CN102132788B - 水产养殖用橙色粘球菌微生态制剂的制备及应用方法 - Google Patents

水产养殖用橙色粘球菌微生态制剂的制备及应用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了水产养殖用橙色粘球菌微生态制剂的制备及应用方法，（1）取一株橙色粘球菌JCH-04，保藏号为CGMCCNo.2893，菌株在CY培养基上30℃培养3天，在发酵培养基中30℃、180rpm摇瓶培养5天；（2）从斜面挑取一环菌种接种于CY液体培养基中试管30℃培养3天，再将接种于装有发酵培养基试管中30℃培养3天；（3）将步骤（2）的液体菌种接种于装有发酵培养基三角瓶中30℃、180rpm摇瓶培养5天；（4）将步骤（3）的摇瓶培养菌液用0.2μm微滤膜过滤浓缩成500亿CFU/mL菌液，获得的浓缩菌液为微生态制剂。本发明橙色粘球菌微生态制剂可抑制水产品养殖中的病原微生物生长，提高饲料利用率，降低病死率。

Description

水产养殖用橙色粘球菌微生态制剂的制备及应用方法
技术领域
本发明涉及微生态制剂的制备及应用方法，具体涉及一种水产养殖用橙色粘球菌微生态制剂的制备及应用方法。
背景技术
粘细菌作为微生态制剂在水产养殖业方面的应用，其最重要的特性就是粘细菌作为一种捕食性微生物，能够吞噬大肠杆菌及其它一些革兰氏阴性菌，它分泌的胞外活性物质对真菌和细菌具有较强的抗性，因此具有以菌治菌的生物防治作用；粘细菌还能产生消化酶将蛋白质、核酸、酯类等大分子物质分解，有利于饲料消化率的提高；粘细菌及其酶，从菌来说，未发现其有害作用，从酶来说，化学成分是蛋白质，故不会产生对环境的污染和对人体健康的危害。利用粘细菌作为饲料添加剂，将在防病抗病、提高水产品养殖生产力方面发挥巨大的潜能，并有利于绿色环保型水产品的生产。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种水产养殖用橙色粘球菌微生态制剂的制备及应用方法，本发明制备的水产养殖用橙色粘球菌微生态制剂针可抑制水产品养殖中的病原微生物生长，提高饲料利用率，降低病死率。
本发明的技术解决方案是该水产养殖用橙色粘球菌微生态制剂的制备方法包括以下步骤：
（1）菌株提取：取一株橙色粘球菌(Myxococcus fulvus) JCH-04，保藏号为CGMCC No. 2893，菌株在CY培养基上30℃培养3天，在发酵培养基中30℃、180rpm摇瓶培养5天，该菌株16S rDNA的GenBank登录号为FJ826620；所述的CY培养基为：酪素水解蛋白胨3g，酵母膏1g，氯化钙1g，去离子水定溶至1000mL，pH7.4； 发酵培养基为：可溶性淀粉10g ，黄豆粉15g，葡萄糖2.5g，酵母膏0.5g , CaCl2 1g， MgSO4·7H2O 0.5g，去离子水定溶至1000mL，pH 7.4；
（2）菌株活化：从斜面挑取一环菌种接种于CY液体培养基中试管30℃培养3天，再将接种于装有发酵培养基试管中30℃培养3天，接种量为106CFU/mL，反复3次；
（3）菌株扩培：将步骤（2）的液体菌种接种于装有发酵培养基三角瓶中30℃、180rpm摇瓶培养5天，接种量为106CFU/mL；
（4）菌株收集浓缩：在无菌条件下，将步骤（3）的摇瓶培养菌液用0.2μm微滤膜过滤浓缩成500亿CFU/mL菌液，获得的浓缩菌液为微生态制剂。
其中，上述橙色粘球菌微生态制剂的应用方法：采用外喷涂低温烘干添加到饲料中，在水产品养殖饲料中微生态制剂的添加量为107-8CFU/g。
本发明的优点在于：1、提供了橙色粘球菌(Myxococcus fulvus)新菌株JCH-04保藏号为CGMCC No. 2893，该菌株16S rDNA的GenBank登录号为FJ826620，它具有良好的培养特性，其发酵液具有良好的抑菌和多种酶解能力，可作为优良的微生态饲料添加剂用于水产养殖领域；2、一株橙色粘球菌(Myxococcus fulvus) JCH-04易于富集培养，制备发酵工艺操作简单，对其进行毒理试验表明可安全使用于动物饲料中，可有效的抑制水产品养殖病原微生物生长，降低病死率；3、该菌株可产淀粉酶和蛋白酶、脂肪酶，当该菌在动物的肠道存活时，就有可能分泌消化酶，辅助消化，提高饲料的消化率，进而提高饲料利用率；4、在水产品养殖中添加橙色粘球菌微生态制剂于饲料中，提高饲料利用率，所述的水产品养殖中的病原微生物为：大肠杆菌(Escherichia coli)，霍乱弧菌(Vibri cholera)， 次副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)，嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)，铜绿假单胞菌(Pseudomons aeruginosa)，水生黄杆菌(Flavobacterium aquatile)。
具体实施方式
实施例1：菌种筛选与保藏
（1）本菌株是从土壤中分离得到的对病原微生物具有较强抑菌作用的菌株，将菌株培养，得到菌株培养液，观察培养液对水产品养殖中的6种病原微生物抑菌能力，同时测定培养液中的产各种消化酶的能力；
（2）该菌株根据GeneBank比对结果，将其命名为橙色粘球菌JCH-04亚种(Myxococcus fulvus subsp JCH-04）, 保藏号为CGMCC No. 2893，该菌株16S rDNA的GenBank登录号为FJ826620。
实施例2：橙色粘球菌(Myxococcus fulvus) JCH-04对病原微生物抑菌实验
（1）实验用病原微生物指示菌为：大肠杆菌(Escherichia coli)，次副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)，霍乱弧菌(Vibri cholera)，嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)，铜绿假单胞菌(Pseudomons aeruginosa)，水生黄杆菌(Flavobacterium aquatile)；
