KR20080050506A

KR20080050506A - 동물용 사료 첨가제

Info

Publication number: KR20080050506A
Application number: KR1020087009416A
Authority: KR
Inventors: 아키히코 가도타; 모토시 스즈키; 신지 이토; 야스아키 스기모토; 마사미 모치즈키
Original assignee: 이데미쓰 고산 가부시키가이샤
Priority date: 2005-09-20
Filing date: 2006-08-01
Publication date: 2008-06-05
Also published as: WO2007034627A1; TW200806190A; EP1935253A1; EP1935253A4; US20090155417A1; BRPI0616153A2

Abstract

동물의 소화활동을 보조하고, 사료효율을 높이거나, 염증성 장관장해 등의 동물의 장내 감염증을 예방ㆍ개선하기 위해, 아스퍼질러스ㆍ소야, 아스퍼질러스ㆍ타마리, 아스퍼질러스ㆍ포에티더스, 아스퍼질러스ㆍ나이거 및 아스퍼질러스ㆍ오리제로부터 선택되는 적어도 1종의 균과 이들 균이 산생하는 산성효소를 조합하여 동물에 섭취시킨다.

Description

동물용 사료 첨가제{ADDITIVE FOR ANIMAL FEED}

본 발명은, 산성효소를 산생하는 능력을 갖는 아스퍼질러스(aspergillus)속 균을 함유하는 동물용 사료 첨가제에 관한 것이다.

가축이나 애완동물(이하, 동물이라고 함) 등의 사료는, 분쇄 등의 가공은 행해지지만, 일반적으로 가열 처리 등은 행해지지 않으므로, 소화 흡수율이 낮아져, 사료효율이 나쁘다는 문제가 있다. 또한, 최근에는 인간의 병으로 알려진 궤양성 대장염이나 크론씨병 등의 염증성 장관장해(腸管障害)가 동물에도 보고되고 있고, 설사 등의 증상을 야기한다는 문제가 있다. 또한, 이러한 염증성 장관장해는, 사료의 흡수 저하나 건전 비육을 방해하는 것도 알려져 있다. 동물의 장내 감염증을 야기하는 병원균으로는, 병원성 대장균, 살모넬라속 세균, 크로스트리듐속 세균, 캄필로박터속 세균 등이 알려져 있다. 이러한 병원균은, 이상증식하면 독소(장독소, 세포독소)를 산생하여, 장관 점막에 장해를 일으켜, 묽은 변이나 심한 설사 등을 야기하는 것이 알려져 있다. 또한, 콕시듐은, 닭, 돼지, 소 등의 장관 내에 기생하는 원생동물로서, 감염되면 설사, 식욕부진 등을 야기한다. 이러한 염증성 장 관장해를 예방ㆍ치료하기 위해 항생물질을 이용하는 것이 행해지고 있지만, 약제 내성균의 출현 등의 문제가 있다.

최근, 장내 세균총의 밸런스를 개선하여, 장내의 병원균의 증식을 억제하기위해, 프로바이오틱스를 이용하는 기술이 주목되고 있다(특허 문헌 1, 특허 문헌 2). 그러나, 유산균이나 비피더스균은, 0.3% 디옥시콜산의 농도에서 사멸하는 것이나 pH4 이하에서 사멸하는 것이 많고, 대장균군으로 총칭되는 세균 이외는, 담즙산 중의 미생물에 대하여 강한 항균성을 갖는 디옥시콜산의 존재하에서 생존할 수 없는 균종이 많다. 그래서, 동물의 소화관 내에서도 사멸하지 않고, 숙주에 유리한 효과를 가져오는 균종이 요구되고 있다.

한편, 동물용 사료를 그 가공 단계에서 효소나 효소 생산균으로 처리하여, 어느 정도 분해하여 둠으로써 동물의 위장의 부담을 경감하는 기술 등이, 소화기계 질병의 예방이나 개선에 유용하다는 것이 보고되어 있다(특허 문헌 3). 또한, 누룩균을 이용하여 생선가루를 저수분으로 발효시켜, 프로테아제, 리파아제 등을 고농도로 함유하는 물고기용 생선가루 발효사료를 얻는 방법이 알려져 있다(특허 문헌 4). 그러나 이러한 기술에 있어서는, 사료 중의 수분함량을 높여 사료의 성분분해를 행한 후, 건조하여 제품화하는 복잡한 공정이 필요하다는 문제가 있었다. 또한, 성분분해를 위해 수분의 함량을 높인 사료는, 부패균이나 곰팡이 등이 발생하기 쉽고, 품질의 유지가 곤란하다는 등의 문제도 있었다.

또한, 누룩균의 포자를 동물에게 경구투여함으로써 동물의 배설물을 개질하는 방법이 보고되어 있지만, 동물의 장내에서 염증 등을 야기하는 유독한 세균의 증식을 억제하거나, 체중증가를 촉진하거나 하는 용도에 대해서는 검토되어 있지 않고, 누룩균에 산성효소를 산생시킨 형태로 동물에게 투여하는 것도 알려져 있지 않다(특허 문헌 5).

또한, 갑각류의 갑각분쇄물에 발효영양원을 가하여 혼합하고, 이것에 아스퍼질러스속 균을 접종하여 키틴 또는 키토산을 분해시켜 발효물을 얻어, 동물에게 주는 것이 기재되어 있다(특허 문헌 6). 이 방법에 의한 동물의 성장촉진 효과는 일부 인정되고 있지만, 동물 장내의 병원균 증식을 억제하여, 장내 감염증을 예방ㆍ치료하는 것에 대해서는 검토되어 있지 않고, 그와 같은 효과도 인정되고 있지 않다.

한편, 아스퍼질러스ㆍ소야, 아스퍼질러스ㆍ타마리, 아스퍼질러스ㆍ오리제는 누룩산을 산생하는 것이 보고되어 있다(비특허 문헌 1). 또한, 누룩산은 Aerobacter, Alcaligenes, Bacillus, Brucella, Chromobacterium, Clostridium, Corynebacterium, Diplococcus, Eberthella, Escherichia, Klebsiella, Leptospira, Micrococcus, Neisseria, Pasteurella, Proteus, Pseudomonas, Salmonella, Sarcina, Shigella, Serratia, Spirillum, Staphylococcus, Streptococcus, Vibrio에 대하여 항균활성을 갖는 것이 보고되어 있다(비특허 문헌 2). 그러나, 누룩산을 투여한 생쥐(mouse)에서 간세포 종양의 발생이 인정되고, 쥐(rat)에서도 누룩산의 간 발암성의 가능성이 시사되고 있다. 또한, 유전독성의 유무에 대해서는 명확히는 되어 있지 않지만, 유전독성을 가질 가능성에 대해서도 부정은 할 수 없다. 즉, 사료에 있어서 누룩산을 함유시키는 것에 대해서는 주의 가 필요하다.

(특허 문헌 1) 일본 특허 공표 제 2005-507670 호 공보

(특허 문헌 2) 일본 특허 공표 제 2004-523241 호 공보

(특허 문헌 3) 일본 특허 공개 제 2004-141147 호 공보

(특허 문헌 4) 일본 특허 공표 평 6-319464 호 공보

(특허 문헌 5) 일본 특허 공개 평 11-171674 호 공보

(특허 문헌 6) 일본 특허 공개 제 2002-238466 호 공보

(비특허 문헌 1) George A. Burdock, Madhusudan G. Soni, and Ioana G. Carabin(2001) Regulatory Toxicology and Pharmacology 33, 80-101

(비특허 문헌 2) Harry E. Morton, Walter Kocholaty, Renate Junowicz-Kocholaty, and Albert Kelner(1945) J. Bacteriol 50, 579-584

발명의 개시

본 발명은, 동물의 소화활동을 보조하여, 사료효율을 높이기 위한 안전하고 간편한 수단을 제공하는 것을 과제로 한다. 구체적으로는, 동물의 소화기관 내에서 증식이 가능한 균을 이용하여, 동물의 장내의 병원균이나 콕시듐의 증식을 억제함으로써 감염증을 예방ㆍ치료하고, 동물의 체중증가를 실현하는 수단을 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구를 행한 결과, 아스퍼질러스ㆍ소야, 아스퍼질러스ㆍ타마리, 아스퍼질러스ㆍ포에티더스, 아스퍼질러스ㆍ나이거 및 아스퍼질러스ㆍ오리제가 산성효소, 특히 산성 아밀라아제의 산생능력이 우수한 것, 이들 균이 장내 감염증을 야기하는 병원균에 대한 항균활성 및 콕시듐에 대한 살원생동물 활성(protozoa-killing activity)을 갖는 것, 및 이들이 프로바이오틱스로서 기능하는 것을 발견했다. 또한, 이들 균의 산성효소 산생능은, 현미를 영양원으로 하여 배양한 경우에 매우 우수한 것을 발견했다. 그리고, 이들의 균체와 균체에 의해 산생된 산성효소를 조합시켜 사료와 함께 동물에게 섭취시킴으로써, 소화를 촉진하고, 장내 감염증을 예방ㆍ개선하여, 동물의 체중증가에 기여하는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은, 이하와 같다.

(1) 아스퍼질러스ㆍ소야(Aspergillus sojae), 아스퍼질러스ㆍ타마리(Aspergillus tamarii), 아스퍼질러스ㆍ포에티더스(Aspergillus foetidus), 아스퍼질러스ㆍ나이거(Aspergillus niger) 및 아스퍼질러스ㆍ오리제(Aspergillus oryzae)로부터 선택되는 적어도 1종의 균, 및 이들 균이 산생하는 산성효소를 포함하는 배양물을 포함하는, 동물용 사료 첨가제.

(2) 상기 균이, 아스퍼질러스ㆍ소야 및/또는 아스퍼질러스ㆍ오리제인, (1)에 기재된 동물용 사료 첨가제.

(3) 상기 아스퍼질러스ㆍ오리제가, 아스퍼질러스ㆍ오리제 IK-05074주(FERM BP-10622) 또는 이것과 같은 산성효소를 산생하는 능력을 갖는 상기 균주의 변이주인 (1) 또는 (2)에 기재된 동물용 사료 첨가제.

(4) 상기 산성효소가, 산성 아밀라아제인, (1)~(3) 중 어느 하나에 기재된 동물용 사료 첨가제.

(5) 상기 균이, 동물의 장내 감염증을 야기하는 병원균에 대한 항균활성 및/또는 콕시듐에 대한 살원생동물 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, (1)~(4) 중 어느 하나에 기재된 동물용 사료 첨가제.

(6) 상기 배양물이, 식물성 영양원을 포함하는 (1)~(5) 중 어느 하나에 기재된 동물용 사료 첨가제.

(7) 상기 식물성 영양원이, 현미인 (6)에 기재된 동물용 사료 첨가제.

(8) (1)~(7) 중 어느 하나에 기재된 동물용 사료 첨가제를 포함하는 사료.

(9) 균의 증식을 위한 영양원을 포함하는 고체 배지에서, 아스퍼질러스ㆍ소야, 아스퍼질러스ㆍ타마리, 아스퍼질러스ㆍ포에티더스, 아스퍼질러스ㆍ나이거 및 아스퍼질러스ㆍ오리제로부터 선택되는 적어도 1종의 균을 배양하여, 얻어진 배양물을 사료에 함유시키는 것을 특징으로 하는, 사료의 제조방법.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

본 발명의 동물용 사료 첨가제에 함유하는 아스퍼질러스ㆍ소야, 아스퍼질러스ㆍ타마리, 아스퍼질러스ㆍ포에티더스, 아스퍼질러스ㆍ나이거 및 아스퍼질러스ㆍ오리제는, 당해 기술분야에서, 누룩균의 종의 동정(同定)에 일반적으로 이용되는 방법에 의해 분류한 경우에, 각각 상기의 종으로 분류되는 균이다. 균종의 동정에는, 예컨대, 「H. Murakami, The Journal of General and Applied Microbiology, 17, p.281-309, (1971)」, 「무라카미 히데야(村上英也), 일본양조협회지, 제 74 권, 제 12 호, p.849-853, (1979)」, 「Nikkuni, S., et al, The Journal of General and Applied Microbiology, 44, p.225-230, (1998)」 등도 참조할 수 있다.

