥重量で示す）を利用して調製した：顆粒XA（コート化） 上記の表から明らかな通り、顆粒XA内で利用される主要充填剤は水溶性硫酸ナ トリウムであり、そして疎水性物質（水素化牛脂）及び水不溶性物質（水素化牛 脂＋セルロース＋炭酸カルシウム）の総含有量はそれぞれ８重量％及び36重量％ であった。後者の値は前述のアッセイ手順を利用して決定した値（それぞれ９重 量％及び36重量％）とよく一致した。顆粒XAのキシラナーゼ活性はNovo Nordisk 分析法KAL−SM−0356.01/01を利用し、810FXU／ｇと決定された（Novo Nordisk A/Sより注文に応じて入手できる）。顆粒XB（コート化） 上記の表から明らかな通り、顆粒XB内で利用される主要充填剤は水不溶性硫酸 カルシウムであり、そして疎水性物質（水素化牛脂）及び水不溶性物質（水素化 牛脂＋硫酸カルシウム＋カオリン＋セルロース＋炭酸カルシウム）の総含有量は それぞれ８重量％及び90重量％であった。後者の値は前述のアッセイ手順を利用 して決定した値（それぞれ８重量％及び90重量％）とよく一致した。顆粒XBのキ シラナーゼ活性はNovo Nordisk分析法KAL−SM−0356.01/01を利用し、770FXU／ ｇと決定された（前掲）。顆粒XC（未コート化） 上記の表から明らかな通り、顆粒XC内で利用される主要充填剤は水溶性硫酸ナ トリウムであり、そして水不溶性物質の総含有量は17重量％であった。疎水性物 質（本明細書において定義）は使用せず、これは疎水性物質についての前述のア ッセイを用いての＜１重量％の疎水性物質の認定と一貫する。顆粒XCのキシラナ ーゼ活性はNovo Nordisk分析法KAL−SM−0356.01/01を利用し、1080FXU／ｇと決 定された（前掲）。顆粒XD（未コート化） 上記の表から明らかな通り、顆粒XD内で利用される主要充愼剤は水不溶性硫酸 カルシウムであり、そして水不溶性物質の総含有量は87重量％であった。これは 水不溶性物質についての前述のアッセイを利用して決定した値（88重量％）とよ く一致した。疎水性物質（本明細書において定義）は使用せず、これは疎水性物 質についての前述のアッセイを用いての＜１重量％の疎水性物質の認定と一貫す る。顆粒XDのキシラナーゼ活性はNovo Nordisk分析法KAL−SM−0356.01/01を利 用し、1090FXU／ｇと決定された（前掲）。顆粒XE（コート化） 上記の表から明らかな通り、顆粒XE内で利用される主要充填剤は水不溶性炭酸 カルシウムであり、そして疎水性物質（水素化牛脂）及び水不溶性物質（水素化 牛脂＋セルロース＋炭酸カルシウム）の総含有量はそれぞれ８重量％及び88重量 ％であった。後者の値は前述のアッセイ手順を利用して決定した値（それぞれ６ 重量％及び90重量％）とよく一致した。顆粒XEのキシラナーゼ活性はNovo Nordi sk分析法KAL−SM−0356.01/01を利用し、410FXU／ｇと決定された（Novo Nordis k A/Sより注文に応じて入手できる）。 実施例３フィターゼ含有飼料製剤のフィターゼ活性に対するスチーム加熱効 果 フィターゼ含有顆粒PA，PB，PC，PD及びPEのいづれかを組込んだ飼料製剤のス チーム加熱を経た酵素活性の保持率を調べた： 下記の組成（重量／重量）のすり潰した飼料製剤を選定した： 62％の小麦 15％のダイズミール 12％の大麦 ７％の魚類ミール ２％のダイズ油 １％の炭酸カルシウム １％のリン酸二カルシウム 0.2％のSolivit（商標）Mikro 106^{* *}市販のビタミン／鉱物添加剤 フィターゼ含有顆粒調製品PA，PB，PC，PD及びPEのそれぞれについて、注目の 調製品を上記の飼料製剤の一部とよく混合した。