KR101284539B1 - 비전분성 다당류 분해용 복합 효소 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

비전분성 다당류 분해용 복합 효소 조성물 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 비전분성 다당류 분해용 복합 효소 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-N1 및 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) GB-X2를 순환식 고체 발효법(AASF)에 의해 배양하여 획득되는 프로테아제, 아밀라제, α-갈락토시다제, 자일라제, 및 셀룰라제를 포함하는 비전분성 다당류 분해용 복합 효소 조성물, 및 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-N1 및 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) GB-X2 균주를 종균 배양하는 단계; 상기 종균배양액을 수분 함량이 조절되는 강제 순환식 고체 발효법(AASF)에 의해 배양하는 단계; 및 상기 배양물을 회수하여 효소를 제조하는 단계를 포함하는 비전분성 다당류 분해용 복합 효소 조성물의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 효소 조성물 제조방법은 수분 함량이 조절되는 강제 순환식 고체 발효법(AASF)을 이용한 효소의 다중발현을 유도하는 기술로서 기존 생산방식을 이용한 효소제 생산보다 경제적인 고활성 복합 효소제의 생산이 가능하여 국내 및 세계시장에서의 가격경쟁력을 갖출 수 있다. 본 발명에 의해 제조된 복합 효소 조성물은 난분해성 다당류, 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 기타 비전분성 다당류, 단백질 등의 소화율을 향상시키며, 2차 대사물질의 작용에 의해 장내 미생물 균총을 정상적으로 유지시키고, 분변의 암모니아 가스 발생을 줄이며 축사 내 환경 개선 및 가축의 질병에 대한 저항성을 증대시킨다. 나아가, 본 발명은 다양한 사료 및 식품에서 생산하고 있는 대사산물 대량생산 공정에도 널리 활용 가능한 기초 기술로 사료 및 식품산업에서 다양한 용도로 활용 가능하다.

Description

비전분성 다당류 분해용 복합 효소 조성물 및 이의 제조방법{Complex enzyme composition for degradating non starch polysaccharide and method for preparation thereof}
본 발명은 비전분성 다당류 분해용 복합 효소 조성물 및 강제 순환식 고체 발효법에 의한 비전분성 다당류 분해용 복합 효소 조성물의 제조방법에 관한 것이다.
최근 광우병, 구제역, 돼지 콜레라 등의 파동으로 배합사료의 안정성에 대한 인식이 고조되면서, 동물성 사료의 사용이 줄고 식물성 사료의 이용이 증가하고 있다. 이와 함께 급격한 원자재 가격의 상승으로 고품질의 식물성 원료를 상대적으로 저렴한 가격의 원료로 대체하고자 하는 시도들이 이루어지고 있다. 식물성 원료의 경우 단위동물에서는 이용효율이 떨어지는 난분해성 다당류(NSP: Non Starch Polysaccharide) 등 특정 영양소 저해 인자들을 함유하고 있는데 이러한 식물성 원료 사료의 이용률 증대와 사료의 영양적 가치를 제고하기 위해서는 사료의 소화를 최적화 할 수 있는 조건을 부여하여야 한다. 곡류를 주원료로 하는 사료에 전분, 단백질, 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스 등을 가수분해하는 소화효소를 첨가하면 영양소의 이용률을 10% 이상 개선시킬 수 있는 것으로 조사되었다. 특히 닭, 돼지 같은 단위동물들은 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스 등의 섬유소를 가수분해하는 내생효소가 없으므로, 베타글루칸 (β-glucan)과 자일란 (xylan) 등의 난분해성 다당류를 가수분해할 수 있는 외인성 소화 효소제는 양계 및 양돈 배합사료 생산에 필요한 요소이다.
농업 산업에서 발생하는 부산물들은 지속적으로 막대한 양으로 생산되고 있으며 상대적으로 저렴한 가격을 형성하고 있기에 사료 시장에 널리 이용될 수 있다. 하지만 사료 시장에서는 제한적으로만 사용되고 있는데 이는 곡류 가공 부산물에 존재하는 난분해성 다당류가 단위동물 소화기내의 점도를 증가시켜 영양소의 소화, 흡수를 방해하여 가축의 성장 저해 및 소화기 질병을 야기하기 때문이다. 특히 자돈에서는 높은 섬유질을 함유하는 저급 사료 부산물의 이용은 매우 제한적이다. 보고된 바에 의하면 소맥, 보리, 귀리 및 호밀 등 NSP가 많은 사료 자원들은 자돈의 항영양인자로 작용하여 부정적인 효과를 나타낸다 (Hesselman and Aman 1986; Li et al., 1996). 하지만 NSP 분해효소를 처리하여 항영양인자를 제거하면 자돈을 위한 사료로서 영양학적인 가치를 개선하여 이용성을 개선할 수 있는 것으로 보고되고 있다 (Simons et al., 1990; Li et al., 1996).
