CN102267833A

CN102267833A - 松乳菇菌丝深层发酵培养基及其应用

Info

Publication number: CN102267833A
Application number: CN2010101899312A
Authority: CN
Inventors: 李益; 王慧明
Original assignee: Hunan Minkang Biological Technology Institute
Current assignee: Hunan Xiangnong Animal Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2010-06-02
Filing date: 2010-06-02
Publication date: 2011-12-07
Anticipated expiration: 2030-06-02
Also published as: CN102267833B

Abstract

本发明涉及到一种培养液，具体是松乳菇菌丝深层发酵的一种培养基。同时，本发明还涉及利用该培养基培养松乳菇后所获得的产物的应用。所述松乳菇菌培养基，在普通培养基的基础上，加入一种或多种中草药，尤其是多糖类中草药。本发明对松乳菇菌丝深层发酵培养基进行改进优化，通过在发酵液体培养液中添加中药材进行深层发酵，提高菌丝及胞内多糖产量，同时改善多糖成份，增强多糖的药理活性。本发明筛选出的添加中药材来源广，产量高、价格低，为大规模地生产高活性松乳菇多糖提供技术和物质保障。

Description

松乳菇菌丝深层发酵培养基及其应用

技术领域：

本发明涉及到一种培养液，具体是松乳菇菌丝深层发酵的一种培养基。同时，本发明还涉及利用该培养基培养松乳菇后所获得的产物的应用。

背景技术

液体深层发酵是食(药)用菌菌丝培养的一种常用方法。它是将菌种接种于发酵罐或锥形瓶的培养液中，在自动控制理化调节下，通过不断同期搅拌或振荡，使菌种在液体深层处快速繁殖的方法。在液体深层培养中，菌丝细胞能在反应器内处于最适宜的温度、酸碱度、氧气和碳氮比等环境中生长，呼吸作用所产生的代谢废气又能及时排放，因此新陈代谢旺盛，菌丝生长分裂迅速，能在短时间内产生大量的菌丝体。液体深层发酵是获取大量松乳菇多糖的有效途径。与其它发酵研究一样，食用菌的发酵培养基包括碳源、氮源、无机盐、生长因子等，国内学者对松乳菇的发酵条件与工艺进行了研究，但结果很不一致。多数研究表明松乳菇菌丝在以葡萄糖、蔗糖、糊精、甘露醇等为碳源、以玉米浆、牛肉膏、硝酸铵等为氮源的培养基上生长好，矿质盐MgSO₄和NaCl使菌丝启动加快，磷酸二氢钾使菌丝产量提高；VB1、VB6、烟酸对菌丝的生长有促进作用，适宜的培养温度25～27℃，pH6～7.5。目前常用松乳菇基础培养基成分为：玉米浆1.5％，硝酸铵0.15％，羧甲基纤维素钠0.4％，葡萄糖1.5％，PH6.5。

以上研究为松乳菇的开发利用提供了基础，但目前液体深层发酵技术得到的松乳菇菌丝量少，多糖的分离纯化技术不成熟，多糖得率很低。

发明内容

本发明对松乳菇菌丝深层发酵培养基进行改进优化，通过在发酵液体培养液中添加中药材进行深层发酵，提高菌丝及胞内多糖产量，同时改善多糖成份，增强多糖的药理活性。

本发明提供的松乳菇菌培养基是在基础培养基的基础上，加入一种或多种中草药。

上述中药材中优选白术、甘草、天花粉、大枣、玉竹、麦冬、党参、粉葛、百合、当归、淮山。

根据本发明的实施例，更优选麦冬、淮山、大枣、玉竹。

本发明根据生物体生物酶作用机制和产物的累积作用，在普通培养基中添加中药材，提高松乳菇菌丝及其多糖的生物产量，并改善多糖成份，增强药理活性。经对添加14种中草药的初筛试验表明，培养基添加多糖类中药材可促进松乳菇菌丝生长，提高多糖产量。进而挑选麦冬、淮山、大枣三种促进作用强的中药材进行重复试验，再次发现菌丝生长量及多糖含量均显著高于基础培养基的产量；同时经组分分析发现添加这三种中药材菌丝多糖组分明显改变，经抗菌和抗病毒的药理试验证明药理作用增强。

