CN104322272A - 一种以蚯蚓为载体培养人工蛹虫草的方法 - Google Patents

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Abstract

一种以蚯蚓为载体培养人工蛹虫草的方法，包括以下步骤：（1）筛选虫草菌菌株；（2）准备蚯蚓：收集活蚯蚓，用于培育蛹虫草子实体，晾干作宿主；（3）制作菌悬液：将出发菌株接种于PDA培养基平板上培养，并接种于一种液体培养基内培养，得到菌悬液；（4）接种：在无菌操作台内，吸取菌悬液注入宿主尾部或口器；（5）子座的培育：将接种蚯蚓放于无菌的玻璃瓶中，保护至其僵硬；然后将僵硬的蚯蚓置于自然光照的无菌培养室中培养，得到成熟子座；（6）收集保存虫草：将成熟子座收集烘干，置阴凉干燥处密封保存。该方法所得蛹虫草口感独特，营养价值高，具有很好的保健功能，可以适合各年龄阶段人群；同时显著提高蚯蚓的附加值。

Description

一种以蚯蚓为载体培养人工蛹虫草的方法
技术领域
本发明涉及一种以蚯蚓为载体培养人工蛹虫草的方法，属于药用菌栽培技术领域。 
背景技术
冬虫夏草是我国的一种名贵中药，由于它需要特殊的生长条件，生长期较长，因而在自然界中的数量十分稀少，目前市场价格达到每千克4万元左右。冬虫夏草列为国家二级保护物种，各地政府也出台政策禁挖、限挖，但对冬虫夏草的采挖并未得到遏制。蛹虫草是名贵的中药材，是冬虫夏草很好的替代品，具有很高的滋补保健价值和药用价值，而且蛹虫草和冬虫夏草在生物分类上同属于子囊菌纲肉座菌目麦角菌科虫草属。 
冬虫夏草菌寄生于蝙蝠蛾幼虫而形成，但现如今大部分蛹虫草都是利用大米粉等廉价培养基培育，如中国专利文献CN102428830A公开的《蛹虫草人工栽培技术》，CN103044119A公开的《一种蛹虫草培养基及其制备方法和应用》，CN103503689A公开的《一种利用豆渣栽培蛹虫草的方法及其培养基》，CN103539498A公开的《一种蛹虫草培养基及其应用》等，但是这些技术不能很好的模拟冬虫夏草菌的实际生长环境，所得虫草营养成份有限。 
所以，很多学者尝试采用黄粉虫和鸡蛋等培养基来培育蛹虫草，所得的蛹虫草和冬虫夏草药化成分及药理功能都非常相近。如CN102907256B公开的《一种柞蚕蛹虫草盒式培养方法》，包括蚕蛹清洗、消毒、接种、虫草培养，菌种用PDA液体培养基培养，培养基高温灭菌接种后摇床23℃左右培养至培养液较粘稠并有菌球出现，培养好的液体菌种过滤至无菌瓶内，菌球用菌液体积0.5-1倍的无菌水冲洗2-3次，整个过程无菌操作。接种时用注射器吸取菌液，从蚕蛹尾部数第二节处注射；接种后单层摆放于消过毒的培养室内，接种处变干结痂，转移到灭过菌的塑料盒内培养，至尾部僵化变硬、环节处有菌丝出现时摆放在有通气孔盒内，保持温、湿度，直至长出蛹虫草，采收，烘干。该方法温、湿度易控制、调节，能充分光照，易采收，虫草培养时间短、操作方便、出草整齐，成功率高达95％以上，虫草商品性好。 
蚯蚓，中药称地龙，其味咸性寒，功能为清热、镇痉、止喘、利尿。主治高热狂躁、惊风抽搐、头痛目赤、喘息痰热、中风、半身不遂等病证。地龙提取液有良好的定咳平喘的作用。蚯蚓灰与玫瑰油混合能治秃发。蚯蚓也具有很好的营养价值，据测定，蚯蚓的蛋白质含量约占干重的53.5％-65.1％，脂肪含量约为4.4％-17.38％，碳水化合物约为11％-17.4％，水分7.8％-23％。蚯蚓体内还含有丰富的维生素D(约占鲜体重的0.04％-0.073％)，以及钙和磷(约占鲜体重的0.124％-0.188％)等矿物质元素。蚯蚓体内含有地龙素、地龙解毒素、黄嘌呤、抗组织胺和维生素B等多种药用成分。鉴于以上蚯蚓药食两用的特点，本发明首次尝试采用蚯蚓为载体培育蛹虫草。 