아스퍼질러스ㆍ소야는, 토양, 누룩 등에서 발견되는 실 모양의 불완전 균류의 일종으로 간장, 된장의 양조에 이용되는 균이다. 본 발명의 동물용 사료 첨가제에 있어서는, 이하에 상술하는 산성효소 중 적어도 1종, 바람직하게는 산성 아밀라아제를 산생하는 능력을 갖고 있는 것으로서, 동물에게 섭취시키는 데에 있어서 안전한 것이면, 특별히 제한 없이 이용할 수 있다. 본 발명의 동물용 사료 첨가제에 있어서는, 시판되고 있는 균주를 이용할 수도 있고, 이러한 균으로서 아스퍼질러스ㆍ소야 AOK 210주(주식회사 아키타콘노 상점)를 바람직하게 이용할 수 있다.

아스퍼질러스ㆍ타마리는, 토양, 누룩, 식품 등에서 발견되는 실 모양의 불완전 균류의 일종으로 간장, 된장의 양조에 이용되는 균이다. 본 발명의 동물용 사료 첨가제에 있어서는, 이하에 상술하는 산성효소 중 적어도 1종, 바람직하게는, 산성 아밀라아제를 산생하는 능력을 갖고 있는 것으로서, 동물에게 섭취시키는 데에 있어서 안전한 것이면, 특별히 제한 없이 이용할 수 있다. 본 발명의 동물용 사료 첨가제에 있어서는, 시판되고 있는 균주를 이용할 수도 있고, 이러한 균으로서 아스퍼질러스ㆍ타마리 AOK 43주(주식회사 아키타콘노 상점)를 바람직하게 이용할 수 있다.

아스퍼질러스ㆍ포에티더스는, 토양, 누룩, 곡물찌꺼기 등에서 발견되는 실 모양의 불완전 균류의 일종으로 술, 된장, 간장의 양조에 이용되는 균이다. 본 발명의 동물용 사료 첨가제에 있어서는, 이하에 상술하는 산성효소 중 적어도 1종, 바람직하게는, 산성 아밀라아제를 산생하는 능력을 갖고 있는 것으로서, 동물에게 섭취시키는 데에 있어서 안전한 것이면, 특별히 제한 없이 이용할 수 있다. 본 발명의 동물용 사료 첨가제에 있어서는, 시판되고 있는 균주를 이용할 수도 있고, 이러한 균으로서 아스퍼질러스ㆍ포에티더스 AOK N4586주(주식회사 아키타콘노 상점)를 바람직하게 이용할 수 있다.

아스퍼질러스ㆍ나이거는, 토양, 누룩, 곡물찌꺼기 등에서 발견되는 실 모양의 불완전 균류의 일종으로 주류의 제조, 식품가공, 당의 제조나 의약의 제조 등 여러 가지 방면에서 이용되는 균이다. 본 발명의 동물용 사료 첨가제에 있어서는, 이하에 상술하는 산성효소 중 적어도 1종, 바람직하게는, 산성 아밀라아제를 산생하는 능력을 갖고 있는 것으로서, 동물에게 섭취시키는 데에 있어서 안전한 것이면, 특별히 제한 없이 이용할 수 있다. 본 발명의 동물용 사료 첨가제에 있어서는, 시판되고 있는 균주를 이용할 수도 있고, 이러한 균으로서 아스퍼질러스ㆍ나이거 AOK B650주(주식회사 아키타콘노 상점)를 바람직하게 이용할 수 있다.

또한, AOK 210주, AOK 43주, AOK N4586주 또는 AOK B650주의 변이주를 이용할 수도 있다. 변이주는, 이들 균주를 자연변이시키거나, 화학적 변이제나 자외선 등으로 변이처리하여 얻어진 균주로부터, 각각 AOK 210주, AOK 43주, AOK N4586주 또는 AOK B650주와 같은 산성효소를 산생하는 능력을 갖는 균주를 선발하여 얻을 수 있다. 또한, 산성효소를 산생하는 능력에 더하여, 상기 균주와 같은 항균활성, 살원생동물 활성, 담즙산 내성, 내산성의 적어도 하나를 더 갖는 상기 균주의 변이주를 이용하는 것도 바람직하다. 또한, 상기 이외의 다른 균학적 성질도 AOK 210주, AOK 43주, AOK N4586주 또는 AOK B650주와 마찬가지인 변이주를 이용하는 것도 바람직하다.

아스퍼질러스ㆍ오리제는, 토양, 누룩 등에서 발견되는 실 모양의 불완전 균류의 일종으로 간장, 된장의 양조에 이용되는 균이다. 본 발명의 동물용 사료 첨가제에 있어서는, 하기에 상술하는 산성효소 중 적어도 1종, 바람직하게는 산성 아밀라아제를 산생하는 능력을 갖고 있고, 동물에게 섭취시키는 데에 있어서 안전한 것이면, 특별히 제한 없이 이용할 수 있다. 본 발명의 동물용 사료 첨가제에 있어서는, 시판되고 있는 균주를 이용할 수도 있고, 이러한 균으로서 아스퍼질러스ㆍ오리제 IK-05074주를 바람직하게 이용할 수 있다. IK-05074주는, 각종 발효식품으로부터 분리된 주로, 평성 18년 2월 15일에, 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(일본 이바라키현 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1-1 중앙 제 6)에 수탁번호 FERM P-20798로서 기탁되고, 평성 18년 6월 20일에 부다페스트조약에 근거한 국제기탁으로 이관되어, 수탁번호 FERM BP-10622가 부여되어 있다.

IK-05074주의 균학적 성질은 이하와 같다.

(1) 콜로니의 성상(Czapek-Dox 한천 배지(25℃에서 7일간 배양))

크기는 직경 50~60㎜, 색은 황색 내지 녹색, 시간의 경과에 따라 갈색 비슷한 색으로 변화한다. 균사체는 눈에 띄지 않고, 이면(裏面)은 무색이다.

(2) 형태

분생자병 : 박벽~후벽, 활면~약간 거친 면이며, 직경은 20㎛이하, 길이는 2 ㎜이하, 소낭은 직경 40~50㎛, 80㎛ 이하의 구형.

기저경자(metulae) : 큰 분생자병의 대부분에 존재하고, 길이는 12㎛ 이하.

파자(phialide) : 앰플형, 길이는 8~12㎛, 짧은 목을 갖는다.

분생자 : 직경 5~6㎛의 구형, 색은 황색 내지 녹색, 표면은 활면~미세한 거친 면.

이상으로부터, IK-05074주는, 아스퍼질러스ㆍ오리제(Aspergillus oryzae)에 귀속한다고 추정되었다.

또한, 본 발명의 동물용 사료 첨가제에 있어서는, IK-05074주의 변이주를 이용할 수도 있다. IK-05074주의 변이주는, IK-05074주를 자연변이시키거나, 화학적 변이제나 자외선 등으로 변이처리하거나 하여 얻어진 균주로부터 IK-05074주와 같은 산성효소를 산생하는 능력을 갖는 균주를 선발하여 얻을 수 있다. 또한, 산성효소를 산생하는 능력에 더하여, IK-05074주와 같은 항균활성, 살원생동물 활성, 담즙산 내성, 내산성 중 적어도 하나를 더 갖는 IK-05074주의 변이주를 이용하는 것도 바람직하다. 또한, 상기 이외의 다른 균학적 성질도 IK-05074주와 마찬가지인 변이주를 이용하는 것도 바람직하다.

또한, 본 발명의 동물용 사료 첨가제에 있어서는, 예컨대, 토양, 누룩, 식품, 곡물찌꺼기 등으로부터 단리(單離)한 아스퍼질러스ㆍ소야, 아스퍼질러스ㆍ타마리, 아스퍼질러스ㆍ포에티더스, 아스퍼질러스ㆍ나이거, 아스퍼질러스ㆍ오리제 중, 산성효소를 산생하는 능력을 갖고 있는 균주를 단리하여 이용할 수도 있다.

산성효소를 산생하는 능력이란, 균체를 배양하여 얻어진 배양물 중에, 산성효소 활성을 검출할 수 있을 정도로 산성효소를 산생하는 것을 말한다. 배양물의 산성효소 활성의 검출은, 통상적 방법에 따라 행할 수 있다. 예컨대, 국세청 소정분석법(개정 제 3 회 세청훈령 제 1 호)의 고체 누룩의 분석법의 글루코아밀라아제 활성측정법, α-아밀라아제 활성측정법, 내산성 α-아밀라아제 활성측정법, 산성 프로테아제 활성측정법 및 산성 카복시펩티다아제 활성측정법에 준거하여 측정할 수 있다.

또한, 본 발명에 이용하는 아스퍼질러스ㆍ소야, 아스퍼질러스ㆍ타마리, 아스퍼질러스ㆍ포에티더스, 아스퍼질러스ㆍ나이거, 아스퍼질러스ㆍ오리제는, 동물의 장내 감염증을 야기하는 병원균에 대하여 항균활성을 갖고 있는 것이 바람직하다.

상기 병원균은, 통상 장내세균과에 속한다. 그램 음성 세균에 속하는 병원균으로서는, 병원성 대장균(Escherichia coli), 살모넬라속(Salmonella), 캄필로박터속(Campylobacter)에 속하는 세균을 들 수 있다. 그램 양성 세균에 속하는 병원균으로서는 클로스트리듐속(Clostridium), 바실러스속(Bacillus), 리스테리아속(Listeria), 포도상 구균속(Staphylococcus), 연쇄상 구균속(Streptococcus)에 속하는 세균을 들 수 있다.

병원성 대장균으로는, 예컨대, 장관 침입성 대장균(Enteroinvasive E. coli : EIEC), 장관 독소원성 대장균(Enterotoxigenic E. coli : ETEC), 장관 병원성 대장균(Enteropathogenic E. coli : EPEC), 시가 독소 산생성 대장균(Shiga toxin producing E. coli : STEC), 장관 응집 접착성 대장균(Enteroaggregative E. coli : EAEC) 등을 들 수 있다. 살모넬라속에 속하는 세균으로는, S. pullorum, S. gallinarum, S. typhi, S. typhimurium, S. enteritidis, S. choleraesuis, S. derby, S. dublin 등을 들 수 있다. 캄필로박터속에 속하는 세균으로는, C. jejuni, C. coli, C. fetus, C. fetus subsp. intestinalis 등을 들 수 있다.

클로스트리듐속에 속하는 세균으로는, C. perfringens, C. botulinum, C. difficile 등을 들 수 있다. 바실러스속에 속하는 세균으로는, B. cereus 등을 들 수 있다. 리스테리아속에 속하는 세균으로서는, L. monocytogenes 등을 들 수 있다. 포도상 구균속에 속하는 세균으로는, 황색포도상 구균(S. aureus) 등을 들 수 있다. 연쇄상 구균속에 속하는 세균으로는, S. suis, S. pyogenes 등을 들 수 있다. 본 발명의 동물용 사료 첨가제에 포함되는 상기 아스퍼질러스속 균은 특히 살모넬라속 세균, 그 중에서도 S. enteritidis 및 클로스트리듐속 세균, 그 중에서도 C. perfringens, 부종병균 등의 대장균, 황색 포도상 구균에 대하여 높은 항균활성을 갖는다.

