CN102911871B - 一种应用于发酵大生产的菌种保存方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种菌种保存方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤1：将固体斜面培养基上生长成熟的菌种中灭菌洗脱液洗脱制成菌悬液；步骤2：过滤菌悬液去除培养基；步骤3：过滤后的菌悬液进行冷冻管分装；步骤4：将分装后装有菌悬液的菌种置于-78℃-82℃下超低温保存。采用上述技术方案，本发明所述的菌种保存方法，具有显著优点如下：该方法能实现菌种无需屡次传代，保证菌种性状稳定，不易变异；并能够缩小贮存空间，确保菌种保存环境安全可靠；减少或避免杂菌污染。有利于提高生产效率和质量。

Description

一种应用于发酵大生产的菌种保存方法

技术领域

本发明涉及菌种保存方法，特别涉及一种应用于发酵大生产的菌种保存方法。 

背景技术

实验室和工厂菌种室对菌种常用的保藏法是斜面低温保藏法，即将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2-8℃的冰箱中保藏，其优点是操作简单，使用方便，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等；但是其缺点是容易变异，因为培养基与菌种同时处在2-8℃保存条件下，菌种仍会缓慢利用培养基残留成分而缓慢生长，影响微生物的性状；其次因菌种屡次传代会使微生物的代谢改变，进而影响微生物的性状；再次因菌种在固体斜面培养基上涂布生长的差异影响发酵生产批水平的不稳定差异，同时贮存空间大，器皿保管困难；污染杂菌的机会较多。 

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提供一种应用于发酵大生产的菌种保存方法，该方法能实现菌种无需屡次传，保证菌种性状稳定，不易变异；并能够缩小贮存空间，确保菌种保存环境安全可靠；减少或避免杂菌污染。尤其因其可直接复制性的使用于发酵大生产，无需进行菌种孢子的二次扩培，避免了因菌种制备的因素对发酵生产批水平稳定性的影响，有利于提高生产效率和质量。 

为达到上述目的，本发明所提出的技术方案为：一种应用于发酵大生产的菌种保存方法，其特征在于：包括如下步骤： 

步骤1：将固体斜面培养基上生长成熟的菌种中灭菌洗脱液洗脱制成菌悬液；

步骤2：过滤菌悬液去除培养基； 

步骤3：过滤后的菌悬液进行冷冻管分装；

步骤4：将分装后装有菌悬液的菌种置于-78℃—-82℃下超低温保存。

进一步，所述的斜面培养基的组分及其重量配比为：麸皮 3.2－3.5%，硫酸镁 0.004－0.006%，磷酸氢二铵 0.01－0.02%，磷酸氢二钾 0.008－0.012%，酵母膏 0.5-1.0%，葡萄糖 1.0-2.0%，琼脂 1.0－2.0%，其余为无菌水。 

进一步，所述的菌种为金霉素产生菌、盐霉素产生菌、泰乐菌素产生菌。 

进一步，所述的灭菌洗脱液为灭菌甘油。 

进一步，步骤2中所述的过滤为采用双层无菌纱布过滤。 

优选的，所述的灭菌甘油为质量分数为20-25%的灭菌甘油。 

进一步，所述的冷冻管体积为1-60mL。 

优选的，所述的冷冻管为PV材质。 

采用上述技术方案，本发明所述的菌种保存方法，具有显著优点如下：一是采用该发明保存方法，去除了培养基，避免了菌种在保存期内有生长的营养条件，稳定了菌种的性状；二是采用该发明保存方法，对菌种采用了20-25%的灭菌甘油作为保护剂保护，在确保菌种在保存期内的存活稳定性同时也确保了菌种的性状；三是采用该发明保存方法，大大缩小了菌种的贮存空间，同时因其采用PV材质冷冻管保存，不易造成破碎，使菌种保存安全可靠；四是采用该发明保存方法实现了每支分装菌种的一次性使用，减少或避免发生杂菌污染尤其是交叉污染。五是采用该发明保存方法实现了菌种直接复制性的使用于发酵大生产，无需进行菌种孢子的二次扩培，避免了因菌种制备的因素对发酵生产批水平稳定性的影响。采用上述菌种保存方法对其主菌种和工作菌种进行保存，主菌种在10年的保存期内及工作菌种在180天的保存期内能达到保持性状稳定、生产水平稳定的效果。 

具体实施方式

下面结合具体实施方式，对本发明做进一步说明。 

实施例1 金霉素产生菌菌种的保存方法

步骤1：将固体斜面培养基上生长成熟的菌种中灭菌洗脱液洗脱制成菌悬液；斜面培养基的组成成分为麸皮 32g，硫酸镁 0.04g，磷酸氢二铵 0.1g，磷酸氢二钾 0.08g，酵母膏 5g，葡萄糖 10g，琼脂 10g，无菌水定容至1L；灭菌洗脱液为20%灭菌甘油。 

