CN104388338A - 一种复合菌制剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的是提供一种复合菌制剂及其应用，即来源于对虾消化道的地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的复合菌株制剂，上述菌株组合使用可增强对虾细胞和体液的免疫水平，特别是提高对虾抗病毒感染能力。本发明的复合菌制剂，包括有地衣芽孢杆菌LV005菌株、短小芽孢杆菌LV012菌株和枯草芽孢杆菌LV023菌株。本发明的复合菌制剂包含的菌株均筛选自对虾消化道，具有改善对虾消化道优势菌群的组成和数量，形成并维持良好的消化道微生态平衡，通过营养竞争、空间竞争或分泌细菌素等抵御病毒在消化道的黏附和增殖；通过提高对虾溶菌酶、过氧化氢酶等相关免疫酶活性，增强对虾非特异免疫功能，减少病毒感染的机会。
Description
技术领域
本发明属于益生菌筛选制备技术领域，具体涉及一种复合菌制剂及其应用。
背景技术
人类面临人口、资源、环境三大问题，开发利用海洋已成为沿海各国的国家战略。随着海洋捕捞资源的急剧衰减，海水养殖已成为国际社会为满足人类日益增长的蛋白质需求普遍采纳的主要举措。发展可持续的水产养殖已成为世界共同关注的主题，水产养殖产品作为高品质蛋白来源已得到国际社会的广泛认同和肯定。作为世界水产品生产大国，中国水产养殖总产量占全世界总产量的70％以上，连续多年居世界首位，对外贸易占农产品出口净收入的50％以上，出口额连续多年居大宗农产品首位。
近年来，病害问题已成为限制海水养殖业持续发展的重要因素，造成了重大的经济损失，而且逐年攀升。每年养殖对虾、鱼类的病害造成了百亿元以上的经济损失，而盲目使用药物等造成了养殖环境恶化和沿海环境污染。残留药物不仅威胁国民健康，也严重影响水产品的出口创汇。人们逐渐开始从生态平衡的角度制定新的水产健康养殖方案，益生菌的使用就是其中重要的措施之一。
水产养殖动物肠道不仅是饲料消化和营养吸收的场所，也是动物机体免疫防御的关键部位。改善动物肠道微生物的群落结构对于提高饲料营养价值和利用效率，增强动物抗病力意义重大。有益微生物水产养殖动物肠道中的作用效果包括：形成有益微生物屏障、增加饲料的消化和利用、分泌抗菌素、刺激和活化免疫系统、与病原微生物的生存竞争等。但目前对虾养殖生产中应用的芽孢杆菌菌株较少，且存在着菌种生物学性状平平，活菌数量偏低，作用效果不稳定等不足，特别是还没有抗对虾病毒病菌株的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种复合菌制剂及其应用，即来源于对虾消化道的地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的复合菌株制剂，上述菌株组合使用可增强对虾细胞和体液的免疫水平，特别是提高对虾抗病毒感染能力。
本发明的复合菌制剂，包括有地衣芽孢杆菌(Bacillus lincheniformis)LV005菌株、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)LV012菌株和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)LV023菌株。
地衣芽孢杆菌(Bacillus lincheniformis)LV005菌株于2013年6月16日在武汉的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCC M 2013262。
短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)LV012菌株于2013年6月16日在武汉的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCC M 2013263。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)LV023菌株于2013年6月16日在武汉的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCC M 2013264。