병원균에 대하여 항균활성을 갖는다는 것은, 병원균과 동일한 배지에 접종한 경우에, 병원균의 증식을 억제하는 능력을 갖고 있는 것을 말한다. 항균활성을 갖는 아스퍼질러스ㆍ소야, 아스퍼질러스ㆍ타마리, 아스퍼질러스ㆍ포에티더스, 아스퍼질러스ㆍ나이거 및 아스퍼질러스ㆍ오리제는, 예컨대, 토양, 누룩 등의 분리원을 Salmonella enteritidis(SE), Clostridium perfringens(CP), Escherichia coli(EC), Staphylococcus aureus(SA) 등의 병원균을 접종한 한천 배지에 첨가하여, 배양을 행한 후, 저지원을 형성한 균체를 분리함으로써 얻을 수 있다. 이렇게 하여 얻은 균은, 상술한 병원균의 증식을 억제하는 능력을 갖고 있으므로, 동물에게 투여함으로써, 동물의 장내 감염증을 예방ㆍ치료할 수 있다.

또한, 동물의 장내 감염증을 야기하는 병원균의 증식이 억제되어 있는 것은, 예컨대, 동물의 맹장내용물이나 배설물 중의 병원균의 균체 농도(생균수)를 측정하는 것 등에 의해 확인할 수 있다.

또한, 본 발명에 이용하는 아스퍼질러스ㆍ소야, 아스퍼질러스ㆍ타마리, 아스퍼질러스ㆍ포에티더스, 아스퍼질러스ㆍ나이거, 아스퍼질러스ㆍ오리제는, 동물의 장내 감염증을 야기하는 콕시듐에 대하여 살원생동물 활성을 갖고 있는 것이 바람직하다.

콕시듐이란, 포자충류(Sporozoasida아강)에 속하는 원생동물을 말한다. 구체적으로는 Eimeria속, Isospora속, Toxoplasma속, Cryptosporidium속 등을 들 수 있다. Eimeria속에 속하는 원생동물로는, E. tenella, E. necatrix, E. acervulina, E. maxima, E. mitis, E. zuernii, E. bovis 등을 들 수 있다. Isospora속에 속하는 원생동물로는, I. suis, I. belli, I. hominis 등을 들 수 있다. Toxoplasma속에 속하는 원생동물로는, T. gondii 등을 들 수 있다. Cryptosporidium속에 속하는 원생동물로는, C. parvum 등을 들 수 있다. 본 발명의 동물용 사료 첨가제는, 특히, E. tenella, E. zuernii에 의한 감염증에 대하여 적합하게 이용할 수 있다.

콕시듐에 대하여 살원생동물 활성을 갖는다는 것은, 콕시듐의 접합자(oocyst)와 균의 배양물을 공존시킨 경우에, 접합자의 발아ㆍ증식을 억제하고, 바람직하게는 접합자를 감소시키는 능력을 갖고 있는 것을 말한다. 구체적으로는, 접합자의 세포벽을 변형, 용해하여, 접합자를 붕괴시키는 능력을 갖고 있는 것을 말한다. 접합자의 붕괴나 세포벽의 상태는, 현미경을 이용하여 관찰하면 좋다.

콕시듐에 대한 살원생동물 활성을 갖는 아스퍼질러스ㆍ소야, 아스퍼질러스ㆍ타마리, 아스퍼질러스ㆍ포에티더스, 아스퍼질러스ㆍ나이거 및 아스퍼질러스ㆍ오리제는, 예컨대, 이하의 방법에 의해 얻을 수 있다. 토양, 누룩 등의 분리원을 E. tenella나 E. zuernii의 접합자를 현탁시킨 멸균수를 넣은 페트리 접시에 가하고, 37℃에서 배양을 행하여, 1~7일간 관찰을 행한다. 접합자의 변형 또는 용해가 인정된 페트리 접시로부터 균체를 분리하고, 이것을 다시, E. tenella나 E. zuernii의 접합자를 현탁시킨 멸균수를 넣은 페트리 접시에 가하고, 37℃에서 배양을 행하여, 접합자의 변형 또는 용해를 확인한다. 이렇게 하여 페트리 접시에 포함되는 균을 배양하여, 각각 아스퍼질러스ㆍ소야, 아스퍼질러스ㆍ타마리, 아스퍼질러스ㆍ포에티더스, 아스퍼질러스ㆍ나이거, 아스퍼질러스ㆍ오리제의 균학적 성질을 갖는 균을 선택함으로써, 본 발명에 이용하는 아스퍼질러스속 균을 얻을 수 있다. 이렇게 하여 얻은 균을 동물에게 투여함으로써, 동물의 장내 콕시듐감염증을 예방ㆍ치료할 수 있다.

또한, 상술한 아스퍼질러스속 균을 투여함으로써, 콕시듐의 증식이 억제되고 있는지에 대해서는, 예컨대, 동물의 맹장내용물이나 배설물 중의 콕시듐의 접합자를 현미경으로 관찰하는 것 등에 의해 확인할 수 있다.

본 발명의 동물용 사료 첨가제에 포함되는 아스퍼질러스ㆍ소야, 아스퍼질러스ㆍ타마리, 아스퍼질러스ㆍ포에티더스, 아스퍼질러스ㆍ나이거, 아스퍼질러스ㆍ오리제는, 위산이나 담즙산에 대한 내성을 갖고 있는 것이 바람직하다. 이에 따라, 동물의 장내에서도 균체가 유용한 산성효소를 산생하여, 산성효소에 의한 소화보조의 기능이 지속된다고 생각된다. 또한, 이들 아스퍼질러스속 균이 상술한 바와 같은 병원균에 대한 항균활성을 갖고 있는 경우에는, 동물의 장내 감염증을 야기하는 병원균의 증식을 억제하여, 장내 세균총의 밸런스 개선에도 기여한다. 위산이나 담즙산에 대한 내성을 갖는다는 것은, 보통의 소화기관 내의 조건에서 균이 사멸하는 일 없이, 장까지 도달하는 것을 말한다. 보통, 인간이나 동물의 위 내부는 공복시에는 pH 2 또는 그 이하에 달하는 경우가 있지만, 음식물을 섭취한 상태에서는, 위 내부의 pH는 3.5~6의 범위로 공복시보다 높다. 따라서, 본 발명의 사료 첨가제에 이용할 수 있는 내산성을 갖는 균주는, 예컨대, 분리원을 pH 3.5에서 2시간 정도 처리한 경우에, 생존하는 능력을 갖는 균주를 선발함으로써 얻을 수 있다. 또한, 이렇게 하여 선발한 균을 디옥시콜산 농도 10g/l의 존재하에서 24시간 정도 처리하여, 생존하는 능력을 갖는 균주를 선발함으로써, 본 발명의 사료 첨가제에 이용하는데 적합한 위산이나 담즙산에 대한 내성을 갖고 있는 균주를 얻을 수 있다. 또한, 균이 사멸하지 않고 장까지 도달하고 있는 것은, 예컨대, 동물의 배설물 중의 균체의 농도를 측정하는 것 등에 의해 확인할 수 있다.

본 발명의 동물용 사료 첨가제는, 상술한 균종 중, 1종의 균주를 단독으로 함유할 수도 있고, 2종 이상의 균주를 조합시켜 함유할 수도 있다. 그 중에서도, 아스퍼질러스ㆍ소야 및 아스퍼질러스ㆍ오리제 중 적어도 1종을 함유하는 것이 바람직하다.

본 발명의 동물용 사료 첨가제에 함유하는 아스퍼질러스ㆍ소야, 아스퍼질러스ㆍ타마리, 아스퍼질러스ㆍ포에티더스, 아스퍼질러스ㆍ나이거 및 아스퍼질러스ㆍ오리제의 균체 농도는, 사료 첨가제를 동물에게 투여했을 때에, 균체가 소화기관 내에서 사멸하지 않는 범위이면 좋고, 통상은 산성효소 활성을 갖는 사료 첨가제를 제조하기 위해 적당한 농도의 균체를 배양하고, 사료 첨가제 중의 산성효소 활성을 적절히 조절하면 좋다.

본 발명의 동물용 사료 첨가제에 포함되는 산성효소는, 상기 균이 산생하는 소화효소인 것이 바람직하고, 위장 내의 산성조건하에 있어서 비활성화하지 않고서 활성을 갖는 것이면 특별히 제한되지 않지만, 그 중에서도 최적 pH를 2.5~5.5로 갖는 것이 바람직하다. 예컨대, 산성의 α-아밀라아제, 글루코아밀라아제, 타카디아스타아제, 프로테아제, 셀룰라아제, 리보뉴클레아제, 뉴클레아제, 자일라나아제, 펙티나아제, 리파아제 등을 들 수 있고, 본 발명의 동물용 사료 첨가제는, 이들 중 1종 또는 2종 이상을 함유한다. 이 중에서도 특히, 가축의 사료성분 중 주된 성분의 하나인 전분을 분해하는 산성의 아밀라아제를 포함하는 것이 바람직하다. 본 발명의 동물용 사료 첨가제에 포함되는 산성 아밀라아제는, 전분을 가수분해하는 산성효소이면 특별히 제한되지 않고, 예컨대, α-아밀라아제, β-아밀라아제, 글루코아밀라아제 등을 들 수 있다. 이 중에서도 최적 pH를 3 부근에 갖는 내산성 α-아밀라아제를 바람직하게 들 수 있다.

본 발명의 동물용 사료 첨가제는, 아스퍼질러스ㆍ소야, 아스퍼질러스ㆍ타마리, 아스퍼질러스ㆍ포에티더스, 아스퍼질러스ㆍ나이거, 아스퍼질러스ㆍ오리제가 산생하는 산성효소 중 적어도 1종을 포함하고 있을 수도 있지만, 다른 균종이나 다른 생물종 유래의 효소를 더 포함하고 있을 수도 있다.

본 발명의 동물용 사료 첨가제에 있어서의 산성효소의 함유량은, 동물의 종류, 체중 등에 따라 적절히 조절할 수 있다. 통상은, 국세청 소정분석법(개정 제 3 회 세청훈령 제 1 호)의 고체 누룩의 분석법에 준거하여 산성효소의 활성을 측정한 경우, 동물용 사료 첨가제 1g당 산성효소 활성의 총합이 12,000U 이상인 것이 바람직하고, 20,000U 이상인 것이 더 바람직하다. 특히, 동물용 사료 첨가제 1g당 산성 아밀라아제 활성이 100U 이상인 것이 바람직하고, 300U 이상인 것이 더 바람직하다. 또한, 산성 프로테아제 활성과 산성 카복시펩티다아제 활성의 총합이 10,000U 이상인 것이 바람직하고, 15,000U 이상인 것이 더 바람직하다.

본 발명의 동물용 사료 첨가제는, 상술한 아스퍼질러스ㆍ소야, 아스퍼질러스ㆍ타마리, 아스퍼질러스ㆍ포에티더스, 아스퍼질러스ㆍ나이거 및 아스퍼질러스ㆍ오리제 중 적어도 1종의 균을 배양하여, 산성효소를 산생시킴으로써 얻을 수 있다. 본 발명의 동물용 사료 첨가제에 이용하는 아스퍼질러스ㆍ소야, 아스퍼질러스ㆍ타마리, 아스퍼질러스ㆍ포에티더스, 아스퍼질러스ㆍ나이거 및 아스퍼질러스ㆍ오리제는, 통상의 배양조건으로 배양함으로써 산성효소를 산생한다. 예컨대, 배양온도는 25℃~40℃로 행할 수 있지만, 통상은 28~32℃에서 배양하는 것이 바람직하다. 또한, 배양방법은, 왕복이동식 진동배양, 자 발효조(jar fermenter) 배양 등에 의한 액체 배양법이나 고체 배양법을 이용할 수 있지만, 상기 균체가 갖는 산성효소 산생유전자 중에는, 고체 배지에서만 발현하는 유전자도 존재하므로, 본 발명에 있어서는 고체 배양법을 이용하는 것이 바람직하다.

배양에 이용하는 배지성분은, 동물성 또는 식물성 중 하나를 이용하여도 좋지만, 식물성 영양원을 함유하는 것이 바람직하고, 예컨대, 현미, 겨, 쌀겨, 대두, 보리 등을 함유하는 것이 바람직하다. 이 중에서도, 특히 현미를 영양원으로 하는 것이 바람직하다. 이에 따라, 산성 아밀라아제 등의 산성효소의 산생효율을 높일 수 있다.