이러한 식물성 원료에 존재하는 NSP는 곡류의 경우 소맥에는 아라비노자일란(arabinoxylan)이며 보리의 경우는 β-글루칸(β-glucan)이 대표적인 난분해성 다당류로 분류되며, 식물성 박류인 대두박의 경우에는 갈락토만난(galactomannans) 등이 있다. 식물성 원료에 존재하는 NSP들은 단위 동물인 돼지나 가금류에서는 NSP 분해효소를 생산하지 못하기 때문에 분해 및 이용되지 못해 가축의 소화기내에서 항영양인자로서 작용하게 된다. 이러한 NSP들은 소화기내의 점성을 증가 시킬 뿐만 아니라 이로 인한 가축의 소화기관에서 생산된 효소들의 작용을 저해하고 영양소의 흡수를 감소시킨다.
일반적으로 NSP라 하면, β-글루칸(β-glucan), 펜토산(pentosans), 아라비노갈락탄(arabinogalactans), 갈락토만난(galactomannans), 자일란(xylans), 그리고 펙틴(pectins)으로 구분할 수 있다. NSP를 분해하는 효소들은 수분 함유 용량(water holding capacity)을 감소시키고 그 후에 장을 채우게 되는데 이는 세포벽 부분의 소화율을 증가시키고 장 점도를 감소시켜 장의 흡수 표면적에 더욱더 노출되는 결과를 유도하는 작용 기작을 가진다.
저급 사료 원료 내에 존재하는 NSP의 항영양적 작용으로는 하부장기에서 미생물에 의한 이상발효를 유도하여 장내 가스발생을 유발하고 (Gitzelmann and Auricchio, 1965), 장벽 손상을 통한 영양소 흡수 억제 (Veldman et al., 1993), 설사 및 소화장애 유발 및 분뇨의 악취 유발 (Clarke and Wiseman, 2000), 장관내 삼투압 증가 (Coon et al., 1990), 그리고 원료 사료의 대사에너지 가치를 저하시킨다 (Leske et al., 1993).
이에 본 발명의 한 측면은, 난분해성 다당류(NSP: Non Starch Polysaccharide)를 효과적으로 분해하기 위한 복합 효소 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 복합 효소 조성물을 효과적으로 제조하기 위한 강제 순환식 고체 발효법에 의한 비전분성 다당류 분해용 복합 효소 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 견지에 의하면, 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-N1 및 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) GB-X2를 순환식 고체 발효법(AASF)에 의해 배양하여 획득되는 프로테아제, 아밀라제, α-갈락토시다제, 자일라제, 및 셀룰라제를 포함하는 비전분성 다당류 분해용 복합 효소 조성물이 제공된다.
상기 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-N1 및 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) GB-X2는 배지를 달리하여 단일 균주 별로 배양한 후 획득되는 효소를 혼합하는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 견지에 의하면, 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-N1 및 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) GB-X2 균주를 종균 배양하는 단계; 상기 종균배양물을 수분 함량이 조절되는 강제 순환식 고체 발효법(AASF)에 의해 배양하는 단계; 및 상기 배양물을 회수하여 효소를 제조하는 단계를 포함하는 비전분성 다당류 분해용 복합 효소 조성물의 제조방법이 제공된다.
상기 효소는 프로테아제, 아밀라제, α-갈락토시다제, 자일라제, 및 셀룰라제를 포함하는 것이 바람직하다.
상기 종균배양액은 소맥피를 포함하는 배양배지에서 배양되는 것이 바람직하다.
상기 수분 함량은 45%~50%로 조절되는 것이 바람직하다.
상기 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-N1 및 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) GB-X2는 배지를 달리하여 단일 균주 별로 배양한 후 획득되는 효소를 혼합하는 것이 바람직하다.
상기 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-N1는 초기 접종 균수를 104~107 cfu/g수준으로 접종하고 48 시간 ~ 72 시간 동안 배양하는 것이 바람직하다.
상기 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) GB-X2는 초기 접종 균수를 104~105 cfu/g수준으로 접종하고 24 시간 ~ 72 시간 동안 배양하는 것이 바람직하다.
상기 배양 온도는 30℃ 내지 35℃인 것이 바람직하다.
본 발명의 효소 조성물 제조방법은 수분 함량이 조절되는 강제 순환식 고체 발효법(AASF)을 이용하여 효소의 다중발현을 유도하는 기술로서 기존 생산방식을 이용한 효소제 생산보다 경제적인 고활성 복합 효소제의 생산이 가능하여 국내 및 세계시장에서의 가격경쟁력을 갖출 수 있다. 본 발명에 의해 제조된 복합 효소 조성물은 난분해성 다당류, 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 기타 비전분성 다당류, 단백질 등의 소화율을 향상시키며, 2차 대사물질의 작용에 의해 장내 미생물 균총을 정상적으로 유지시키고, 분변의 암모니아 가스 발생을 줄이며 축사 내 환경 개선 및 가축의 질병에 대한 저항성을 증대시킨다. 나아가, 본 발명은 다양한 사료 및 식품에서 생산하고 있는 대사산물 대량생산 공정에도 널리 활용 가능한 기초 기술로 사료 및 식품산업에서 다양한 용도로 활용 가능하다.
