CN106047716A - 一种雪峰虫草菌株和雪峰虫草子实体及其人工栽培方法和应用 - Google Patents

一种雪峰虫草菌株和雪峰虫草子实体及其人工栽培方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种雪峰虫草菌株(Ophiocordyceps xuefengensis)ZJ3和雪峰虫草子实体及其人工栽培方法和应用，所述雪峰虫草菌株(Ophiocordyceps xuefengensis)ZJ3，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期为2015年12月24日，保藏编号为CCTCC M 2015777。通过对所述雪峰虫草菌株进行活化培养、扩大培养、固体培养基培养以及暗培养和光照培养，获得了雪峰虫草子实体，得到的该人工培养的雪峰虫草子实体粗壮、组织紧密，子座为棒状，单生或分枝，锈色，长约1‑13cm，直径为1‑6mm，雪峰虫草子实体生物转化率可达10％‑20％，可将其广泛用于食品或保健品领域。

Description

一种雪峰虫草菌株和雪峰虫草子实体及其人工栽培方法和 应用
技术领域
本发明涉及药物栽培技术领域，尤其涉及一种人工培养雪峰虫草子实体的方法。
背景技术
雪峰虫草(Ophiocordyceps xuefengensis)在分类上隶属于子囊菌门(Ascomycota)、粪壳菌纲(Sordariomycetes)、肉座菌目(Hypocreales)、虫草菌科(Cordycipitaceae)、线虫草属(Ophiocordyceps)，是寄生于疖蝙蛾昆虫幼虫上的一类重要的虫生真菌，而疖蝙蛾幼虫寄生于马鞭草科植物大青(Clerodendrum cyrtophyllumTurca.)的近地面根髓或茎髓中。
雪峰虫草于2012年首次在湖南洞口县雪峰山区被发现并命名，是与冬虫夏草(Ophiocordyceps sinensis)亲缘关系很近的同属于线虫草属(Ophiocordyceps sp.)的一个新种。雪峰虫草是一种低海拔虫草，是已知的最大的虫草，目前仅在湖南省雪峰山区有发现。现代科学研究表明，虫草中的许多种类都含有对人体有益的营养成分及其虫草素、虫草酸、腺苷和虫草多糖等有效成份，具有抗病毒、抗肿瘤、抗氧化和增强免疫力等功效。目前野生虫草资源资稀少，由于连年过度采挖，其生态环境破坏严重，野生虫草资源日趋枯竭。
目前，国内外还没有有关雪峰虫草子实体培养方面的报道，雪峰虫草可能作为一种潜在的药食两用真菌进行开发，加之野生雪峰虫草资源较少，采挖对植被大青破坏严重，所以人工培养其子实体是解决开发利用该资源的有效途径之一，也为虫草药用价值的开发利用提供宝贵的资源。
发明内容
鉴于现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种雪峰虫草菌株(Ophiocordyceps xuefengensis)ZJ3和雪峰虫草子实体及其人工栽培方法和应用。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种雪峰虫草菌株(Ophiocordyceps xuefengensis)ZJ3，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期为2015年12月24日，保藏编号为CCTCC M 2015777，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学保藏中心。
雪峰虫草菌株(Ophiocordyceps xuefengensis)ZJ3在马铃薯葡萄糖平板培养基上生长较慢，通过点种法接种后，22℃培养45天，菌落直径在75mm的培养皿上可达50mm。菌落圆形，与培养基接触紧密，并形成褶皱，不易挑起，气生菌丝呈无色，粉末状，后期菌丝颜色逐渐变锈色，培养皿背面呈锈色；菌丝呈无色，有隔膜，有分支，直径为4-6μm；分生孢子锈色，单胞，椭圆形，顶端稍尖，基部稍尖，大小8-12μm×5-7μm；分生孢子梗短小，直径为1-5μm，长31-78μm，基部淡锈色，无分枝，分生孢子梗无隔膜或有一个隔膜。
本发明所提供的雪峰虫草(Ophiocordyceps xuefengensis)ZJ3菌种的获得是通过野外采集的雪峰虫草拟菌核、子座柄或可孕部分经过表面消毒后采用组织分离的方法分离纯化获得原始菌株，原始菌株再经过培育得到本发明所使用的菌株。