또한, 그 밖의 탄소원으로서 글루코오스, 수크로오스, 당밀 등의 당류, 또한 질소원으로서 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 질산암모늄 등의 암모늄염이나 질산염 등을 첨가할 수도 있다.

본 발명의 동물용 사료 첨가제에 있어서는, 이렇게 하여 얻은 배양물을 그대로 동물용 사료 첨가제로 할 수도 있고, 얻어진 배양물로부터, 균체 및 산성효소를 포함하는 일부를 분리하여, 동물용 사료 첨가제에 함유시킬 수도 있다. 예컨대, 고체 배지를 이용하여 균체의 배양을 행하는 경우는, 균체를 배지와 함께 분쇄한 것을 동물용 사료 첨가제에 함유시키는 것이 간편성의 면에서 바람직하다. 또한, 배양물을 건조시키거나, 보존성을 높이기 위한 임의 성분을 더 첨가하거나 하는 등의 가공을 하여, 제품의 품질안정성을 높이는 것도 바람직하다.

건조방법은, 특별히 제한되는 것이 아니고, 예컨대, 통풍건조, 자연건조, 분무건조, 동결건조 등에 의해 행할 수 있지만, 이 중에서도 통풍건조가 바람직하게 이용된다. 또한, 동결건조를 이용할 수도 있지만, 그때에는, 보호제를 첨가하여도 좋다. 보호제의 종류는, 특별히 제한되지 않지만, 탈지유, 글루타민산나트륨 및 당류로부터 1종 또는 2종 이상을 선택하여 이용하는 것이 바람직하다. 또한, 당류를 이용하는 경우에 그 종류는 특별히 제한되지 않지만, 글루코오스나 트레할로스를 이용하는 것이 바람직하다.

또한, 건조 후는, 얻어진 건조물에, 탈산소제, 탈수제를 가하여, 가스 배리어성의 알루미늄 봉투에 넣고 밀봉하여, 실온으로부터 저온에 저장하는 것이 바람직하다. 이에 따라, 균체를 장기간 산채로 보존하는 것이 가능해진다.

또한, 본 발명의 동물용 사료 첨가제는, 누룩산의 함유농도가 낮은 것이 바람직하다. 통상은, 누룩산의 함유농도가 0.1㎎/l 이하인 것이 바람직하고, 0.01㎎/l 이하인 것이 더 바람직하다.

또한, 본 발명의 동물용 사료 첨가제는, 통상 이용되고 있는 동물용 사료의 성분과 혼합하여, 동물의 성장촉진을 위한 사료로 할 수 있다. 또한, 상술한 아스퍼질러스속 균이 동물의 장내 감염증을 야기하는 병원균에 대한 항균활성 및/또는 콕시듐에 대한 살원생동물 활성을 더 갖고 있는 경우에는, 병원균 및/또는 콕시듐에 의한 동물의 장내 감염증을 예방ㆍ치료하기 위한 사료로 할 수 있다.

사료의 종류나 성분은, 본 발명의 동물용 사료 첨가제에 포함되는 균체가 사멸하지 않고, 또한 산성효소가 비활성화하지 않는 한 특별히 제한되지 않고, 통상, 가축의 사료나 펫 푸드(pet food), 동물용 보충제 등, 동물의 사료로서 이용되고 있는 것에 첨가할 수 있다.

본 발명의 사료는, 본 발명의 동물용 사료 첨가제를 사료의 성분에 첨가함으로써 제조할 수 있다. 본 발명의 사료에 포함되는 동물용 사료 첨가제의 함유량은, 동물의 종류, 체중, 연령, 성별, 사용목적, 건강상태, 사료의 성분 등에 따라 적절히 조절할 수 있어 특별히 제한되지 않지만, 통상은 사료 전체 양에 대하여, 건조상태에서 10~5000ppm, 바람직하게는 50~1000ppm으로 하는 것이 좋다.

또한, 본 발명의 동물용 사료 첨가제는, 그대로 사료성분에 첨가하여, 혼합하여도 좋지만, 분말상, 고형상의 동물용 사료 첨가제를 첨가, 혼합하는 경우는, 사료에의 혼합을 용이하게 하기 위해 액상 또는 겔상의 형태로 하여 사용할 수도 있다. 이 경우는, 물, 대두유, 채종유, 옥수수기름 등의 식물유, 액체 동물유, 폴리바이닐알코올이나 폴리바이닐피롤리돈, 폴리아크릴산 등의 수용성 고분자화합물을 액체담체로서 이용할 수 있다. 또한, 사료 중에서의 균체 농도의 균일성을 유지하기 위해, 알긴산, 알긴산나트륨, 잔탄검, 카제인나트륨, 아라비아고무, 구아검, 타마린드종자 다당류 등의 수용성 다당류를 배합하는 것도 바람직하다. 또한, 잡균의 번식을 막기 위해 유기산을 배합하여, 액체 생균제를 산성으로 할 수도 있다.

본 발명의 사료를 섭취시키는 동물의 종류는, 특별히 제한되지 않고, 예컨대, 포유류, 조류, 파충류, 양서류, 어류 등을 들 수 있다. 이 중에서도, 특히 가금, 가축에 대하여 적합하게 이용할 수 있다. 동물에게 섭취시키는 사료의 양은, 동물의 종류, 체중, 연령, 성별, 사용목적, 건강상태, 사료의 성분 등에 따라 적절히 조절할 수 있다.

(1-1) 내산성, 담즙산 내성 아스퍼질러스속 균의 선발

PDA(potato dextrose agar) 배지의 pH를 5로 조정하여, 121℃에서 15분간 살균했다. 이 한천 배지의 온도가 60℃까지 저하한 때에 디옥시콜산나트륨을 배지 1L당 10g의 농도로 첨가하고, 주식회사 아키타콘노상점(일본 아키타현 다이센시 가리와노 248)에 보존되어 있는 아스퍼질러스속 균을 접종한 바, 아스퍼질러스ㆍ소야(Aspergillus sojae), 아스퍼질러스ㆍ타마리(Aspergillus tamarii), 아스퍼질러스ㆍ포에티더스(Aspergillus foetidus) 및 아스퍼질러스ㆍ나이거(Aspergillus niger)가 배지에 양호하게 생육했다. 그 중에서도, 아스퍼질러스ㆍ소야 AOK 210주, 아스퍼질러스ㆍ타마리 AOK 43주, 아스퍼질러스ㆍ포에티더스 AOK N4586주, 및 아스퍼질러스ㆍ나이거 AOK B650주가 특히 양호하게 생육했다.

(1-2) 내산성, 담즙산 내성 아스퍼질러스속 균의 선발

상기와 같이 디옥시콜산나트륨을 함유하는 배지에, 각종 발효식품을 분리원으로 하여 많은 아스퍼질러스속 균을 접종하고, 배지에 생육해온 균주 중, 가장 생육이 양호한 주를 선발했다. 이 주를, 아스퍼질러스ㆍ오리제 IK-05074주라 하고, 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터에 기탁했다.

IK-05074주의 균학적 성질은, 상술한 바와 같다.

(2-1) 균종의 비교실험

(a) 균체의 배양 및 산성효소 활성의 측정

현미를 고체 배지로 하여, (1-1)에서 선발한 AOK 210주, AOK 43주, AOK N4586주 및 AOK B650주의 배양을 행했다. 즉, 현미 100g을 하루 밤낮을 물에 담가 팽윤시킨 후, 뚜껑에 무균필터가 부착된 직경 14㎝, 깊이 10㎝의 폴리카보네이트제 용기에 2㎝의 두께가 되도록 넣어, 오토클레이브에서 121℃ 15분간 살균했다. 이 용기에 상기 각 균체를 접종하여 28℃에서 5일간 배양하여, 종균을 제조했다.

이어서, 상기와 같이 팽윤시킨 현미를 30×40×10㎝의 스테인리스 통(vat)에 1.5㎝의 두께가 되도록 적층하고, 20×25㎝의 필터로 덮은 통기구를 갖는 뚜껑을 덮어, 대형 오토클레이브에 넣어 121℃에서 25분간 살균했다. 이 통을 냉각한 후, 미리 배양해둔 상기 종균을 전량 접종했다. 이 통을 28℃의 부란기에 넣어, 7일간 배양했다.

배양 후, 35℃에서 통풍건조하고, 제트밀로 분쇄하여, 각각의 균종에 대하여 고체 배양물을 얻었다. 또, 아스퍼질러스ㆍ카와치(Aspergillus kawachii) AOK 1006s주(주식회사 아키타콘노상점)에 대해서도 상기와 같이 하여 고체 배양물을 얻었다.

각각의 고체 배양물 1g당 내산성 α-아밀라아제 활성, 및 산성 프로테아제 활성과 산성 카복시펩티다아제 활성의 총합을 측정했다. 결과를 표 1에 나타낸다. 또, 상기 산성효소의 측정은, 국세청 소정분석법(개정 제 3 회 세청훈령 제 1 호)의 고체 누룩의 분석법의 내산성 α-아밀라아제 활성 측정법, 산성 프로테아제 활성 측정법 및 산성 카복시펩티다아제 활성 측정법에 준거하여 행했다.

(b) 투여시험

상기에서 얻은 균주의 병아리에의 투여시험을 행했다. 상기에서 얻은 AOK 210주, AOK 43주, AOK N4586주 및 AOK B650주의 고체 배양물을, 사료(SD 브로일러 전후기용, 일본배합사료주식회사 제품) 전체 질량에 대하여, 100ppm, 150ppm의 농도로 사료에 혼합하여, 실시예 1~8로 했다. 또한, AOK 1006s주의 고체 배양물을 마찬가지로 사료에 혼합한 것을 비교예 1 및 2로 했다. 또한, 오토클레이브 살균을 하여 균을 첨가하지 않고서 건조한 현미를 150ppm의 농도로 사료에 혼합하여, 대조구로 했다. 투여시험은 10마리를 1군으로 하여, 부화 후 일주일째의 병아리에 상기 사료를 28일간 자유롭게 섭취시켜 비육했다. 부화 후 35일째의 각 군의 병아리의 평균체중을 표 1에 나타낸다.

AOK 210주, AOK 43주, AOK N4586주 및 AOK B650주의 고체 배양물의 내산성 α-아밀라아제 활성은, AOK 1006s주를 배양하여 얻어진 배양물의 내산성 α-아밀라아제 활성의 4배 이상이었다. 또한, 산성 프로테아제 활성 및 산성 카복시펩티다아제 활성의 총합도 약 2.5배~6배였다. 이에 따라, 상기 4종의 균은, 산성 아밀라아제, 산성 프로테아제 및 산성 카복시펩티다아제의 산생능력이 우수한 것을 알 수 있다. 이 중에서도, 특히, AOK 210주는, 산성 아밀라아제, 산성 프로테아제 및 산성 카복시펩티다아제의 모든 산생능력이 우수한 것을 알 수 있다.

본 발명의 동물용 사료 첨가제를 포함하는 사료를 투여한 실시예 1~8의 군의 병아리의 체중은, 비교예 1 및 2의 군의 병아리의 체중에 비하여 보다 증가하고 있었다. 이에 따라, 본 발명의 동물용 사료 첨가제를 포함하는 사료는, 동물의 성장을 촉진하는 효과가 우수한 것을 알 수 있다. 특히, AOK 210주를 이용하여 제조한 동물용 사료 첨가제를 포함하는 사료는, 동물의 체중의 증가를 촉진하는 효과가 우수한 것을 알 수 있다.

(2-2) 균종의 비교실험

(a) 균체의 배양 및 산성효소 활성의 측정

현미를 고체 배지로 하여, (1-2)에서 선발한 IK-05074주의 배양을 행했다. 배양은, 10일간 배양하여 종균을 제조한 것, 및 이 종균을 전량 접종하여 10일간 배양한 것을 제외하고는, 상기와 마찬가지로 하여 행했다. 또, 아스퍼질러스ㆍ카와치 AOK 1006s주의 배양도 마찬가지로 행했다. 배양 후, 상기와 같이 하여 이들의 고체 배양물을 얻었다.