顆粒PA，PB及びPCの場合、混合 比は最終飼料製剤のフィターゼ活性が約1500〜2500 FYT／kgの範囲に入るように し、一方顆粒PD及びPEの場合、混合比は最終飼料製剤のフィターゼ活性が約3000 〜4000 FYT／kgの範囲の範囲に入るようにした。得られる５種類のフィターゼ濃 厚飼料製剤の各サンプルのフィターゼ活性を下記のNovo Nordisk分析法ED−9513 614を利用して決定した。フィターゼ含有調製品を加えていない上記の飼料製剤 のサンプルの内性フィターゼ活性を同じようにして決定し、そしてその値を各フ ィターゼ濃厚飼料製剤についての値から差し引いた。分析方法 １．分析原理及び単位定義：Novo Nordisk分析法ED−9513614においては、フィ ターゼを飼料から水性溶液において抽出し、次いで酵 素を標準化条件（温度37℃、酢酸バッファーでpH5.5、反応時間60分、初期フィ ターゼ濃度５mM）下でミオ−イノシトールヘキサキスホスフェート（フィテート ）と反応させる。この反応を停止させ、そして無機リン酸塩を硝酸中でモリブデ ン酸塩／バナジン酸塩の添加により決定する。ブランク値はフィテートの添加前 のモリブデン酸塩／バナジン酸塩／硝酸の添加により決定する。このアッセイは リン酸標準品に対して標準化させる。１FTUのフィターゼはこれらの標準条件下 で１分当り１μmolのPO₄ ^3-を生成する。 ２．範囲：このアッセイは＞50 FTU／kgを含む動物飼料のフィターゼ活性の決定 に適する。 ３．備品のリスト： ｉ）適当な電極の付いた小数点２位のデジタル読取値を有するpHメーター。pH メーターはバッファー及び基質溶液のpHをチェック及び調製するために使用する 。 ii）10mmのフローセルの付いた、415nmにて小数点３位のデジタル吸収読取値 （光学密度OD）を供する光度計。 iii）37±0.2 ℃を維持できる恒温浴槽。 iv）約2000 rcf(典型的なベッチトップ遠心機で約3000rpm)を供することので きる遠心機。この遠心機は：ａ）サンプリングを助長するため、飼料抽出物から 不溶性材料のバルクを分離する、及びｂ）光度計測定のために透明溶液を生成す る、のに利用する。 ｖ）ガラス遠沈管。 vi）マグネチックスターラー。 vii）±１％以内で指定量を秤量できる天びん。 viii）ボルテックスミキサー。 ix）容量分析器具：一式の反復ピペット、分注器及び容量分析ガラス製品が必 要とされる。使用する器具は指定容量を±１％で移す ものであるべきである。 ４．化学品のリスト： 酢酸、氷酢酸(100％) 購入先Merck 63 アンモニア溶液25％ 購入先Merck 5432 アンモニウムヘプタモリブデート四水和物 購入先Merck 1182 アンモニウムモノバナデート 購入先Merck 1226 塩化カルシウム二水和物 購入先Merck 2382 硝酸65％ 購入先Merck 456 リン酸二水素カリウム 購入先Merck 4873 酢酸ナトリウム三水和物 購入先Merck 6267 フィチン酸ナトリウム、米由来、Sigma P-3168 ５．試薬のリスト： ５．１．希薄硝酸：１容量の硝酸（65％）を２容量の水で希釈する。室温で保存 する。最長保存期間：無期限。 ５．２．アンモニウムヘプタモリブデート試薬：100.0ｇの(NH₄)₆Mo₇O₂₄・4H₂O を秤量する。約800mlの水に溶解する。10mlの25％のアンモニア溶液を添加する 。1000mlの最終容量となるように水を加える。暗所において室温で保存する。