中药材最好以均浆的形式加入，以扩大中草药与松乳菇菌丝的接触面积，产生的菌丝体或菌丝体中多糖的含量与加入中草药的量成正比。但是，加入到液体培养基中中草药的比例有一定的限制，量过多，则培养液容易成团或凝固，不利于菌丝充分发酵。对于麦冬、淮山、大枣优选其占培养基的重量体积浓度为0.5-5％，更优选2-3％。

本发明的优点和积极效果：

本发明从中药材中筛选出14种富含糖类的中草材，添加到松乳菇发酵液中，能提高松乳菇菌丝及其胞内多糖的产量，并增强其多糖的药理(抑菌等)活性。

本发明所选择的中药材本身富含多糖，松乳菇菌丝在生长过程中可能对这些多糖直接吸收利用或通过修饰改造后整合到松乳菇菌丝胞内多糖的组分中，使得松乳菇菌丝胞内多糖含量从26％提高到48.5％；

本发明使松乳菇多糖的药理功能也发生相应的改变。如原松乳菇胞内多糖对大肠杆菌、沙门氏菌、链球菌和巴氏杆菌的MIC分别为25mg/ml、12.5mg/ml、3.175mg/ml、25mg/ml，添加了麦冬、淮山和大枣所得到的菌丝胞内多糖对四种细菌的MIC除了对链球菌有所提高或相同外，其余均有所降低，表明通过添加中草药，可以提高松乳菇菌丝胞内多糖的抗菌能力。经鸡胚鸡新城疫病毒和鸡法氏囊病毒感染抑制试验证明：添加麦冬、淮山或大枣发酵的松乳菇多糖与未添加中药发酵的松乳菇多糖比，显著提高感染鸡胚的存活时间，且有约30％的鸡胚存活。这种药效提高可能是松乳菇菌丝体一方面同化吸纳了中药中的药理活性成分，即药效叠加；另一方面菌丝体异化作用对中药成份进行修饰，将非活性多糖成分改造成活性成份，将低活性成份改造成高活性成份。

本发明筛选出的添加中药材来源广，产量高、价格低，为大规模地生产高活性松乳菇多糖提供技术和物质保障。本发明利用富含糖类的中药材添加发酵松乳菇，既提高了松乳菇菌丝多糖的含量，也提高了松乳菇菌丝多糖的药理活性。

具体实施方式

本发明中，按照加入物质的形态来区分百分比，本发明培养基是液态，一般来说加入是干物质，百分比即重量/体积；加入的是液体物质，百分比即体积/体积。

实例1：中药发酵对松乳菇菌丝生长及胞内多糖产量的影响

1材料

松乳菇菌种：由湖南民康生物技术研究所保存。

普通培养基：玉米浆1.5％，硝酸铵0.15％，羧甲基纤维素钠0.4％，葡萄糖1.5％，蒸馏水定容至100ml，pH6.5真菌发酵液体培养基各组分都是用百分比表示，参见朱戎，陈向东，兰进“药用真菌液体发酵研究进展”

中草药：购自湖南养天和大药房，将中草药洗净，干燥箱内60℃烘干，粉碎后放入匀浆机匀浆，最后经冷冻干燥机干燥，备用。

中草药改良培养基：中草药2％，玉米浆1％，硝酸铵0.15％，羧甲基纤维素钠0.4％，葡萄糖1.5％，蒸馏水定容至100ml，PH6.5

2方法

将斜面培养基上的菌种接种于固体培养基进行一次活化，然后挑选2cm大小长势好的圆形菌丝块接入装有普通培养基的三角瓶中，于恒温培养摇床上(转速120rpm)28℃培养5d得普通培养基，再将普通培养基按15％的接种量接入中草药改良培养基中，按前述条件培养5d，每天观察菌丝生长情况并记录。5d后将发酵液抽滤，所得菌丝干燥称重，粉碎过60目筛，超声提取后测量多糖含量。比较添加不同单味中草药的发酵液中菌丝干重以及多糖含量，以此探讨添加中草药对松乳菇菌丝生长及其胞内多糖含量的影响。