도 1은 NSP를 효율적으로 분해하는 후보 미생물을 선발한 것으로, A 배지는 셀룰라제(Cellulase), B 배지는 자일라나제(Xylanase), C 배지는 아밀라제(Amylase), D 배지는 프로테아제(Protease)를 나타낸다.
도 2는 분리 균주의 최적 효소 발효 조건 조사를 위한 실험을 나타낸 것이다.
도 3은 아스퍼질러스 오리재 (A. oryzae ) GB-N1의 접종 농도에 따른 프로테아제의 발현을 나타낸 것이다.
도 4는 아스퍼질러스 오리재 (A. oryzae) GB-N1의 접종 농도에 따른 α-갈락토시다제의 발현을 나타낸 것이다.
도 5는 아스퍼질러스 오리재 (A. oryzae ) GB-N1의 접종 농도에 따른 아밀라제의 발현 을 나타낸 것이다.
도 6은 아스퍼질러스 니거(A. niger ) GB-X2의 접종 농도에 따른 자일라나제의 발현을 나타낸 것이다.
도 7은 아스퍼질러스 니거(A. niger) GB-X2의 접종 농도에 따른 셀룰라제의 발현을 나타낸 것이다.
도 8은 아스퍼질러스 오리재 (A. oryzae ) GB-N1의 발효시간에 따른 프로테아제 생성량의 변화를 나타낸 것이다.
도 9는 아스퍼질러스 오리재 (A. oryzae) GB-N1의 발효시간에 따른 아밀라제 생성량의 변화를 나타낸 것이다.
도 10은 아스퍼질러스 오리재 (A. oryzae ) GB-N1의 발효시간에 따른 α-갈락토시다제 생성량의 변화를 나타낸 것이다.
도 11은 아스퍼질러스 니거(A. niger) GB-X2의 발효시간에 따른 자일라나제 생성량의 변화를 나타낸 것이다.
도 12는 아스퍼질러스 니거(A. niger) GB-X2의 발효시간에 따른 셀룰라제 생성량의 변화를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 효소 조성물과 기존 시판 효소제의 처리에 따른 원료대비 가수분해율을 나타낸 것이다.
본 발명은 프로테아제, 아밀라제, α-갈락토시다제, 자일라제, 및 셀룰라제를 포함하는 비전분성 다당류 분해용 복합 효소 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-N1 및 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) GB-X2를 순환식 고체 발효법(AASF)에 의해 배양하여 획득되는 프로테아제, 아밀라제, α-갈락토시다제, 자일라제, 및 셀룰라제를 포함하는 비전분성 다당류 분해용 복합 효소 조성물에 관한 것이다.
자이라나제(Xylanase)는 식물 세포벽에 존재하는 헤미셀룰로스의 주요 구성성분인 자일란을 가수분해하여 자일로스 또는 자일로올리고사카라이드로 전환시키는 효소이다. 자일란을 가수분해하기 위해서는 자일라나제(엔도-β-1,4-자일라나제) 외에 β-자일로시다제, α-글루쿠로니다제(glucuronidase), α-L-아라비노퓨라노시다제와 아세틸에스테라제 등이 공동으로 관여해야 한다. 하지만 이중에서 자일라나제는 자일란의 기본 골격인 β-1,4 결합을 분해하기 때문에 자일란의 가수분해 과정에서 가장 중요하다 (Kulkarni et al., 1999).
셀룰라제(Cellulase) 중에서 CMCase (carboxymethyl cellulase, Endo-β-1,4-glucanase)는 exo-β-1,4-글루카나제, β-글루코시다제와 함께 셀룰라제계 구성효소로서 특히 곡물사료의 가축 장내에서의 이용성 증진을 위해 널리 이용되고 있다. 셀룰라제에 의한 셀룰로스의 분해 작용은 순차적 메커니즘(sequencial mechanism)에 의한 상승작용에 의해 이루어진다. 셀룰라제계의 구성효소들이 동시에 존재할 때 이들의 상승작용에 의해 결정성 셀룰라제를 분해할 수 있다.
α-갈락토시다제(Galactosidase)는 장벽 손상을 통한 영양소 흡수를 억제, 설사 및 소화 장애 유발 및 분뇨의 악취 유발, 원료사료의 대사에너지 가치를 저하시키는 곡류의 일반적의 항영영인자인 α-갈락토시드(Stachyose, Raffinose)를 가수분해 시킨다.
프로테아제(Protease) 및 아밀라제(Amylase)는 사료의 단백질, 아미노산 및 탄수화물 등의 이용성을 증대시켜 사료의 이용 효율 향상 및 분변으로 배설되는 질소함량을 감소시켜 환경오염을 줄일 수 있다.
