CN106818206A - 一种雪峰虫草的人工培育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人工培育形成雪峰虫草的方法，将线虫草菌科真菌雪峰虫草菌通过人工寄生在疖蝙蛾科昆虫幼虫体上。本发明的积极效果是：操作简单，成本低，技术容易推广；虫体感染率及出草率高，所得雪峰虫草的营养活性成分接近野生雪峰虫草，所得雪峰虫草的子座外层结构紧密，外形近似野生雪峰虫草、子座饱满、大小形状比较均一，易于规模化栽培。
Description
技术领域
本发明涉及一种雪峰虫草的人工培育方法，尤其涉及一种雪峰虫草菌种感染活体疖蝙蝠蛾幼虫人工培育雪峰虫草的方法以及所得到的雪峰虫草。
背景技术
随着人们生活水平以及生活质量的不断提高，认识领域的不断扩大，对功能保健产品以及食品的需求也日渐增大。虫草是一类具有显著保健疗效的药用和食用真菌，其中最著名的是冬虫夏草，其相关的系列产品高达数十种，包括保健品、食品、中成药等几大类产品，在全世界都享有盛誉。但冬虫夏草寄主专一，生活环境苛刻，人工培育很难完全成功，而且由于其天然寄主蝙蝠蛾生活周期长、天敌多、病害多，自然繁殖的幼虫产量严重不足，加之这些年来冬虫夏草产区环境污染严重，人为过早、过量地滋采滋挖以及草甸沙化，从而造成未成熟的虫草菌感染寄主的机会大量减少等原因，造成冬虫夏草数量和质量大幅度下降，货源稀缺，价格昂贵，远远不能满足市场日益增长的需求。
雪峰虫草为全球首次发现的新物种、药用新资源，为线虫草菌科真菌雪峰虫草菌Ophiocordyceps xuefengensis T.C.Wen,R.C.Zhu,J.C.Kang&K.D.Hyde寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座和幼虫尸体的干燥复合体，生于海拔300～1000m阔叶林中的马鞭草科植物大青Clerodendrum cyrtophyllum Turcz.近地面根或茎中，主要分布在我省雪峰山片区，如湖南的洞口县、隆回县等。雪峰虫草作为瑶药使用历史悠久，当地群众通过蒸煮、炖肉、泡酒等方式服用，具有补肺益肾、止咳化痰等功效，主要用于肺部疾病，如肺炎、哮喘、百日咳、干咳、热咳等，配伍后对高血压、病毒性肝炎、类风湿性关节炎、痛风等疾病有良好的疗效。
经过多基因的分子系统学和形态学研究，发现其与已发表的虫草都不相同，是与冬虫夏草亲源关系很近的一种线型虫草属的一个新种。经湖南省中医药研究院的主要成份及含量检测，结果表明：16种氨基酸的含量、D-甘露醇含量、腺苷、虫草素含量均符合冬虫夏草的标准规定。经雪峰虫草的动物急性毒性试验，长期毒性试验，均表明雪峰虫草是一种无毒安全虫草。雪峰虫草在湖南雪峰山区被长期当成名贵中药冬虫夏草的替代品来使用，效果极佳，目前售价约每克20 美元。它也是世界上目前发现的最大的虫草。
中国发明专利，申请号201310245503.0；申请日：2013-06-20；发明名称：人工培育雪峰虫草的方法；公开(公告)日2013-10-09：公开(公告)号：CN103340091A，公开了一种人工培育雪峰虫草的方法：将雪峰虫草菌粉与培养料混合，将疖蝙蛾3龄以上寄生的大青根装箱，撒上雪峰虫草粉末，控制箱内温度、湿度，培养出雪峰虫草。该培育方法中雪峰虫草的产出需要有大青、疖蝙蛾幼虫、雪峰虫草菌种，缺一不可，其不足在于要砍伐大量大青，破坏生态环境；培养料和菌粉混合容易交叉感染，滋生杂菌；幼虫的进食量有限，感染率较低，感染时间较长。
发明内容
本发明的目的在于针对上述现有技术的不足，提供一种雪峰虫草菌种感染活体疖蝙蝠蛾幼虫人工培育雪峰虫草的方法以及所得到的雪峰虫草。
一种雪峰虫草的人工培育方法，方法步骤如下：
S1：幼虫选择：选择疖蝙蛾幼虫；
S2：菌种选择：线虫草菌科真菌雪峰虫草菌Ophiocordyceps xuefengensisT.C.Wen,R.C.Zhu,J.C.Kang&K.D.Hyde；该菌种由申请人采集，并于2015年8月10日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌株保藏号：CGMCC NO.11107；分类命名：雪峰虫草菌Ophiocordyceps xuefengensis；