包含所述雪峰虫草菌株和/或其代谢产物，并以其为活性成分的微生物制剂也属于本发明的保护范围。
第二方面，本发明还提供了一种雪峰虫草子实体，其由如第一方面所述雪峰虫草菌株ZJ3经人工培养获得。
本发明所述雪峰虫草子实体生长初期以及生长顶端为白色，后期子实体从根部往顶端逐渐变成锈色，粗壮、组织紧密，子座为棒状，单生或分枝，锈色，长约1-13cm，直径为1-6mm。
第三方面，本发明还提供了一种雪峰虫草子实体的人工培养方法，其包括以下步骤：
(1)将雪峰虫草菌株进行活化培养；
(2)将活化培养后的菌种进行扩大培养，得到种子液，将其接种到固体培养基上进行培养；
(3)将步骤(2)得到的菌株先进行暗培养，再进行光照培养，即得到所述的雪峰虫草子实体；
任选地，(4)将步骤(3)得到的雪峰虫草子实体进行组织分离，利用其进行所述步骤(1)-(3)的培养，得到雪峰虫草子实体。
本发明的步骤(2)中是采用将种子液直接接种于固体培养基上进行培养，而不采用将种子液先扩大培养成发酵液后再接种于固体培养基上；与现有的先扩大培养种子液的方式相比，将种子液直接接种于固体培养基上，有利于提高子实体的基原形成数量和形成粗壮子实体，从而大大提高子实体的生物转化率。
本发明的步骤(3)采用先暗培养再光照培养的方式，有利于形成粗壮的子实体，并大大提高子实体的生物转化率。
本发明中，在进行步骤(3)之后，利用其得到的部分雪峰虫草子实体作为原料，对其进行组织分离，利用其进行所述步骤(1)-(3)的培养，同样能够得到生产上所需规模的、高生物转化率的雪峰虫草子实体，其中提及的组织分离是采用本领域公知的分离技术进行。
通过上述方法获得的雪峰虫草子实体，其子实体粗壮、组织紧密，子座为棒状，单生或分枝，锈色，长约1-13cm，直径为1-6mm，雪峰虫草子实体生物转化率可达10％-20％，可将其广泛用于食品或保健品领域。
本发明中，步骤(1)可以采用野生雪峰虫草或者是本发明第一方面所述的雪峰虫草菌株(Ophiocordyceps xuefengensis)ZJ3，在此不做特殊限定，然而优选采用本发明第一方面所述的雪峰虫草菌株(Ophiocordyceps xuefengensis)ZJ3进行雪峰虫草子实体的人工培养，利用该菌株可以使雪峰虫草子实体生物转化率可达15％以上，大大提高其利用价值。
根据本发明，步骤(1)所述活化培养的温度为18-22℃，例如18℃、18.2℃、18.3℃、18.5℃、18.8℃、19℃、19.5℃、20℃或22℃，活化培养的时间为10-15天，例如10天、10.5天、11天、12天、13天、14天或15天。
根据本发明，步骤(1)所述活化培养是在斜面培养基上进行的，优选在斜面试管培养基上进行，其中，斜面培养基的组成典型但非限制性的实例为：马铃薯100-200g、葡萄糖10-20g、琼脂10-15g，加水至1000mL，pH值为5-6.5，具体可以是：马铃薯100g、葡萄糖10g、琼脂10g，加水至1000mL，pH值为5；或者，马铃薯120g、葡萄糖11g、琼脂12g，加水至1000mL，pH值为5.5；或者，马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15g，加水至1000mL，pH值为6.5等，优选斜面培养基的组成为马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15g，加水至1000mL，pH值为6.5。
本发明中，步骤(2)所述扩大培养是在温度为20-22℃、转速为150-180r/min、黑暗条件下恒温振荡培养7-10天；其中温度例如可以是20℃、20.5℃、21℃、21.5℃或22℃；转速例如可以是150r/min、155r/min、160r/min、165r/min、170r/min、175r/min或180r/min；培养例如7天、7.5天、8天、8.5天、9天或10天。
本发明中，步骤(2)所述扩大培养采用液体种子培养基进行的，对于液体种子培养基的组成，其典型但非限制性的实例为：蔗糖10-15g、蛋白胨5-10g、磷酸氢二钠1-1.18g、磷酸二氢钾1-1.13g、硫酸镁1-3g、硝酸钾1-3g，加水至1000mL，pH值为5-6.5。对于液体种子培养基，可以采用液体摇瓶种子培养基。
本发明中所述液体种子培养基的碳源为蔗糖，而非其他糖醇类，且不含马铃薯水煮液；两种磷酸盐(磷酸氢二钠和磷酸二氢钾)在液体培养过程中对pH具有缓冲作用；利用该液体种子培养基培养的种子有利于后期固体培养基中子实体基原的形成，增加子实体的数量。