본 발명의 상기와 같은 효소생산에 이용되는 균주는 아밀라제, 프로테아제, 셀룰라제 (β-glucanase), 자일라나제, α-갈락토시다제 등을 강력하게 생산하는 아스퍼질러스(Aspergillus spp.) 균주이며 일반적으로 균류(fungi)가 당화능이 뛰어나다.
강제 순환식 고체 발효법(Active aero solid state fermentation, AASF) 공정은 균 성장 및 대사물질 생산을 위한 온도, 산소, 수분 함량을 일정하게 유지하는 최적의 효소발현조건으로 일반적인 고체 발효공정과는 차별성을 가지는 개선된 발효방식이다. AASF 공정은 액상 발효와 대비하여 효소생산비용이 매우 저렴한 특징을 지닌다. 또한 이러한 공정을 거쳐 생산된 제품은 광범위한 대사과정을 유도함으로써 다양하게 적용할 수 있다.
본 발명의 비전분성 다당류 분해용 복합 효소 조성물은 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-N1 및 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) GB-X2 균주를 종균 배양하는 단계; 상기 종균배양액을 수분 함량이 조절되는 강제 순환식 고체 발효법(AASF)에 의해 배양하는 단계; 및 상기 배양물을 회수하여 효소를 제조하는 단계를 포함하는 비전분성 다당류 분해용 복합 효소 조성물의 제조방법에 의해 제조된다.
상기와 같은 복합 효소 조성물에 포함되는 효소는 프로테아제, 아밀라제, α-갈락토시다제, 자일라제, 및 셀룰라제를 포함하며, 상기와 같은 효소의 발현량이 가장 우수한 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-N1 및 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) GB-X2 2종의 곰팡이 균주를 최종 효소생산을 위한 균주로 선정하였고. 상기 균주를 한국미생물보존센터(KCCM)에 각각 수탁번호 KCCM11125P와 KCCM11127P로 기탁하였다.
아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-N1는 프로테아제, 아밀라제, α-갈락토시다제의 과량 발현 균주이고, 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) GB-X2는 자일라제, 및 셀룰라제 과량 발현 균주이다.
상기와 같은 효소 생산에 필요한 기초 배지의 선정에 있어서 소맥피를 원료로 사용한 처리구에서 가장 우수한 결과를 나타내었으며, 따라서 상기 종균배양액은 소맥피를 포함하는 배양배지에서 배양한다.
소맥피를 효소생산용 배지로 사용하여 발효하는 경우, 발효 중 수분의 함량유지/관리, 초기 종균 접종량, 배양온도 및 발효시간에 따른 효소활성 변화가 효소 활성에 영향을 줄 수 있으며, 배양 중 수분함량의 조절은 일반적인 고체 발효보다는 배양온도와 배양시간이 동일할 경우 배양중의 수분함량 조절에 의한 고체발효방식(AASF)이 효소 발현 측면에서 우수하였다. 일반적으로 곰팡이는 포자생성기로 전환 시 효소의 활성이 감소하므로 포자의 생성을 최대한 지연시키기 위해서 수분함량의 조절이 필요하다. 따라서 배양 후기까지 수분함량을 약 45%~50%로 유지 할 경우 일반적인 고체 발효보다 최대 10배까지의 효소활성 차이를 나타낼 수 있으며, 보다 바람직하게는 46%~ 47%로 유지한다.
한편, 본 발명에 있어서 효소의 다중-발현을 위한 2가지 균주의 복합 발효기술 확립은 효소의 적정 발효시간이 차이가 있으며, 2가지 균주 모두 곰팡이 균으로 성장 및 효소 발현에서 상호간 간섭현상으로 인해, 대상 효소에 따라 배지를 달리하여 단일 균주별로 배양한 후 적절히 혼합하는 것이 바람직하다.
상기 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-N1는 초기 접종 균수를 104~107 cfu/g수준으로 접종하고 48 시간 ~ 72 시간 동안 배양하는 것이 바람직하며, 특히, 104 cfu/g 수준의 초기 접종 시 프로테아제, α-갈락토시다제의 발현에서 가장 우수한 결과를 나타낸다. 아밀라제의 경우 초기 접종농도를 107 cfu/g 수준으로 하였을 때 가장 높은 효소발현을 나타내나, 초기접종농도를 104 cfu/g 수준에서도 높은 효소활성을 나타낸다. 나아가, 프로테아제는 배양 48시간 그리고 아밀라제와 α-갈락토시다제는 배양 72시간째에 최대 효소 발현량을 나타낸다.
한편, 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) GB-X2는 초기 접종 균수를 104~105 cfu/g수준으로 접종하고 24 시간 ~ 72 시간 동안 배양하는 것이 바람직하며, 특히, 셀룰라제는 104 cfu/g 수준의 초기 종균 접종 시, 자일라나제는 105 cfu/g 수준의 초기 종균 접종 시에 효소 발현량이 가장 우수하다. 나아가, 자일라나제는 72시간 그리고 셀룰라제는 배양 24시간째에 최대 발현량을 나타낸다.