다음으로, PD(potato dextrose) 액체 배지를 121℃, 15분 살균한 후, 60℃까지 저하시키고 디옥시콜산나트륨을 배지 1L당 5g의 농도로 첨가한 배지에, IK-05074주를 접종하여, 28℃에서 6일간 배양했다. 이 배양물을 0.4㎛의 필터로 여과하여, 균체를 모았다. 모은 균체에 배양 전의 배지를 흘려 3회 세정하여, 균체외 효소를 제거했다. 이어서, 균체에 배지성분을 첨가하여, 36℃에서 24시간 통풍건조하여, 산성효소를 포함하지 않는 IK-05074주의 고체 배양물을 얻었다.

각각의 고체 배양물 1g당 내산성 α-아밀라아제 활성, 및 산성 프로테아제 활성과 산성 카복시펩티다아제 활성의 총합을, (2-1)(a)와 같은 방법으로 측정했다. 결과를 표 2에 나타낸다.

(b) 투여시험

IK-05074주의 병아리에의 투여시험을 (2-1)(b)와 같은 방법으로 행했다. 상기에서 얻은 IK-05074주의 고체 배양물을 100ppm, 150ppm의 농도로 사료에 혼합한 것을 각각 실시예 9 및 10으로 했다. 또한, 아스퍼질러스ㆍ카와치의 고체 배양물을 마찬가지로 사료에 혼합한 것을 비교예 3 및 4로 하고, 산성효소를 제거한 IK-05074주의 고체 배양물을 150ppm의 농도로 사료에 혼합한 것을 비교예 5로 했다. 또한, 오토클레이브 살균을 하여 균을 첨가하지 않고 건조한 현미를 150ppm의 농도로 사료에 혼합하여, 대조구로 했다. 투여시험은 10마리를 1군으로 하여, 부화 후 일주일째의 병아리에 상기 사료를 48일간 자유롭게 섭취시켜 비육했다. 부화 후 55일째의 각 군의 병아리의 평균체중을 표 2에 나타낸다.

아스퍼질러스ㆍ오리제 IK-05074주를 배양하여 얻어진 배양물의 내산성 α-아밀라아제 활성은, 아스퍼질러스ㆍ카와치를 배양하여 얻어진 배양물의 내산성 α-아밀라아제 활성의 약 57배였다. 또한, 산성 프로테아제 활성 및 산성 카복시펩티다아제 활성의 총합도 약 6배였다. 이에 따라, IK-05074주는, 산성 아밀라아제, 산성 프로테아제 및 산성 카복시펩티다아제의 산생능력이 우수하고, 특히 산성 아밀라아제의 산생능력이 우수한 것을 알 수 있다.

본 발명의 동물용 사료 첨가제를 포함하는 사료를 투여한 실시예 9 및 10의 병아리의 체중은, 비교예 3~5의 군의 병아리의 체중에 비하여 증가해 있었다. 이에 따라, 본 발명의 아스퍼질러스ㆍ오리제 및 이것이 산생하는 산성효소를 함유하는 동물용 사료 첨가제를 포함하는 사료는, 동물의 성장을 촉진하는 효과를 갖는 것을 알 수 있다.

(3) 고체 배지의 비교실험

(a) 균체의 배양 및 내산성 α-아밀라아제 활성의 측정

현미, 보리 및 파쇄대두를 고체 배지로 하여, AOK 210주의 배양을 행했다. 즉, 현미, 보리 및 파쇄대두 각각 100g을 밤새 물에 담가 팽윤시킨 후, 각각 30×40×5㎝의 스테인리스 통에 두께 2.0㎝로 적층하여, 표면을 여과지로 덮은 후, 그 위에 스테인리스의 뚜껑을 덮어, 대형 오토클레이브에 넣어 121℃에서 30분간 살균했다. 이 통을 냉각한 후, (2-1)(a)에서 배양하여 둔 종균 전량을 나누어 각 배지에 접종했다. 이 통을 28℃의 부란기에 넣어, 5일간 배양했다.

배양 후, 35℃에서 통풍건조하고, 제트밀로 분쇄하여, 고체 배양물을 얻었다. 각각의 고체 배양물의 내산성 α-아밀라아제 활성을 측정했다. 결과를 표 3에 나타낸다. 또, 내산성 α-아밀라아제 활성의 측정은, 상기와 마찬가지이다.

(b) 투여시험

상기에서 얻어진 건조 고체 배양물의 병아리에의 투여시험을 행했다. 상기 고체 배양물을, 사료(SD 브로일러 전후기용, 일본배합사료주식회사 제품) 전체 질량에 대하여 50ppm, 100ppm의 농도로 사료에 혼합하여, 실시예 11~16으로 했다. 또한, 오토클레이브 살균을 하여 균을 첨가하지 않고서 건조한 현미를 100ppm의 농도로 사료에 혼합하여, 대조구로 했다. 투여시험은 10마리를 1군으로 하여, 부화 후 일주일째의 병아리에 상기 사료를 35일간 자유롭게 섭취시켜 비육했다. 부화 후 42일째의 각 군의 병아리의 평균체중을 표 3에 나타낸다.

현미를 고체 배지성분으로 하여 얻은 배양물의 내산성 α-아밀라아제 활성은, 대두, 보리를 고체 배지성분으로 하여 얻은 배양물의 내산성 α-아밀라아제 활성에 비하여 약 1.5배로, 분명히 높았다. 이에 따라, 현미를 고체 배지성분으로서 이용한 경우에, 특히 산성 아밀라아제의 산생능력이 증대하는 것을 알 수 있다.

본 발명의 동물용 사료 첨가제를 포함하는 사료를 투여한 실시예 11~16의 군의 병아리의 체중은, 모두 대조구의 병아리의 체중에 비하여 보다 증가하고 있었다. 특히, 현미를 고체 배지성분으로 하여 제조한 동물용 사료 첨가제를 포함하는 본 발명의 사료는, 체중의 증가를 촉진하는 효과가 우수한 것을 알 수 있다.

(4-1) 아스퍼질러스속 균의 배양물의 항균활성의 측정

AOK 210주, AOK 43주, AOK N4586주 및 AOK B650주와 병원균을 공배양함으로써 이들 균의 병원균에 대한 항균활성을 시험했다.

Salmonella enteritidis(SE)에 대해서는, 표준 한천 배지에서 37℃, 24시간 호기배양을 행했다. 평판상에 발육한 콜로니를 떼어 멸균 생리식염수에 부유시켰다. 1L 용량의 삼각플라스크에 Brain Heart Infusion Broth 「닛스이(日水)」 500㎖를 제작하여, 오토클레이브 살균 후, SE의 최종 농도가 약 1.0×10⁴~1.0×10⁵CFU/㎖가 되도록 무균적으로 투입했다. 삼각플라스크에, (2-1)(a)에서 얻은 AOK 210주, AOK 43주, AOK N4586주 및 AOK B650주의 분쇄 고체 배양물을, 각각 5g씩 무균적으로 투입하여, 실시예 17~20으로 했다. AOK 1006s주의 분쇄 고체 배양물 5g을 무균적으로 투입한 삼각플라스크를 비교예 6으로 하고, 누룩균 배양물을 가하지 않은 삼각플라스크를 대조구로 했다. 각각의 삼각플라스크를 37℃의 항온기로, 호기조건하에서 완만하게 교반하여 배양했다.

Clostridium perfringens(CP)에 대해서는, 언에어로 팩 켄키(Anaero Pack Kenki)(미쓰비시가스화학(주) 제품)를 이용하여, 난황이 보충된 CW 한천 배지(닛스이제약(주) 제품)에서 37℃, 24시간 혐기배양을 행했다. 평판상에 발육한 콜로니를 떼어 멸균 생리식염수에 부유시켰다. 1L 용량의 삼각플라스크에 Brain Heart Infusion Broth 「닛스이」 500㎖를 제작하여, 오토클레이브 살균 후, CP의 최종농도가 약 1.0×10⁴~1.0×10⁵CFU/㎖가 되도록 무균적으로 투입했다. 삼각플라스크에, (2-1)(a)에서 얻은 AOK 210주, AOK 43주, AOK N4586주 및 AOK B650주의 분쇄 고체 배양물을, 각각 5g씩 무균적으로 투입하여, 실시예 21~24로 했다. AOK 1006s주의 분쇄 고체 배양물 5g을 무균적으로 투입한 삼각플라스크를 비교예 7로 하고, 누룩균 배양물을 가하지 않은 삼각플라스크를 대조구로 했다. 각각의 삼각플라스크를 37℃의 항온기로, 언에어로 팩 켄키를 이용하여 혐기조건하에서 완만하게 교반하여 배양했다.

시험개시 후, 0일, 3일, 7일째에 SE 및 CP의 생균수 측정을 실시했다. SE의 생균수 측정방법은, 채취한 배양액을, 멸균 생리식염수로 10배 단계희석 후, 각각의 희석단계액의 0.1㎖를 X-SAL 한천 배지 「닛스이」에 도포하여, 37℃에서, 24시간 호기배양을 행하여, 발육한 특징적인 콜로니를 계수했다. CP의 생균수 측정방법은, 채취한 배양액을, 멸균 생리식염수로 10배 단계희석 후, 각각의 희석단계액의 0.1㎖를 난황이 보충된 CW 한천 배지(닛스이제약(주) 제품)에 도포하여, 언에어로 팩 켄키를 이용하여 37℃에서, 24시간 혐기배양을 행하여, 발육한 특징적인 콜로니를 계수했다.

또한, 동시에 누룩산 농도를 정량하기 위해, 배양액을 8,000rpm으로 10분간 원심분리하고, 그 상청액을 셀룰로스 혼합 에스터타입 멤브레인 필터(구경 0.45㎛, 어드밴틱동양(주) 제품)로 여과했다. HPLC 장치는, Waters 600(Multisolvent Delivery system) 및 waters 490E(Programmable multiwavelength Detector)를 이용했다. 컬럼은, YMC-Pack ODS-AM 6.0㎜×150㎜(YMC사 제품)를 이용했다. 이동상(mobile phase)은 0.1mol/l 인산2수소나트륨용액(pH 3.0)-메탄올(97:3), 유속은 1.0㎖/min, 컬럼 온도는 40℃, 측정파장은 270㎚로 누룩산의 검출을 행했다. 검량선은 누룩산(시약특급, 와코순약공업(주) 제품)을 이용하여 제작했다.

표 4에 SE의 생균수를, 표 5에 SE의 공배양 시험의 배양물의 누룩산 농도를, 표 6에 CP의 생균수를, 표 7에 CP의 공배양 시험의 배양물의 누룩산 농도를 나타낸다.

실시예 17~20에 나타내는 바와 같이, AOK 210주, AOK 43주, AOK N4586주 및 AOK B650주의 고체 배양물은, 비교예 6에 나타내는 AOK 1006s주의 고체 배양물에 비하여 분명히 높은 SE에 대한 항균활성을 나타냈다. 특히 AOK 210주와 공배양한 경우는 SE의 생균수가 시험 3일째 이후부터 검출한계 이하가 되어, 가장 높은 항균활성이 인정되었다. 또한, AOK 43주에 대해서도, 시험 7일째에는 SE의 생균수가 검출한계 이하가 되었다. 또, 대조구에서는 시험 7일째까지 균수의 상승이 인정되고, 7일째에 2.8×10⁸CFU/㎖를 나타냈다.

또한, 어느 현탁액에 있어서도 누룩산 함량은 검출한계 이하였다.

실시예 21~24에 나타내는 바와 같이, AOK 210주, AOK 43주, AOK N4586주 및 AOK B650주의 고체 배양물은, 비교예 7에 나타내는 AOK 1006s주의 고체 배양물에 비하여 분명히 높은 CP에 대한 항균활성을 나타냈다. 특히 AOK 210주와 공배양한 경우는 CP의 생균수가 시험 3일째 이후부터 검출한계 이하가 되어, 가장 높은 항균활성이 인정되었다. 대조구에 대해서는 시험 7일째까지 균수의 상승이 인정되고, 7일째에 1.0×10⁶CFU/㎖를 나타냈다.