其中混合菌液中，活菌总浓度≥109CFU/mL；且地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌优选为1：1：1。
本发明的复合菌制剂，是将地衣芽孢杆菌LV005发酵菌液、短小芽孢杆菌LV012发酵菌液、枯草芽孢杆菌LV023发酵菌液混合后制备的。
其中地衣芽孢杆菌LV005发酵菌液制备方法如下：从-80℃保存的菌种挑取少量划线于2216E固体培养基，在37℃培养24h获得单菌落，取一单菌落接种于2216E培养液中，37℃摇瓶培养24h获得种子液，再把种子液接种于地衣芽孢杆菌发酵液中发酵培养，发酵温度控制在37℃；当发酵液OD600值达到1.5～1.7时，终止发酵，获得发酵菌液；发酵液中地衣芽孢杆菌LV005活菌浓度≥109CFU/mL。
地衣芽孢杆菌LV005的发酵液成分质量百分比为：蛋白胨，1.5％；酵母粉，0.4％；蔗糖，1.0％；氯化钠，2.5％；磷酸高铁，0.001％；硫酸镁，0.02％；硫酸锰，0.05％。
短小芽孢杆菌LV012发酵菌液制备方法如下：从-80℃保存的菌种挑取少量划线于2216E固体培养基，在37℃培养24h获得单菌落，取一单菌落接种于2216E培养液中，37℃摇瓶培养24h获得种子液，再把种子液接种于地衣芽孢杆菌发酵液中发酵培养，发酵温度控制在37℃；当发酵液OD600值达到1.2～1.4时，终止发酵，获得发酵菌液；发酵液中短小芽孢杆菌LV012活菌浓度≥109CFU/mL。
短小芽孢杆菌LV012的发酵液成分质量百分比为：蛋白胨，0.5％；酵母粉，0.1％；蔗糖，1.5％；氯化钠，2.5％；硫酸铁，0.05％；硫酸镁，0.004％；硫酸锰，0.01％。
枯草芽孢杆菌LV023发酵菌液制备方法如下：从-80℃保存的菌种挑取少量划线于2216E固体培养基，在37℃培养24h获得单菌落，取一单菌落接种于2216E培养液中，37℃摇瓶培养24h获得种子液，再把种子液接种于地衣芽孢杆菌发酵液中发酵培养，发酵温度控制在28℃；当发酵液OD600值达到1.2～1.4时，终止发酵，获得发酵菌液；发酵液中枯草芽孢杆菌LV023活菌浓度≥109CFU/mL。
枯草芽孢杆菌LV023的发酵液成分质量百分比为：蛋白胨，1.0％；酵母粉，0.2％；蔗糖，1.0％；氯化钠，3.0％；硫酸铁，0.001％；硫酸镁，0.005％。
本发明的复合菌制剂用于制备对虾饲料添加剂或是免疫增强剂。
本发明的复合菌制剂包含的菌株均筛选自对虾消化道，具有改善对虾消化道优势菌群的组成和数量，形成并维持良好的消化道微生态平衡，通过营养竞争、空间竞争或分泌细菌素等抵御病毒在消化道的黏附和增殖；通过提高对虾溶菌酶、过氧化氢酶、酚氧化酶、磷酸酶、超氧化物歧化酶等相关免疫酶活性，增强对虾非特异免疫功能，减少病毒感染的机会；激活对虾酚氧化酶原、超氧化物歧化酶、溶菌酶、热休克蛋白、脂多糖-葡聚糖结合蛋白、信号传导及转录激活因子等与抗病原感染相关分子的表达，减缓病毒在对虾体内的增值速率；提高对虾蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活性，促进对虾消化能力和饲料养分的消化，提高对虾抗应激反应能力等多种生物学功能。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细的描述
实施例1：地衣芽孢杆菌的筛选