다만, 대량 생산 시 높은 초기 균수로 생산하기 어려우므로 상기 두 균주의 초기 접종 균수는 1.2 X 104 cfu/g 수준으로 결정하는 것이 보다 바람직하다.
배양 온도는 30℃ 내지 35℃인 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는, 약 32℃인 것이다. 배양 온도가 30℃ 미만인 경우 배양시간이 길어져 생산순환 증가 및 기타 세균에 의한 오염확률 상승의 문제가 있으며, 배양 온도가 35℃를 초과하는 경우 배양 중 상승하는 발효열의 제어가 어려우며 균주의 포자생성으로 인한 효소 생산량 감소의 문제가 있다.
한편, 본 발명에 따른 강제 순환식 고체 발효법의 발효조건을 이용하여 파일럿 규모(pilot scale)에서의 복합 효소 조성물의 생성 조건을 확립하는 경우, 소맥피를 원료로 하여 500kg 수준에서의 발효조건을 확립할 수 있고, 최적의 발효조건은 실험실 규모에서와 동일하게 발효 온도를 곰팡이인 선발 균주의 성장에 적합하게 약 32℃로 설정하고 발효 중 수분함량을 약 45% 수준으로 유지 관리하면서 발효시간을 균주 별로 목표 효소별로 달리하고, 72시간 발효를 기준으로 설정하여 발효공정을 확립할 수 있다.
파일럿 규모(pilot scale) 생산 결과 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-N1의 경우 프로테아제와 아밀라제의 최대 발현은 42시간째이지만, α-갈락토시다제의 경우에는 배양 72시간째에 최대 발현이 이루어지므로 배양시간은 72시간까지 진행하는 것이 바람직하다. 또한, 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) GB-X2 경우 자일라나제는 실험실 규모에서의 실험 결과와 유사한 발현패턴을 보이지만, 셀룰라제의 경우에는 실험실 규모의 결과와는 달리 배양 72시간까지 안정적인 효소활성이 유지될 수 있어서 대량 생산 시에는 배양 42시간 이상 72시간 미만에서 발효를 종료하는 것이 바람직하다.
<실시예 >
1. NSP 제거를 위한 미생물 선발
사료 자원내의 NSP를 효율적으로 제거하기 위해서 부패한 목질계와 영세한 제지공장의 폐수로부터 자일라나제(xylanase), 셀룰라제(cellulose), 프로테아제(protease), 아밀라제(amylase), α-갈락토시다제(α-galactosidase) 활성이 우수한 후보 균주들을 분리 하였다 (도 1).
분리 균주의 고체발효 특성을 확인하기 위해 대두박을 기본 원료 배지로 하여 초기 수분함량을 40%로 조절하고 121℃에서 15분간 멸균한 후 각각의 선발균주를 1%가 되게 접종하고 곰팡이 균주는 30℃, 바실러스(Bacillus) 균주는 37℃에서 각각 48시간씩 배양한 후 배양물의 효소활성 평가를 통해 NSP 분해에 적합한 균주를 최종 선발하였다 (표 1).
고체발효를 통한 선발 균주의 효소활성 평가
선발균주 효소 활성(U/g)
아밀라제 프로테아제 자일라나제 셀룰라제 α-갈락토시다제
Fungi-1
(Aspergillus sp.)		 660 2,140 25 91 22
Fungi-2
(A. oryzae GB-N1)		 720 6,800 50 58 62
Fungi-3
(A. niger GB-X2)		 498 2,880 160 230 35
Bacteria-1
(B. subtilis GB-1)		 244 3,600 18 47 10
Bacteria-2
(B. subtilis GB-2)		 285 2,120 11 63 11
최종 선발 균주를 보관하면서 게노믹(genomic) DNA를 분리(isolation)하여 ITS 5.8s-rDNA 시퀀싱 분석을 실시하여 상동성(homology) 분석을 통해 생균제로 활용가능 한 균주 중 효소의 발현량이 가장 우수한 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-N1, 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger ) GB-X2 2종의 곰팡이 균주를 최종 NSP 효소생산을 위한 균주로 선정하였고. 상기 균주를 KCCM에 각각 수탁번호 KCCM11125P와 KCCM11127P로 기탁하였다. 최종 선별한 균주들의 효소발현 특성을 요약하면 표 2와 같다.
최종 선별한 균주들의 효소 발현에 대한 특징
균주 최종 선발 균주 효소 발현 특징
1 A. oryzae GB-N1 프로테아제, 아밀라제, 및 α-갈락토시다제 과량 발현 균주
2 A. niger GB-X2 자일라나제, 및 셀룰라제 과량 발현 균주
2. 미생물 고체발효 방법을 이용한 최적의 NSP 분해효소 발현 조건
NSP 분해효소 발현을 위해 최종 선발 균주인 2종의 곰팡이 균주를 이용하여 사료산업에서 가장 널리 사용되는 사료곡물인 옥수수, 대두박, 소맥피를 배지 원료로 하여 고체발효방법의 적용을 통한 NSP 분해효소 발현 정도를 평가하고 아울러 효소제 생산배지를 선정하였다.