本发明中所述液体种子培养基的组成具体可以是：蔗糖15g、蛋白胨5g、磷酸氢二钠1g、磷酸二氢钾1.13g、硫酸镁3g、硝酸钾3g，加水至1000mL，pH值为5；或者，蔗糖12g、蛋白胨6g、磷酸氢二钠1.18g、磷酸二氢钾1.13g、硫酸镁1g、硝酸钾2g，加水至1000mL，pH值为5.5；或者，蔗糖10g、蛋白胨10g、磷酸氢二钠1g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁2g、硝酸钾2g，加水至1000mL，pH值为6.5，优选液体种子培养基的组成为：蔗糖15g、蛋白胨10g、磷酸氢二钠1.18g、磷酸二氢钾1.13g、硫酸镁3g、硝酸钾3.g，加水至1000mL，pH值为6.5。
示例性地，对于步骤(2)所述扩大培养的过程具体如下：
将步骤(1)中经活化培养后的雪峰虫草菌种通过液体摇瓶进行扩大培养，得到种子液，在250mL锥形瓶中装入50mL液体摇瓶种子培养基，在高温高压下灭菌，待自然冷却至室温，将斜面菌种接种到液体摇瓶种子培养基中，在温度20-22℃、转速150-180r/min、黑暗条件下恒温振荡培养7-10d，得到液体摇瓶种子。
本发明中，步骤(2)所述固体培养基的配制方法为：将大米5-10g、燕麦1-5g、小米1-5g和玉米1-5g进行混合，先按料液比为1:1的比例加入子实体栽培营养液中，经搅拌、浸泡、灭菌和冷却后，再按料液比2:1的比例加入无菌的子实体栽培营养液中。
本发明中的固体培养基配制过程中，第一个料液比(即1:1)，其中的“料”是指大米5-10g、燕麦1-5g、小米1-5g和玉米1-5g的混合物，其中的“液”是指子实体栽培营养液，其比例为质量体积比，例如g/mL；第二个料液比(即2:1)，其中的“料”是指第一个料液比中的“料”与“液”的总混合物，其中的“液”是指子实体栽培营养液，其比例同样为质量体积比，例如g/mL。
本发明通过采取分两次加入子实体营养液的方法得到子实体栽培所需的固体培养基，大大增加了固体培养基的透气性和含水量，有利于雪峰虫草菌丝在固体培养基上快速生长，提高子实体的基原形成数量和形成粗壮子实体，从而大大提高子实体的生物转化率。
其中固体物料可以是大米5g、燕麦1g、小米1g和玉米1g进行混合，或者大米6g、燕麦2g、小米2g和玉米2g进行混合，或者大米10g、燕麦5g、小米3g和玉米1g进行混合，或者大米8g，燕麦4g，小米2g和玉米2g进行混合。
对于上述固体物料的混合物与子实体栽培营养液的料液比，包括第一料液比和第二料液比，其比例(质量/体积比，例如g/mL)还可以是1.1:1、1.2:1、1.5:1、1.6:1、1.8:1或1.9:1，但优选第一料液比为1:1，第二料液比为2:1。
本发明中，所述子实体栽培营养液营养丰富，含马铃薯水煮液、蔗糖和蚕蛹粉；两种磷酸盐和两种钙盐在菌丝体生长过程中具有缓冲pH值的作用；添加这种子实体栽培营养液有利于雪峰虫草菌丝在固体培养基中快速生长，形成子实体基原，缩短子实体栽培时间，缩短栽培周期。
本发明中所述子实体栽培营养液的组成为：马铃薯150-200g、蚕蛹粉5-10g、蔗糖10-15g、蛋白胨5-10g、磷酸氢二钠1-1.18g、磷酸二氢钾1-1.13g、硫酸镁1-2g、硝酸钾1-3g、碳酸钙2-5g、硫酸钙2-5g、复合维生素B100-140mg，加水至1000mL，pH值为6-6.5。
上述子实体栽培营养液典型但非限制性的组成可以是：马铃薯200g、蚕蛹粉5g、蔗糖10g、蛋白胨5g、磷酸氢二钠1.18g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁1-2g、硝酸钾1g、碳酸钙5g、硫酸钙5g、复合维生素B 140mg，加水至1000mL，pH值为6；或者，马铃薯150g、蚕蛹粉8g、蔗糖12g、蛋白胨6g、磷酸氢二钠1.18g、磷酸二氢钾1.13g、硫酸镁2g、硝酸钾3g、碳酸钙5g、硫酸钙5g、复合维生素B 120mg，加水至1000mL，pH值为6.2；或者，马铃薯180g、蚕蛹粉10g、蔗糖15g、蛋白胨10g、磷酸氢二钠1.18g、磷酸二氢钾1.13g、硫酸镁1g、硝酸钾1g、碳酸钙2g、硫酸钙2g、复合维生素B 140mg，加水至1000mL，pH值为6.5等，优选子实体栽培营养液的组成为：马铃薯200g、蚕蛹粉10g、蔗糖15g、蛋白胨10g、磷酸氢二钠1.18g、磷酸二氢钾1.13g、硫酸镁2g、硝酸钾3g、碳酸钙5g、硫酸钙5g、复合维生素B 140mg，水1000mL，pH值为6.5。