松乳菇菌丝胞内多糖超声提取：松乳菇菌丝干燥后粉碎过60目筛，料液比1∶2500，超声功率400W，一次超声9s，间隔3s，超声30min。吸取超声提取液1ml至100ml容量瓶中，加水至100ml，摇匀，测多糖含量。

3结果

表1：添加14种中草药的发酵液菌丝生长情况

由表1可知，第一天只有添加了大枣、麦冬、粉葛和淮山的发酵液中有少量菌丝生长，其中添加麦冬、粉葛和淮山的发酵液较添加大枣的发酵液清亮，其余发酵液均浑浊。到第二天，所有添加了中草药的发酵液都有菌丝生长，第一天四瓶较清亮的发酵液清亮程度降低，而其中添加了百合和白术的发酵液清亮程度增高，其余不变。第三天，添加百合和白术的发酵液清亮程度降低，前两天浑浊的发酵液浑浊程度加深。第四天，六瓶较清亮的发酵液变得浑浊。第五天，所有发酵液均变得浑浊。以上所述表明在发酵液中添加一定量的中草药，不会抑制松乳菇菌丝生长。由于匀浆后的中草药溶解性不同，导致添加不同中草药的发酵液清亮程度不同，菌丝生长初期可能由于对中草药某些成分的吸收利用，使得发酵液清亮程度升高，随着菌丝生长增多，发酵液变得浑浊。

表2：添加14种中草药的发酵液菌丝干重和菌丝多糖含量

由表2可知，添加甘草的发酵液所得菌丝干重最大，为1.9403g/100ml，但其多糖含量较低，仅为28.4％；添加白术、大枣、玉竹、麦冬和淮山的发酵液所得菌丝多糖含量较高，其中添加麦冬的发酵液所得菌丝多糖含量最大，为48.5％，多糖重量达到0.7738g，其他依次为淮山40.5％，白术37.2％，玉竹36.3％和大枣35.4％，多糖重量分别达到0.6545g，0.6702g，0.6637g和0.5903g。表明添加中草药后，松乳菇菌丝生长量和多糖含量发生了变化。

发酵过程的关键是培养基的配制或组成，一种优良培养基应具备：目的物产出率高，产生目的物的菌丝体生长快，发酵周期短，培养基成本低，来源广，目的物的后处理工艺简单，得率高。综合各方面因素，选出大枣、麦冬、淮山进行以下的试验。

实例2添加不同浓度的大枣、麦冬、淮山的发酵液对菌丝干重和菌丝多糖含量的影响

1材料

松乳菇菌种：由湖南民康生物技术研究所保存。

普通培养基：玉米浆1.5％，硝酸铵0.15％，羧甲基纤维素钠0.4％，葡萄糖1.5％，蒸馏水定容至100ml，PH6.5

大枣、麦冬、淮山：购自湖南养天和大药房，洗净，干燥箱内60℃烘干，粉碎后放入匀浆机匀浆，最后经冷冻干燥机干燥，备用。

2方法

将斜面培养基上的菌种接种于固体培养基进行一次活化，然后挑选2cm大小长势好的圆形菌丝块接入装有普通培养基的三角瓶中，于恒温培养摇床上(转速120rpm)28℃培养5d得普通液，再将普通培养基按15％的接种量接入添加了中草药改良培养基中，其中中药材的种类和含量按下表一所述加入，按前述条件培养5d，每天观察菌丝生长情况并记录。5d后将发酵液抽滤，所得菌丝干燥称重，粉碎过60目筛，超声提取后测量多糖含量。比较添加不同剂量大枣、麦冬、淮山发酵液中所得菌丝干重以及多糖含量，以此探讨加入普通培养基中三种药物的的浓度对松乳菇菌丝生长及其胞内多糖含量的影响。

3结果

表3：不同浓度中药材对松乳菇菌丝干重的影响(g/100ml)