선발 균주를 효소발현 특성에 맞게 아밀라제(amylase), 프로테아제(protease), α-갈락토시다제(α-galactosidase) 생산을 위해서는 아스퍼질러스 오리재 (A. oryzae) GB-N1 균주를 사용하였으며, 셀룰로스, 자일라나제 발현을 위해서는 아스퍼질러스 니거(A. niger) GB-X2 균주를 각각 사용하였다.
2 균주 모두 곰팡이 균주로서 균주 선발과 정에서의 고체 발효 조건을 기준으로 효소제 발현을 위한 최적 조건을 설정하기 위해 초기 수분함량을 45%, 배양온도를 32℃, 배양시간을 48시간으로 설정하여 원료 배지에 따른 효소발현 정도를 비교 평가하였다 (도 2, 표 3). 그 결과 모든 효소생산에는 소맥피를 원료로 사용한 처리구에서 가장 우수한 결과를 나타내어, 소맥피를 효소제 생산을 위한 기초배지로 선정하였다.
배지 종류에 따른 효소 발현의 비교
균주 배지원 효소 활성 (U/g)
프로테아제 아밀라제 α-갈락토시다제 셀룰라제 자일라나제
A. oryzae GB-N1 옥수수 10,200 3,854 101 - -
대두박 3,066 4,783 150 - -
소맥피 12,133 14,576 148 - -
A. niger GB-X2 옥수수 - - - 79 870
대두박 - - - 42 410
소맥피 - - - 98 987
효소제 특화 고체발효 기술 개발을 위해 발효 조건에 따른 NSP 분해효소의 발현 정도의 평가를 통해 최종 분리 균주에 적합한 NSP 분해효소들의 다중-발현(multi-expression)이 가능한 고체발효 공정을 확립하였다. 이를 위해 소맥피를 효소생산용 배지로 사용하여 발효 중 수분 함량유지/관리, 초기 종균 접종량, 배양온도 및 발효시간에 따른 효소활성 변화를 조사하였다. 배양 중 수분함량의 조절은 일반적인 고체 발효보다는 배양온도와 배양시간이 동일할 경우 배양중의 수분함량 조절에 의한 고체발효방식(AASF)이 효소 발현 측면에서 우수하였다. 일반적으로 곰팡이는 포자 생성기로 전환 시 효소의 활성이 감소하므로 포자의 생성을 최대한 지연시키기 위해서 수분함량의 조절이 필요하다. 따라서 배양 후기까지 수분함량을 약 45%로 유지 할 경우 일반적인 고체 발효보다 최대 10배까지의 효소활성 차이를 나타내었다[표 4].
발효 방식에 따른 효소의 발현량 비교
균주 효소종류 효소 활성 (U/g) 증감(배수)
일반 고체 발효 AASF
A. oryzae GB-N1 프로테아제 933 9,733 10.4
아밀라제 1,739 15,713 9.0
α-갈락토시다제 64 127 1.98
A. niger GB-X2 자일라나제 677 1,089 1.61
셀룰라제 53 95 1.79
초기 종균 접종량에 대한 영향을 확인하기 위해 선발균주별로 각각 104~107 cfu/g까지 접종량을 달리하여 32℃에서 48시간 동안 배양을 통해 효소 발현량을 조사하였다. 아스퍼질러스 오리재 (A. oryzae) GB-N1의 경우 104 cfu/g 수준의 초기 접종 시 프로테아제, α-갈락토시다제의 발현에서 가장 우수한 결과를 나타내었다 (도 3, 4).
아밀라제의 경우 초기 접종농도를 107 cfu/g 수준으로 하였을 때 가장 높은 효소발현을 나타내었으나, 초기접종농도를 104 cfu/g 수준에서도 높은 효소활성을 나타내었다 (도 5). 아스퍼질러스 니거(A. niger) GB-X2의 경우 셀룰라제는 104 cfu/g 수준의 초기 종균 접종 시, 자일라나제는 105 cfu/g 수준의 초기 종균 접종 시에 효소 발현량이 가장 우수하였다 (도 6, 7). 대량 생산 시 높은 초기 균수로 생산하기 어려우므로 아스퍼질러스 오리재 (A. oryzae) GB-N1과 아스퍼질러스 니거(A. niger) GB-X2의 초기 접종 균수는 1.2 X 104 cfu/g 수준으로 결정하였다.
배양시간에 따른 영향을 조사하기 위해 발효 시간 별 효소 역가 변화를 선발 균주별로 각각 조사하였다. 그 결과 아스퍼질러스 오리재 (A. oryzae) GB-N1의 경우 프로테아제는 배양 48시간 그리고 아밀라제와 α-갈락토시다제는 배양 72시간째에 최대 효소 발현량을 나타내었다 (도 8, 9, 10).