示例性地，对于固体培养的具体过程如下：
在350mL栽培瓶中加入大米8g，燕麦4g，小米2g，玉米2g，先按料液比1:1的比例加入子实体栽培营养液，搅拌均匀，封口，30℃浸泡24h，温度121℃灭菌40min，自然冷却至40℃-50℃，再按料液比2:1的比例加入无菌的子实体栽培营养液，得到固体培养基，将扩大培养的液体摇瓶种子液接种到固体培养基上，每瓶接种量5mL，紧密封口。
本发明中，步骤(3)所述暗培养是将固体培养基置于18-22℃的恒温恒湿培养箱中，在温度为18-22℃，相对湿度为60％-70％的黑暗条件下培养10-15天，使菌丝长满固体培养基。
对于暗培养的温度，例如可以是18℃、18.2℃、18.3℃、18.5℃、18.8℃、19℃、19.5℃、20℃或22℃，培养的时间为10-15天，例如10天、10.5天、11天、12天、13天、14天或15天，相对湿度为60％、61％、62％、65％、66％、68％或70％。
示例性地，步骤(3)所述暗培养的具体过程为：
将接种和封口后的固体培养基置于22℃的恒温恒湿培养箱中，在温度为22℃，相对湿度为60％-70％，培养10-15天，菌丝培养阶段，保持黑暗条件，使菌丝长满固体培养基。
根据本发明，所述光照培养的温度为18-20℃，例如18℃、18.2℃、18.3℃、18.5℃、18.8℃、19℃、19.5℃或20℃；光照强度为10-100lux，例如10lux、20lux、30lux、40lux、50lux、60lux、70lux、80lux或100lux，光照时间为6-8h/天，例如6h/天、6.5h/天、7h/天、7.5h/天或8h/天，相对空气湿度为50-60％，例如50％、52％、55％、58％或60％。
示例性地，步骤(3)所述光照培养的具体过程为：
将菌丝铺满固体培养基的栽培瓶置于温度为18-19℃条件下的人工模拟环境培养室中培养；在子实体培养阶段进行光照培养，光照强度为10-100lux，光照时间8h/d，相对空气湿度60％，在子实体长满栽培瓶，几乎不再生长并保持健壮时采摘，即得到人工培养的雪峰虫草子实体；人工培养的雪峰虫草子实体粗壮、组织紧密，子座棒状，单生或分枝，锈色，长约1-13cm，直径1-6mm，雪峰虫草子实体生物转化率可达10％-20％。
示例性地，本发明所述雪峰虫草子实体的人工培养方法具体包括以下步骤：
(1)将雪峰虫草菌株在斜面培养基上、18-22℃温度下活化培养10-15天；所述斜面培养基的组成为：马铃薯100-200g、葡萄糖10-20g、琼脂10-15g，加水至1000mL，pH值为5-6.5；
(2)将活化培养后的菌种在温度为20-22℃、转速为150-180r/min、黑暗条件下恒温振荡扩大培养7-10天，得到种子液，将其接种到固体培养基上进行培养；
所述固体培养基的配制方法为：将大米5-10g、燕麦1-5g、小米1-5g和玉米1-5g进行混合，先按料液比为1:1的比例加入子实体栽培营养液中，经搅拌、浸泡、灭菌和冷却后，再按料液比2:1的比例加入无菌的子实体栽培营养液中；
所述子实体栽培营养液组成为：马铃薯150-200g、蚕蛹粉5-10g、蔗糖10-15g、蛋白胨5-10g、磷酸氢二钠1-1.18g、磷酸二氢钾1-1.13g、硫酸镁1-2g、硝酸钾1-3g、碳酸钙2-5g、硫酸钙2-5g、复合维生素B 100-140mg，加水至1000mL，pH值为6-6.5；
(3)将固体培养基置于18-22℃的恒温恒湿培养箱中，在温度为18-22℃，相对湿度为60％-70％的黑暗条件下培养10-15天，使菌丝长满固体培养基，再在温度为18-20℃，光照强度为10-100lux，光照时间为6-8h/天，相对空气湿度为50-60％的条件下进行光照培养，即得到所述的雪峰虫草子实体。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
本发明人工培养的雪峰虫草子实体粗壮、组织紧密，子座棒状，单生或分枝，锈色，长约1-13cm，直径1-6mm，雪峰虫草子实体生物转化率可达10％-20％。
附图说明
图1示出了人工栽培的雪峰虫草子实体。
图2示出了采集的雪峰虫草子实体。
下面对本发明进一步详细说明。但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
