CN102432692A

CN102432692A - 华美牛肝菌多糖

Info

Publication number: CN102432692A
Application number: CN2011104426635A
Authority: CN
Inventors: 丁祥; 侯怡铃; 侯万儒
Original assignee: China West Normal University
Current assignee: China West Normal University
Priority date: 2011-12-27
Filing date: 2011-12-27
Publication date: 2012-05-02

Abstract

本发明公开了华美牛肝菌多糖的结构，由两个单糖组成的杂多糖，即α-L-甘露糖和α-D-半乳糖以2∶1的比例组成，平均分子量约为1.3×10⁴D，具有(1-4)α-L-甘露糖的骨架，6-O上连接一个→1)-α-D-半乳糖的侧链。纯化的华美牛肝菌多糖样品多DPPH自由基有很好的清除活性，其消除DPPH自由基的IC50值约为7-4mg/ml，剂量越大，效果越好。华美牛肝菌多糖对ABTS⁺阳离子自由基清除的活性实验结果表明，华美牛肝菌多糖消除ABTS⁺阳离子自由基的IC50值约为5.02mg/ml，剂量越大，效果越好。

Description

华美牛肝菌多糖

技术领域

本发明涉及华美牛肝菌多糖的结构，属于生物医药技术领域。

背景技术

真菌多糖一般是指各种真菌的子实体和菌丝体所产生的一类代谢产物，可分为纯多糖和杂多糖两类，纯多糖一般由10个以上的单糖通过糖苷键连接而成，可分为直链结构，也可有分支结构。杂多糖除含有糖链外，还可含有肽链或脂类成份。真菌多糖(polysaccharides)又称多聚糖，是生物有机体内普遍存在的一类生物大分子，不仅参与组织细胞骨架的构成，而且是多种内源性生物活性分子的重要组成成分。20世纪60年代前，在分子生物学研究中，除核糖外很少涉及其他糖类。自1958年Brander报道了酵母细胞壁多糖(Zymosan)具有抗肿瘤作用以来，人们对真菌多糖产生了浓厚的兴趣，并对真菌多糖的化学结构和生物活性进行了深入细致的研究，已经取得了丰硕的成果。近20年来，已有大量关于真菌多糖生物活性的研究报道，主要集中在抗肿瘤、免疫调节、抗突变、抗病毒、降血脂、降血糖、抗氧化、抗辐照和抗溃疡等方面，其作用是多途径、多环节、多靶点的。在国际上，真菌多糖被称为“生物反应调节物(Biological Response Modifier)”，简称“BRM”，体现了其显著的免疫调节活性其中，如促进免疫细胞增殖与分化，激活T细胞和B细胞，分泌各种淋巴因子，调节神经-内分泌-免疫调节网络(NIM)的平衡，增强网状内皮系统吞噬肿瘤细胞的作用，并促进抗体的形成以及DNA、RNA、蛋白质的合成等，从而在一定程度上具有抗肿瘤的活性，对一些易发生广泛转移，不粗采取手术治疗和放射疗法的白血病，淋巴瘤等，特别有价值。目前，肿瘤药物发展战略是以占恶性肿瘤90％以上的实体瘤为主要研究对象，从天然产物中寻找抗肿瘤的活性成分，针对肿瘤发生发展机制寻找新的酶、受体、基因等分子作用靶点。真菌多糖及其复合物的研究引起越来越多的关注，已成为分子生物学、医药学、食品科学等领域的研究热点之一。迄今为止，人类在核酸和蛋白质的研究方面取得了重大进展，推动了生命科学及相关科学领域发展，多糖将成为最后一类有待攻破的生物活性大分子。

华美牛肝菌，拉丁学名为Boletus speciosus Forst，中文别名：风手青、粉盖牛肝菌、小美牛肝菌。子实体较大，菌盖浅粉肉桂色至浅土黄色，直径8-16cm，扁半球形至扁平，具绒毛。菌肉受伤处变蓝色。菌柄长4.5-11cm，粗1.8-4cm，菌柄具网纹，上部黄色，下基部近似盖色。菌管层绿黄色，凹生，受伤处变蓝色，管口圆形，每毫米2-3个。孢子浅黄色，近梭形，光滑，10-12×3.5-4μm。管侧囊体梭形至长纺锤形，50-65μm×9-15μm。此种我国西南地区，包括江苏、云南、四川、贵州、西藏、广东、广西等地食用较普遍，且味道较好。该菌可药用治消化不良、腹胀，属树木的外生菌根菌，夏秋季在混交林地上分散或成群生长。