S3：菌种的制备：雪峰虫草斜面菌种分割成黄豆大小，每2-3块接种到PDA液体培养基中，于25℃、130r/min震荡培养15-20d得发酵液，过滤得液体菌种；
S4：营养土的制备：将沙壤土和草炭土按照2:1的比例混合均匀，然后加水至含水量为15-30％，再进行高温高压灭菌；
S5：幼虫体表消毒：先用75％的酒精擦拭，后紫外消毒，消毒时间20-50min；
S6：接种；
S7：培养管理。
优选地，所述S1中的疖蝙蛾幼虫的长度4-8cm。
优选地，所述S4中的高温高压为121℃、0.1Mpa，灭菌时间为30min。
优选地，所述S6中的接种为涂抹法、浸泡法、注射法中的一种。
涂抹法：用无菌棉球蘸菌液涂抹；浸泡法：或将消毒的幼虫放入菌液中浸泡60s；注射法：用一次性的注射器吸取0.2-0.5ml的液体菌种注射到已消毒的幼虫体内。
优选地，所述S7中的培养管理方法步骤如下：
进一步的，步骤1，将接种后的幼虫放入上述S4中的营养土内，放置在4-15℃环境下避光培养16-30d；
进一步的，步骤2，转入光照强度为0-250lx,培养温度为5-15℃12h,15-25℃12h，湿度为80-90％的条件下培养至菌丝布满幼虫表面，长出子座；
进一步的，步骤3，转入温度10-25℃，湿度90％，弱光培养至子座成熟。
温度对子座的形成和生长发育具有很重要的影响，持续低温难以形成子座，持续高温子座生长太快，容易形成细小的子座，一定的温差有利于形成健壮的子座。
优选地，权利要求1-6之一的方法得到的雪峰虫草。
与已有技术相比，本发明有益效果体现在：
1、操作简单，成本低，技术容易推广。
2、虫体感染率高达80％，出草率90％以上，所得雪峰虫草的营养活性成分接近野生雪峰虫草，所得雪峰虫草的子座外层结构紧密，外形近似野生雪峰虫草、子座饱满、大小形状比较均一，易于规模化栽培。
3、本发明的雪峰虫草中的腺苷、甘露醇、虫草素均符合冬虫夏草的标准规定。
4、按照本专利流程操作，如培育周期缩短至2个月，比自然条件缩短了13个月左右，可以在狭小的空间里立体化培育雪峰虫草，亩产量是自然条件的50倍以上。
附图说明
图1为一种雪峰虫草的人工培育方法的流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，但并不构成对本发明的任何限制。
营养土原料来源说明：沙壤土取自中药所种植园，过100目的筛子；草炭土购买自广州市生升农业有限公司。
实施例1
S1：幼虫的选择：选择大小为4cm的疖蝙蝠蛾幼虫作为寄主；
S2：菌种选择：线虫草菌科真菌雪峰虫草菌；
S3：雪峰虫草菌种的制备：将复壮后的雪峰虫草斜面菌种分割成黄豆大小，每2块接种到PDA液体培养基中，于25℃、130r/min震荡培养15d得发酵液，过滤得液体菌种；
S4：营养土的制备：将沙壤土和草炭土按照2:1的比例混合均匀，然后加水配制含水量为15％的土壤，在温度121℃，压力0.1Mpa的条件下灭菌30min；
S5：幼虫体表消毒及接种：将S1中的幼虫用75％酒精擦拭后放入超净工作台上紫外消毒20min，然后用无菌棉球蘸菌液涂抹消毒的幼虫体表；
S6：前期培养管理：将S5中的幼虫放入S4制备的无菌营养土内，放置在4℃环境下避光培养16d；
S7：后期培养管理：将经S6中的培养的幼虫放在光照条件下培养，光照强度为50lx，培养温度为10℃12h,20℃12h，湿度为90％。
培养结束后，其虫体感染率0％，出草率为0％。
实施例2
S1：幼虫的选择：选择大小为8cm的疖蝙蝠蛾幼虫作为寄主；
S2：菌种选择：线虫草菌科真菌雪峰虫草菌；
S3：雪峰虫草菌种的制备：将复壮后的雪峰虫草斜面菌种分割成黄豆大小，每3块接种到PDA液体培养基中，于25℃、130r/min震荡培养15d得发酵液，过滤得液体菌种；
S4：营养土的制备：将沙壤土和草炭土按照2:1的比例混合均匀，然后加水配制含水量为15％的土壤，在温度121℃，压力0.1Mpa的条件下灭菌30min；
S5：幼虫体表消毒及接种：将S1中的幼虫用75％酒精擦拭后放入超净工作台上紫外消毒30min，将消毒的幼虫在菌液浸泡60s；
