CN103805542A - 一种用于粘细菌菌体规模制备的液体发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种用于粘细菌菌体规模制备的液体发酵方法。本发明通过粘细菌固体种子的培养、液体培养基发酵培养，菌丝体过滤等工艺环节来获取大量粘细菌菌体。本发明利用简单易行的平板培养基便可培养出生长能力强、浓度高的粘细菌发酵种子，通过液体发酵使产生的粘细菌菌体产量大、得率高，操作简单且价格低廉，可进一步放大到工业规模，可工业化生产粘细菌菌体。
Description
技术领域：
本发明涉及一种通过液体发酵制备粘细菌菌体的工艺方法，具体涉及一种用于粘细菌菌体规模制备的液体发酵方法。
背景技术：
粘细菌（Myxobacteria）是一类可以通过分泌黏液来执行滑行运动的革兰氏阴性杆状细菌。粘细菌在营养贫乏等逆境条件下，其营养细胞聚集成堆，并形成鲜艳的菌体结构；另外，粘细菌具有原核生物稀有的多细胞行为，特别是能形成肉眼可见的菌体结构，在细胞的生长、摄食、运动和分化发育等方面表现出显著的社会性特征，因而粘细菌也常常被认为是具有社会行为的细菌。粘细菌因其能产生丰富而且结构新颖的次级代谢产物而受到广大研究者的关注，自20世纪八十年代以来，从粘细菌中发现了许多结构新颖活性明显的次级代谢产物。根据已分离出来的天然产物统计，大多数来自于堆囊菌属、黏球菌属和软骨霉状菌。特别是从黏球菌代谢产物中分离得到了许多新的大环内酯类、糖肽类等化合物，多具有抗细菌、抗真菌、抗肿瘤等活性。此外，粘细菌产生的胞外酶的种类繁多，如淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶等，可以降解大分子物质为小分子的物质。迄今为止，粘细菌次级代谢产物中已经发现了几百种不同结构的化合物，而且这些化合物结构新颖，因此，粘细菌是具有巨大药物开发潜力的药源菌类群。另外，粘细菌在细胞分化、发育、生物进化研究以及抗生素药物筛选等方面具有重要的实际意义和经济价值，成为专家学者们研究的热点。
相关研究表明，粘细菌多种生物活性代谢产物产生处于细胞生长和发育的中后期，并且随着菌体的发育和成熟会产生大量的活性代谢产物，这些分子所具有的独特的生物活性也越来越引起学者的关注。然而，因粘细菌特殊的生境条件而使其在分离、培养、保藏过程中存在诸多困难，而通过大量发酵研究粘细菌菌体是进一步研究和开发粘细菌次级代谢产物的关键。
粘细菌为典型的好氧有机化能营养菌，研究表明，大多数粘细菌适于在比较贫瘠的培养基上生长，而在常用的细菌培养基上不生长或者生长缓慢。目前粘细菌的发酵多为在固体琼脂培养基上完成固体培养基虽然为粘细菌提供了使其充分生长的氧气，但是对菌体生长需要的营养成分却容易耗尽，也限制了大量粘细菌菌体的形成，而且工作量太大且不利于工业化生产。
经过文献和专利搜索，对于上述不足和相关技术方法目前未见具体报道。
发明内容：
本发明的主要目的是针对上述规模制备粘细菌菌体发酵过程中技术和方法的不足，提供一种用于粘细菌菌体规模制备的液体发酵方法。本发明的用于粘细菌菌体规模制备的液体发酵方法可以有效克服目前生产工艺上的不足，使产生的粘细菌菌体产量大、得率高，操作简单且价格低廉，可进一步放大到工业规模，可工业化生产粘细菌菌体。
本发明的用于粘细菌菌体规模制备的液体发酵方法，包括以下步骤：
（4）、粘细菌一级斜面种子的制备：取匣状粘球菌Pyxidicoccus fallax接种于固体斜面培养基上，24～30℃培养6～11天，得到粘细菌一级斜面种子。固体斜面培养基的成分为：酵母5.0～15g/L，CaCl2·5H2O0.6～1.0g/L，琼脂15～20g/L，PH7.0～7.4；
（5）、粘细菌二级平板种子的制备：取上述粘细菌一级斜面种子，挑取菌株子实体接种于平板培养基，24～30℃培养5～11天，得到粘细菌二级平板种子。平板培养基成分为：酵母5.0～15g/L，CaCl2·2H2O0.6～1.0g/L，琼脂15～20g/L，PH7.0～7.4；
（6）、粘细菌菌体的液体发酵：取上述粘细菌二级平板种子，接种于发酵容器内的液体培养基中，24～30℃，120～140转/分摇床培养8～20天，得到粘细菌发酵液。液体培养基成分为：可溶性淀粉6.0～12.0g/L，豆粉2.0～5.0g/L，葡萄糖2.0～5.0g/L，酵母提取物3.0～6.0g/L，细菌学蛋白胨3.0～8.0g/L，CaCl2·2H2O0.5～2.0g/L，MgSO4·7H2O0.5～2.0g/L，pH7.0～7.4。
