CN103865802B - 一种提高高雄山虫草子实体产量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高高雄山虫草子实体产量的方法，包括：用PDA培养基活化茭白黑粉菌GZUIFR-DX091菌株，将活化好后菌种用接种环挑取3环接入茭白黑粉菌发酵培养基，置于28℃，160r/min下培养5d后，将培养液于5000r/min离心5min，取上清液，得到茭白黑粉菌UIFR-DX091菌株的发酵液；高雄山虫草感染家蚕，待家蚕感染变硬并开始产子实体时备用；将培养容器预先消毒，然后将灭菌处理的吸水纸单层或双层平铺在容器底部；将制备好的茭白黑粉菌GZUIFR-DX091菌株的发酵液缓缓加入容器底部的吸水纸上，将已感染的家蚕，放入已添加了茭白发酵液的容器中，在20-23℃温度下进行12h见光培养，在暗培养阶段可降低培养温度5℃培养。培养过程中，若添加的发酵液变干，需及时补充；在培养3-4周时即可收获。本发明能大幅提高高雄山虫草子实体产量。

Description

一种提高高雄山虫草子实体产量的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体来说涉及一种提高高雄山虫草子实体产量的方法。
背景技术
CordycepstakaomontanaYakush.&Kumaz.1941（=Isariatenuipespeck（1879）=IsariajaponicaYasuda（1915）=Paecilomycestenuipes(Peck)Samson（1974）=Paecilomycesjaponica）是一种优良的虫草资源，研究发现它在抗癌、抗抑郁、抗虫、抗菌、抗病毒及调节免疫力等方面有明显作用。特别是近年发现，它的一种抗癌成分乙酰环氧单端孢烯二醇（4β–acetoxyscirpene-3α,15–diol＝AETD）的抗癌活性大约比目前用于临床癌症病患者治疗用的顺铂强4-6倍。药理试验表明高雄山虫草对小鼠毒性口服剂量LD_(50)为70g/kg；腹腔注射LD_(50)为17.6±1.78g/kg，毒性较低（陈祝安和徐珊，1989）。另外，该菌的小鼠急性毒性和大鼠亚急性毒性实验显示其毒性低，安全范围大（吴真列等，1995）。因此，高雄山虫草无论作为药物开发还是作为保健品应用都具有广阔前景。在韩国，高雄山虫草已经应用于食品及保健品中。而利用家蚕培养虫草是当前规模化生产虫草子实体，用于功能食品的主要方法之一。提高虫草子实体产量是人工培养中重点关注的问题，目前利用家蚕培养虫草子实体时，提高虫草子实体产量，主要关注的是如何提高对家蚕的感染率进而提高产子实体率（出草率）来达到提高虫草子实体的产量，而忽视了成功感染家蚕后，在子实体发育过程中对其增产的方法，这就导致虫草子实体产量普遍不高。
发明内容
本发明的目的在于克服上述问题而提供的一种能大幅提高高雄山虫草子实体产量的提高高雄山虫草子实体产量的方法。
一种提高高雄山虫草子实体产量的方法，包括以下步骤：
（1）茭白黑粉菌UstilagoesculentaHennGZUIFR-DX091菌株发酵液的制备
用PDA培养基活化茭白黑粉菌GZUIFR-DX091菌株，将活化好后菌种用接种环挑取3环接入茭白黑粉菌发酵培养基，置于28℃，160r/min下培养5d后，将培养液于5000r/min离心5min，取上清液，即得到茭白黑粉菌GZUIFR-DX091菌株的发酵液；
（2）高雄山虫草感染家蚕后的增产培养
a、高雄山虫草感染家蚕：以使用注射法来完成对家蚕的感染为例，具体步骤如下：①菌丝段生产，②将生产获得的浓度在105~107/mL的菌丝段，按照50~100μL/头的剂量注射入家幼虫或蚕蛹的体内，③20-23℃下培养，④待家蚕感染变硬并开始产子实体时备用；
b、将培养容器预先消毒，然后将灭菌处理的吸水纸单层或双层平铺在容器底部；将制备好的茭白黑粉菌GZUIFR-DX091菌株的发酵液缓缓加入容器底部的吸水纸上，以吸水纸完全浸湿，但倾斜时没有明显的液体流出为宜；
c、将已感染的家蚕，放入已添加了茭白发酵液的容器中，置于人工气候箱中，在20-23℃温度下进行12h见光培养，在暗培养阶段可降低培养温度5℃培养。培养过程中，若添加的发酵液变干，需及时补充；在培养3-4周时即可收获。
上述的提高高雄山虫草子实体产量的方法，其中：第（1）步中发酵培养基为马铃薯200g煮沸30min滤汁，加入葡萄糖20g，加水至1000ml，121°C，灭菌25min。
上述的提高高雄山虫草子实体产量的方法，其中：茭白黑粉菌GZUIFR-DX091(UstilagoesculentaHenn.GZUIFR-DX091)菌株（菌株保存号为：CCTCCNo：M2011216；于2011年6月26日在中国典型培养物保藏中心保藏，地址：中国武汉武汉大学）。
