CN102850462B

CN102850462B - 松乳菇多糖及其应用

Info

Publication number: CN102850462B
Application number: CN201210078709.4A
Authority: CN
Inventors: 丁祥; 侯怡铃; 侯万儒
Original assignee: China West Normal University
Current assignee: China West Normal University
Priority date: 2012-03-23
Filing date: 2012-03-23
Publication date: 2016-04-27
Anticipated expiration: 2032-03-23
Also published as: CN102850462A

Abstract

本发明公开了松乳菇多糖的结构及其应用，松乳菇多糖是由两个单糖组成的杂多糖，即α-L-甘露糖和α-D-木糖以3∶1的比例组成，平均分子量约为1.1×10⁴D，具有(1-6)α-L-甘露糖的骨架，2-O上连接一个→3)-α-D-木糖的侧链，一定剂量的松乳菇多糖能够显著抑制移植性肿瘤S180的生长。在腹腔注射给药20mg/Kg.d、40mg/Kg.d、80mg/Kg.d组(L1、L2、L3组)其抑瘤率分别为44.358％、52.326％、68.422％，而浓度为20mg/Kg阳性对照组甘露聚糖肽(M)抑瘤率为57.727％，且对小鼠脏器均无明显的损伤、无毒副作用，能够显著提高其免疫力。

Description

松乳菇多糖及其应用

技术领域

本发明涉及真菌多糖提取及应用技术领域，尤其涉及的是松乳菇多糖及其应用。

背景技术

真菌多糖一般是指各种真菌的子实体和菌丝体所产生的一类代谢产物，可分为纯多糖和杂多糖两类，纯多糖一般由10个以上的单糖通过糖苷键连接而成，可分为直链结构，也可有分支结构。杂多糖除含有糖链外，还可含有肽链或脂类成份。真菌多糖(polysaccharides)又称多聚糖，是生物有机体内普遍存在的一类生物大分子，不仅参与组织细胞骨架的构成，而且是多种内源性生物活性分子的重要组成成分。20世纪60年代前，在分子生物学研究中，除核糖外很少涉及其他糖类。自1958年Brander报道了酵母细胞壁多糖(Zymosan)具有抗肿瘤作用以来，人们对真菌多糖产生了浓厚的兴趣，并对真菌多糖的化学结构和生物活性进行了深入细致的研究，已经取得了丰硕的成果。近20年来，已有大量关于真菌多糖生物活性的研究报道，主要集中在抗肿瘤、免疫调节、抗突变、抗病毒、降血脂、降血糖、抗氧化、抗辐照和抗溃疡等方面，其作用是多途径、多环节、多靶点的。在国际上，真菌多糖被称为“生物反应调节物(BiologicalResponseModifier)”，简称“BRM”，体现了其显著的免疫调节活性其中，如促进免疫细胞增殖与分化，激活T细胞和B细胞，分泌各种淋巴因子，调节神经-内分泌-免疫调节网络(NIM)的平衡，增强网状内皮系统吞噬肿瘤细胞的作用，并促进抗体的形成以及DNA、RNA、蛋白质的合成等，从而在一定程度上具有抗肿瘤的活性，对一些易发生广泛转移，不粗采取手术治疗和放射疗法的白血病，淋巴瘤等，特别有价值。目前，肿瘤药物发展战略是以占恶性肿瘤90％以上的实体瘤为主要研究对象，从天然产物中寻找抗肿瘤的活性成分，针对肿瘤发生发展机制寻找新的酶、受体、基因等分子作用靶点。真菌多糖及其复合物的研究引起越来越多的关注，已成为分子生物学、医药学、食品科学等领域的研究热点之一。迄今为止，人类在核酸和蛋白质的研究方面取得了重大进展，推动了生命科学及相关科学领域发展，多糖将成为最后一类有待攻破的生物活性大分子。