（7）、菌体的分离：过滤上述粘细菌发酵液，待粘细菌发酵液滤干后即得粘细菌菌体。
优选，步骤（3）中所述的发酵容器为可操作性强的三角瓶。
优选，步骤（3）中所述的液体培养基的pH在灭菌前用KOH和/或HCl调整。
步骤（4）中所述的过滤粘细菌发酵液，优选使用漏斗过滤粘细菌发酵液，将纱布或脱脂棉塞进漏斗口作为过滤粘细菌菌体的介质，待培养液滤干后即得粘细菌菌体。将粘细菌发酵液过滤一次即可。
本发明的用于粘细菌菌体规模制备的液体发酵方法，利用简单易行的平板培养基便可培养出生长能力强、浓度高的粘细菌发酵种子，通过液体发酵使产生的粘细菌菌体产量大、得率高，操作简单且价格低廉，可进一步放大到工业规模，可工业化生产粘细菌菌体。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
所用菌株：一株匣状粘球菌Pyxidicoccus fallax。该菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GIM3.140。
（1）、粘细菌一级斜面种子的制备：取匣状粘球菌Pyxidicoccus fallax接种于固体斜面培养基上，24℃培养6天，得到粘细菌一级斜面种子。
1升固体斜面培养基的制备方法为：酵母5.0g/L，CaCl2·5H2O0.6g/L，琼脂15g/L，PH7.0，加水定容至1升，高压灭菌。
（2）、粘细菌二级平板种子的制备：取上述粘细菌一级斜面种子，挑取适量菌株子实体接种于平板培养基，24℃培养5天，得到粘细菌二级平板种子。
1升平板培养基的制备方法为：酵母5.0g/L，CaCl2·2H2O0.6g/L，琼脂15g/L，PH7.0，加水定容至1升，高压灭菌；
（3）、粘细菌菌体的液体发酵：取上述粘细菌二级平板种子，接种于发酵容器内的液体培养基中，24℃，120转/分摇床培养8天，得到粘细菌发酵液。
液体培养基的制备方法为：可溶性淀粉6.0g/L，豆粉2.0g/L，葡萄糖2.0g/L，酵母提取物3.0g/L，细菌学蛋白胨3.0g/L，CaCl2·2H2O0.5g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，用KOH/或和HCL调节pH7.0，加水定容至1升，高压灭菌。
（4）、菌体的分离：使用漏斗过滤粘细菌发酵液，将少许纱布塞进漏斗口作为过滤粘细菌菌体的介质，待培养液滤干后即得粘细菌菌体。
所得到的粘细菌菌体湿重约51.0g/L。
实施例2：
所用菌株：一株匣状粘球菌Pyxidicoccus fallax。该菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GIM3.140。
（1）、粘细菌一级斜面种子的制备：取匣状粘球菌Pyxidicoccus fallax接种于固体斜面培养基上，26℃培养8天，得到粘细菌一级斜面种子。
1升固体斜面培养基的制备方法为：酵母5.0g/L，CaCl2·5H2O0.8g/L，琼脂15g/L，PH7.2，加水定容至1升，高压灭菌；
（3）、粘细菌二级平板种子的制备：取上述粘细菌一级斜面种子，挑取适量菌株子实体接种于平板培养基，26℃培养6天，得到粘细菌二级平板种子。
1升平板培养基的制备方法为：酵母10.0g/L，CaCl2·2H2O0.8g/L，琼脂15g/L，PH7.2，加水定容至1升，高压灭菌；
（3）、粘细菌菌体的液体发酵：取上述粘细菌二级平板种子，接种于发酵容器内的液体培养基中，26℃，130转/分摇床培养10天，得到粘细菌发酵液。
液体培养基的制备方法为：可溶性淀粉9.0g/L，豆粉2.0g/L，葡萄糖3.0g/L，酵母提取物3.0g/L，细菌学蛋白胨4.0g/L，CaCl2·2H2O1.0g/L，MgSO4·7H2O0.8g/L，用KOH和/或HCL调节pH7.2，加水定容至1升，高压灭菌。
（5）、菌体的分离：使用漏斗过滤粘细菌发酵液，将少许脱脂棉塞进漏斗口作为过滤粘细菌菌体的介质，待培养液滤干后即得粘细菌菌体。
所得到的粘细菌菌体湿重约51.0g/L。
实施例3：
所用菌株：一株匣状粘球菌Pyxidicoccus fallax。该菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GIM3.140。