本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus lincheniformis)LV0005菌株筛选自凡纳滨对虾消化道。将采集的健康对虾样品放在盛有海水的充气袋中运回实验室。无菌操作台上用75％的酒精擦拭活虾体表进行消毒，无菌操作将活虾解剖，取出对虾肠道组织。将取出的肠道组织用无菌的PBS(pH＝7.0)缓冲液冲洗3-4次后，用无菌研磨棒研磨均匀。之后用无菌PBS缓冲液适当稀释，取0.1ml涂布于2216E固体培养基上，倒置于28℃恒温培养箱中培养16h-20h。观察2216E平板上细菌的菌落形态，对菌落形态一致的细菌进行编号，无菌条件下用接种环挑取优势菌单菌落接种于2216E海水固体培养基中进行反复纯化培养。纯化后的单菌落接种于2216E海水液体培养基，在转速为180rpm/min，28℃振荡培养箱中培养16h-20h，取0.8ml菌悬液放入保种管中，再加入0.2ml的70％灭菌甘油，混匀，用封口膜封好，放于-80℃冰箱保存。
纯化的菌株活化培养后稀释至105～107CFU/ml，注射健康凡纳滨对虾，每个梯度为一组，每组3个平行，每个平行10尾，用于考察该菌株的对养殖对虾的安全性。在此基础上通过对虾养殖实验和病原感染实验，综合考察该菌株提高对虾免疫水平和抗病原感染能力的效果，与对照组对虾比较达到显著性差异的初步结果后，该菌株作为抗病候选菌株，并进行下一步生理生化特性分析和16sRNA分子特性鉴定。
地衣芽孢杆菌在2216E培养基上的菌落形态：菌落直径约2-3mm，菌落呈圆形，白色、半透明，表面光滑湿润、有凸起且边缘整齐，菌落黏稠不易挑起，培养时间延长菌落中间会塌进去形成中间扁平四周高的形状。
碳源利用情况为：β-甲基-D-葡萄糖苷、D－阿糖醇、腺苷、D-丙氨酸、松二糖、L-乳酸、L-丙氨酸、麦芽三糖、木糖醇、L-丙氨酰-甘氨酸、N-乙酰-L谷氨酸、D-蜜三糖/棉子糖、D-木糖、琥珀酸单甲基酯、α-甲基-D-半乳糖苷、D-甘露糖、L-鼠李糖、丙酮酸甲酯、5'-磷酸腺苷、D-半乳糖、D-松三糖、γ-羟丁酸、3-甲基-D-葡萄糖、2,3-丁二醇、6-磷酸-D-葡萄糖、苦杏仁苷在Biolog中碳源消耗中呈现阳性。
其它生理生化特性：淀粉水解阳性，明胶液化阳性，氧化酶试验阳性，过氧化氢酶试验阳性。
将制得的100mL地衣芽孢杆菌LV005溶液与10Kg基础对虾饲料原料(含鱼粉30％、虾粉10％、豆粉25％、花生粉25％、面粉3％、玉米粉3％、复合维生素1％)混合，制成含地衣芽孢杆菌LV005的免疫饲料。各种原料分别粉碎过60目筛，准确称重后逐级充分混匀，以褐藻酸钠作为粘合剂，加适量水用小型绞肉机挤压制成颗粒饲料，在40℃条件下烘干至水分含量10％以下，分袋包装，于4℃冰箱中保存备用。
健康凡纳滨对虾300余尾，实验对虾初始平均体长为6.3cm，随机为实验组和对照组2个处理组，每个处理组有3个平行，每个平行组养殖对虾50尾。实验组连续4天投喂免疫饲料，3天投喂基础饲料，7天一个循环，直至实验结束。对照组在整个实验阶段一直投喂基础饲料。水温24-26℃，连续充气；每日换水1次，日换水量为1/3；每日投喂饲料4次，日投饵量约为1.2-1.4克/10尾，投喂1h后吸去剩余饲料，并根据残饵的多少调节投饵量。免疫饲料养殖21天后，进行白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus，WSSV)人工注射感染实验。感染前1天停止投喂饲料，次日每尾对虾在第2腹节处注射50μL WSSV粗提液(浓度为0.16g/mL)，以PBS溶液为阴性对照组。攻毒后各组继续投喂相应饲料，每天及时捡出死虾，记录死亡数量，14d后结束感染实验。实验组和对照组每日平均累计死亡率结果见下表，实验结果显示在感染5d内，实验组与对照组累积死亡率为差异不显著(P>0.05)；从第6d始各组均呈明显的上升趋势，对照组累积死亡率较实验组差异显著(P<0.05)；至感染实验结束前1天对照组的累积死亡率为100％，实验组的累积死亡率为75％。
实施例2：短小芽孢杆菌的筛选