最 長保存期間：８週。 ５．３．アンモニウムバナデート試薬：2.35ｇのNH₄VO₃を秤量する。50〜60℃に 予備加熱しておいた水400mlの中に完全に溶解させる。次いで20mlの希薄硝酸を 添加する（上記５．１参照）。水を1000mlの最終容量になるまで加える。暗所に おいて室温で保存する。最長保存期間：８週。 ５．４．MoV停止試薬：１容量のアンモニウムバナデート試薬（上記５．３参照 ）を１容量のアンモニウムモリブデート試薬（上記５．２参照）に加える。次い で２容量の希薄硝酸（上記５．１参照）を加える。混合する。室温で保存する。 各日に改めて調製する。 ５．５．酢酸バッファーpH5.5：150.1ｇの酢酸ナトリウム三水和物及び0.735ｇ のCaCl₂・2H₂Oを約4500mlの水の中に溶解する。pHを酢酸（約10mlの氷酢酸）で5 .50±0.02に調整する。水を最終容量5000mlになるように加える。室温で保存す る。最長保存期間：１週。使用日にpHをチェックし、必要なら調整する。 ５．６．10％の塩化カルシウム溶液：100ｇのCaCl₂・2H₂Oを秤量する。水に溶解 する。水を最終容量1000mlになるように加える。室温で保存する。最長保存期間 ：無期限。 ５．７．フィテート基質溶液：1.40ｇのフィチン酸ナトリウムを秤量する。200m lの酢酸バッファー（上記５．５参照）に溶解する。pHを希薄酢酸（約0.4mlの氷 酢酸に対応）の添加により室温において5.50±0.02に調整する。酢酸バッファー （上記５．３参照）で最終容量250mlに希釈する。フィチン酸ナトリウムが10水 和物であり、1104の分子量をもつものと仮定して、この基質溶液は5.1mMのフィ テートを含む。各日に改めて調製する。 ５．８．リン酸ストック標準溶液（50mM）：真空オーブンの中で１05℃で２時間 KH₂PO₄約10ｇを乾燥させる。デシケーター内で保存する。正確に682mgの乾燥KH₂ PO₄を秤量する。100mlの酢酸バッファー（上記５．５参照）に溶解する。０〜５ ℃で保存する。最長保存期間：１週。 ５．９．10mMのリン酸標準品：10mlのリン酸ストック標準溶液(5.8)を50mlの酢 酸バッファー（上記５．５参照）で希釈する。各日に改めて調製する。 ６．飼料サンプル：飼料の代表サンプルを例えば家庭用コーヒーグラインダーで 粉末にまで破砕する。 ７．方法： ７．１．飼料抽出：40.0±0.25ｇの飼料粉末を秤量する。16mlの10 ％の塩化カルシウム溶液（上記５．６参照）を含む500mlの脱イオン水を加える 。60分強く撹拌する。約５mlをガラス遠沈管に移す。例えば3000rpmで５分遠心 する。ガラス試験管を用意する。各飼料サンプルにつき、４本の試験が必要であ る（これらの試験管は酵素反応段階の後に遠心することに注意−そのサイズ及び 品質はそれに従って選定すべきである。）100μｌの遠心した飼料サンプルを４ 本の試験管それぞれに分注する。 ７．２．分析：分析手順はサンプル抽出手順の開始後90分以内に開始する。酵素 反応のために２本、そしてブランクのために２本の試験管を使用する。また、10 0μｌづつの10mMのリン酸標準品（上記５．９参照）を含む４本の試験管及び100 μｌづつの酢酸バッファー（上記５．５参照）を含む４本の試験管を用意する。 これらは全て酵素サンプル試験管と同じようにして処理する。 酵素サンプル、リン酸標準品及びバッファー：15秒間隔。０時（ｔ＝０）に、3. 0mlのフィテート基質(5.7)を加え、混合し、そして37℃の湯浴の中に入れる。ｔ ＝60分時に、2.0mlの停止試薬（上記５．