S6：前期培养管理：将S5中的幼虫放入S4制备的无菌营养土内，放置在4℃环境下避光培养16d；
S7：后期培养管理：将经S6中的培养的幼虫放在光照条件下培养，光照强度为100lx，培养温度为10℃12h,20℃12h，湿度为90％。
培养结束后，其虫体感染率0％，出草率为0％。
实施例3
S1：幼虫的选择：选择大小为4cm的疖蝙蝠蛾幼虫作为寄主；
S2：菌种选择：线虫草菌科真菌雪峰虫草菌；
S3：雪峰虫草菌种的制备：将复壮后的雪峰虫草斜面菌种分割成黄豆大小，每2块接种到PDA液体培养基中，于25℃、130r/min震荡培养20d得发酵液，过滤得液体菌种；
S4：营养土的制备：将沙壤土和草炭土按照2:1的比例混合均匀，然后加水配制含水量为15％的土壤，在温度121℃，压力0.1Mpa的条件下灭菌30min；
S5：幼虫体表消毒及接种：将S1中的幼虫用75％酒精擦拭后放入超净工作台上紫外消毒20min，然后用一次性的注射器吸取0.2ml的液体菌种注射到幼虫体内；
S6：前期培养管理：将S5中的幼虫放入S4制备的无菌营养土内，放置在10℃环境下避光培养16d；
S7：后期培养管理：将经S6中的培养的幼虫放在光照条件下培养，光照强度为50lx，培养温度为10℃12h，20℃12h，湿度为90％，待虫体表面布满菌丝，长出子座，转入弱光条件，温度为22℃，湿度90％，以上培养条件待子座成熟。
培养结束后，其虫体感染率45％，出草率为90％。
实施例4
S1：幼虫的选择：选择大小为6cm的疖蝙蝠蛾幼虫作为寄主；
S2：菌种选择：线虫草菌科真菌雪峰虫草菌；
S3：雪峰虫草菌种的制备：将复壮后的雪峰虫草斜面菌种分割成黄豆大小，每3块接种到PDA液体培养基中，于25℃、130r/min震荡培养15d得发酵液，过滤得液体菌种；
S4：营养土的制备：将沙壤土和草炭土按照2:1的比例混合均匀，然后加水配制含水量为20％的土壤，在温度121℃，压力0.1Mpa的条件下灭菌30min；
S5：幼虫体表消毒及接种：将S1中的幼虫用75％酒精擦拭后放入超净工作台上紫外消毒30min，然后用一次性的注射器吸取0.4ml的液体菌种注射到幼虫体内；
S6：前期培养管理：将S5中的幼虫放入S4制备的无菌营养土内，放置在13℃环境下避光培养20d；
S7：后期培养管理：将经S6中的培养的幼虫放在光照条件下培养，光照强度为0lx，培养温度为5℃12h，20℃12h，湿度为85％，待虫体表面布满菌丝，长出子座，转入弱光条件，温度为22℃，湿度90％，以上培养条件待子座成熟。
培养结束后，其虫体感染率70％，出草率为90％。
实施例5
S1：幼虫的选择：选择大小为8cm的疖蝙蝠蛾幼虫作为寄主；
S2：菌种选择：线虫草菌科真菌雪峰虫草菌；
S3：雪峰虫草菌种的制备：将复壮后的雪峰虫草斜面菌种分割成黄豆大小，每2块接种到PDA液体培养基中，于25℃、130r/min震荡培养20d得发酵液，过滤得液体菌种；
S4：营养土的制备：将沙壤土和草炭土按照2:1的比例混合均匀，然后加水配制含水量为30％的土壤，在温度121℃，压力0.1Mpa的条件下灭菌30min；
S5：幼虫体表消毒及接种：将S1中的幼虫用75％酒精擦拭后放入超净工作台上紫外消毒50min，然后用一次性的注射器吸取0.4ml的液体菌种注射到幼虫体内；
S6：前期培养管理：将S5中的幼虫放入S4制备的无菌营养土内，放置在13℃环境下避光培养20d；
S7：后期培养管理：将经S6中的培养的幼虫放在光照条件下培养，光照强度为0lx，培养温度为5℃12h，25℃12h，湿度为80％，待虫体表面布满菌丝，长出子座，转入弱光条件，温度为25℃，湿度90％，以上培养条件待子座成熟。
培养结束后，其虫体感染率73％，出草率为90％。
实施例6
S1：幼虫的选择：选择大小为5cm的疖蝙蝠蛾幼虫作为寄主；
S2：菌种选择：线虫草菌科真菌雪峰虫草菌；
S3：雪峰虫草菌种的制备：将复壮后的雪峰虫草斜面菌种分割成黄豆大小，每2块接种到PDA液体培养基中，于25℃、130r/min震荡培养17d得发酵液，过滤得液体菌种；