表4：不同浓度中药材对松乳菇多糖含量的影响

根据上表选出大枣、麦冬、淮山最适比例为2-3％，选用添加2％的大枣、麦冬、淮山发酵培养液进行以下的试验。

实例3：大枣、麦冬、淮山发酵所得松乳菇多糖体外抑菌试验

1材料

(1)菌种

大肠杆菌 C44103 购自湖南农业大学微生物实验室

链球菌 O1026 购自湖南农业大学微生物实验室

沙门氏菌购自湖南农业大学微生物实验室

巴氏杆菌购自湖南农业大学微生物实验室

(2)松乳菇多糖按本发明方法制备

添加大枣发酵所得松乳菇多糖自制

添加麦冬发酵所得松乳菇多糖自制

添加淮山发酵所得松乳菇多糖自制

2方法

(1)菌液制备

所用菌株使用前将保存菌种先接种平板，于37℃培养24h后，挑选典型菌落接种于肉汤中，再经37℃肉汤培养18h后，将菌液稀释至10⁵～10⁶个菌/ml备用。

(2)活菌计数

将制备菌液用生理盐水进行10倍梯度稀释。然后选取适当浓度的0.1ml菌液置于平皿琼脂培养基上，2～3个平皿共用1支无菌的接种环或玻璃棒，轻轻将菌液推开，将平皿置37℃恒温培养，先使平皿盖部分打开，使液体蒸发避免细菌繁殖在平皿培养基上成片。经培养18～20小时后，计算菌落数目。挑选平皿上生长30～300个菌落作为计数，将2～3个平皿均数进行计算，根据菌液稀释浓度计算每毫升菌液的活菌数。

(3)最小抑菌浓度(MIC)的测定

采用微量稀释法。经消毒的聚苯乙烯微孔板上的各孔中，用微量可调移液器依次加入用培养基倍比稀释的松乳菇多糖溶液(经中草药发酵后所得)，每孔0.1ml，使得各孔中多糖终浓度分别为50mg/ml、25mg/ml、12.5mg/ml、6.25mg/ml、3.175mg/ml、1.563mg/ml，最后一孔加普通松乳菇多糖(未经中草药发酵所得)为细菌生长对照孔，然后在每孔中加入稀释菌液0.01ml，另外留一列孔不加细菌(仅加培养基和经中草药发酵所得多糖溶液)作药液对照孔。微孔板加盖并用胶纸密封，置于振荡器上振荡1min，使孔内溶液充分混匀后，放在铺有湿纱布的方形搪瓷盘中，于37℃温箱中孵育18h，眼观无细菌生长孔所含最低药物浓度即为最小抑菌浓度。

3结果

表5：松乳菇菌丝多糖的MIC测定结果

由表5可知，在本试验条件下，松乳菇菌丝多糖对四种菌均有抑菌作用，原松乳菇菌丝多糖(对照组)对大肠杆菌、链球菌、沙门氏菌、巴氏杆菌的MIC分别为25mg/ml、3.175mg/ml、12.5mg/ml、25mg/ml，对链球菌的MIC最小，说明效果最好；添加了麦冬、淮山和大枣所得松乳菇多糖与未经过中草药发酵所得的多糖相比，对四种菌的MIC发生了变化，除了对链球菌的MIC升高及相同外，其余均比原菌丝胞内多糖的MIC要小，添加麦冬、淮山和大枣所得松乳菇菌丝多糖对沙门氏菌、链球菌及巴氏杆菌的MIC小，效果好，都为3.175mg/ml。说明往发酵液中添加中草药，有增强菌丝胞内多糖抑菌能力的效果。

实例4：大枣、麦冬、淮山发酵所得松乳菇多糖在鸡胚中对病毒的抑制试验

1材料

(1)毒种：新城疫病毒(IBDV)强毒株由广东温氏惠赠

法氏囊病毒(NDV)强毒株由云南省畜牧兽医研究所惠赠。

(2)鸡胚：普通鸡胚从种鸡场购买种蛋自孵至9-11日龄，经琼脂扩散试验检测对病毒呈阴性。

(3)松乳菇多糖按本发明方法制备

添加大枣发酵所得松乳菇多糖

添加麦冬发酵所得松乳菇多糖

添加淮山发酵所得松乳菇多糖

2方法

(1)病毒的增殖及最小致死量测定

将新城疫病毒液和法氏囊病毒液作50倍稀释接种于10日龄普通鸡胚，每枚鸡胚0.1ml，收取致死胚的尿囊液，加双抗分装冰冻保存，将病毒液作连续10稀释，从10^-1～10^-10为止，每个稀释度经尿囊腔接种5枚鸡胚，每枚0.1ml，经10小时间隔照蛋。弃去24h内死亡鸡胚，观察至120h，记录各胚死亡时间，使所有胚都发生死亡的最高稀释度为该病毒的鸡胚最小致死量(MLD)。