为更好地说明本发明，便于理解本发明的技术方案，本发明的典型但非限制性的实施例如下：
实施例1
雪峰虫草(Ophiocordyceps xuefengensis)ZJ3菌种的分离与鉴定：以2014年6月从湖南省洞口县雪峰山区采集野生雪峰虫草，并以其子座柄经过表面消毒后采用组织分离的方法分离纯化，获得一种雪峰虫草原始菌株，接入PDA斜面培养基制备斜面母种，斜面母种再接种至液体培养基中制备种子液，种子液接种在子实体栽培的固体培养基中经过培育获得了一种粗壮子实体，再将粗壮子实体进行组织分离，得到本发明所使用的菌株
本发明所述雪峰虫草菌株经分子生物学技术鉴定，包括进行ITS-PCR扩增和测序，将获得的序列与Genbank中所登录的雪峰虫草序列比对，与它最近的雪峰虫草Ophiocordyceps xuefengensis的相似性为99％。
实施例2
一种雪峰虫草子实体的人工培养方法，其包括以下步骤：
(1)将雪峰虫草(Ophiocordyceps xuefengensis)菌种ZJ3(保藏编号为CCTCC M2015777)栽培后获得的子实体进行组织分离，取子实体接种于斜面试管培养基，在22℃温度下培养10d，得到斜面菌种。
斜面试管培养基的组成为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，加水至1000ml，pH值为6.5。
(2)通过液体摇瓶进行扩大培养，得到种子液，在250mL锥形瓶中装入50mL液体摇瓶种子培养基，在高温高压下灭菌，待自然冷却至室温，将斜面菌种接种到液体摇瓶种子培养基中，在温度为22℃、转速180r/min、黑暗条件下恒温振荡培养7d，得到液体摇瓶种子。
液体摇瓶种子培养基的组成为：蔗糖15g，蛋白胨10g，磷酸氢二钠1.18g，磷酸二氢钾1.13g，硫酸镁3g，硝酸钾3g，水1000ml，pH为6.5。
(3)在350mL栽培瓶中加入大米8g，燕麦4g，小米2g，玉米2g，先按料液比1:1的比例加入子实体栽培营养液，搅拌均匀，封口，30℃浸泡24h，温度121℃灭菌40min，自然冷却至50℃，再按料液比2:1的比例加入无菌的子实体栽培营养液，得到固体培养基，将扩大培养的液体摇瓶种子液接种到固体培养基上，每瓶接种量5mL，紧密封口。
子实体栽培营养液的组成为：马铃薯160g、蚕蛹粉7g，蔗糖11g，蛋白胨10g，磷酸氢二钠1.18g，磷酸二氢钾1.13g，硫酸镁2g，硝酸钾3g，碳酸钙5g，硫酸钙5g，复合维生素B140mg，水1000mL，pH为6。
(4)将接种和封口后的固体培养基置于20℃的恒温恒湿培养箱中，在温度22℃，相对湿度68％，培养10d，菌丝培养阶段，保持黑暗条件，使菌丝长满固体培养基。
(5)将菌丝铺满固体培养基的栽培瓶置于温度为19℃条件下的人工模拟环境培养室中培养；在子实体培养阶段进行光照培养，光照强度为80lux，光照时间7h/d，相对空气湿度55％，在子实体长满栽培瓶，几乎不再生长并保持健壮时采摘，即得到人工培养的雪峰虫草子实体。
采用该方法得到的人工培养的雪峰虫草子实体粗壮、组织紧密，子座棒状，单生或分枝，锈色，长约1-13cm，直径1-6mm，雪峰虫草子实体生物转化率达20％。
实施例3
一种雪峰虫草子实体的人工培养方法，其包括以下步骤：
(1)将雪峰虫草(Ophiocordyceps xuefengensis)菌种ZJ3(保藏编号为CCTCC M2015777)点接种于斜面试管培养基，在22℃温度下培养10d，得到斜面菌种。
斜面试管培养基的组成为：马铃薯200g，葡萄糖20g、琼脂15g，加水至1000ml，pH为6.5。
(2)通过液体摇瓶进行扩大培养，得到种子液，在250ml锥形瓶中装入50ml液体摇瓶种子培养基，在高温高压下灭菌，待自然冷却至室温，将斜面菌种接种到液体摇瓶种子培养基中，在温度为22℃、转速180r/min、黑暗条件下恒温振荡培养7d，得到液体摇瓶种子。
液体摇瓶种子培养基的组成为：蔗糖15g，蛋白胨10g，磷酸氢二钠1.18g，磷酸二氢钾1.13g，硫酸镁3g，硝酸钾3g，水1000ml，pH值为6.5。
(3)在350mL栽培瓶中加入大米8g，燕麦4g，小米2g，玉米2g，先按料液比1:1的比例加入子实体栽培营养液，搅拌均匀，封口，30℃浸泡24h，温度121℃灭菌40min，自然冷却至40℃，再按料液比2:1的比例加入无菌的子实体栽培营养液，得到固体培养基，将扩大培养的液体摇瓶种子液接种到固体培养基上，每瓶接种量5mL，紧密封口。