S4：营养土的制备：将沙壤土和草炭土按照2:1的比例混合均匀，然后加水配制含水量为22％的土壤，在温度121℃，压力0.1Mpa的条件下灭菌30min；
S5：幼虫体表消毒及接种：将S1中的幼虫用75％酒精擦拭后放入超净工作台上紫外消毒25min，然后用一次性的注射器吸取0.5ml的液体菌种注射到幼虫体内；
S6：前期培养管理：将S5中的幼虫放入S4制备的无菌营养土内，放置在9.5℃环境下避光培养23d；
S7：后期培养管理：将经S6中的培养的幼虫放在光照强度为250lx的条件下培养，培养温度为15℃12h，20℃12h，湿度为85％，待虫体表面布满菌丝，长出子座，转入弱光条件，温度为10℃，湿度90％，以上培养条件待子座成熟。
培养结束后，其虫体感染率50％，出草率为90％。
实施例7
S1：幼虫的选择：选择大小为7cm的疖蝙蝠蛾幼虫作为寄主；
S2：菌种选择：线虫草菌科真菌雪峰虫草菌；
S3：雪峰虫草菌种的制备：将复壮后的雪峰虫草斜面菌种分割成黄豆大小，每3块接种到PDA液体培养基中，于25℃、130r/min震荡培养18d得发酵液，过滤得液体菌种；
S4：营养土的制备：将沙壤土和草炭土按照2:1的比例混合均匀，然后加水配制含水量为27％的土壤，在温度121℃，压力0.1Mpa的条件下灭菌30min；
S5：幼虫体表消毒及接种：将S1中的幼虫用75％酒精擦拭后放入超净工作台上紫外消毒35min，然后用一次性的注射器吸取0.3ml的液体菌种注射到幼虫体内；
S6：前期培养管理：将S5中的幼虫放入S4制备的无菌营养土内，放置在15℃环境下避光培养30d；
S7：后期培养管理：将经S6中的培养的幼虫放在光照条件下培养，光照强度为125lx，培养温度为10℃12h，15℃12h，湿度为90％，待虫体表面布满菌丝，长出子座，转入弱光条件，温度为18℃，湿度90％，以上培养条件待子座成熟。
培养结束后，其虫体感染率60％，出草率为90％。
实施例中虫体感染率跟接种方法密切相关，菌液涂抹和浸泡的方法虫体感染雪峰虫草菌的概率为0，有的在培养期间甚至还蜕皮生长；而用注射的方法提高其感染率。感染率的高低还与培养温度有直接关系，前期温度太高容易造成杂菌污染，降低感染率，而持续低温会使菌丝生长缓慢，延长感染时间，甚至无法形成子座。在后期管理中，持续的高温导致子座生长细弱，所以一定的温差有利于形成健壮的子座，成功感染的幼虫其出草率高达90％。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种雪峰虫草的人工培育方法，其特征在于，方法步骤如下：
S1：幼虫选择：选择疖蝙蛾幼虫；
S2：菌种选择：线虫草菌科真菌雪峰虫草菌；
S3：菌种的制备：雪峰虫草斜面菌种分割成黄豆大小，每2-3块接种到PDA液体培养基中，于25℃、130r/min震荡培养15-20d得发酵液，过滤得液体菌种；
S4：营养土的制备：将沙壤土和草炭土按照2:1的比例混合均匀，然后加水至含水量为15-30％，再进行高温高压灭菌；
S5：幼虫体表消毒：先用75％的酒精擦拭，后紫外消毒，消毒时间20-50min；
S6：接种；
S7：培养管理。
2.根据权利要求1所述的一种雪峰虫草的人工培育方法，其特征在于，所述S1中的疖蝙蛾幼虫的长度4-8cm。
3.根据权利要求1所述的一种雪峰虫草的人工培育方法，其特征在于，所述S4中的高温高压为121℃、0.1Mpa，灭菌时间为30min。
4.根据权利要求1所述的一种雪峰虫草的人工培育方法，其特征在于，所述S6中的接种为涂抹法、浸泡法、注射法中的一种。
5.根据权利要求1所述的一种雪峰虫草的人工培育方法，其特征在于，所述S7中的培养管理方法步骤如下：
步骤1，将接种后的幼虫放入上述S4中的营养土内，放置在4-15℃环境下避光培养16-30d；
步骤2，转入光照强度为0-250lx,培养温度为5-15℃12h,15-25℃12h，湿度为80-90％的条件下培养至菌丝布满幼虫表面，长出子座；
步骤3，转入温度10-25℃，湿度90％，弱光培养至子座成熟。
6.权利要求1-6之一的方法得到的雪峰虫草。
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