４参照）を加え、混合し、そして室温 で放置する。 酵素ブランク：全てのサンプルを開始するやいなや、下記のようにブランクを用 意する：2.0mlの停止試薬（上記５．４参照）を加え、直ちに3.0mlのフィテート 基質（上記５．７参照）を加え、混合し、そして室温で放置する。ｔ＝70〜90分 時に、全ての試験管を3000rpmで10分遠心する。ｔ＝最大120分で、415nmでODを 測定する。対照として水を使用する。 ８．計算：各サンプル及びリン酸標準品について、二重測定についての平均値を 計算し、そしてブランク値を差し引いてΔOD₄₁₅を計算する（リン酸標準品につ いてのブランク値はバッファーサンプルについてのアッセイ値である）。 10mMのリン酸標準溶液の濃度：「Ｐ」mM（使用したKH₂PO₄の重量及び希釈率よ り）。 リン酸標準アッセイにおけるPO₄ ^3-のmmol：「Ｐ×0.1」。 ΔOD₄₁₅リン酸標準品：「Ａ」。 アッセイにおけるサンプルの重量（秤量、希釈率及び使用した最終容量より） ：「Ｅ」ｇ。 サンプルのΔOD₄₁₅：「Ｂ」。 サンプルのフィターゼ活性をサンプル１ｇ当り１分間に放出されるリン酸塩の μmolとして計算。サンプルフィターゼ活性、FTU／ｇ＝(Ｂ×Ｐ×0.1)／（Ａ× Ｅ×60）。 ８．１．実施例：飼料40.2ｇで500mlの水と16mlのCaCl₂溶液との中で抽出した。 飼料濃度＝0.0779ｇ／ml又は 0.00779ｇ／100μｌ。 OD₄₁₅飼料サンプルアッセイ＝0.506 OD₄₁₅飼料サンプルブランク＝0.252 OD₄₁₅飼料サンプル＝0.254 リン酸標準品の実際の濃度＝9.62mM 100ml中のリン酸塩＝0.962μmol OD₄₁₅リン酸標準品＝0.563 OD₄₁₅バッファーブランク＝0.197 ΔOD₄₁₅リン酸標準品＝0.366 飼料サンプルフィターゼ活性＝ (0.254×0.962)／(0.366×0.00779×60)＝1.428FTU／ｇ ９．備考： ９．１．バナデート毒性：バナデート（酸化状態＋５のバナジウム）は非常に毒 性である（ラットのLD₅₀p.o．は18mg／kg）。MoV 停止試薬は0.6mg／mlのバナデ ートを含む。最終アッセイ溶液（これ は取り扱い、例えば遠心を最も要する）は0.24mg／mlのバナデート（及び約２％ のHNO₃）を含む。 ９．２．飼料アッセイにおけるカルシウム添加：飼料サンプルのための上記方法 においてカルシウム添加が含まれる。カルシウム添加はサンプル調製段階の際に 遊離リン酸の生成を減少させる、即ち、ブランク及び酵素OD値の双方を下げる。 ９．３．リン酸標準品：リン酸応答は少なくとも1.5のOD₄₁₅まで直線的である。 リン酸標準測定は非常に再現性よく、そして一つのリン酸濃度のみの利用で十分 に正確な較正を供する。10mMのリン酸標準品についてのΔOD₄₁₅はほぼ0.37であ る。 ９．４．最大サンプル濃度：OD₄₁₅は0.8を超えるべきでない。もしそれより高い 値が得られたら、サンプル希釈の調整が有用である。例えば、７．１（前掲）に おいて500mlの水の代わりに1000mlの脱イオン水が使用される。スチーム加熱 各フィターゼ濃厚飼料製剤の一部、及びフィターゼを加えていない飼料製剤の 一部を、典型的な飼料ペレット化工程において利用されるスチーム加熱条件をシ ュミレーションしたスチーム加熱手順にかけた：100ｇの注目の飼料製剤をブフ ナーろう斗(Schott Duran 21 341 44 05)に移し、そしてそのろう斗を介してス チームをそのろう斗内に含まれている飼料製剤に通すことにより加熱する。スチ ーム加熱は30秒間続け、その際飼料を均一に撹拌した。