将待检病毒液用生理盐水作1∶5稀释，再于大孔塑料滴定板上中进行梯度稀释，直至1∶2560，每孔0.25毫升，最后1孔只加生理盐水作为对照。随即向各孔内加入0.25毫升的1％鸡红细胞悬液，充分混匀，于室温放置45分钟后判定结果。红细胞凝集程度以++++、+++、++、+和-表示。最后一孔的红细胞应无凝集现象。

(2)松乳菇菌丝多糖，添加大枣、麦冬、淮山发酵所得松乳菇多糖对鸡胚的毒性试验

将3种浓度100mg/ml、50mg/ml、25mg/ml的松乳菇菌丝多糖、添加大枣、麦冬、淮山发酵所得松乳菇多糖接种到9-11日龄的鸡胚尿囊腔，每种浓度接20枚种蛋，接种0.1ml/枚，设对照组10枚，接种等量的生理盐水。接药后每隔12h照蛋，记录死亡时间，直到144h结束，最后根据存活鸡胚数判定对鸡胚的毒性，找到无毒性最大浓度，该浓度即为对鸡胚的最大安全浓度。

(3)添加大枣、麦冬、淮山发酵所得松乳菇多糖在鸡胚中对病毒的抑制试验

(3.1)添加大枣、麦冬、淮山发酵所得松乳菇多糖在鸡胚中抑制法氏囊病毒试验：

120枚鸡胚，分成6组，每组20枚，分为1、2、3、4组，分别接50倍稀释法氏囊病毒冻存原液和等剂量添加大枣发酵所得松乳菇多糖溶液、麦冬发酵所得松乳菇多糖溶液、淮山发酵所得松乳菇多糖溶液、无添加松乳菇多糖溶液，0.2ml/枚；第5组，接种50倍稀释的法氏囊病毒0.2ml/枚，对照组第6组接种生理盐水对照，0.2ml/枚，记录鸡胚的平均死亡时间MDT，并测定血凝价。

(3.2)添加大枣、麦冬、淮山发酵所得松乳菇多糖在鸡胚中抑制新城疫病毒试验：(处理同上)

3结果

(1)病毒效价

新城疫强毒株接种后2天内鸡胚死亡。取尿囊液，用制备好的0.5％--1％红细胞悬进行凝集试验。经检测：病毒的血凝价为2⁸～2¹⁰，最小致死量浓度为10^-3。

法氏囊病毒处理同上，经检测，病毒的血凝价为2⁶～2⁸，，最小致死量浓度为10^-2。

(2)多糖毒性试验结果

接种松乳菌多糖和添加大枣、麦冬、淮山发酵所得松乳菇多糖最大浓度100mg/ml的鸡胚均发育正常，144h后，血管明显，证明松乳菇多糖和添加大枣、麦冬、淮山发酵所得松乳菇多糖对鸡胚无毒，以50mg/ml作为实验浓度。

(3.1)添加大枣、麦冬、淮山发酵所得松乳菇多糖在鸡胚中抑制法氏囊病毒试验

鸡胚接种法氏囊病毒(阳性对照组)72小时内全部死亡，组织病变：四肢皮肤或趾关节有充血和出血点，也有的绒毛尿囊膜轻度增厚并混浊，头部和腹部皮下水肿，多数鸡胚发育缓慢。肝肿大，淡黄色，有形状不同的坏死点脾肿大，并有坏死点。肾肿大，充血。心肌色淡。接种试验结果如下表