步骤2：过滤菌悬液去除培养基，过滤采用双层无菌纱布过滤； 

步骤3：过滤后的菌悬液进行1ml冷冻管分装；

步骤4：将分装后装有菌悬液的菌种置于-78℃下超低温保存。

实施例2 金霉素产生菌菌种的保存方法

步骤1：将固体斜面培养基上生长成熟的菌种中灭菌洗脱液洗脱制成菌悬液；斜面培养基的组成成分为麸皮 35g，硫酸镁 0.06g，磷酸氢二铵 0.2g，磷酸氢二钾 0.12g，酵母膏 10g，葡萄糖 20g，琼脂 20g，无菌水定容至1L；灭菌洗脱液为25%灭菌甘油。 

步骤2：过滤菌悬液去除培养基，过滤采用双层无菌纱布过滤； 

步骤3：过滤后的菌悬液进行60ml冷冻管分装；

步骤4：将分装后装有菌悬液的菌种置于-82℃下超低温保存。

实施例3 金霉素产生菌菌种的保存方法

步骤1：将固体斜面培养基上生长成熟的菌种中灭菌洗脱液洗脱制成菌悬液；斜面培养基的组成成分为麸皮 33.5g，硫酸镁 0.05g，磷酸氢二铵 0.15g，磷酸氢二钾 0.10g，酵母膏 7.5g，葡萄糖 15g，琼脂 15g，无菌水定容至1L；灭菌洗脱液为23%灭菌甘油。 

步骤2：过滤菌悬液去除培养基，过滤采用双层无菌纱布过滤； 

步骤3：过滤后的菌悬液进行30ml冷冻管分装；

步骤4：将分装后装有菌悬液的菌种置于-80℃下超低温保存。

实施例4-9菌种的保存方法见下表

表1

 

实施例10 实施例1-9所保存菌种的孢子存活率及活性测定

在冷冻前测定保存菌种的活孢子浓度，然后在主菌种保存1、3、5、7、10年时和工作菌种保存1、3、6个月时，分别取实施例1-9所保存的菌种进行活孢子浓度测定、计算保存后的孢子存活率及菌种发酵后的发酵水平和发酵得率的测定。

结果见表2-9，主菌种在保存十年后，各菌种的孢子存活率高达85%以上，且保持性状稳定、生产水平稳定。工作菌种保存6个月后各菌种的孢子存活率95%以上，且保持性状稳定、生产水平稳定。说明本发明所述的菌种保存方法切实有效，且利于生产。 

表2 主菌种保存1年后各菌种的孢子存活率及活性测定 

表3 主菌种保存3年后各菌种的孢子存活率及活性测定

表4 主菌种保存5年后各菌种的孢子存活率及活性测定

表5 主菌种保存7年后各菌种的孢子存活率及活性测定

表6 主菌种保存10年后各菌种的孢子存活率及活性测定

表7 工作菌种保存1个月后各菌种的孢子存活率及活性测定

表8 工作菌种保存3个月后各菌种的孢子存活率及活性测定

表9 工作菌种保存6个月后各菌种的孢子存活率及活性测定

尽管结合优选实施方案具体展示和介绍了本发明，但所属领域的技术人员应该明白，在不脱离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围内，在形式上和细节上对本发明做出各种变化，均为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种菌种保存方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤1：将固体斜面培养基上生长成熟的菌种用灭菌洗脱液洗脱制成菌悬液；

步骤2：过滤菌悬液去除培养基； 

步骤3：过滤后的菌悬液进行冷冻管分装；

步骤4：将分装后装有菌悬液的菌种置于-78℃—-82℃下超低温保存；

所述的灭菌洗脱液为灭菌甘油；所述的灭菌甘油为质量分数为20-25%的灭菌甘油；所述的菌种为金霉素产生菌、盐霉素产生菌、泰乐菌素产生菌；

所述的斜面培养基的组分及其重量配比为：麸皮 3.2－3.5%，硫酸镁 0.004－0.006%，磷酸氢二铵 0.01－0.02%，磷酸氢二钾 0.008－0.012%，酵母膏 0.5-1.0%，葡萄糖 1.0-2.0%，琼脂 1.0－2.0%，其余为无菌水。

2.根据权利要求1所述的一种菌种保存方法，其特征在于：所述的过滤采用双层无菌纱布过滤。

3.根据权利要求1所述的一种菌种保存方法，其特征在于：所述的冷冻管体积为1-60mL。

4.根据权利要求3所述的一种菌种保存方法，其特征在于：所述的冷冻管为PV材质。