아스퍼질러스 니거(A. niger) GB-X2의 경우 자일라나제는 72시간 그리고 셀룰라제는 배양 24시간째에 최대 발현량을 나타내었다 (도 11, 12).
결론적으로 실험실 조건에서의 NSP 분해효소의 생산을 위한 최적의 강제 순화식 고체 발효법(active aero solid state fermentation)(AASF) 공정은 초기 접종균수를 104~105 cfu/g수준으로 접종하여 발효 중 수분함량을 45%이상으로 유지를 기본 조건으로 하였을 때 아스퍼질러스 오리재 (A. oryzae) GB-N1의 경우, 배양 72시간째에 아밀라제, 프로테아제, α-갈락토시다제가 최대의 다중-발현(multi-expression)된다는 것을 확인하였으며, 아스퍼질러스 니거(A. niger) GB-X2의 경우에는 배양 24시간 째에 자일라나제, 셀룰라제를 최대 생산할 수 있다는 것을 확인하였다.
3. 복합 효소 조성물의 제조- 제조예 1
상기에서 확인된 발효 조건에 따라 아스퍼질러스 오리재 (A. oryzae) GB-N1을 소맥피에서 배양하여 생산한 배양물, 아스퍼질러스 오리재 (A. oryzae) GB-N1을 대두박에서 배양하여 생산한 배양물 및 아스퍼질러스 니거(A. niger) GB-X2를 소맥피에서 생산한 배양물을 40%, 34% 및 26%의 비율(W/W)로 혼합하여 최종적으로 프로테아제 20000 u/g, 아밀라제 5000 u/g, α-갈락토시다제 100 u/g, 셀룰라제 100 u/g, 자일라나제 700 u/g을 함유한 복합효소제를 제조하였다.
4. 복합 NSP 분해효소의 인비트로( in vitro ) 소화율 측정
(1) 사료자원 별 글루코스 유리 시험
본 발명의 복합 효소 조성물을 처리할 경우 사료자원의 주요 성분인 탄수화물의 이용성이 증대된다. 이런 결과를 확인하기 위해 상기 제조예 1에서 제조된 본 발명의 복합 효소 조성물의 처리 수준을 0.1% 및 0.2%로 달리하고, 소화 효소제를 첨가하지 않은 비교예 1과 기존 시판되고 있는 수입제품을 비교예 2 (ComE; Commercial enzyme)로 하여 조사하였다. 인비트로(In vitro) 시험에서 탄수화물의 이용성의 한 지표인 유리된 총 당(released total sugar)의 양을 측정하기 위해 두-단계(two-stage) 인비트로 소화(in vitro digestion)를 이용하여 대상 원료들에 대한 소화율을 조사하였다. 그 결과는 다음 표 5 에 나타난 바와 같다.
곡물 사료 자원인 옥수수와 소맥의 경우 본 발명이나 시판되는 수입제품을 첨가한 경우 효소제를 첨가하지 않은 비교예 1에 비해 유리되는 총 당(total sugar) 함량이 유의적으로 (p<0.05) 증가하는 결과를 보였다. 이러한 결과는 본 발명의 복합 NSP 효소 조성물의 첨가를 통해 곡류 사료자원의 탄수화물 이용성을 증가시킬 수 있음을 의미하는 것이고, 나아가 본 발명의 복합 효소 조성물이 시판되고 있는 수입제품에 비해 보다 효과적으로 곡류의 탄수화물의 이용성을 증가시킬 가능성을 확인할 수 있었다.
복합 NSP 분해효소제의 처리에 따른 곡류 사료자원으로부터 유리되는 총 당의 양
유리된 총 당(mg/ml)
처리 옥수수(Corn) 소맥(Wheat)
비교예 1 (효소 미첨가) 7.71a 8.17a
비교예 2 (0.1%) 8.58b 9.01b
실시예 1 (0.1%) 8.64b 9.51c
실시예 2 (0.2%) 8.71b 9.37bc
SEM 1.55 1.02
P value 0.0293 0.0025
Means within a column with no common superscript differ significantly (P < 0.05)
SEM = Standard error of mean
* ComE: Commercial enzyme
국내산 대두박을 포함한 식물성 박류의 경우에서는 야자박을 제외한 모든 원료사료에 있어서 시판되는 제품뿐 아니라 본 발명 역시 첨가로 인한 탄수화물의 이용성이 유의적으로 개선된 것으로 나타났다 (표 6).