本发明的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)LV012菌株筛选自凡纳滨对虾消化道。将采集的健康对虾样品放在盛有海水的充气袋中运回实验室。无菌操作台上用75％的酒精擦拭活虾体表进行消毒，无菌操作将活虾解剖，取出对虾肠道组织。将取出的肠道组织用无菌的PBS(pH＝7.0)缓冲液冲洗3-4次后，用无菌研磨棒研磨均匀。之后用无菌PBS缓冲液适当稀释，取0.1ml涂布于2216E固体培养基上，倒置于28℃恒温培养箱中培养16h-20h。观察2216E平板上细菌的菌落形态，对菌落形态一致的细菌进行编号，无菌条件下用接种环挑取优势菌单菌落接种于2216E海水固体培养基中进行反复纯化培养。纯化后的单菌落接种于2216E海水液体培养基，在转速为180rpm/min，28℃振荡培养箱中培养16h-20h，取0.8ml菌悬液放入保种管中，再加入0.2ml的70％灭菌甘油，混匀，用封口膜封好，放于-80℃冰箱保存。
筛选的短小芽孢杆菌在2216E培养基上的菌落形态：菌落直径约1-2mm，菌落呈圆形，乳白色、不透明，表面呈蜡状，有凸起且边缘整齐。
碳源利用情况为α-环式糊精、β-甲基-D-葡萄糖苷、D－阿糖醇、腺苷、D-丙氨酸、2'-脱氧腺苷、β-环式糊精、松二糖、L-丙氨酸、麦芽三糖、D-阿洛酮糖、木糖醇、D-苹果酸、D-甘露醇、D-蜜三糖/棉子糖、D-木糖、L-天门冬酰胺、琥珀酸单甲基酯、D-甘露糖、L-鼠李糖、丙酮酸甲酯、5'-磷酸腺苷、D-半乳糖、D-松三糖、吐温80、龙胆二糖、γ-羟丁酸、p-羟基苯乙酸、β-甲基-D-半乳糖苷、α-酮戊二酸、2,3-丁二醇、6-磷酸-D-葡萄糖、苦杏仁苷在Biolog碳源消耗中呈现阳性。
其它生理生化特性：淀粉水解呈阴性，明胶液化阴性，氧化酶试验阳性，过氧化氢酶试验阳性。
短小芽孢杆菌LV012菌株可用于制备短小芽孢杆菌LV012发酵菌液。
短小芽孢杆菌LV012发酵菌液制备方法如下：从-80℃保存的菌种挑取少量划线于2216E固体培养基，在37℃培养24h获得单菌落，取一单菌落接种于2216E培养液中，37℃摇瓶培养24h获得种子液，再把种子液接种于地衣芽孢杆菌发酵液中发酵培养，发酵温度控制在37℃；当发酵液OD600值达到1.2～1.4时，终止发酵，获得发酵菌液；发酵液中短小芽孢杆菌LV012活菌浓度≥109CFU/mL。
短小芽孢杆菌LV012的发酵液成分质量百分比为：蛋白胨，0.5％；酵母粉，0.1％；蔗糖，1.5％；氯化钠，2.5％；硫酸铁，0.05％；硫酸镁，0.004％；硫酸锰，0.01％。
将制得的100mL短小芽孢杆菌LV012溶液与10Kg基础对虾饲料原料(含鱼粉30％、虾粉10％、豆粉25％、花生粉25％、面粉3％、玉米粉3％、复合维生素1％)混合，制成含短小芽孢杆菌LV012的免疫饲料。各种原料分别粉碎过60目筛，准确称重后逐级充分混匀，以褐藻酸钠作为粘合剂，加适量水用小型绞肉机挤压制成颗粒饲料，在40℃条件下烘干至水分含量10％以下，分袋包装，于4℃冰箱中保存备用。
健康凡纳滨对虾300余尾，实验对虾初始平均体长为6.3cm，随机为实验组和对照组2个处理组，每个处理组有3个平行，每个平行组养殖对虾50尾。实验组连续4天投喂免疫饲料，3天投喂基础饲料，7天一个循环，直至实验结束。对照组在整个实验阶段一直投喂基础饲料。水温24-26℃，连续充气；每日换水1次，日换水量为1/3；每日投喂饲料4次，日投饵量约为1.2-1.4克/10尾，投喂1h后吸去剩余饲料，并根据残饵的多少调节投饵量。免疫饲料养殖21天后，进行白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus，WSSV)人工注射感染实验。感染前1天停止投喂饲料，次日每尾对虾在第2腹节处注射50μL WSSV粗提液(浓度为0.16g/mL)，以PBS溶液为阴性对照组。攻毒后各组继续投喂相应饲料，每天及时捡出死虾，记录死亡数量，14d后结束感染实验。实验组和对照组每日平均累计死亡率结果见下表，实验结果显示在感染4d内，实验组与对照组累积死亡率为差异不显著(P>0.05)；从第5d始各组均呈明显的上升趋势，对照组累积死亡率较实验组差异显著(P<0.05)；至感染实验结束前1天对照组的累积死亡率为100％，实验组的累积死亡率为63.3％。
实施例3枯草芽孢杆菌的筛选