（1）、粘细菌一级斜面种子的制备：取匣状粘球菌Pyxidicoccus fallax接种于固体斜面培养基上，30℃培养11天，得到粘细菌一级斜面种子。
1升固体斜面培养基的制备方法为：酵母15g/L，CaCl2·5H2O1.0g/L，琼脂20g/L，PH7.4，加水定容至1升，高压灭菌；
（4）、粘细菌二级平板种子的制备：取上述粘细菌一级斜面种子，挑取适量菌株子实体接种于平板培养基，30℃培养11天，得到粘细菌二级平板种子。
1升平板培养基的制备方法为：酵母15g/L，CaCl2·2H2O1.0g/L，琼脂20g/L，PH7.4，加水定容至1升，高压灭菌；
（3）、粘细菌菌体的液体发酵：取上述粘细菌二级平板种子，接种于发酵容器内的液体培养基中，30℃，140转/分摇床培养20天，得到粘细菌发酵液。
液体培养基的制备方法为：可溶性淀粉12.0g/L，豆粉5.0g/L，葡萄糖5.0g/L，酵母提取物6.0g/L，细菌学蛋白胨8.0g/L，CaCl2·2H2O2.0g/L，MgSO4·7H2O2.0g/L，用KOH/或和HCL调节pH7.4，加水定容至1升，高压灭菌。
（6）、菌体的分离：使用漏斗过滤粘细菌发酵液，将少许纱布塞进漏斗口作为过滤粘细菌菌体的介质，待培养液滤干后即得粘细菌菌体。
所得到的粘细菌菌体湿重约51.0g/L。
Claims (4)
1.一种用于粘细菌菌体规模制备的液体发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）、粘细菌一级斜面种子的制备：取匣状粘球菌Pyxidicoccus fallax接种于固体斜面培养基上，24～30℃培养6～11天，得到粘细菌一级斜面种子；固体斜面培养基的成分为：酵母5.0～15g/L，CaCl2·5H2O0.6～1.0g/L，琼脂15～20g/L，PH7.0～7.4；
（2）、粘细菌二级平板种子的制备：取上述粘细菌一级斜面种子，挑取菌株子实体接种于平板培养基，24～30℃培养5～11天，得到粘细菌二级平板种子；平板培养基成分为：酵母5.0～15g/L，CaCl2·2H2O0.6～1.0g/L，琼脂15～20g/L，PH7.0～7.4；
（3）、粘细菌菌体的液体发酵：取上述粘细菌二级平板种子，接种于发酵容器内的液体培养基中，24～30℃，120～140转/分摇床培养8～20天，得到粘细菌发酵液；液体培养基成分为：可溶性淀粉6.0～12.0g/L，豆粉2.0～5.0g/L，葡萄糖2.0～5.0g/L，酵母提取物3.0～6.0g/L，细菌学蛋白胨3.0～8.0g/L，CaCl2·2H2O0.5～2.0g/L，MgSO4·7H2O0.5～2.0g/L，pH7.0～7.4。
（4）、菌体的分离：过滤上述粘细菌发酵液，待粘细菌发酵液滤干后即得粘细菌菌体。
2.根据权利要求1所述的用于粘细菌菌体规模制备的液体发酵方法，其特征在于，步骤（3）中所述的发酵容器为可操作性强的三角瓶。
3.根据权利要求1所述的用于粘细菌菌体规模制备的液体发酵方法，其特征在于，步骤（3）中所述的液体培养基的pH在灭菌前用KOH和/或HCl调整。
4.根据权利要求1所述的用于粘细菌菌体规模制备的液体发酵方法，其特征在于，步骤（4）中所述的过滤粘细菌发酵液，具体为使用漏斗过滤粘细菌发酵液，将纱布或脱脂棉塞进漏斗口作为过滤粘细菌菌体的介质，待培养液滤干后即得粘细菌菌体。
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| CN102132788B (zh) * | 2011-03-22 | 2012-11-21 | 淮阴工学院 | 水产养殖用橙色粘球菌微生态制剂的制备及应用方法 |
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2014
- 2014-01-23 CN CN201410032549.9A patent/CN103805542B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102132788B (zh) * | 2011-03-22 | 2012-11-21 | 淮阴工学院 | 水产养殖用橙色粘球菌微生态制剂的制备及应用方法 |
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| Title |
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