松乳菇，拉丁学名为Lactariusdeliciosus(L.exFr.)Gray，它是Fires在1921年命名的。英文俗名叫“Saffronmilkcap”，意为它的颜色近于藏红花橙红色。松乳菇属红菇科、乳菇属，在中国其俗名很多，又名美味松乳菇、松树蘑、松菌、寒菌、乌松菌、紫花菌、奶浆菌等，它的营养丰富，味香汁鲜，脆嫩可口，是一种深受欢迎的纯天然的珍稀名贵食用菌类，被誉为“菌中王子”。子实体中等至大型，菌盖直径4-10(15)cm，扁半球形，中央粘状，伸后下凹，边缘最初内卷，后平展，湿时粘，无毛，虾仁色，胡萝卜黄色或深橙色，花纹酷似松树的年轮。。菌柄长2-5cm，粗0.7-2cm，近圆柱形并向基部渐细，有时具暗橙色凹窝，色同菌褶或更浅，内部松软后变中空，菌柄切面先变橙红色，后变暗红色。此菌是外生菌根菌，夏秋季在阔叶林中地上单生或群生，可与松衫、铁衫、冷衫、高山松马尾形成菌根。

目前，对松乳菇多糖的结构与活性研究及其应用尚未见任何报道。

发明内容

本发明提供了松乳菇多糖的结构，松乳菇多糖是由两个单糖组成的杂多糖，即α-L-甘露糖和α-D-木糖以3∶1的比例组成，平均分子量约为1.1×10⁴D，具有(1-6)α-L-甘露糖的骨架，2-O上连接一个→3)-α-D-木糖的侧链，松乳菇多糖的结

构式为：

本发明还提供了松乳菇多糖在制备抑制肿瘤药物中的应用。

一定剂量的松乳菇多糖能够显著抑制移植性肿瘤S180的生长。在腹腔注射给药20mg/Kg.d、40mg/Kg.d、80mg/Kg.d组(L1、L2、L3组)其抑瘤率分别为44.358％、52.326％、68.422％，而浓度为20mg/Kg阳性对照组甘露聚糖肽(M组)抑瘤率为57.727％，且对小鼠脏器均无明显的损伤、无毒副作用，能够显著提高其免疫力。

附图说明

图1松乳菇纯多糖重均分子量；

图2松乳菇的红外谱；

图3松乳菇多糖的1HNMR图谱；

图4松乳菇多糖的13CNMR图谱；

图5松乳菇多糖的结构；

图6松乳菇多糖的原子力学显微镜立体图形貌；

图7松乳菇多糖对小鼠S180肉瘤的抑制作用(mean±SD，n＝6)。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例，对本发明进行详细说明。

实施例1松乳菇多糖的分离提取

常用的大型食、药用真菌多糖的提取方法，主要有溶剂浸提法、超声波浸提法、微波浸提法、超临界萃取法和酶法等五种提取技术。经过除杂、粉碎、预处理、热水浸提、醇沉处理后，得到松乳菇多糖粗提物。我们运用DEAE-cellulosecolumn和SephadexG-100column进行分离纯化。其提取分离与纯化的工艺流程为：原料→破碎→脱脂→溶剂提取→提取液→离心→浓缩→透析→醇沉→除蛋白→粗多糖→柱层析→分布收集→浓缩干燥→纯度鉴定。

1.1材料

1.1.1菌株

采集新鲜松乳菇子实体，由四川大学生命科学学院杨志荣教授鉴定，其松乳菇子实体样本均于4℃条件下保存。

1.1.2试剂

氯仿、正丁醇、2.5～3％的戊二醛、30％，50％，70％，90％，100％的乙醇，浓硫酸、苯酚、DEAE-cellulosecolumn、SephadexG-100column

1.1.3仪器

721型分光光度计(上海第三分析仪器厂)；扫描式电子显微镜(AV11-600MH日本电子JEOL)；低俗离心机(TDL-40Bantrituge)；真空冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)；ZFO-85^a旋转蒸发器(上海医械专机厂)；BSZ-160型自动部分收集器(上海沪西分析仪器厂)；粉碎机(PHILIPSHR1375/A巴西)；电子天平(METTLERTOLEDO)；HL-2恒流泵(上海沪西分析仪器厂)

1.2方法

1.2.1松乳菇多糖的提取

采集新鲜松乳菇，洗净、阴凉处晾干，机械绞碎，再用无水乙醇浸泡2小时，提取脂溶性物质并除杂。残渣挥干乙醇，90℃用蒸馏水提取3次，每次6小时。合并3次水提取液，减压浓缩、4℃预冷后加入4倍体积无水乙醇醇沉，离心收集沉淀。然后再取少量上清液继续加入无水乙醇，无沉淀产生，说明多糖己完全沉淀。再用适量蒸馏水溶解沉淀，对蒸馏水透析48小时(截留分子量为5000)，收集透析袋内溶液，离心，弃去沉淀，上清液经冷冻干燥即得松乳菇总多糖。