복합 NSP 분해효소제의 처리에 따른 식물성 박류 사료자원으로부터 유리되는 총 당의 양
유리된 총 당(mg/ml)
처리 SBM1
(local)		 SBM1
(imported)		 RSM2
(China)		 RSM2
(India)		 옥수수 배아 깻묵
 야자박
비교예 1 (효소 미첨가) 3.27a 3.26a 2.93a 2.78a 8.39a 2.72
비교예 2 (0.1%) 3.70b 3.85b 3.46b 3.18b 9.46b 2.75
실시예 1 (0.1%) 3.95b 4.06bc 3.41b 3.37bc 9.66b 2.79
실시예 2 (0.2%) 4.04b 4.16c 3.52b 3.46c 9.65b 2.82
SEM 0.98 0.66 0.49 0.54 1.13 0.91
P value 0.0171 0.0022 0.0031 0.0033 0.0036 0.8319
Means within a column with no common superscript differ significantly (P < 0.05)
SEM = Standard error of mean
* ComE: Commercial enzyme
1SBM : Soybean meal(콩가루)
2RSM : Rapeseed meal(유채 씨 깻묵)
강피류인 생미강과 소맥피를 대상으로 총 당 유리량을 조사한 결과는 표 7과 같다. 두 가지 원료 모두에서 효소 조성물을 첨가한 처리구에서 당의 유리량을 증가시켰고 (p<0.05), 특히 소맥피의 경우 본 발명을 이용한 실시예 1 및 2에서 비교예 1 및 비교예 2와 유의적인 차이를 나타내어 배합사료에 첨가 시 탄수화물 이용성 증가를 기대할 수 있다.
복합 NSP 분해효소제의 처리에 따른 강피류 사료자원으로부터 유리되는 총 당의 양
유리된 총 당(mg/ml)
처리 생미강(Rice bran) 소맥피(Wheat bran)
비교예 1 (효소 미첨가) 5.45a 6.81a
비교예 2 (0.1%) 5.76ab 7.81b
실시예 1 (0.1%) 5.87b 8.28c
실시예 2 (0.2%) 5.97b 8.24c
SEM 0.83 0.77
P value 0.0421 0.0005
Means within a column with no common superscript differ significantly (P < 0.05)
SEM = Standard error of mean
* ComE: Commercial enzyme
(2) 주요 원료의 가수분해율 조사
사료회사에서 가장 많이 사용되고 있는 원료인 옥수수, 대두박 및 소맥피를 대상으로 개발 효소제의 가수분해율을 측정하여 인비트로(in vitro) 실험으로 원료의 영양소 이용성을 조사하였다. 조사방법으로는 기존의 보이션(2002)의 소화율 분석 방법을 수정하여 적용하였고, 원료별로 복합 효소제 첨가수준을 달리하여, 일정시간 반응 후에 가수분해량을 측정하였다. 사료자원의 가수분해율을 조사한 결과에서도 본 발명의 복합 효소 조성물(GBT-NE)을 첨가한 처리구에서 높은 가수분해율을 나타내었다 (도 13).
이에 따라 본 발명의 복합 효소 조성물을 처리함으로써 사료자원에 대한 이용성 개선효과에 대해 간접적으로 판단할 수 있으며, 효소 조성물 첨가에 따른 총 유리 당 양 및 가수분해율 분석 결과로 미루어 볼 때 본 발명의 복합 효소 조성물을 사료에 첨가할 경우 사료자원의 이용성 개선에 효과가 있음을 알 수 있다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM11125P 20101028 한국미생물보존센터(국외) KCCM11127P 20101028

Claims (10)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-N1 및 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) GB-X2 균주를 종균 배양하는 단계;
    상기 종균배양액을 소맥피를 포함하는 배양배지에서 수분 함량이 조절되는 강제 순환식 고체 발효법(AASF)에 의해 배양하여 배양물을 생산하는 단계; 및
    상기 배양물을 회수하여 프로테아제, 아밀라제, α-갈락토시다제, 자일라제, 및 셀룰라제를 포함하는 효소를 제조하는 단계
    를 포함하는 비전분성 다당류 분해용 복합 효소 조성물의 제조방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제 3항에 있어서, 상기 수분 함량은 45%~50%로 조절되는 비전분성 다당류 분해용 복합 효소 조성물의 제조방법.
  7. 제 3항에 있어서, 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-N1 및 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) GB-X2는 배지를 달리하여 단일 균주 별로 배양한 후 획득되는 효소를 혼합하는 비전분성 다당류 분해용 복합 효소 조성물의 제조방법.
  8. 제 7항에 있어서, 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) GB-N1는 초기 접종 균수를 104~107 cfu/g으로 접종하고 48 시간 ~ 72 시간 동안 배양하는 비전분성 다당류 분해용 복합 효소 조성물의 제조방법.
  9. 제 7항에 있어서, 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) GB-X2는 초기 접종 균수를 104~105 cfu/g으로 접종하고 24 시간 ~ 72 시간 동안 배양하는 비전분성 다당류 분해용 복합 효소 조성물의 제조방법.
  10. 제 3항에 있어서, 배양 온도는 30℃ 내지 35℃인 비전분성 다당류 분해용 복합 효소 조성물의 제조방법.
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