（2）培养基：营养琼脂培养基（MH )：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，去离子水定溶至1000mL，pH7.2-7.4；培养次副溶血性弧菌MH培养基中加盐量为3%，培养霍乱弧菌MH培养基中pH为8.8，其它不变，同MH培养基；其它指示菌培养用培养基同MH培养基；
（3）实验方法：将指示菌用无菌生理盐水稀释成不同梯度，测定OD600 并涂平板，确定不同细菌最适涂布浓度OD600为0.02-0.03 ，将不同指示菌0.2ml 均匀涂于直径为9cm平板表面，晾干，在平板不同位置等距离放置高温灭菌的牛津杯，再将培养浓缩得到的橙色粘球菌(Myxococcus fulvus) JCH-04菌液，用无菌枪头吸取200μl加于牛津杯，牛津杯直径5mm ，在37℃下培养16-24 小时，观察抑菌圈；抑菌圈直径均大于10mm，说明橙色粘球菌(Myxococcus fulvus) JCH-04对所列6种病原微生物指示菌具有较强的抑菌作用。
实施例3：橙色粘球菌(Myxococcus fulvus) JCH-04安全性试验
将橙色粘球菌(Myxococcus fulvus) JCH-04培养，用生理盐水调节菌液的浓度分别为108、109、1010CFU/mL；试验开始前24h停止投喂，对南美白对虾（体长5cm-6cm/尾），采用注射的方法，剂量为 50μL/尾，每组用虾30尾，以同浓度的副溶血弧菌和生理盐水做对照，每组设6个重复，记录观察7d累计死亡情况；对幼银鲫鱼（体重20g左右/尾），采用灌服的方法，剂量为 0.5mL/尾，每组鱼30尾，以同浓度的嗜水气单胞菌和生理盐水做对照，每组设6个重复，记录观察20d累计死亡情况。
结果表明，注射108、109、1010cfu/mL副溶血弧菌的南美白对虾全部死亡；灌服108、109、1010CFU/mL嗜水气单胞菌的幼银鲫鱼死亡率分别为89.67%、97.67%、100%,将银鲫鱼屠宰取肝和脾脏，做电镜切片观察，肝、脾细胞形态异常，病变特征明显；注射108、109、1010CFU/mL Myxococcus fulvus JCH-04的南美白对虾、灌服108、109、1010CFU/mL Myxococcus fulvusJCH-04的银鲫鱼和空白对照组在试验期间采食和生长均正常，无死亡；将银鲫鱼屠宰取肝和脾脏，做电镜切片观察，肝、脾细胞形态正常，未见病变特征。说明Myxococcus fulvus JCH-04菌株对南美白对虾和银鲫鱼安全无毒，可以作为在水产品养殖中具有安全性和潜在应用价值的外源益生菌使用。
实施例4：微生态制剂的制备
（1）菌株提取：取一株橙色粘球菌(Myxococcus fulvus) JCH-04，保藏号为CGMCC No. 2893，菌株在CY培养基上30℃培养3天，在发酵培养基中30℃、180rpm摇瓶培养5天，该菌株16S rDNA的GenBank登录号为FJ826620；所述的CY培养基为：酪素水解蛋白胨3g，酵母膏1g，氯化钙1g，去离子水定溶至1000mL，pH7.4； 发酵培养基为：可溶性淀粉10g ，黄豆粉15g，葡萄糖2.5g，酵母膏0.5g , CaCl2 1g， MgSO4·7H2O 0.5g，去离子水定溶至1000mL，pH 7.4；
（2）菌株活化：从斜面挑取一环菌种接种于CY液体培养基中试管30℃培养3天，再将接种于装有发酵培养基试管中30℃培养3天，接种量为106CFU/mL，反复3次；
（3）菌株扩培：将步骤（2）的液体菌种接种于装有发酵培养基三角瓶中30℃、180rpm摇瓶培养5天，接种量为106CFU/mL；
（4）菌株收集浓缩：在无菌条件下，将步骤（3）的摇瓶培养菌液用0.2μm微滤膜过滤浓缩成500亿CFU/mL菌液，获得的浓缩菌液为微生态制剂。
实施例5：橙色粘球菌(Myxococcus fulvus) JCH-04产各种消化酶的能力测定
将实施例4中获得的摇瓶悬液，离心分离，测清液中淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶的活性。
测定发酵液中淀粉酶活力为3148 .8U/mL，蛋白酶活力为78.5 U/mL和脂肪酶活力为48.4 U/mL；益生菌能产生胞外酶，分泌到周围环境中，尤其是在动物的肠道中，往往是益生菌发挥营养作用的原因之一；该菌株可以产生淀粉酶和蛋白酶、脂肪酶，因此，当该菌在动物的肠道存活时，就有可能分泌消化酶辅助消化，进而提高饲料的消化率。
实施例6：在水产品养殖饲料中的应用
鲫鱼饲料配方:鱼粉12%，花生粕20%，豆粕15%,膨化大豆粉5%，麸皮15%，棉粕11%，次粉8%，维生素预混料0.6%， 矿物质预混料2%，植物油1.4%。
对虾饲料配方:豆粕30%，鱼粉32%，次粉15%，矿剂0.8%，酵母粉10%，复合维生素0.2%。
菌剂加入方法：将鱼饲料制成直径为5mm 的颗粒料，虾饲料制成直径0.5 mm微粒料，用喷涂机采用外喷涂方法，等菌液浸入到颗粒料内再低温烘干；鱼饲料菌剂加入量为108CFU/g，虾饲料加入量为107CFU/g。
用本发明制备的橙色粘球菌(Myxococcus fulvus) JCH-04微生态制剂添加到水产饲料中，经饲喂实验证明：饲料转化率鱼达到1.84%，虾达到1.90%，成活率鱼达到96.2%，虾达到93.0%，鱼死亡率减低了27.7%，虾死亡率减低了26.5%；对其免疫保护率也有一定的提高；从生长性能的指表反映，菌剂的添加可改善鱼虾生长性能；同时对鱼、虾体内消化酶指标测定表明：菌剂的添加可显著提高鱼和虾淀粉酶活性，对脂肪酶和蛋白酶活性也有一定提高。