スチームの供給の全実験 中一定に保ち、そして30秒の加熱期間の終了時に飼料製剤の温度が＞85℃までと なるのに十分なものとした。次いで加熱飼料製剤をろう斗の外に注ぎ出し、そし て周囲温度に冷却した。 スチーム加熱した飼料製剤のそれぞれのサンプルのフィターゼ活性をNovo Nor disk分析法ED−9513614(前掲)に利用して決定し、そ してスチーム加熱したフィターゼ濃厚調製品それぞれの活性を、フィターゼ調製 品の加えていないスチーム加熱した飼料製剤について決定した残留内因性フィタ ーゼ活性を差し引くことにより補正した。 スチーム加熱したフィターゼ濃厚飼料製剤のそれぞれにおけるフィターゼ活性 の％保持率を下記の表に示す： これらの結果は、共に本発明に係る調製品であり、そして疎水性物質を含む高 含有量の水不溶性物質を有する顆粒PC又は顆粒PEの利用が、顆粒PA，PB及びPE（ これらの組成物は本発明の範囲に属さない）について観察されるよりも、スチー ム加熱工程の際の著しく高い酵素活性保持を供することを示した。 実施例４キシラナーゼ含有飼料製剤のキシラナーゼ活性に対するスチーム加熱の効果 ： キシラナーゼ含有顆粒調製品XA，XB，XC，XD及びXE（実施例２参照）のいづれ かを含む飼料製剤のスチーム加熱を経た酵素活性の保持の度合いをそれぞれ調べ た。実施例３に記載と同一の基礎組成を有するすり潰した飼料製剤（前掲）をこ の目的のために利用した。 キシラナーゼ含有顆粒調製品のそれぞれについて、注目の調製品 を飼料製剤の中に約800〜1000FXU／kgの範囲の最終キシラナーゼ活性が供される ように組込んだ。顆粒XA及びXBの場合、これは96000FXUに対応する量の顆粒を10 kgの飼料製剤の中に混合することにより成し遂げた。得られる酵素濃厚飼料の一 部を110kgの基礎飼料製剤とよく混合し、800FXU／kgの計算上の活性を有する総 重量120kgとした。顆粒XC，XD及びXEの場合、より小さいバッチ（＜１kg）の濃 厚飼料製剤を調製した。 ５種類の得られるキシラナーゼ濃厚飼料製剤のそれぞれのサンプルのキシラナ ーゼ活性を下記のNovo Nordisk分析法ED−9511460.2を利用して決定した。分析法 １．分析原理：Novo Nordisk分析法ED−9511460.2においては、キシラナーゼを 飼料サンプルから水性溶液の中へと抽出する。次いでこの酵素を改質小麦キシラ ンと反応させる。この小麦キシランは架橋されており（不活性にされている）、 そして青色色素とのカップリングにより着色され、そして錠剤形態で利用できる 。反応を標準化条件（温度70℃，pH6.0、反応時間120分）下で行い、そしてpHを 高めることにより停止させる。溶液を濾過し、そして基質の酵素触媒式可溶化の 尺度である溶液の青色を光学的に決定する。ブランク値は酵素サンプルの添加抜 きでアッセイを実施することにより決定する。このアッセイは飼料サンプルに既 知の酵素活性を加えることにより較正する。加えた酵素活性に基づく応答の上昇 を利用して飼料サンプルの活性を計算する。 ２．範囲：このアッセイは50〜250FXU／kgを含む飼料のBio−Feed（商標）Wheat Lキシラナーゼ活性の決定によく適する。濃度及び希釈率を調製することを条件 に、より高い活性もアッセイできる。kg当り200〜1000FXUの活性範囲についての ガイドラインを本明細 書に含ませる。 ３．備品のリスト： ｉ）適当な電極の付いた小数点２位のデジタル読取値を有するpHメーター。この pHメーターはバッファー溶液のpHをチェック及び調製するために利用する。 