CN101205519公开了一种《以地鳖虫为培养基培育蛹虫草的方法》，把地鳖虫进行粉碎与蚕蛹粉混合，配比为地鳖虫粉50－100％，蚕蛹粉0－50％，加水为1∶1.2－1.4，混合后装入容器，灭菌，接入蛹虫草菌种在一定的温度湿度等条件下，培养长出蛹虫草子实体。地 鳖虫的营养成份，与蚕蛹相似，但地鳖虫含有许多药用成份，这就使培育出的地鳖虫蛹虫草，不但具有蛹虫草的药效同时具有地鳖虫的药效。 
蚯蚓与地鳖虫特性不同，以地鳖虫为培养基培育蛹虫草的方法不能适用于以蚯蚓为载体的蛹虫草培养。目前，尚未有记载以蚯蚓为载体培养人工蛹虫草的文献。 
发明内容
本发明针对现有蛹虫草培养技术存在的不足以及尚没有以蚯蚓为载体培育蛹虫草的问题，提供一种能够制备成本低廉的蚯蚓蛹虫草的以蚯蚓为载体培养人工蛹虫草的方法，所得蚯蚓蛹虫草口感独特、营养丰富、保健功能强。 
本发明的以蚯蚓为载体培养人工蛹虫草的方法，包括以下步骤： 
(1)筛选虫草菌菌株：在20-23℃以及相对湿度65％的条件下，将蛹虫草菌株(任何蛹虫草均可以)接种于一种平板培养基上，该平板培养基的配方是蚯蚓粉末20g-40g、葡萄糖20g-40g和琼脂15g-20g，三者加水混合至体积1000mL，pH值自然，密封121℃灭菌20分钟，待菌丝体长满平板，反复筛选直至获得子座长度最长且性状稳定的蛹虫草纯菌株，以筛选的上述菌株作为出发菌株； 
(2)准备蚯蚓：收集活蚯蚓，用于培育蛹虫草子实体；在无菌操作台内，将活蚯蚓用75％酒精消毒8分钟-10分钟，用无菌水冲洗5-6次，晾干作宿主； 
(3)制作菌悬液：将出发菌株接种于PDA培养基(PDA培养基是马铃薯葡萄糖琼脂培养基的简称)平板上，置于20℃下培养，待长满菌丝后，挑取一块菌块(面积3cm2-4cm2)接种于一种液体培养基内培养，培养4-5天，得到菌悬液；所述液体培养基的配方为马铃薯150g-300g，葡萄糖20g-40g，加水混合至体积1000mL，pH值自然； 
上述液体培养基的制备过程是：马铃薯洗净去皮切成块，加水1000ml加热至沸腾，维持20分钟-30分钟，用纱布趁热过滤，滤渣弃取，加热滤液，加入葡萄糖，搅拌均匀，冷却后再加水至体积1000毫升，密封121℃灭菌20分钟-25分钟，冷却后贮存备用。 
(4)接种：在无菌操作台内，用无菌注射器吸取菌悬液注入宿主尾部或口器，每只蚯蚓的注入量为0.1毫升-0.15毫升，注射深度为0.1厘米-0.2厘米； 
(5)子座的培育：将接种蚯蚓放于无菌的玻璃瓶中，20℃下保护至其僵硬；然后将僵硬的蚯蚓置于15-25℃、空气相对湿度为85-95％的自然光照的无菌培养室中培养4周，得到成熟子座； 
(6)收集保存虫草：将成熟子座收集，放在60℃环境下烘干1-5小时，置阴凉干燥处密封保存。 
本发明用蛹虫草菌株制备菌悬液接种到活体蚯蚓上经人工培育而成蚯蚓蛹虫草，所得蛹虫草口感独特，营养价值高，具有很好的保健功能，可以适合各年龄阶段人群；同时显著提高蚯蚓的附加值，为蚯蚓产品深加工提供一条新的途径。 
本发明具有以下特点： 
1.独创性的选择具有药食两用的蚯蚓为载体来生产新型蛹虫草； 
2.蚯蚓作为人类食物有很长的食用历史，所以，利用蚯蚓来生产蛹虫草，它的食品安全性更高； 
3.丰富了现有蛹虫草的品种，所得蚯蚓蛹虫草口味独特，很好的改善了传统蛹虫草口味 差的技术难题； 
4.蚯蚓具有抗肿瘤作用，蚯蚓提取液中含有一些蛋白类物质，DNA、RNA、糖、维生素和微量元素等成分对抑制肿瘤的生长和提高细胞免疫功能有明显的效果；利用蚯蚓为培养基生产蛹虫草，则更加强化了蛹虫草的抗肿瘤和提高细胞免疫功能的效果。 
具体实施方式
实施例1 