本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)LV023菌株筛选自凡纳滨对虾消化道。将采集的健康对虾样品放在盛有海水的充气袋中运回实验室。无菌操作台上用75％的酒精擦拭活虾体表进行消毒，无菌操作将活虾解剖，取出对虾肠道组织。将取出的肠道组织用无菌的PBS(pH＝7.0)缓冲液冲洗3-4次后，用无菌研磨棒研磨均匀。之后用无菌PBS缓冲液适当稀释，取0.1ml涂布于2216E固体培养基上，倒置于28℃恒温培养箱中培养16h-20h。观察2216E平板上细菌的菌落形态，对菌落形态一致的细菌进行编号，无菌条件下用接种环挑取优势菌单菌落接种于2216E海水固体培养基中进行反复纯化培养。纯化后的单菌落接种于2216E海水液体培养基，在转速为180rpm/min，28℃振荡培养箱中培养16h-20h，取0.8ml菌悬液放入保种管中，再加入0.2ml的70％灭菌甘油，混匀，用封口膜封好，放于-80℃冰箱保存。
枯草芽孢杆菌在2216E培养基上的菌落形态：菌落直径约2-3mm，菌落呈圆形，白色、扁平、表面粗糙干燥，边缘不整齐。
碳源利用情况为L-阿拉伯糖、α-D-乳糖、α-环式糊精、D－阿糖醇、D-丙氨酸、2'-脱氧腺苷、β-环式糊精、麦芽三糖、D-阿洛酮糖、D-苹果酸、琥珀酸单甲基酯D-甘露糖、L-鼠李糖、5'-磷酸腺苷、D-半乳糖、α-羟丁酸、龙胆二糖、水苏(四)糖、D-L-α-磷酸甘油在Biolog中的碳源消耗中都呈现阳性结果。
其它生理生化特性：淀粉水解阳性，明胶液化阳性，氧化酶试验阳性，过氧化氢酶试验阳性。
枯草芽孢杆菌LV023菌株可用于制备枯草芽孢杆菌LV023发酵菌液。
枯草芽孢杆菌LV023发酵菌液制备方法如下：从-80℃保存的菌种挑取少量划线于2216E固体培养基，在37℃培养24h获得单菌落，取一单菌落接种于2216E培养液中，37℃摇瓶培养24h获得种子液，再把种子液接种于地衣芽孢杆菌发酵液中发酵培养，发酵温度控制在28℃；当发酵液OD600值达到1.2～1.4时，终止发酵，获得发酵菌液；发酵液中枯草芽孢杆菌LV023活菌浓度≥109CFU/mL。
枯草芽孢杆菌LV023的发酵液成分质量百分比为：蛋白胨，1.0％；酵母粉，0.2％；蔗糖，1.0％；氯化钠，3.0％；硫酸铁，0.001％；硫酸镁，0.005％。
将制得的100mL枯草芽孢杆菌LV023溶液与10Kg基础对虾饲料原料(含鱼粉30％、虾粉10％、豆粉25％、花生粉25％、面粉3％、玉米粉3％、复合维生素1％)混合，制成含枯草芽孢杆菌LV023的免疫饲料。各种原料分别粉碎过60目筛，准确称重后逐级充分混匀，以褐藻酸钠作为粘合剂，加适量水用小型绞肉机挤压制成颗粒饲料，在40℃条件下烘干至水分含量10％以下，分袋包装，于4℃冰箱中保存备用。
健康凡纳滨对虾300余尾，实验对虾初始平均体长为6.3cm，随机为实验组和对照组2个处理组，每个处理组有3个平行，每个平行组养殖对虾50尾。实验组连续4天投喂免疫饲料，3天投喂基础饲料，7天一个循环，直至实验结束。对照组在整个实验阶段一直投喂基础饲料。水温24-26℃，连续充气；每日换水1次，日换水量为1/3；每日投喂饲料4次，日投饵量约为1.2-1.4克/10尾，投喂1h后吸去剩余饲料，并根据残饵的多少调节投饵量。免疫饲料养殖21天后，进行白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus，WSSV)人工注射感染实验。感染前1天停止投喂饲料，次日每尾对虾在第2腹节处注射50μL WSSV粗提液(浓度为0.16g/mL)，以PBS溶液为阴性对照组。攻毒后各组继续投喂相应饲料，每天及时捡出死虾，记录死亡数量，14d后结束感染实验。实验组和对照组每日平均累计死亡率结果见下表，实验结果显示在感染7d内，实验组与对照组累积死亡率为差异不显著(P>0.05)；从第8d始对照组呈明显的上升趋势，对照组累积死亡率较实验组差异显著(P<0.05)；至感染实验结束前1天对照组的累积死亡率为100％，实验组的累积死亡率为73％。