表6：添加大枣、麦冬、淮山发酵所得松乳菇多糖抑制法氏囊病毒试验(鸡胚死亡数：个)

“-”表示胚体全部死亡

从表6中可以得出，松乳菇多糖和法氏囊病毒混合液，平均死亡时间比阳性对照明显增长，尿囊液血凝效价明显降低，说明松乳菇多糖对法氏囊病毒有一定的抑制作用，减缓了鸡胚的死亡，但是对病毒不能起到杀灭作用，鸡胚最终全部死亡。添加大枣、麦冬、淮山发酵所得松乳菇多糖和法氏囊病毒混合液，平均死亡时间比未添加中草药松乳菇多糖明显增长，尿囊液血凝效价降低明显，鸡胚有存活，说明添加大枣、麦冬、淮山发酵所得松乳菇多糖能抑制法氏囊病毒，且能杀灭病毒，其中以麦冬作用最佳。

(3.2)添加大枣、麦冬、淮山发酵所得松乳菇多糖在鸡胚中抑制新城疫病毒试验

鸡胚在接种新城疫病毒(阳性对照组)后48h内死亡，死亡鸡胚全身严重出血、水肿，呈透明状，肝脏有坏死和出血点。接种试验结果如下表

表7：添加大枣、麦冬、淮山发酵所得松乳菇多糖抑制新城疫病毒试验(鸡胚死亡数：个)

	大枣	麦冬	淮山	无添加组	5(阳性对照)	6(生理盐水对照)
							1(d)	0	0	0	2	20	0
2(d)	1	1	2	5	-	0
							3(d)	2	3	8	10	-	0
4(d)	9	6	10	3	-	0
							5(d)	5	9	-	-	-	0
存活胚数	3	1	-	-	-	20
							MDT	4.05	3.47	3.4	2.7	1
尿囊液血凝效价	2⁵～2⁸	2⁵～2⁸	2⁵～2⁸	2⁶～2⁹	2⁸～2¹⁰

“-”表示无存活胚

从表7中可以得出，松乳菇多糖和新城疫病毒混合液与阳性对照相比，平均死亡时间明显增长，尿囊液HA值明显降低，说明松乳菇多糖对新城疫病毒有一定的抑制作用，减缓了鸡胚的死亡，但是对病毒不能起到杀灭作用，鸡胚最终全部死亡。添加大枣、麦冬、淮山发酵所得松乳菇多糖和法氏囊病毒混合液，平均死亡时间比未添加中草药松乳菇多糖更长，尿囊液血凝效价更低，降低了病毒的毒力，鸡胚有存活，说明添加大枣、麦冬、淮山发酵所得松乳菇多糖能抑制法氏囊病毒，且能杀灭病毒，其中以大枣作用最佳。

Claims

1.松乳菇菌培养基，在普通培养基的基础上，加入一种或多种中草药，尤其是多糖类中草药。

2.根据权利要求1所述的松乳菇培养基，其特征在于上述中药材选自白术、甘草、天花粉、大枣、玉竹、麦冬、党参、粉葛、百合、当归、淮山中的一种或多种。

3.根据权利要求2所述的松乳菇培养基，其特征在于中药材选自麦冬、淮山、大枣、玉竹中的一种或多种。

4.根据权利要求3所述的松乳菇培养基，其特征在于中药材麦冬、淮山或大枣在培养基中的重量体积百分浓度为0.5-5％。

5.根据权利要求4所述的松乳菇培养基，其特征在于药材麦冬、淮山或大枣在培养基中的重量体积百分浓度为2-3％。

6.一种松乳菇菌丝体制备方法，其特征在于采用权利要求1-5所述的培养基。

7.一种松乳菇菌丝体中提取的多糖，其特征是采用权利要求6的方法制备松乳菇菌丝体。

8.权利要求7所述的松乳菇菌丝体中提取的多糖在制备抗菌兽药中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所说的抗菌兽药，为抗沙门氏菌、链球菌及巴氏杆菌的兽药。

10.权利要求7所述的松乳菇菌丝体中提取的多糖在制备抗病毒药物中的应用，其中所述的病毒是新城疫病毒和鸡法氏囊病毒。