上述的提高高雄山虫草子实体产量的方法，其中：高雄山虫草GZUIFR-PT211(CordycepstakaomontanaYakush.&Kumaz.GZUIFR-PT211)菌株（属于粪壳菌纲、肉座菌目、麦角菌科、虫草属，于2011年6月26日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号：CCTCCNo：M2011217，地址：中国武汉武汉大学）。
本发明与现有技术相比，具有明显的有益效果，从以上技术方案可知：本发明培养容器预先消毒，且保湿培养时发酵液不可加入过多，以浸湿倾斜时不成股流水为好，另外培养容器应适当透气。本发明着眼于成功感染后子实体的培养阶段，在家蚕被虫草菌感染变硬后，再在子实体培养过程中添加特定真菌发酵液来提高子实体产量，其效果明显，在虫草的人工培养中有良好的应用前景。
具体实施方式
实施例1
一种提高高雄山虫草子实体产量的方法，包括以下步骤：
（1）茭白黑粉菌GZUIFR-DX091发酵液的制备
用PDA培养基活化茭白黑粉菌GZUIFR-DX091菌株，将活化好的菌种用接种环挑取3环接入装有茭白黑粉菌发酵培养基（马铃薯200g煮沸30min滤汁，加入葡萄糖20g，加水至1000ml，121°C，灭菌25min）的250ml三角瓶中，装液量为50ml，置于28℃，160r/min下培养5d后，将培养液于5000r/min离心5min，取上清液，即得到茭白黑粉菌GZUIFR-DX091菌株的发酵液；
（2）高雄山虫草感染家蚕后的增产培养
a、高雄山虫草GZUIFR-PT211菌株感染家蚕：以使用注射法来完成对家蚕的感染为例，具体步骤如下：①菌丝段生产，②将生产获得的浓度在105~107/mL的菌丝段，按照50~100μL/头的剂量注射入家蚕幼虫或蚕蛹的体内，③20-23℃下培养，④待家蚕感染变硬并开始产子实体时备用；
b、将培养容器预先消毒，然后将灭菌处理的吸水纸单层或双层平铺在容器底部；将制备好的茭白黑粉菌GZUIFR-DX091菌株的发酵液缓缓加入容器底部的吸水纸上，以吸水纸完全浸湿，但倾斜时没有明显的液体流出为宜；
c、将已感染的家蚕，每组30头，放入已添加了茭白发酵液的容器中，置于人工气候箱中，在20-23℃温度下进行12h见光培养，在暗培养阶段可降低培养温度5℃培养。培养过程中，若添加的发酵液变干，需及时补充；在培养3-4周时即可收获。
将对照组（用无菌水，不用茭白黑粉菌发酵液）与实验组的子实体收集后，分别称量鲜重和干重，所得数据如表1，由表1可知添加茭白发酵液可以使鲜品产量提高39%，干品产量提高53%。
表1添加茭白发酵液培养与对照组子实体产量的比较
实施例1（茭白黑粉菌发酵液） 对照组（无菌水）
子实体鲜重 14.801 g/组 10.653 g/组
子实体干重 4.275 g/组 2.801 g/组
以上实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种提高高雄山虫草子实体产量的方法，包括以下步骤：
（1）茭白黑粉菌GZUIFR-DX091菌株发酵液的制备
用PDA培养基活化茭白黑粉菌GZUIFR-DX091，保藏号为：CCTCCNo：M2011216，将活化好后菌种用接种环挑取3环接入茭白黑粉菌发酵培养基，置于28℃，160r/min下培养5d后，将培养液于5000r/min离心5min，取上清液，即得到茭白黑粉菌GZUIFR-DX091菌株的发酵液；
（2）高雄山虫草感染家蚕后的增产培养
a、高雄山虫草GZUIFR-PT211，保藏号：CCTCCNo：M2011217，感染家蚕：待家蚕感染变硬并开始产子实体时备用；
b、将培养容器预先消毒，然后将灭菌处理的吸水纸单层或双层平铺在容器底部；将制备好的茭白黑粉菌GZUIFR-DX091菌株的发酵液缓缓加入容器底部的吸水纸上，以吸水纸完全浸湿，但倾斜时没有明显的液体流出为宜；
c、将已感染的家蚕，放入已添加了茭白黑粉菌发酵液的容器中，置于人工气候箱中，在20-23℃温度下进行12h见光培养，在暗培养阶段降低培养温度5℃培养，
培养过程中，若添加的发酵液变干，需及时补充；在培养3-4周时即可收获。
2.如权利要求1所述的提高高雄山虫草子实体产量的方法，其中：第（1）步中发酵培养基为马铃薯200g煮沸30min滤汁，加入葡萄糖20g，加水至1000ml，121°C，灭菌25min。
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家蚕蛹体表预处理对高雄山虫草感染效果的影响;梁建东等;《山地农业生物学报》;20131231;第32卷(第4期);307-309 *

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