将上述制备的地衣芽孢杆菌LV005发酵菌液、短小芽孢杆菌LV012发酵菌液、枯草芽孢杆菌LV023发酵菌液按等体积混合后制成复合菌制剂，复合菌制剂中活菌总浓度≥109CFU/mL；地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的数量比近似为1：1：1。
下面对本发明的复合菌制剂的效果进行描述。
实施例4：
将制得的100mL混合芽孢杆菌制剂与10Kg基础对虾饲料原料(含鱼粉30％、虾粉10％、豆粉25％、花生粉25％、面粉3％、玉米粉3％、复合维生素1％)混合，制成含混合芽孢杆菌制剂的免疫饲料。各种原料分别粉碎过60目筛，准确称重后逐级充分混匀，以褐藻酸钠作为粘合剂，加适量水用小型绞肉机挤压制成颗粒饲料，在40℃条件下烘干至水分含量10％以下，分袋包装，于4℃冰箱中保存备用。
健康凡纳滨对虾300余尾，实验对虾初始平均体长为6.3cm，随机为实验组和对照组2个处理组，每个处理组有3个平行，每个平行组养殖对虾50尾。实验组连续4天投喂免疫饲料，3天投喂基础饲料，7天一个循环，直至实验结束。对照组在整个实验阶段一直投喂基础饲料。水温24-26℃，连续充气；每日换水1次，日换水量为1/3；每日投喂饲料4次，日投饵量约为1.2-1.4克/10尾，投喂1h后吸去剩余饲料，并根据残饵的多少调节投饵量。免疫饲料养殖21天后，进行白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus，WSSV)人工注射感染实验。感染前1天停止投喂饲料，次日每尾对虾在第2腹节处注射50μL WSSV粗提液(浓度为0.16g/mL)，以PBS溶液为阴性对照组。攻毒后各组继续投喂相应饲料，每天及时捡出死虾，记录死亡数量，14d后结束感染实验。实验组和对照组每日平均累计死亡率结果见下表，实验结果显示在感染4d内，实验组与对照组累积死亡率为差异不显著(P>0.05)；从第5d始各组均呈明显的上升趋势，对照组累积死亡率较实验组差异显著(P<0.05)；至感染实验结束前1天对照组的累积死亡率为100％，实验组的累积死亡率为50％。
实施例5：
含1％(V/W)混合芽孢杆菌制剂的对虾免疫饲料(活菌总浓度≥107CFU/mL)的制备方法同实施例1。
健康凡纳滨对虾300余尾，实验对虾初始平均体长为6.3cm，随机为实验组和对照组2个处理组，每个处理组养殖对虾150尾。实验组连续4天投喂免疫饲料，3天投喂基础饲料，7天一个循环，直至实验结束。对照组在整个实验阶段一直投喂基础饲料。免疫饲料养殖21天后，进行WSSV人工注射感染实验。感染前1天停止投喂饲料，次日每尾对虾在第2腹节处注射50μL WSSV粗提液(浓度为0.16g/mL)，以PBS溶液为阴性对照组。免疫期间分别在1、3、7和15d进行取样，攻毒期间分别在6h，18h，96h，192h取样，采用实时荧光定量PCR法测定复合芽孢杆菌制剂对凡纳滨对虾肠道硫氧还蛋白(Thioredoxin，Trx)基因表达量的影响。以对照组Trx表达量为1，实验组Trx的相对表达量见下表。从表中数据可以看出实验组Trx相对表达量在整个免疫期间呈上调再下调趋势，不同时刻的实验组的Trx相对表达量较对照组有显著差异；WSSV感染期间实验组Trx相对表达量呈上调再下降的趋势，不同时刻都可看出免疫饲料组较对照组有显著差异。结果表明投喂含复合芽孢杆菌饲料后，凡纳滨对虾肠道Trx基因的表达水平可显著提高。
实施例6：
含1％(V/W)混合芽孢杆菌制剂的对虾免疫饲料(活菌总浓度≥107CFU/mL)的制备方法同实施例1。
健康凡纳滨对虾300余尾，实验对虾初始平均体长为6.3cm，随机为实验组和对照组2个处理组，每个处理组养殖对虾150尾。实验组连续4天投喂免疫饲料，3天投喂基础饲料，7天一个循环，直至实验结束。对照组在整个实验阶段一直投喂基础饲料。免疫饲料养殖21天后，进行WSSV人工注射感染实验。感染前1天停止投喂饲料，次日每尾对虾在第2腹节处注射50μL WSSV粗提液(浓度为0.16g/mL)，以PBS溶液为阴性对照组。分别在病毒感染后的6、18、96和192h取样，采用实时荧光定量PCR法测定虾鳃的病毒拷贝数，结果见下表。