ii）10mmのフロールセルの付いた、580nmでの小数点３位のデジタル吸収（光学 密度、OD）読取値の備わった光度計。 iii）サンプリングを助長するため、飼料抽出物から不活性材料のバルクを分離 するのに用いる実験室ベンチトップ遠心機。 iv）５〜10mlのサンプルのための遠沈管。 ｖ）70±0.5℃を維持できる恒温浴槽。 vi）ボルテックスミキサー。 vii）マグネチックスターラー。 viii）ガラスファイバーフィルター、Whatman GF／ｃ、直径９cm。 ix）指定量を±１％以内で秤量できる天びん。 ｘ）容量分析備品：一式の反復ピペット、分注器及び容量分析ガラス製品が必要 とされる。この備品は指定容量を±１％以内で移すことができるものであるべき である。 xi）ガラス試験管、例えば15mm×100mm、キャップ付き。 ４．化学品のリスト リン酸水素二ナトリウム二水和物 購入先、例えばMerck 6580 リン酸二水素ナトリウム一水和物 購入先、例えばMerck 6346 トリス（ヒドロキシメチル）メタン、例えばSigma ７−９、Sigma Ｔ−1378 Xylazyme AX 、キシラナーゼアッセイ錠剤、Megazymc Pty．Ltd.，Australia Bio −Feed（商標）Wheat L（活性既知のキシラナーゼ調製品） Novo Nordisk A/S，Denmark ５．試薬のリスト： ５．１．リン酸バッファー、pH６：60.0ｇのNaH₂PO₄・H₂O 及び11.6ｇのNa₂HPO₄ ・2H₂Oを約4500mlの水に溶解する。pHを１ＮのHCl又は１ＮのNaOHで6.00±0.05 に調整する。最終容量を5000mlに希釈する。室温で保存する。最長保存期間：１ 週。 ５．２．トリス停止試薬：10.0ｇのトリス（ヒドロキシメチル）メタンを1000ml の水に溶解する。室温で保存する。最長保存期間：１週。 ５．３．酵素標準溶液：Bio−Feed（商標）Wheat L（キシラナーゼ活性既知）よ り、4.8〜5.2FXU／mlの範囲内において正確に活性のわかっているバッファー中 の溶液を調整する。例えば、もしBio−Feed（商標）Wheat L製品が500FXU／ｇな ら、約1000mgを正確に秤量し、そして100mlのリン酸バッファー（上記５．１参 照）に溶解する。室温で保存する。最長保存期間：２時間。 ６．飼料サンプル：「飼料サンプル」は研究所より受け取った飼料サンプル全て をいう。 Bio−Feed（商標）WheatキシラナーゼアッセイのためのサンプルFX：FXは「飼 料サンプル」から得たサンプル100ｇとする。FXを得るために用いる手順はそれ が代表的なサンプルとなるように確実なものとする。FXを粉末に砕き、それをア ッセイに用いる。同一の「飼料サンプル」についての反復アッセイのため、サン プリング手順全体を繰り返すべきである。 ７．方法：それぞれ40±0.4ｇづつの飼料FXの２つのサンプルを秤量する。「ａ 」及び「ｂ」とラベルする。下記の手順において、双方のサンプルを同じように 処理する。０時（ｔ＝０）で、800mlの水を加え、そして撹拌を開始する。ｔ＝3 0分の時に約５mlを取り出 し、そして遠沈管に移す。「aS」及び「bS」としてラベルする。 1.0 mlの酵素標準溶液（上記５．３参照）を加え、そして撹拌し続ける。ｔ＝ 45分時に、約５mlを取り出し、そして遠沈管に移す。「aE」及び「bE」とラベル する。４本の遠沈管を全て約3000rpmで５分遠心する。 2.0 mlづつのリン酸バッファー（上記５．１参照）を含む16本のガラス試験管 を用意する。ラベルは１〜16の順より成る。