Claims (2)

1. 水产养殖用橙色粘球菌微生态制剂的制备方法，其特征在于该制备方法包括以下步骤：
（1）菌株提取：取一株橙色粘球菌JCH-04，保藏号为CGMCC No. 2893，菌株在CY培养基上30℃培养3天，在发酵培养基中30℃、180rpm摇瓶培养5天，该菌株16S rDNA的GenBank登录号为FJ826620；所述的CY培养基为：酪素水解蛋白胨3g，酵母膏1g，氯化钙1g，去离子水定溶至1000mL，pH7.4； 发酵培养基为：可溶性淀粉10g ，黄豆粉15g，葡萄糖2.5g，酵母膏0.5g , CaCl2 1g， MgSO4·7H2O 0.5g，去离子水定溶至1000mL，pH 7.4；
（2）菌株活化：从斜面挑取一环菌种接种于CY液体培养基中试管30℃培养3天，再将接种于装有发酵培养基试管中30℃培养3天，接种量为106CFU/mL，反复3次；
（3）菌株扩培：将步骤（2）的液体菌种接种于装有发酵培养基三角瓶中30℃、180rpm摇瓶培养5天，接种量为106CFU/mL；
（4）菌株收集浓缩：在无菌条件下，将步骤（3）的摇瓶培养菌液用0.2μm微滤膜过滤浓缩成500亿CFU/mL菌液，获得的浓缩菌液为微生态制剂。
2. 水产养殖用橙色粘球菌微生态制剂的应用方法，其特征在于该橙色粘球菌微生态制剂的应用方法是：采用外喷涂低温烘干添加到饲料中，在水产品养殖饲料中微生态制剂的添加量为107-8CFU/g。
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