由表中数据可知，在感染实验的8d内实验组的病毒拷贝数先上升后下降趋势，而对照组的病毒拷贝数一直呈现上升趋势，且在8d内实验组的病毒拷贝数均低于对照组1个数量级。结果证实饲料中添加复合芽孢杆菌制剂可有效降低虾鳃组织内的病毒拷贝数，延缓病毒在虾体内的复制速度。
Claims (10)
1.一种复合菌制剂，其特征在于，所述的复合菌制剂包含有地衣芽孢杆菌LV005菌株、短小芽孢杆菌LV012菌株和枯草芽孢杆菌LV023菌株。
2.如权利要求1所述的复合菌制剂，其特征在于，所述的地衣芽孢杆菌的保藏编号为CCTCC M 2013262。
3.如权利要求1所述的复合菌制剂，其特征在于，所述的短小芽孢杆菌的保藏编号为CCTCC M 2013263。
4.如权利要求1所述的复合菌制剂，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌的保藏编号为CCTCC M 2013264。
5.如权利要求1所述的复合菌制剂，其特征在于，所述的复合菌制剂中活菌总浓度≥109CFU/mL。
6.权利要求1所述的复合菌制剂的制备方法，其特征在于，是将地衣芽孢杆菌LV005发酵菌液、短小芽孢杆菌LV012发酵菌液、枯草芽孢杆菌LV023发酵菌液混合后制备的。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的地衣芽孢杆菌LV005发酵菌液的制备方法如下：从-80℃保存的菌种挑取少量划线于2216E固体培养基，在37℃培养24h获得单菌落，取一单菌落接种于2216E培养液中，37℃摇瓶培养24h获得种子液，再把种子液接种于地衣芽孢杆菌发酵液中发酵培养，发酵温度控制在37℃；当发酵液OD600值达到1.5～1.7时，终止发酵，获得发酵菌液；所述的地衣芽孢杆菌LV005的发酵液成分质量百分比为：蛋白胨，1.5％；酵母粉，0.4％；蔗糖，1.0％；氯化钠，2.5％；磷酸高铁，0.001％；硫酸镁，0.02％；硫酸锰，0.05％。
8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的短小芽孢杆菌LV012发酵菌液的制备方法如下：从-80℃保存的菌种挑取少量划线于2216E固体培养基，在37℃培养24h获得单菌落，取一单菌落接种于2216E培养液中，37℃摇瓶培养24h获得种子液，再把种子液接种于地衣芽孢杆菌发酵液中发酵培养，发酵温度控制在37℃；当发酵液OD600值达到1.2～1.4时，终止发酵，获得发酵菌液；所述的短小芽孢杆菌LV012的发酵液成分质量百分比为：蛋白胨，0.5％；酵母粉，0.1％；蔗糖，1.5％；氯化钠，2.5％；硫酸铁，0.05％；硫酸镁，0.004％；硫酸锰，0.01％。
9.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌LV023发酵菌液的制备方法如下：从-80℃保存的菌种挑取少量划线于2216E固体培养基，在37℃培养24h获得单菌落，取一单菌落接种于2216E培养液中，37℃摇瓶培养24h获得种子液，再把种子液接种于地衣芽孢杆菌发酵液中发酵培养，发酵温度控制在28℃；当发酵液OD600值达到1.2～1.4时，终止发酵，获得发酵菌液；所述的枯草芽孢杆菌LV023的发酵液成分质量百分比为：蛋白胨，1.0％；酵母粉，0.2％；蔗糖，1.0％；氯化钠，3.0％；硫酸铁，0.001％；硫酸镁，0.005％。