これらのチューブを下記の通りに利 用する： チューブ１〜３：サンプル「aS」のアッセイ。 チューブ４：ブランク。 チューブ５〜７：サンプル「aE」のアッセイ。 チューブ８：ブランク。 チューブ９〜11：サンプル「bS」のアッセイ。 チューブ12：ブランク。 チューブ13〜15：サンプル「bE」のアッセイ。 チューブ16：ブランク。 200 μｌの飼料抽出遠心物を対応のアッセイ管に移す。ボルテックスミキサー で混合する。200μｌのリン酸バッファー（上記３．ｌ参照）をブランク管に加 える。 下記のアッセイ手順とサンプル抽出を開始して60〜90分後に開始する。チュー ブ間での慣用の時間間隔を利用し、Xylazymc AX錠剤１錠を16本の試験管それぞ れに加え、試験管にキャップをし、そして70℃の湯浴の中に入れる。錠剤の添加 後、混合しないことが重要である。 湯浴の中で120分経過後、試験管を下記の通りに処理する：試験管を取り出し 、５mlのトリス停止試薬（上記５．２参照）を加え、再びキャップし、そして内 容物をボルテックスミキサーでよく混合 する。試験管を全て室温で15分放置し、次いで再び混合し、そしてWhatman GF／ ｃフィルターを介して清浄試験管に濾過する。16本のサンプル全てについて585n mでODを測定する。これらの測定は濾過後30分以内に完了させる。 ８．計算：「aS」、「bS」、「aE」及び「bE」アッセイのOD₅₈₅の平均値（それ ぞれにつき３回の測定の平均）を計算する。ブランクについてのOD₅₈₅値を計算 する。「aS」、「bS」、「aE」及び「bE」についてのΔODを、対応の平均アッセ イ値から平均ブランク値を差し引くことにより計算する。 抽出の際に飼料サンプルに加えて酵素活性（例えば、125FXU／kgとなるように 40ｇの飼料に５ FXU／ml １mlを加える）を計算する(FXU／kg飼料)。 飼料サンプル「ａ」及び「ｂ」中の活性を計算する。 FXU／kg飼料、サンプル「ａ」＝ (ΔOD，aS)×（添加酵素FXU／kg）／〔（ΔOD，aE）−（ΔOD，aS）〕 FXU／kg飼料、サンプル「ｂ」＝ (ΔOD，bS)×（添加酵素FXU／kg）／〔（ΔOD，bE）−（ΔOD，bS）〕 「飼料サンプル」のキシラナーゼ活性は「ａ」及び「ｂ」値の平均として示す 。 ９．200 〜1000 FXU／kgを有する飼料サンプルについてのガイドライン 酵素標準溶液（上記５．３参照）の濃度を５から20FXU／mlに上げる。アッセ イに利用する飼料抽出物の容量を200μｌから50μｌへと減らす。その他の変更 は不要である。ペレット化／スチーム加熱 顆粒XA及びXBをそれぞれ利用して調製したキシラナーゼ含有飼料製剤の場合、 これらの製剤をパイロットスケールスチームコンディ ショナー（パドル刃及びスチーム入口の付いた連続水平ミキサー）を用いてペレ ット化する。コンディショナーでの流速は200kg／時間とし、コンディショナー 内で滞留時間は30秒とし、そしてスチーム入口は95℃の出口スチーム流の温度と なるように調整する。コンディショナー出口より飼料はSimon Heesen押出機へと 入り、そして３mm×35mmの穴サイズを有するマトリックスを通して押し出されて ペレットとなる。ペレットサンプルを冷却器に移し、そしてIP−流で周囲温度に 冷やす。冷却ペレットサンプルをキシラナーゼ活性分析のために取り出す。 顆粒XC，XD及びXEのそれぞれを利用して調製したキシラナーゼ含有飼料製剤の 場合、実施例３に記載と類似のスチーム加熱手順を利用した。スチームの供給は 全実験にわたって一定とし、そして30秒の加熱期間の終了時において＞90℃まで 飼料製剤の温度とするのに十分なものとした。