1.2.2粗多糖除蛋白

称取0.5g松乳菇粗多糖充分溶于50mlddH₂O中，用Na₂CO₃稀溶液调PH为7.8，加入胰蛋白酶0.08，甲苯2ml，39℃恒温水解12h，按糖液总体积1/4加入Sevage试剂(氯仿∶正丁醇＝4∶1)，充分振荡1～2小时，静止，离心，取上清重复，至无游离蛋白为止。

1.2.3透析除去小分子

采用截留分子量8000的透析袋，剪取适当长度的透析袋，用透析袋夹子夹住一端，然后灌入除蛋白后多糖溶液，再用透析袋夹子夹住另一端，放入一只大烧杯中，用一导管将水通入烧杯底部，逆向对流水透析48h，以除去小分子的无机盐、低聚糖等杂质，即得到松乳菇粗多糖。然后通过2540-UV紫外分光光度计200-700nm进行全波段扫描，以检测蛋白是否被完全去除。

1.2.4松乳菇多糖的分级纯化

1.2.4.1DEAEcellulose-52色谱柱层析

将上述除杂后的松乳菇多糖(TMP)配制成10％溶液，上样DEAEcelluse-52离子交换柱(3.5×40cm)10ml，分别以0mol/L、0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L、0.5mol/LNacl为流动洗脱相，流速为0.5ml、min，用自动部分收集器以每管5ml收集洗脱液，将收集到的样品溶液用苯酚-硫酸法在595nm波长下比色检测多糖，以试管数为横坐标，以吸光度值为纵坐标，做DEAE-celluse52色谱柱层析洗脱曲线图。然后合并各个主峰溶液，低压冷冻干燥，得到松乳菇多糖级分。

1.2.4.2SephadexG-100凝胶色谱柱层析纯化

自然沉降法装SephadexG-100凝胶色谱柱(2×60cm)，脱气后用ddH₂O(1000ml)平衡层析柱，流速为每分钟3滴。取100mg松乳菇多糖级分溶于5mlddH₂O中，上样于SephadexG-100凝胶色谱柱(2×60cm)，以ddH2O为流动相，流速为每分钟3滴，用自动部分收集器以每管5ml收集洗脱液，将收集到的样品溶液用苯酚-硫酸法在595nm波长下比色检测多糖，以试管数为横坐标，以吸光度值为纵坐标，做SephadexG-100凝胶色谱柱层析洗脱曲线图。然后合并各个主峰溶液，低压冷冻干燥，得到松乳菇纯多糖级分。

1.3.松乳菇多糖的结构鉴定

真菌多糖是由10个以上的单糖构成的生物大分子，其单糖组成可相同或不相同，而且单糖之间的链的链接方式和位置很多，可以形成直连或者带有分支的支链，这样就导致了多糖一级结构更为复杂，另外其可通过分子之间的氢键和各个基团之间的相互作用又能形成不同形式的高级结构而造成结构上的不同，因此其结构远比蛋白质和核酸复杂的多。运用水解、甲基化分析、气相色谱和质谱联用技术(GC-MS)、扫描电镜技术(SEM)、红外谱技术(IR)、核磁共振技术(NMR)，对松乳菇纯品多糖进行结构解析。

1.3.1试剂

乙醇、氯化钠、盐酸、氢氧化钠、苯酚、硫酸、丙酮、重水、吡啶、三氟乙酸

1.3.2仪器

WZZ-2A旋光仪(上海宇隆仪器有限公司)；AJ-III原子力学显微镜(上海爱建纳米公司)；Vector型傅立叶变换红外光谱仪(德国BRUKER公司)；扫描式电子显微镜(AV11-600MH日本电子JEOL)；721型分光光度计(上海第三分析仪器厂)；真空冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)；GC-MS(日本岛津公司)；BRUKERADVANCEDMX500核磁共振仪(德国BRUKER公司)；KXS恒温水浴锅：上海科析实验仪器厂；DZF-200型真空干燥箱：上海浦东东荣丰科学仪器有限公司上海浦东跃欣科学仪器厂；SH21-1恒温磁力搅拌器：上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司；J-25I高速冷冻离心机：BeckmanCoulter，美国；PA92-F112I型电子分析天平：SartoriusLimited，GermanyOlympus；显微镜(BH-2型)：Japan，Tokyo；BECKMAN高速冷冻离心机(J-25I型)USA；Herine多功能食品捣碎机：上海海菱电器有限公司。