10.权利要求1所述的复合菌制剂在制备对虾饲料添加剂或免疫增强剂中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20190610 Address after: 443000 No. 519 Juxiang Road, Biological Industrial Park, Yichang High-tech Zone, Hubei Province Patentee after: Hubei Yishui Environmental Protection Technology Co.,Ltd. Address before: 266071 106 Nanjing Road, Shinan District, Qingdao, Shandong Patentee before: YELLOW SEA FISHERIES Research Institute CHINESE ACADEMY OF FISHERY SCIENCES |
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: A compound bacterial preparation and its application Effective date of registration: 20220114 Granted publication date: 20150624 Pledgee: Yichang financing guarantee Group Co.,Ltd. Pledgor: Hubei Yishui Environmental Protection Technology Co.,Ltd. Registration number: Y2022980000496 |
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Date of cancellation: 20230214 Granted publication date: 20150624 Pledgee: Yichang financing guarantee Group Co.,Ltd. Pledgor: Hubei Yishui Environmental Protection Technology Co.,Ltd. Registration number: Y2022980000496 |
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| CP03 | Change of name, title or address | ||
| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: 443000 No. 519 Juxiang Road, Biological Industrial Park, Yichang High-tech Zone, Hubei Province Patentee after: Hubei Yishui Biotechnology Co.,Ltd. Country or region after: China Address before: 443000 No. 519 Juxiang Road, Biological Industrial Park, Yichang High-tech Zone, Hubei Province Patentee before: Hubei Yishui Environmental Protection Technology Co.,Ltd. Country or region before: China |
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: A composite bacterial preparation and its application Granted publication date: 20150624 Pledgee: Yichang financing guarantee Group Co.,Ltd. Pledgor: Hubei Yishui Biotechnology Co.,Ltd. Registration number: Y2024980022488 |