加熱した飼料製剤をろう斗の外に 注ぎ出し、そして周囲温度に冷やした。 スチーム加熱した飼料製剤のそれぞれのサンプルのキシラナーゼ活性をNovo N ordisk分析法ED−9511460.2（前掲）を利用して決定した。 スチーム加熱したキシラナーゼ濃厚飼料製剤のそれぞれにおけるキシラナーゼ 活性の％保持率を下記の表に示す： これらの結果は、共に本発明に係る調製品であり、そして疎水性物質を含む高 含有量の水不溶性物質を有する顆粒XB及びXEの利用が、顆粒XA，XC及びXD（これ らの組成物は本発明の範囲外である）について観察されるよりも、ペレット化工 程又はその他のスチーム加熱工程におけるスチーム加熱の際の酵素活性のはるか に高い保持を供することを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ (72)発明者 レウリン，クリスティン バッハ デンマーク国，デーコー−2880 バグスバ エルト，ノボ アレ，ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ (72)発明者 アズマル，パー バーン デンマーク国，デーコー−2880 バグスバ エルト，ノボ アレ，ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．全体の１重量％以上の１又は複数種の疎水性物質と、この疎水性物質を含 む全体の75重量％以上の１又は複数種の水不溶性物質とを含んで成る、粒状酵素 含有調製品。 ２．５重量％以上の前記疎水性物質を含んで成る、請求項１記載の調製品。 ３．90重量％以上の前記水不溶性物質を含んで成る、請求項１又は２記載の調 製品。 ４．前記調製品の粒子材料全体に実質的に均一に分散した５〜95重量％の前記 疎水性物質を含んで成る、請求項１〜３のいづれか１項記載の調製品。 ５．酵素含有コアと、前記疎水性物質を含み且つ前記酵素含有コアを覆ったコ ーティング層とを含んで成る、請求項１〜３のいづれか１項記載の調製品。 ６．１〜50重量％の前記疎水性物質を含んで成る請求項５記載の調製品。 ７．５〜15重量％の前記疎水性物質を含んで成る請求項５又は６記載の調製品 。 ８．水不溶性物質として、無機塩類及び多糖類より成る群から選ばれる物質を 含んで成る、先の請求項のいづれか１項記載の調製品。 ９．水不溶性物質として、無機塩類及び多糖類より成る群から選ばれる物質を 含んで成る、請求項５〜７のいづれか１項記載の調製品。 10．前記酵素含有コアがファイバー形状のセルロースを含んで成る、請求項９ 記載の調製品。 11．前記酵素がフィターゼ、ホスファターゼ、キシラナーゼ、β−グルカナー ゼ、α−ガラクトシダーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、セルラーゼ、ペ クチナーゼ及びペプチダーゼより成る群から選ばれる酵素である、請求項１〜10 のいづれか１項記載の調製品。 12．酵素含有動物飼料組成物の製造のための方法であって、最終飼料組成物の その他の成分と混合した請求項１〜11のいづれか１項記載の酵素含有調製品をス チーム加熱段階にかける、方法。 13．前記最終飼料組成物をペレット化する手順を含んで成る、請求項12記載の 方法。 14．酵素含有動物飼料組成物の製造における請求項１〜11のいづれか１項記載 の粒状酵素含有調製品の利用。 15．酵素含有出発材料として請求項１〜11のいづれか１項記載の調製品を利用 して製造した酵素含有動物飼料組成物。 16．請求項12又は13記載の方法により得られる酵素含有動物飼料組成物。