Escherichia coli(EC)에 대해서는, 표준 한천 배지(닛스이제약(주) 제품)에서 37℃, 24시간 호기배양했다. 평판상에 발육한 콜로니를 떼어, 멸균 생리식염수에 부유시켰다. 1L 용량의 삼각플라스크에 Brain Heart Infusion Broth 「닛스이」(닛스이제약(주) 제품) 500㎖를 제작하여, 오토클레이브 살균 후, EC의 최종 농도가 약 1.0×10⁵~1.0×10⁶CFU/㎖가 되도록 무균적으로 투입했다. 삼각플라스크에, (2-1)(a)에서 얻은 AOK 210주, AOK 43주, AOK N4586주 및 AOK B650주의 분쇄 고체 배양물을, 각각 5g씩 무균적으로 투입하여, 실시예 25~28로 했다. AOK 1006s주의 분쇄 고체 배양물 5g을 무균적으로 투입한 삼각플라스크를 비교예 8로 하고, 누룩균 배양물을 가하지 않는 삼각플라스크를 대조구로 했다. 각각의 삼각플라스크를 37℃의 항온기에서, 호기조건하에 느리게 교반하여 배양했다.

Staphylococcus aureus(SA)에 대해서는, 표준 한천 배지에서 37℃, 24시간 호기배양했다. 평판상에 발육한 콜로니를 떼어, 멸균 생리식염수에 부유시켰다. 1L 용량의 삼각플라스크에 Brain Heart Infusion Broth 「닛스이」(닛스이제약(주) 제품) 500㎖를 제작하여, 오토클레이브 살균 후, SA의 최종 농도가 약 1.0×10⁵~1.0×10⁶CFU/㎖가 되도록 무균적으로 투입했다. 삼각플라스크에, (2-1)(a)에서 얻은 AOK 210주, AOK 43주, AOK N4586주 및 AOK B650주의 분쇄 고체 배양물을, 각각 5g씩 무균적으로 투입하여, 실시예 29~32로 했다. AOK 1006s주의 분쇄 고체 배양물 5g을 무균적으로 투입한 삼각플라스크를 비교예 9로 하고, 누룩균 배양물을 가하지 않는 삼각플라스크를 대조구로 했다. 각각의 삼각플라스크를 37℃의 항온기에서, 호기조건하에 느리게 교반하여 배양했다.

시험개시 후, 0일, 3일, 7일째에서 EC 및 SA의 생균수 측정을 실시했다. EC의 생균수 측정방법은, 채취한 배양액을 멸균 생리식염수로 10배 단계희석 후, 각각의 희석단계액의 0.1㎖를 Chromocult Coliform Agar 「Merck」(Merck사 제품)에 도포 후, 37℃에서 24시간 호기배양을 행하여, 발육한 특징적인 콜로니를 계수했다. SA의 생균수 측정방법은, 채취한 배양액을 멸균 생리식염수로 10배 단계희석 후, 각각의 희석단계액의 0.1㎖를 난황이 보충된 만니톨(mannitol) 식염 배지 「에이켄」(에이켄기재(주) 제품)에 도포 후, 37℃에서 48시간 호기배양을 행하여, 발육한 특징적인 콜로니를 계수했다.

표 8에 EC의 생균수를, 표 9에 SA의 생균수를 나타낸다.

실시예 25~28에 나타내는 바와 같이, AOK 210주, AOK 43주, AOK N4586주 및 AOK B650주의 고체 배양물은, 비교예 8에 나타내는 AOK 1006s주의 고체 배양물에 비하여 분명히 높은 EC에 대한 항균활성을 나타냈다. 특히, AOK 210주와 공배양한 경우는 EC의 생균수가 시험 3일째 이후부터 검출한계 이하가 되어, 가장 높은 항균활성이 인정되었다. 또한, AOK 43주, AOK N4586주 및 AOK B650주에 대해서도, 시험 7일째에는 EC의 생균수가 검출한계 이하가 되었다. 또, 대조구에서는 시험 7일째까지 균수의 상승이 인정되고, 7일째에 1.0×10⁷CFU/㎖를 나타냈다.

실시예 29~32에 나타내는 바와 같이, AOK 210주, AOK 43주, AOK N4586주 및 AOK B650주의 고체 배양물은, 비교예 9에 나타내는 AOK 1006s주에 비하여 분명히 높은 SA에 대한 항균활성을 나타냈다. 특히, AOK 21주와 공배양한 경우는 SA의 생균수가 시험 3일째 이후부터 검출한계 이하가 되어, 가장 높은 항균활성이 인정되었다. 또한, AOK 43주, AOK N4586주 및 AOK B650주에 대해서도, 시험 7일째에는 SA의 생균수가 검출한계 이하가 되었다. 대조구에 대해서는 시험 7일째까지 균수의 상승이 인정되고, 7일째에 7.2×10⁷CFU/㎖를 나타냈다.

(4-2) 아스퍼질러스ㆍ오리제의 배양물의 항균활성의 측정

IK-05074주와 병원균을 공배양함으로써, IK-05074주의 병원균에 대한 항균활성을 (4-1)과 같은 방법으로 시험했다.

Salmonella enteritidis(SE)와, (2-2)(a)에서 얻은 IK-05074주의 분쇄 고체 배양물을 가한 삼각플라스크를 실시예 33, SE와 AOK 1006s주의 분쇄 고체 배양물을 가한 삼각플라스크를 비교예 10, 누룩균 배양물을 가하지 않은 삼각플라스크를 대조구로 했다.

Clostridium perfringens(CP)와 (2-2)(a)에서 얻은 IK-05074주의 분쇄 고체 배양물을 가한 삼각플라스크를 실시예 34, CP와 AOK 1006s주의 분쇄 고체 배양물을 가한 삼각플라스크를 비교예 11, 누룩균 배양물을 가하지 않은 삼각플라스크를 대조군으로 했다.

시험개시 후, 0일, 3일, 7일째에 있어서 SE 및 CP의 생균수 측정을 실시했다. 또한, 동시에 누룩산 농도를 정량했다.

표 10에 SE의 생균수를, 표 11에 SE의 공배양 시험의 배양물의 누룩산 농도를, 표 12에 CP의 생균수를, 표 13에 CP의 공배양 시험의 배양물의 누룩산 농도를 나타낸다.

실시예 33에 나타내는 바와 같이, IK-05074주와 공배양한 경우에는, SE의 생균수가 시험 3일째 이후부터 검출한계 이하가 되어, 비교예 10에 나타내는 AOK 1006s주의 고체 배양물에 비하여 분명히 높은 SE에 대한 항균활성을 나타냈다. 또, 대조구에서는 시험 후, 균수의 상승이 인정되고, 3일째에 3.3×10⁸CFU/㎖를 나타냈다.

실시예 34에 나타내는 바와 같이, IK-05074주와 공배양한 경우에는, CP의 생균수가 시험 3일째 이후부터 검출한계 이하가 되어, 비교예 11에 나타내는 AOK 1006s주의 고체 배양물에 비하여 분명히 높은 CP에 대한 항균활성을 나타냈다. 대조구에 대해서는 시험 7일째까지 균수의 상승이 인정되고, 7일째에 1.3×10⁶CFU/㎖를 나타냈다.

Escherichia coli(EC)와 (2-2)(a)에서 얻은 IK-05074주의 분쇄 고체 배양물을 가한 삼각플라스크를 실시예 35, EC와 AOK 1006s주의 분쇄 고체 배양물을 가한 삼각플라스크를 비교예 12, 누룩균 배양물을 가하지 않은 삼각플라스크를 대조구로 했다.

Staphylococcus aureus(SA)와 (2-2)(a)에서 얻은 IK-05074주의 분쇄 고체 배양물을 가한 삼각플라스크를 실시예 36, CP와 AOK 1006s주의 분쇄 고체 배양물을 가한 삼각플라스크를 비교예 13, 누룩균 배양물을 가하지 않은 삼각플라스크를 대조구로 했다.

시험개시 후, 0일, 3일, 7일째에서 EC 및 SA의 생균수 측정을 실시했다.

표 14에 EC의 생균수를, 표 15에 SA의 생균수를 나타낸다.

실시예 35에 나타내는 바와 같이, IK-05074주와 공배양한 경우는 EC의 생균수가 시험 3일째 이후부터 검출한계 이하가 되어, 비교예 12에 나타내는 AOK 1006s주의 고체 배양물에 비하여 분명히 높은 EC에 대한 항균활성을 나타냈다. 또, 대조구에서는 시험 후 균수의 상승이 인정되고, 3일째에 4.0×10⁸CFU/㎖를 나타냈다.

실시예 36에 나타내는 바와 같이, IK-05074주와 공배양한 경우는 SA의 생균수가 시험 3일째 이후부터 검출한계 이하가 되어, 비교예 13에 나타내는 AOK 1006s주의 고체 배양물에 비하여 분명히 높은 SA에 대한 항균활성을 나타냈다. 대조구에 대해서는 시험 후 균수의 상승이 인정되고, 3일째에 3.7×10⁸CFU/㎖를 나타냈다.

(5-1) 병아리에 대한 Salmonella enteritidis 공격시험

병아리의 사료(SD 브로일러 전기용, 일본배합사료(주) 제품, 항균성물질 무첨가사료) 전체 질량에 대하여, (2-1)(a)에서 얻은 AOK 210주, AOK 43주, AOK N4586주 및 AOK B650주의 분쇄 고체 배양물을 100ppm이 되도록 혼합한 사료를, 각각 실시예 37~40으로 했다. 브로일러종 닭(상표 : Chunky) 유래의 종란에서 부화한 병아리 12마리를 1군으로 하여, 실시예 37~40의 사료를, 14일간 주었다. 한편, AOK 1006s주의 분쇄 고체 배양물을 100ppm이 되도록 혼합한 사료를, 비교예 14로 했다. 누룩균 배양물 대신에 유당을 100ppm 혼합한 사료를 대조구로 하여, 마찬가지로 시험을 행했다. 7일령에 1마리당 1.8×10⁵CFU의 Salmonella enteritidis(SE)를 경구투여했다. SE는, 군마현의 양계업자의 농장에서 사망한 닭의 맹장내용물에서 분리한 균주를 이용했다. 14일령에 맹장내용물과, 총배설강을 면봉으로 닦아 배설물을 채취했다.

맹장내용물의 SE 생균수를 이하의 방법에 의해 측정하여, 감염지수 및 방어지수를 산출했다.

맹장내용물 1g을 멸균인산 완충생리식염수를 가하여 10배로 희석하여, 충분히 혼합하여 시료원액으로 했다. 이어서, 시료원액을 멸균 생리식염수를 이용하여 10배로 단계희석하여, 단계희석액으로 했다. 시료원액 및 단계희석액을 각각 SS 한천 평판 배지 「닛스이」(닛스이제약(주) 제품) 및 브릴리언트 그린 한천 평판 배지(Difco Laboratories 제품)에 0.1㎖씩 도포하여, 37℃에서 24시간 배양하여, 각 평판 배지에 생육한 전형적인 SE의 콜로니수를 측정했다. 또한, 콜로니로부터 수집하여 라이신탈탄산 시험용, SIM 한천 배지「닛스이」(닛스이제약(주) 제품) 및 TSI 한천 배지 「닛스이」(닛스이제약(주) 제품)에 접종하여 37℃에서 24시간 배양하여 성상의 확인을 행했다.

이 중에서 SE로 인정된 콜로니수에 희석액의 희석배율을 곱하여 맹장내용물 1g당 SE 생균수를 산출했다. 이 결과를 바탕으로, 이하와 같이 하여 감염지수 및 방어지수를 산출했다. 감염지수란, 병원균의 감염률의 높이를 나타내는 값이며, 방어지수란, 누룩균을 포함하지 않는 사료를 투여한 경우와 비교한 경우의 각각의 사료가 병원균의 감염을 방어하는 능력을 나타내는 값이다.