(1)筛选虫草菌菌株：在20-23℃以及相对湿度65％的条件下，将蛹虫草菌株(任何蛹虫草均可以)接种于一种平板培养基上，该平板培养基的配方是蚯蚓粉末(20-100目)20g、葡萄糖30g和琼脂15g，三者加水混合至体积1000mL，pH值自然，密封121℃灭菌20分钟，待菌丝体长满平板，反复筛选直至获得子座长度最长且性状稳定的蛹虫草纯菌株，以筛选的上述菌株作为出发菌株； 
(2)准备蚯蚓：收集活蚯蚓，用于培育蛹虫草子实体；在无菌操作台内，将活蚯蚓用75％酒精消毒8分钟，用无菌水冲洗5次，晾干作宿主； 
(3)制作菌悬液：将出发菌株接种于PDA培养基(PDA培养基是马铃薯葡萄糖琼脂培养基的简称)平板上，置于20℃下培养，待长满菌丝后，挑取一块菌块(面积3cm2-4cm2)接种于一种液体培养基内培养，培养5天，得到菌悬液； 
所述液体培养基的配方为马铃薯150g，葡萄糖30g，加水混合至体积1000mL，pH值自然；制备过程是：马铃薯洗净去皮切成块，加水1000ml加热至沸腾，维持20分钟，用纱布趁热过滤，滤渣弃取，加热滤液，加入葡萄糖，搅拌均匀，冷却后再加水至体积1000毫升，密封121℃灭菌20分钟，冷却后贮存备用。 
(4)接种：在无菌操作台内，用无菌注射器吸取菌悬液注入宿主尾部或口器，每只蚯蚓的注入量为0.1毫升，注射深度为0.1厘米； 
(5)子座的培育：将接种蚯蚓放于无菌的玻璃瓶中，20℃下保护至其僵硬；然后将僵硬的蚯蚓置于15℃、空气相对湿度为85％的自然光照的无菌培养室中培养4周，得到成熟子座； 
(6)虫草的收集保存：将成熟子座收集，放在60℃环境下烘干3小时，置阴凉干燥处密封保存。 
对本发明制得的蚯蚓蛹虫草的活性成份含量进行检测，并与市售、利用大米粉等廉价培养基培育的蛹虫草进行比较，见下表： 
通过上述数据可以看出，本发明的蚯蚓蛹虫草活性成份含量明显高于市售蛹虫草。 
实施例2 
(1)筛选虫草菌菌株：在20-23℃以及相对湿度65％的条件下，将蛹虫草菌株(任何蛹 虫草均可以)接种于一种平板培养基上，该平板培养基的配方是蚯蚓粉末30g、葡萄糖20g和琼脂20g，三者加水混合至体积1000mL，pH值自然，密封121℃灭菌20分钟，待菌丝体长满平板，反复筛选直至获得子座长度最长且性状稳定的蛹虫草纯菌株，以筛选的上述菌株作为出发菌株； 
(2)准备蚯蚓：收集活蚯蚓，用于培育蛹虫草子实体；在无菌操作台内，将活蚯蚓用75％酒精消毒9分钟，用无菌水冲洗5次，晾干作宿主； 
(3)制作菌悬液：将出发菌株接种于PDA培养基(PDA培养基是马铃薯葡萄糖琼脂培养基的简称)平板上，置于20℃下培养，待长满菌丝后，挑取一块菌块(面积3cm2-4cm2)接种于一种液体培养基内培养，培养4.5天，得到菌悬液； 
所述液体培养基的配方为马铃薯240g，葡萄糖20g，加水混合至体积1000mL，pH值自然；制备过程是：马铃薯洗净去皮切成块，加水1000ml加热至沸腾，维持25分钟，用纱布趁热过滤，滤渣弃取，加热滤液，加入葡萄糖，搅拌均匀，冷却后再加水至体积1000毫升，密封121℃灭菌23分钟，冷却后贮存备用。 
(4)接种：在无菌操作台内，用无菌注射器吸取菌悬液注入宿主尾部或口器，每只蚯蚓的注入量为0.15毫升，注射深度为0.15厘米； 
(5)子座的培育：将接种蚯蚓放于无菌的玻璃瓶中，20℃下保护至其僵硬；然后将僵硬的蚯蚓置于25℃、空气相对湿度为95％的自然光照的无菌培养室中培养4周，得到成熟子座； 
(6)虫草的收集保存：将成熟子座收集，放在60℃环境下烘干1小时，置阴凉干燥处密封保存。 
实施例3 