子实体栽培营养液的组成为：马铃薯200g，蚕蛹粉10g，蔗糖15g，蛋白胨10g，磷酸氢二钠1.18g，磷酸二氢钾1.13g，硫酸镁2g，硝酸钾3g，碳酸钙5g，硫酸钙5g，复合维生素B140mg，水1000mL，pH值为6.5。
(4)将接种和封口后的固体培养基置于22℃的恒温恒湿培养箱中，在温度22℃，相对湿度60％，培养10d，菌丝培养阶段，保持黑暗条件，使菌丝长满固体培养基。
(5)将菌丝铺满固体培养基的栽培瓶置于温度为19℃条件下的人工模拟环境培养室中培养；在子实体培养阶段进行光照培养，光照强度为100lux，光照时间8h/d，相对空气湿度60％，在子实体长满栽培瓶，几乎不再生长并保持健壮时采摘，即得到人工培养的雪峰虫草子实体。
采用该方法得到的人工培养的雪峰虫草子实体粗壮、组织紧密，子座棒状，单生或分枝，锈色，长约1-13cm，直径1-6mm，雪峰虫草子实体生物转化率达18％。
实施例4
一种雪峰虫草子实体的人工培养方法，其包括以下步骤：
(1)将雪峰虫草(Ophiocordyceps xuefengensis)菌种ZJ3(保藏编号为CCTCC M2015777)点接种于斜面试管培养基，在20℃温度下培养12d，得到斜面菌种。
斜面试管培养基的组成为：马铃薯100g，葡萄糖20g，琼脂12g，加水至1000ml，pH值为6.5。
(2)通过液体摇瓶进行扩大培养，得到种子液，在250ml锥形瓶中装入50ml液体摇瓶种子培养基，在高温高压下灭菌，待自然冷却至室温，将斜面菌种接种到液体摇瓶种子培养基中，在温度为21℃、转速180r/min、黑暗条件下恒温振荡培养7d，得到液体摇瓶种子。
液体摇瓶种子培养基的组成为：蔗糖10g，蛋白胨8g，磷酸氢二钠1.18g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁3g，硝酸钾3g，水1000ml，pH为6。
(3)在350ml栽培瓶中加入大米5g，燕麦4g，小米2g，玉米2g，搅拌均匀，先按料液比1:1的比例加入子实体栽培营养液，搅拌均匀，封口，30℃浸泡24h，温度121℃灭菌40min，自然冷却至45℃，再按料液比2:1的比例加入无菌的子实体栽培营养液，得到固体培养基，将扩大培养的液体摇瓶种子液接种到固体培养基上，每瓶接种量5mL，紧密封口。
子实体栽培营养液的组成为：马铃薯150g，蚕蛹粉10g，蔗糖10g，蛋白胨10g，磷酸氢二钠1.18g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁2g，硝酸钾3g，碳酸钙5g，硫酸钙5g，复合维生素B110mg，水1000mL，pH值为6。
(4)将接种和封口后的固体培养基置于22℃的恒温恒湿培养箱中，在温度22℃，相对湿度65％，培养14d，菌丝培养阶段，保持黑暗条件，使菌丝长满固体培养基。
(5)将菌丝铺满固体培养基的栽培瓶置于温度为19℃条件下的人工模拟环境培养室中培养；在子实体培养阶段进行光照培养，光照强度为80lux，光照时间8h/d，相对空气湿度60％，在子实体长满栽培瓶，几乎不再生长并保持健壮时采摘，即得到人工培养的雪峰虫草子实体。
采用该方法得到的人工培养的雪峰虫草子实体粗壮、组织紧密，子座棒状，单生或分枝，锈色，长约1-13cm，直径1-6mm，雪峰虫草子实体生物转化率达21％。
实施例5
一种雪峰虫草子实体的人工培养方法，其包括以下步骤：
(1)将雪峰虫草(Ophiocordyceps xuefengensis)菌种JZ3(保藏编号为CCTCC M2015777)点接种于斜面试管培养基，在18℃温度下培养13d，得到斜面菌种。
斜面试管培养基的组成为：马铃薯180g，葡萄糖18g，琼脂11g，加水至1000ml，pH为5。
(2)通过液体摇瓶进行扩大培养，得到种子液，在250ml锥形瓶中装入50ml液体摇瓶种子培养基，在高温高压下灭菌，待自然冷却至室温，将斜面菌种接种到液体摇瓶种子培养基中，在温度为21℃、转速150r/min、黑暗条件下恒温振荡培养8d，得到液体摇瓶种子。
液体摇瓶种子培养基的组成为：蔗糖12g，蛋白胨6g，磷酸氢二钠1.18g，磷酸二氢钾1.13g，硫酸镁2g，硝酸钾2g，水1000ml，pH值为5。
(3)在350mL栽培瓶中加入大米6g，燕麦2g，小米2g，玉米2g，先按料液比1:1的比例加入子实体栽培营养液，搅拌均匀，封口，30℃浸泡24h，温度121℃灭菌40min，自然冷却至40℃，再按料液比2:1的比例加入无菌的子实体栽培营养液，得到固体培养基，将扩大培养的液体摇瓶种子液接种到固体培养基上，每瓶接种量5mL，紧密封口。