감염지수 : 각 개체의 맹장내용물 중의 SE 생균수의 대수의 평균치(logCFU/g의 평균치)

방어지수 : 대조구의 감염지수/각 시험구의 감염지수

총배설강에서 채취한 배설물에 관해서는, 이하의 방법에 의해 개체별로 정성배양을 행함으로써 SE의 성상을 확인했다. 즉, 면봉에 부착한 배설물을 10㎖의 멸균인산 완충생리식염수에 현탁하여, 시료원액으로 한 후, 이것을 SS 한천 평판 배지 및 브릴리언트 그린 한천 평판 배지에 0.1㎖씩 도포하여, 37℃에서 24시간 배양하여, 각 평판 배지에 생육한 전형적인 SE의 콜로니형성의 유무를 판정했다. 또한, 콜로니로부터 수집하여 LIM 한천 배지 「닛스이」(닛스이제약(주) 제품), SIM 한천 배지 및 TSI 한천 배지에 접종하여 37℃에서 24시간 배양하여 성상의 확인을 행했다.

결과를 표 16에 나타낸다.

실시예 37~40의 AOK 210주, AOK 43주, AOK N4586주 및 AOK B650주를 포함하는 사료를 투여한 병아리는, 맹장내용물의 SE의 균체 농도가 매우 낮고, SE의 감염지수는 대단히 낮았다. 특히 실시예 37에서는 높은 방어지수가 얻어졌다. 비교예 14의 AOK 1006s주를 포함하는 사료를 투여한 병아리는, 대조구와 비교하여 SE의 생균수에 변화가 없었다. 이에 따라, 본 발명의 아스퍼질러스ㆍ소야, 아스퍼질러스ㆍ타마리, 아스퍼질러스ㆍ포에티더스, 및 아스퍼질러스ㆍ나이거가 산생하는 산성효소를 포함하는 배양물에는 SE에 의한 감염증을 예방하는 효과가 있는 것이 나타났다.

(5-2) 병아리에 대한 Salmonella enteritidis 공격시험

(2-2)(a)에서 얻은 IK-05074주의 분쇄 고체 배양물을 100ppm이 되도록 혼합한 병아리의 사료를 실시예 41로 하고, AOK 1006s주의 분쇄 고체 배양물을 100ppm이 되도록 혼합한 사료를 비교예 15로 하고, 누룩균 배양물 대신에 유당을 100ppm 혼합한 사료를 대조구로 하고, 이들 사료를 이용하여 병아리를 사육하여, SE 공격시험을 행했다. 시험방법은, 2.0×10⁵CFU의 SE를 경구투여한 것 이외에는, 상기와 마찬가지이다.

결과를 표 17에 나타낸다.

실시예 41의 IK-05074주를 포함하는 사료를 투여한 병아리는, 맹장내용물의 SE의 균체 농도가 매우 낮고, SE의 감염지수는 대단히 낮았다. 비교예 15의 AOK 1006s주를 포함하는 사료를 투여한 병아리는, 대조구와 비교하여 SE의 생균수에 거의 변화가 없었다. 이에 따라, 본 발명의 아스퍼질러스ㆍ오리제가 산생하는 산성효소를 포함하는 배양물에는 SE에 의한 감염증을 예방하는 효과가 있는 것이 나타났다.

(6-1) 병아리에 대한 Clostridium perfringens 공격시험

병아리의 사료(SD 브로일러 전기용, 일본배합사료(주) 제품, 항균성물질 무첨가사료) 전체 질량에 대하여, (2-1)(a)에서 얻은 AOK 210주, AOK 43주, AOK N4586주 및 AOK B650주의 분쇄 고체 배양물을 100ppm이 되도록 혼합한 사료를, 각각 실시예 42~45로 했다. 브로일러종 닭(상표 : Chunky) 유래의 종란에서 부화한 병아리 12마리를 1군으로 하여, 실시예 42~45의 사료를, 14일간 주었다. 한편, AOK 1006s주의 분쇄 고체 배양물을 100ppm이 되도록 혼합한 사료를, 비교예 16으로 했다. 누룩균 배양물 대신에 유당을 100ppm 혼합한 사료를 대조구로 하여, 마찬가지로 시험을 행했다. 7일령에 1마리당 1.1×10⁹CFU의 Clostridium perfringens(CP)를 경구투여했다. CP는, 군마현의 양계업자의 농장에서 사망한 닭의 맹장내용물에서 분리한 균주를 이용했다. 14일령에 맹장내용물과, 총배설강을 면봉으로 닦아 배설물을 채취했다.

맹장내용물의 CP 생균수를 이하의 방법에 의해 측정하여, 감염지수 및 방어지수를 산출했다.

맹장내용물 1g을 멸균인산 완충 생리식염수를 가하여 10배로 희석하여, 충분히 혼합하여 시료원액으로 했다. 이어서, 시료원액을 멸균 생리식염수를 이용하여 10배로 단계희석하여, 단계희석액으로 했다. 시료원액 및 단계희석액을 각각 클로스트리듐 측정용 배지(닛스이제약(주) 제품)에 0.1㎖씩 도포하여, 언에어로 팩 켄키를 이용하여 35℃에서 24시간 혐기배양하여, 각 평판 배지에서 생육한 흑색집락수를 측정했다. 또한, 콜로니로부터 수집하여 난황이 보충된 CW 한천 배지(닛스이제약(주) 제품)에 접종하여, 35℃에서 24~48시간 호기 및 혐기배양하여 성상의 확인을 행했다.

이 중에서 CP로 인정된 콜로니수에 희석액의 희석배율을 곱하여 맹장내용물 1g당 CP 생균수를 산출했다. 이 결과를 바탕으로, 상기와 같이 하여 감염지수 및 방어지수를 산출했다.

총배설강에서 채취한 배설물에 관해서는, 이하의 방법에 의해 개체별로 정성배양을 행함으로써 CP의 성상을 확인했다. 즉, 면봉에 부착한 매설물을 10㎖의 멸균인산 완충 생리식염수에 현탁하여, 시료원액으로 한 후, 이것을 클로스티리듐 측정용 배지(닛스이제약(주) 제품)에 0.1㎖씩 도포하여, 언에어로 팩 켄키를 이용하여 35℃에서 24시간 혐기배양하여, 각 평판 배지에서 생육한 흑색집락 형성의 유무를 판정했다. 또한, 콜로니로부터 수집하여 난황이 보충된 CW 한천 배지(닛스이제약(주) 제품)에 접종하여, 35℃에서 24~48시간 호기 및 혐기배양하여 성상의 확인을 행했다.

결과를 표 18에 나타낸다.

실시예 42~45의 AOK 210주, AOK 43주, AOK N4586주 및 AOK B650주를 포함하는 사료를 투여한 병아리는, 맹장내용물의 CP의 균체 농도가 매우 낮고, CP의 감염지수는 대단히 낮았다. 특히 실시예 42에서는 높은 방어지수가 얻어졌다. 비교예 16의 AOK 1006s주를 포함하는 사료를 투여한 병아리는, 대조구와 비교하여 CP의 생균수는 변화하지 않았다. 이에 따라, 본 발명의 아스퍼질러스ㆍ소야, 아스퍼질러스ㆍ타마리, 아스퍼질러스ㆍ포에티더스, 및 아스퍼질러스ㆍ나이거가 산생하는 산성효소를 포함하는 배양물에는 CP에 의한 감염증을 예방하는 효과가 있는 것이 나타났다.

(6-2) 병아리에 대한 Clostridium perfringens 공격시험

(2-2)(a)에서 얻은 IK-05074주의 분쇄 고체 배양물을 100ppm이 되도록 혼합한 병아리의 사료를 실시예 46으로 하고, AOK 1006s주의 분쇄 고체 배양물을 100ppm이 되도록 혼합한 사료를 비교예 17로 하고, 누룩균 배양물 대신에 유당을 100ppm 혼합한 사료를 대조구로 하고, 이들 사료를 이용하여 병아리를 사육하여, CP 공격시험을 행했다. 시험방법은, 1.5×10⁹CFU의 CP를 경구투여한 것 이외에는, 상기와 마찬가지이다.

결과를 표 19에 나타낸다.

실시예 46의 IK-05074주를 포함하는 사료를 투여한 병아리는, 맹장내용물의 CP의 균체 농도가 매우 낮고, CP의 감염지수는 대단히 낮았다. 비교예 17의 AOK 1006s주를 포함하는 사료를 투여한 병아리는, 대조구와 비교하여 CP의 생균수는 거의 변화하지 않았다. 이에 따라, 본 발명의 아스퍼질러스ㆍ오리제가 산생하는 산성효소를 포함하는 배양물에는 CP에 의한 감염증을 예방하는 효과가 있는 것이 나타났다.

(7-1) 송아지에 대한 Escherichia coli 공격시험

생후 1주령의 수컷송아지(홀스타인종)를 8마리를 1군으로 하여 사육했다. 송아지용 혼합사료(Miracle Mate(주) 과학사료연구소 제품) 전체 질량에 대하여 (2-1)(a)에서 얻은 AOK 210주, AOK 43주, AOK N4586주 및 AOK B650주의 분쇄 고체 배양물을 100ppm이 되도록 혼합한 사료를, 각각 실시예 47~50으로 했다. 이들 송아지용 혼합사료를 4주령까지 주었다. 한편, AOK 1006s주의 분쇄 고체 배양물을 100ppm 혼합한 사료를 비교예 18로 했다. 누룩균 배양물 대신에 유당을 100ppm 혼합한 사료를 대조구로 하여, 마찬가지로 시험을 행했다. 2주령에 한 마리당 1.2×10⁶CFU의 Escherichia coli(EC)를 전체 송아지에 경구투여했다. 4주령까지 사육하여, 각 군의 송아지의 사망률을 산출했다.

또한, 소장내용물을 채취하여, 소장내용물의 EC의 생균수를 이하의 방법으로 측정했다.

소장내용물 1g을 멸균인산 완충생리식염수를 가하여 10배로 희석하여, 충분히 혼합하여 시료원액으로 했다. 이어서, 시료원액을 멸균 생리식염수를 이용하여 10배로 단계희석하여, 단계희석액으로 했다. 시료원액 및 단계희석액을 각각 Chromocult coliform agar 「Merk」에 0.1㎖씩 도포하여, 37℃에서 24시간 배양하여, 각 평판 배지에 생육한 전형적인 EC의 콜로니수를 측정했다. EC로 인정된 콜로니수에 희석액의 희석배율을 곱하여 소장내용물 1g당 EC 생균수를 산출했다. 이 결과를 바탕으로, 상기와 같이 하여 감염지수 및 방어지수를 산출했다.

결과를 표 20에 나타낸다.

실시예 47~50의 AOK 210주, AOK 43주, AOK N4586주 및 AOK B650주를 포함하는 사료를 투여한 송아지는, 사망률은 0%였다. 또한, 소장내용물의 EC의 감염지수는 낮았다. 특히 실시예 47에서는 높은 방어지수가 얻어졌다. 비교예 18의 AOK 1006s주를 포함하는 사료를 투여한 송아지는, 사망률이 13%였다. 또한, 대조구와 비교하여 EC의 생균수는 변화하지 않았다. 이에 따라, 본 발명의 아스퍼질러스ㆍ소야, 아스퍼질러스ㆍ타마리, 아스퍼질러스ㆍ포에티더스, 및 아스퍼질러스ㆍ나이거가 산생하는 산성효소를 포함하는 배양물에는 EC에 의한 감염증을 예방하는 효과가 있는 것이 나타났다.