(1)筛选虫草菌菌株：在20-23℃以及相对湿度65％的条件下，将蛹虫草菌株(任何蛹虫草均可以)接种于一种平板培养基上，该平板培养基的配方是蚯蚓粉末40g、葡萄糖40g和琼脂18g，三者加水混合至体积1000mL，pH值自然，密封121℃灭菌20分钟，待菌丝体长满平板，反复筛选直至获得子座长度最长且性状稳定的蛹虫草纯菌株，以筛选的上述菌株作为出发菌株； 
(2)准备蚯蚓：收集活蚯蚓，用于培育蛹虫草子实体；在无菌操作台内，将活蚯蚓用75％酒精消毒10分钟，用无菌水冲洗6次，晾干作宿主； 
(3)制作菌悬液：将出发菌株接种于PDA培养基(PDA培养基是马铃薯葡萄糖琼脂培养基的简称)平板上，置于20℃下培养，待长满菌丝后，挑取一块菌块(面积3cm2-4cm2)接种于一种液体培养基内培养，培养4天，得到菌悬液； 
所述液体培养基的配方为马铃薯300g，葡萄糖40g，加水混合至体积1000mL，pH值自然；制备过程是：马铃薯洗净去皮切成块，加水1000ml加热至沸腾，维持30分钟，用纱布趁热过滤，滤渣弃取，加热滤液，加入葡萄糖，搅拌均匀，冷却后再加水至体积1000毫升，密封121℃灭菌25分钟，冷却后贮存备用。 
(4)接种：在无菌操作台内，用无菌注射器吸取菌悬液注入宿主尾部或口器，每只蚯蚓的注入量为0.12毫升，注射深度为0.2厘米； 
(5)子座的培育：将接种蚯蚓放于无菌的玻璃瓶中，20℃下保护至其僵硬；然后将僵硬的蚯蚓置于20℃、空气相对湿度为90％的自然光照的无菌培养室中培养4周，得到成熟子座； 
(6)虫草的收集保存：将成熟子座收集，放在60℃环境下烘干5小时，置阴凉干燥处密封保存。 

Claims (3)

1.一种以蚯蚓为载体培养人工蛹虫草的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）筛选虫草菌菌株：在20-23℃以及相对湿度65%的条件下，将蛹虫草菌株接种于一种平板培养基上，该平板培养基的配方是蚯蚓粉末20g-40g、葡萄糖20g-40g和琼脂15g-20g，三者加水混合至体积1000mL，pH值自然，待菌丝体长满平板，反复筛选直至获得子座长度最长且性状稳定的蛹虫草纯菌株，以筛选的上述菌株作为出发菌株；
（2）准备蚯蚓：收集活蚯蚓，用于培育蛹虫草子实体；在无菌操作台内，将活蚯蚓用75％酒精消毒8分钟-10分钟，用无菌水冲洗5-6次，晾干作宿主；
（3）制作菌悬液：将出发菌株接种于PDA培养基平板上，置于20℃下培养，待长满菌丝后，挑取一块菌块接种于一种液体培养基内培养，培养4-5天，得到菌悬液；所述液体培养基的配方为马铃薯150g-300g，葡萄糖20g-40g，加水至体积1000mL，pH值自然；
（4）接种：在无菌操作台内，用无菌注射器吸取菌悬液注入宿主尾部或口器，每只蚯蚓的注入量为0.1毫升-0.15毫升，注射深度为0.1厘米-0.2厘米；
（5）子座的培育：将接种蚯蚓放于无菌的玻璃瓶中，20℃下保护至其僵硬；然后将僵硬的蚯蚓置于15-25℃、空气相对湿度为85-95％的自然光照的无菌培养室中培养4周，得到成熟子座；
（6）收集保存虫草：将成熟子座收集，放在60℃环境下烘干1-5小时，置阴凉干燥处密封保存。
2.根据权利要求1所述以蚯蚓为载体培养人工蛹虫草的方法，其特征在于，所述步骤（3）中液体培养基的制备过程是：马铃薯洗净去皮切成块，加水1000ml加热至沸腾，维持20分钟-30分钟，用纱布趁热过滤，滤渣弃取，加热滤液，加入葡萄糖，搅拌均匀，冷却后再加水至体积1000毫升，密封121℃灭菌20分钟-25分钟，冷却后贮存备用。
3.一种用权利要求1所述以蚯蚓为载体培养人工蛹虫草的方法制备的蚯蚓蛹虫草产品。
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