子实体栽培营养液的组成为：马铃薯190g，蚕蛹粉6g，蔗糖12g，蛋白胨8g，磷酸氢二钠1.18g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁2g，硝酸钾3g，碳酸钙5g，硫酸钙5g，复合维生素B 120mg，水1000mL，pH值为6.5。
(4)将接种和封口后的固体培养基置于22℃的恒温恒湿培养箱中，在温度22℃，相对湿度60％，培养10d，菌丝培养阶段，保持黑暗条件，使菌丝长满固体培养基。
(5)将菌丝铺满固体培养基的栽培瓶置于温度为19℃条件下的人工模拟环境培养室中培养；在子实体培养阶段进行光照培养，光照强度为100lux，光照时间7h/d，相对空气湿度55％，在子实体长满栽培瓶，几乎不再生长并保持健壮时采摘，即得到人工培养的雪峰虫草子实体。
采用该方法得到的人工培养的雪峰虫草子实体粗壮、组织紧密，子座棒状，单生或分枝，锈色，长约1-13cm，直径1-6mm，雪峰虫草子实体生物转化率达17％。
实施例6
一种雪峰虫草子实体的人工培养方法，其包括以下步骤：
(1)采集野生雪峰虫草，并以其拟菌核、子座柄或可孕部分经过表面消毒后采用组织分离，取黄豆大小组织接种于斜面试管培养基，在22℃温度下培养10d，得到斜面菌种。
斜面试管培养基的组成为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，加水至1000ml，pH值为6.5。
(2)通过液体摇瓶进行扩大培养，得到种子液，在250mL锥形瓶中装入50mL液体摇瓶种子培养基，在高温高压下灭菌，待自然冷却至室温，将斜面菌种接种到液体摇瓶种子培养基中，在温度为22℃、转速180r/min、黑暗条件下恒温振荡培养7d，得到液体摇瓶种子。
液体摇瓶种子培养基的组成为：蔗糖15g，蛋白胨10g，磷酸氢二钠1.18g，磷酸二氢钾1.13g，硫酸镁3g，硝酸钾3g，水1000ml，pH值为6.5。
(3)在350mL栽培瓶中加入大米6g，燕麦2g，小米2g，玉米2g，先按料液比1:1的比例加入子实体栽培营养液，搅拌均匀，封口，30℃浸泡24h，温度121℃灭菌40min，自然冷却至40℃，再按料液比2:1的比例加入无菌的子实体栽培营养液，得到固体培养基，将扩大培养的液体摇瓶种子液接种到固体培养基上，每瓶接种量5mL，紧密封口。
子实体栽培营养液的组成为：马铃薯200g，蚕蛹粉10g，蔗糖15g，蛋白胨10g，磷酸氢二钠1.18g，磷酸二氢钾1.13g，硫酸镁2g，硝酸钾3g，碳酸钙5g，硫酸钙5g，复合维生素B140mg，水1000mL，pH为6.5。
(4)将接种和封口后的固体培养基置于22℃的恒温恒湿培养箱中，在温度22℃，相对湿度60％，培养10d，菌丝培养阶段，保持黑暗条件，使菌丝长满固体培养基。
(5)将菌丝铺满固体培养基的栽培瓶置于温度为19℃条件下的人工模拟环境培养室中培养；在子实体培养阶段进行光照培养，光照强度为40lux，光照时间8h/d，相对空气湿度60％，在子实体长满栽培瓶，几乎不再生长并保持健壮时采摘，即得到人工培养的雪峰虫草子实体；人工培养的雪峰虫草子实体粗壮、组织紧密，子座棒状，单生或分枝，锈色，长约1-13cm，直径1-6mm，雪峰虫草子实体生物转化率达10％。
通过上述实施例可以看出，本发明人工培养的雪峰虫草子实体粗壮、组织紧密，子座棒状，单生或分枝，锈色，长约1-13cm，直径1-6mm，雪峰虫草子实体生物转化率可达10％-20％，可以将其广泛用于食品和保健品中，具有重要的药用价值。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细结构特征，但本发明并不局限于上述详细结构特征，即不意味着本发明必须依赖上述详细结构特征才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用部件的等效替换以及辅助部件的增加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.一种雪峰虫草菌株(Ophiocordyceps xuefengensis)ZJ3，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期为2015年12月24日，保藏编号为CCTCC M 2015777。