1.3.3方法

1.3.3.1分子量的测定

将3mg松乳菇多糖样品溶解于1mlddH₂O中，超声5min，进行HPGPC分析，数据用GPC软件分析后与标准曲线对照测得分子量1.1×10⁴D(标准品T-10，20，50，80，130)。

1.3.3.2松乳菇多糖的硅烷化衍生与甲基化分析

将标准单糖和上述干燥后水解产物进行硅烷化衍生步骤如下：1.0mg的样品溶解于0.2ml的无水吡啶，然后加0.2ml的六甲基二硅氮烷和0.1mg的三甲基氯硅烷，50℃温育20min，然后10000rpm离心20min，取上层溶液用于甲基化分析。

1.3.3.3松乳菇多糖GC-MS谱分析

GC条件：色谱柱：Rtx-5silMS(5％phenylmethylsiloxane30mm×0.25mm×0.25μm)；

进样器温度、GC-MS界面温度、离子源温度和检测器温度分别为250、250、230和250℃，升温程序：载气：高纯氦气。

1.3.3.4松乳菇多糖的红外谱分析

当松乳菇多糖样品2mg左右，KBr压片，红外分光光度计4000cm^-1-400cm^-1。

1.3.3.5松乳菇多糖的核磁共振分析

取松乳菇多糖样品10mg左右溶于0.5mL重水(D₂O)中，在核磁共振仪上常温测定，400MHz测¹HNMR谱，400MHz测¹³CNMR谱。

1.3.3.6松乳菇多糖的原子力学显微镜检测

用胶带纸将云母片表面剥离，得到新鲜的云母，然后吹净云母表面上由于剥离而产生的碎片，备用。取少量样品用去离子水配制最终的浓度为25μg/mL，吸取20μl样品溶液滴在新鲜云母表面，室温干燥约15min，然后用定性滤纸吸去多余溶液，待样片干燥后进行原子力学显微镜检测。针尖为Si；轻敲模式(TappingMode)下获得图像，接触作用力控制在3-4nN量级以内；扫描范围1.000×1.000μm；扫描频率1.001Hz；常温(20℃)；恒力模式采集图象，为了消除慢扫方向的低频噪音，图像均通过平滑处理。

1.3.4结果

1.3.4.1松乳菇多糖的基本性质结果

松乳菇纯多糖重均分子量为1.1×10⁴D(见图1)。

1.3.4.2松乳菇多糖的FTIR谱分析

如图2所示，松乳菇多糖在红外谱中显示3412.67cm^-1的宽吸收峰指定为O-H和N-H伸缩振动峰，存在着分子内和分子间的氢键。2925.85cm^-1指定为-CH2，-CH3的伸缩振动峰。2127.55cm^-1指定为-CH₂，-CH₃的伸缩振动峰。1638.75cm^-1指定为C＝O，C＝C振动峰。1148.96cm^-1，1075.57cm^-1在1200-1000cm^-1范围内指定为-COOH中的C-O-H伸缩振动和吡喃环中醚键C-O-C伸缩振动。800.720cm^-1指示松乳菇多糖有α型吡喃环。

1.3.4.3松乳菇多糖的NMR谱分析

异头氢信号δ5.046，δ5.155指示在松乳菇多糖中α型异头氢存在(见图3)，且两者均与红外谱显示相一致。在碳谱中¹³CNMR(400MHz)98-106ppm区域的共振信号峰归属于α-L-甘露糖和α-D-木糖的碳质子信号(见图4，表1)。

表1松乳菇多糖的¹³CNMR图中的化学位移

1.3.4.4松乳菇多糖的GC-MS谱分析结果

从松乳菇中获得一个结构新颖的由两个单糖组成的杂多糖，即α-L-甘露糖和α-D-木糖以3∶1的比例组成，平均分子量约为1.1×10⁴D，具有(1-6)α-L-甘露糖的骨架，2-O上连接一个→3)-α-D-木糖的侧链(表2)，综上可初步推断松乳菇多糖的结构(见图5)。

表2松乳菇多糖的甲基化GC-MS数据

1.3.4.5松乳菇多糖的原子力学显微镜分析结果

松乳菇多糖在原子力学显微镜下观测，如图6所示松乳菇多糖球状团块直径和高度约为80nm。

实施例2松乳菇多糖的抗肿瘤活性研究

研究松乳菇多糖的免疫调节活性，为松乳菇多糖的应用推广提供理论依据。在体内我们通过腹腔注射松乳菇多糖，检测其对小鼠S180实体瘤的抑制作用实验，以检测其抗肿瘤活性。