(7-2) 송아지에 대한 Escherichia coli 공격시험

IK-05074주의 분쇄 고체 배양물을 100ppm이 되도록 혼합한 송아지용 혼합사료를 실시예 51로 하고, AOK 1006s주의 분쇄 고체 배양물을 100ppm이 되도록 혼합한 사료를 비교예 19로 하고, 누룩균 배양물 대신에 유당을 100ppm 혼합한 사료를 대조구로 하고, 이들 사료를 이용하여 송아지를 사육하여, EC 공격시험을 행했다. 시험방법은, 1.5×10⁶CFU의 EC를 경구투여한 것 이외에는, 상기 EC 공격시험과 마찬가지이다.

결과를 표 21에 나타낸다.

실시예 51의 IK-05074주를 포함하는 사료를 투여한 송아지는, 사망률은 0%였다. 또한, 소장내용물의 EC의 감염지수는 낮았다. 비교예 19의 AOK 1006s주를 포함하는 사료를 투여한 송아지는, 사망률이 13%였다. 또한, 대조구와 비교하여 EC의 생균수는 그다지 변화하지 않았다. 이에 따라, 본 발명의 아스퍼질러스ㆍ오리제가 산생하는 산성효소를 포함하는 배양물에는 EC에 의한 감염증을 예방하는 효과가 있는 것이 나타났다.

(8-1) 새끼돼지에 대한 부종병균 공격시험

새끼돼지용 사료(SD 새끼돼지인공유 전기용, 일본배합사료(주) 제품, 항균성물질 무첨가사료) 전체 질량에 대하여 (2-1)(a)에서 얻은 AOK 210주, AOK 43주, AOK N4586주 및 AOK B650주의 분쇄 고체 배양물을 100ppm이 되도록 혼합한 사료를, 각각 실시예 52~55로 했다. 35일령의 새끼돼지(대요크셔종) 30마리를 1군으로 하여 19일간 섭취시켰다. 한편, AOK 1006s주의 분쇄 고체 배양물을 100ppm 혼합한 사료를, 비교예 20으로 했다. 누룩균 배양물 대신에 유당을 100ppm 혼합한 사료를 대조구로 하여, 마찬가지로 시험을 행했다. 40일령에 한 마리당 2.3×10⁵CFU의 부종병균(Escherichia coli)을 경구적으로 감염시켰다. 54일령까지 사육하여, 각 군의 새끼돼지 사망률을 산출했다.

또한, 상기와 같이 하여, 소장내용물을 채취하여, 소장내용물의 EC의 생균수를 측정하여, 감염지수 및 방어지수를 산출했다.

결과를 표 22에 나타낸다.

실시예 52~55의 AOK 210주, AOK 43주, AOK N4586주 및 AOK B650주를 포함하는 사료를 투여한 새끼돼지는, 사망률은 약 20~30% 정도이며, 비교예 20의 사료를 투여한 군의 사망률에 비교하여 작았다. 또한, 소장내용물의 EC의 감염지수는 낮고, 특히 실시예 52에서는 높은 방어지수가 얻어졌다. 또한, 대조구와 비교하여 부종병균의 생균수는 거의 변화하지 않았다. 이에 따라, 본 발명의 아스퍼질러스ㆍ소야, 아스퍼질러스ㆍ타마리, 아스퍼질러스ㆍ포에티더스, 및 아스퍼질러스ㆍ나이거가 산생하는 산성효소를 포함하는 배양물에는 부종균을 예방하는 효과가 있는 것이 나타났다.

(8-2) 새끼돼지에 대한 부종병균 공격시험

(2-2)(a)에서 얻은 IK-05074주의 분쇄 고체 배양물을 100ppm이 되도록 혼합한 새끼돼지용 사료를 실시예 56으로 하고, AOK 1006s주의 분쇄 고체 배양물을 100ppm이 되도록 혼합한 사료를 비교예 21로 하고, 누룩균 배양물 대신에 유당을 100ppm 혼합한 사료를 대조구로 하고, 이들 사료를 이용하여 새끼돼지를 사육하여, 부종병균 공격시험을 행했다. 시험방법은, 1.8×10⁵CFU의 부종병균을 경구투여한 것 이외에는, 상기 부종병균 공격시험과 마찬가지이다.

결과를 표 23에 나타낸다.

실시예 56의 IK-05074주를 포함하는 사료를 투여한 새끼돼지는, 사망률은 약20% 정도이며, 비교예 21의 사료를 투여한 군의 사망률에 비교하여 작았다. 또한, 소장내용물의 EC의 감염지수는 낮았다. 또한, 대조구와 비교하여 부종병균의 생균수는 거의 변화하지 않았다. 이에 따라, 본 발명의 아스퍼질러스ㆍ오리제가 산생하는 산성효소를 포함하는 배양물에는 부종균을 예방하는 효과가 있는 것이 나타났다.

(9-1) 콕시듐 방제시험

(a) Eimeria tenella 방제시험

Eimeria tenella에 자연감염된 닭의 배설물을 모아, 접합자를 실체현미경하에서 분리하여, 생리식염수로 세정했다. 직경 9㎝의 페트리 접시에 생리식염수 5㎖를 가하여, 세정한 접합자를 약 4000개/㎖가 되도록 투입했다. (2-1)(a)에서 얻은 AOK 210주, AOK 43주, AOK N4586주 및 AOK B650주의 분쇄 고체 배양물을, 페트리 접시당 50㎎씩 투입하여, 각각 실시예 57~60으로 했다. AOK 1006s주의 분쇄 고체 배양물 50㎎을 투입한 페트리 접시를 비교예 22로 하고, 누룩균 배양물을 가하지 않은 페트리 접시를 대조구로 했다. 각각의 페트리 접시를 37℃에서 진동시켰다(150rpm). 7일 후에, 실체현미경하에서, 접합자의 개수의 측정, 세포벽의 변형이나 용해의 상태의 관찰을 행하여, 접합자의 감소율 및 용해변성률을 산출했다.

결과를 표 24에 나타낸다.

실시예 57~60에 나타내는 바와 같이, AOK 210주, AOK 43주, AOK N4586주 및 AOK B650주의 고체 배양물은, 비교예 22에 나타내는 AOK 1006s주의 고체 배양물에 비하여, 분명히 E. tenella의 접합자수가 감소하고 있어, 더 높은 접합자 용해변성 활성을 나타냈다. 특히 AOK 210주로 E. tenella의 접합자를 처리함으로써, 매우 높은 접합자의 감소율 및 용해변성률이 얻어졌다.

(b) Eimeria zuernii 방제시험

Eimeria zuernii에 자연감염된 소의 설사를 모아, 접합자를 실체현미경하에서 분리하여, 생리식염수로 세정했다. 직경 9㎝의 페트리 접시에 생리식염수 5㎖를 가하여, 세정한 접합자를 약 2000개/㎖가 되도록 투입했다. (2-1)(a)에서 얻은 AOK 210주, AOK 43주, AOK N4586주 및 AOK B650주의 분쇄 고체 배양물을, 페트리 접시당 50㎎씩 투입하여, 각각 실시예 61~64로 했다. AOK 1006s주의 분쇄 고체 배양물 50㎎을 투입한 페트리 접시를 비교예 23으로 하고, 누룩균 배양물을 가하지 않은 페트리 접시를 대조구로 했다. 각각의 페트리 접시를 37℃에서 진동시켰다(150rpm). 7일 후에, 실체현미경하에서, 접합자의 개수의 측정, 세포벽의 변형이나 용해의 상태의 관찰을 행하여, 접합자의 감소율 및 용해변성률을 산출했다.

결과를 표 25에 나타낸다.

실시예 61~64에 나타내는 바와 같이, AOK 210주, AOK 43주, AOK N4586주 및 AOK B650주의 고체 배양물은, 비교예 23에 나타내는 AOK 1006s주의 고체 배양물에 비하여, 분명히 E. zuernii의 접합자수가 감소하고 있어, 더 높은 접합자 용해변성 활성을 나타냈다. 특히, AOK 210주로 E. zuernii의 접합자를 처리함으로써, 매우 높은 접합자의 감소율 및 용해변성률이 얻어졌다.

(9-2) 콕시듐 방제시험

(a) Eimeria tenella 방제시험

(2-2)(a)에서 얻은 IK-05074주의 분쇄 고체 배양물을 투입한 페트리 접시를 실시예 65로 하여, 상기와 같은 방법으로 Eimeria tenella 방제시험을 행했다. 또한, AOK 1006s주의 고체 배양물을 투입한 페트리 접시를 비교예 24로 하여, 마찬가지로 시험을 행했다.

결과를 표 26에 나타낸다.

실시예 65에 나타내는 바와 같이, IK-05074주의 고체 배양물은, 비교예 24에 나타내는 AOK 1006s주의 고체 배양물에 비하여, 분명히 E. tenella의 접합자수를 감소시켜, 더 높은 접합자 용해변성 활성을 나타냈다.

(b) Eimeria zuernii 방제시험

(2-2)(a)에서 얻은 IK-05074주의 분쇄 고체 배양물을 투입한 페트리 접시를 실시예 66으로 하여, 상기와 같은 방법으로 Eimeria zuernii 방제시험을 행했다. 또한, AOK 1006s주의 고체 배양물을 투입한 페트리 접시를 비교예 25로 하여, 마찬가지로 시험을 행했다.

결과를 표 27에 나타낸다.

실시예 66에 나타내는 바와 같이, IK-05074주의 고체 배양물은, 비교예 25에 나타내는 AOK 1006s주의 고체 배양물에 비하여, 분명히 E. zuernii의 접합자수를 감소시켜, 더 높은 접합자 용해변성 활성을 나타냈다.

본 발명의 아스퍼질러스속 균 및 그 균이 산생하는 산성효소를 포함하는 배양물을 포함하는 동물용 사료 첨가제를 사료에 혼합하여, 동물에게 섭취시킴으로써, 영양흡수가 촉진되어, 사료효율이 올라간다. 또한, 동물의 장내에서 아스퍼질러스속 균의 균체 농도가 증가함으로써, 장내 세균총의 밸런스가 개선된다. 또한, 병원균이나 콕시듐의 증식을 억제하여, 동물의 장내 감염증을 예방ㆍ개선한다. 본 발명의 사료는, 닭, 돼지, 소 등의 가축의 사육에 적합하게 이용할 수 있다.

Claims

아스퍼질러스ㆍ소야(Aspergillus sojae), 아스퍼질러스ㆍ타마리(Aspergillus tamarii), 아스퍼질러스ㆍ포에티더스(Aspergillus foetidus), 아스퍼질러스ㆍ나이거(Aspergillus niger) 및 아스퍼질러스ㆍ오리제(Aspergillus oryzae)로부터 선택되는 적어도 1종의 균, 및 이들 균이 산생하는 산성효소를 포함하는 배양물을 포함하는 동물용 사료 첨가제.
제 1 항에 있어서,

상기 균은 아스퍼질러스ㆍ소야 및/또는 아스퍼질러스ㆍ오리제인 동물용 사료 첨가제.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

상기 아스퍼질러스ㆍ오리제는 아스퍼질러스ㆍ오리제 IK-05074주(FERM BP-10622) 또는 이것과 같은 산성효소를 산생하는 능력을 갖는 상기 균주의 변이주인 동물용 사료 첨가제.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 산성효소는 산성 아밀라아제인 동물용 사료 첨가제.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 균은 동물의 장내 감염증을 야기하는 병원균에 대한 항균활성 및/또는 콕시듐에 대한 살원생동물 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 동물용 사료 첨가제.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 배양물은 식물성 영양원을 포함하는 동물용 사료 첨가제.
제 6 항에 있어서,

상기 식물성 영양원은 현미인 동물용 사료 첨가제.
청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 기재된 동물용 사료 첨가제를 포함하는 사료.
균의 증식을 위한 영양원을 포함하는 고체 배지에서, 아스퍼질러스ㆍ소야, 아스퍼질러스ㆍ타마리, 아스퍼질러스ㆍ포에티더스, 아스퍼질러스ㆍ나이거 및 아스퍼질러스ㆍ오리제로부터 선택되는 적어도 1종의 균을 배양하여, 얻어진 배양물을 사료에 함유시키는 것을 특징으로 하는 사료의 제조방법.