2.一种雪峰虫草子实体，其特征在于，其由如权利要求1所述的雪峰虫草菌株ZJ3经人工培养获得。
3.如权利要求2所述的雪峰虫草子实体，其特征在于，所述子实体的子座为棒状，单生或分枝，锈色，长度在1-13cm，直径为1-6mm。
4.一种雪峰虫草子实体的人工培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将雪峰虫草菌株进行活化培养；
(2)将活化培养后的菌种进行扩大培养，得到种子液，将其接种到固体培养基上进行培养；
(3)将步骤(2)得到的菌株先进行暗培养，再进行光照培养，即得到所述的雪峰虫草子实体；
任选地，(4)将步骤(3)得到的雪峰虫草子实体进行组织分离，利用其进行所述步骤(1)-(3)的培养，得到雪峰虫草子实体。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述活化培养的温度为18-22℃，活化培养的时间为10-15天；
优选地，所述活化培养是在斜面培养基上进行；
优选地，所述斜面培养基的组成为：马铃薯100-200g、葡萄糖10-20g、琼脂10-15g，加水至1000mL，pH值为5-6.5。
6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述扩大培养是在温度为20-22℃、转速为150-180r/min、黑暗条件下恒温振荡培养7-10天；
优选地，所述扩大培养采用液体种子培养基进行；
优选地，所述液体种子培养基的组成为：蔗糖10-15g、蛋白胨5-10g、磷酸氢二钠1-1.18g、磷酸二氢钾1-1.13g、硫酸镁1-3g、硝酸钾1-3g，加水至1000mL，pH值为5-6.5；
优选地，步骤(2)所述固体培养基的配制方法为：先将大米5-10g、燕麦1-5g、小米1-5g和玉米1-5g进行混合，再按料液比为(1-2):1将该混合物加入子实体栽培营养液中，得到固体培养基；
优选地，所述子实体栽培营养液的组成为：马铃薯150-200g、蚕蛹粉5-10g、蔗糖10-15g、蛋白胨5-10g、磷酸氢二钠1-1.18g、磷酸二氢钾1-1.13g、硫酸镁1-2g、硝酸钾1-3g、碳酸钙2-5g、硫酸钙2-5g、复合维生素B100-140mg，加水至1000mL，pH值为6-6.5。
7.如权利要求4-6之一所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述暗培养是将固体培养基置于18-22℃的恒温恒湿培养箱中，在温度为18-22℃，相对湿度为60％-70％的黑暗条件下培养10-15天，使菌丝长满固体培养基；
优选地，步骤(3)所述光照培养的温度为18-20℃；光照强度为10-100lux，光照时间为6-8h/天，相对空气湿度为50-60％。
8.如权利要求4-7之一所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将雪峰虫草菌株在斜面培养基上、18-22℃温度下活化培养10-15天；所述斜面培养基的组成为：马铃薯100-200g、葡萄糖10-20g、琼脂10-15g，加水至1000mL，pH值为5-6.5；
(2)将活化培养后的菌种在温度为20-22℃、转速为150-180r/min、黑暗条件下恒温振荡扩大培养7-10天，得到种子液，将其接种到固体培养基上进行培养；
所述固体培养基的配制方法为：将大米5-10g、燕麦1-5g、小米1-5g和玉米1-5g进行混合，先按料液比为1:1的比例加入子实体栽培营养液中，经搅拌、浸泡、灭菌和冷却后，再按料液比2:1的比例加入无菌的子实体栽培营养液中；
(3)将固体培养基置于18-22℃的恒温恒湿培养箱中，在温度为18-22℃，相对湿度为60％-70％的黑暗条件下培养10-15天，使菌丝长满固体培养基，再在温度为18-20℃，光照强度为10-100lux，光照时间为6-8h/天，相对空气湿度为50-60％的条件下进行光照培养，即得到所述的雪峰虫草子实体。
9.如权利要求4-8之一所述的人工培养方法培养得到的雪峰虫草子实体，其特征在于，所述子实体的子座为棒状，单生或分枝，锈色，长度在1-13cm，直径为1-6mm。
10.如权利要求1所述的雪峰虫草菌株或者如权利要求2或9所述的雪峰虫草子实体在食品或保健品中的应用。
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