2.1材料

2.1.2试剂

甘露聚糖肽

2.1.3仪器

生物解剖镜：湖南长沙创高科技有限公司；DZF-200型真空干燥箱：上海浦东东荣丰科学仪器有限公司上海浦东跃欣科学仪器厂；SH21-1恒温磁力搅拌器：上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司；J-25I高速冷冻离心机：BeckmanCoulter，美国；PA92-F112I型电子分析天平：SartoriusLimited，GermanyOlympus；显微镜(BH-2型)：Japan，Tokyo；BECKMAN高速冷冻离心机(J-25I型)USA；Herine多功能食品捣碎机：上海海菱电器有限公司。

2.2方法

2.2.1实验动物

实验所用动物昆明种小鼠，购于川北医学院动物实验中心。

2.2实验动物饲养

清洁级雄性、雌性昆明种小鼠(川北医学院动物实验中心提供)，体重30±2g，常规饲养(自然采光，自由进食，饮水温度25±3℃，通风)，按实验需要随机分组，每组8只，适应性喂养2d后开始实验。

2.3松乳菇多糖体内抑制肿瘤实验

2.3.1小鼠体内接种S180瘤细胞株

无菌获取接种七天的S180瘤种鼠腹水，以生理盐水调细胞数为2×10⁶/mL，每只小鼠右前腋下接种0.2mL。

2.3.2分组和实验方法

实验随机分为荷瘤对照组(M)、20mg/Kg.d、40mg/Kg.d、80mg/Kg.d的松乳菇多糖实验组(L1、L2、L3)和20mg/Kg.d的甘露聚糖肽阳性对照组(M组)。正常对照组(N组)不接种S180瘤细胞株，接种后第二天开始腹腔注射，对照组注射等量的生理盐水，连续7天，第14天处死小鼠，称量小鼠体重后，取出瘤块、脾脏、肝脏、胸腺并称重。按下列公式分别计算抑瘤率、脏器指数。

抑瘤率(％)＝(对照组平均瘤重-剂量组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100

脏器指数＝脏器重量(mg)/体重(g)

2.4统计方法与分析

所得数据均用mean±SD表示，差异的显著性用t-test检验，*为与对照组t检验呈显著，P＜0.05，**为极显著，P＜0.01。

3结果

3.1松乳菇多糖体内抑制肿瘤实验结果

由表3和图7所示。一定剂量的松乳菇多糖能够显著抑制移植性肿瘤S180的生长。在腹腔注射给药20mg/Kg.d、40mg/Kg.d、80mg/Kg.d组(L1、L2、L3组)其抑瘤率分别为44.358％、52.326％、68.422％，而浓度为20mg/Kg阳性对照组甘露聚糖肽(M组)抑瘤率为57.727％，且对小鼠脏器均无明显的损伤、无毒副作用，能够显著提高其免疫力。

表3各浓度松乳菇多糖对小鼠S180肉瘤的抑制作用(mean±SD，n＝6)

*为与对照组t检验呈显著，P＜0.05，**为极显著，P＜0.01。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims

1.松乳菇多糖，其特征在于，松乳菇多糖是由两个单糖组成的杂多糖，即α-L-甘露糖和α-D-木糖以3∶1的比例组成，平均分子量约为1.1×10⁴D，具有(1-6)α-L-甘露糖的骨架，2-0上连接一个→3)-α-D-木糖的侧链，松乳菇多糖的结构式为：

松乳菇多糖的提取：采集新鲜松乳菇，洗净、阴凉处晾干，机械绞碎，再用无水乙醇浸泡2小时，提取脂溶性物质并除杂，残渣挥干乙醇，90℃用蒸馏水提取3次，每次6小时，合并3次水提取液，减压浓缩、4℃预冷后加入4倍体积无水乙醇醇沉，离心收集沉淀，然后再取少量上清液继续加入无水乙醇，无沉淀产生，说明多糖已完全沉淀，再用适量蒸馏水溶解沉淀，对蒸馏水透析48小时，截留分子量为5000，收集透析袋内溶液，离心，弃去沉淀，上清液经冷冻干燥即得松乳菇总多糖。