目前，对华美牛肝菌多糖的结构与活性研究及其应用尚未见任何报道。

发明内容

本发明公开了华美牛肝菌多糖的结构。

华美牛肝菌多糖是由两个单糖组成的杂多糖，即α-L-甘露糖和α-D-半乳糖以2∶1的比例组成，平均分子量约为1.3×104D，具有(1-4)α-L-甘露糖的骨架，6-O上连接一个→1)-α-D-半乳糖的侧链，结构式如下：

纯化的华美牛肝菌多糖样品多DPPH自由基有很好的清除活性，其消除DPPH自由基的IC50值约为7.4mg/mL，剂量越大，效果越好。

华美牛肝菌多糖对ABTS+阳离子自由基清除的活性实验结果表明，华美牛肝菌多糖消除ABTS+阳离子自由基的IC50值约为5.02mg/ml，剂量越大，效果越好。

附图说明

图1为华美牛肝菌多糖的红外谱；

图2为华美牛肝菌多糖的1H NMR图谱；

图3为华美牛肝菌多糖的13C NMR图谱；

图4为华美牛肝菌多糖对DPPH-自由基清除活性的实验结果；

图5为华美牛肝菌多糖对ABTS+阳离子自由基清除的活性的实验结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

实施例1

1.2.1华美牛肝菌多糖的提取

采集新鲜华美牛肝菌，洗净、阴凉处晾干，机械绞碎，再用无水乙醇浸泡2小时，提取脂溶性物质并除杂。残渣挥干乙醇，90℃用蒸馏水提取3次，每次6小时。合并3次水提取液，减压浓缩、4℃预冷后加入4倍体积无水乙醇醇沉，离心收集沉淀。然后再取少量上清液继续加入无水乙醇，无沉淀产生，说明多糖已完全沉淀。再用适量蒸馏水溶解沉淀，对蒸馏水透析48小时(截留分子量为5000)，收集透析袋内溶液，离心，弃去沉淀，上清液经冷冻干燥即得华美牛肝菌粗多糖。

1.2.2粗多糖除蛋白

称取0.5g华美牛肝菌粗多糖充分溶于50ml ddH2O中，用Na2CO3稀溶液调PH为7.8，加入胰蛋白酶0.08，甲苯2ml，39℃恒温水解12h，按糖液总体积1/4加入Sevage试剂(氯仿∶正丁醇＝4∶1)，充分振荡1～2小时，静止，离心，取上清重复，至无游离蛋白为止。

1.2.3透析除去小分子

采用截留分子量8000的透析袋，剪取适当长度的透析袋，用透析袋夹子夹住一端，然后灌入除蛋白后多糖溶液，再用透析袋夹子夹住另一端，放入一只大烧杯中，用一导管将水通入烧杯底部，逆向对流水透析48h，以除去小分子的无机盐、低聚糖等杂质，即得到华美牛肝菌粗多糖。然后通过2540-UV紫外分光光度计200-700nm进行全波段扫描，以检测蛋白是否被完全去除。

1.2.4华美牛肝菌多糖的分级纯化

1.2.4.1DEAE cellulose-52色谱柱层析

将上述除杂后的华美牛肝菌多糖(TMP)配制成10％溶液，上样DEAE celluse-52离子交换柱(3.5×40cm)10ml，分别以0mol/L、0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L、0.5mol/L Nacl为流动洗脱相，流速为0.5ml、min，用自动部分收集器以每管5ml收集洗脱液，将收集到的样品溶液用苯酚-硫酸法在595nm波长下比色检测多糖，以试管数为横坐标，以吸光度值为纵坐标，做DEAE-celluse52色谱柱层析洗脱曲线图。然后合并各个主峰溶液，低压冷冻干燥，得到华美牛肝菌多糖级分。

1.2.4.2Sephadex G-100凝胶色谱柱层析纯化

自然沉降法装Sephadex G-100凝胶色谱柱(2×60cm)，脱气后用ddH2O(1000ml)平衡层析柱，流速为每分钟3滴。取100mg华美牛肝菌多糖级分溶于5mlddH2O中，上样于Sephadex G-100凝胶色谱柱(2×60cm)，以ddH2O为流动相，流速为每分钟3滴，用自动部分收集器以每管5ml收集洗脱液，将收集到的样品溶液用苯酚-硫酸法在595nm波长下比色检测多糖，以试管数为横坐标，以吸光度值为纵坐标，做Sephadex G-100凝胶色谱柱层析洗脱曲线图。然后合并各个主峰溶液，低压冷冻干燥，得到华美牛肝菌纯多糖级分。

1.3.华美牛肝菌多糖的结构鉴定

真菌多糖是由10个以上的单糖构成的生物大分子，其单糖组成可相同或不相同，而且单糖之间的链的链接方式和位置很多，可以形成直连或者带有分支的支链，这样就导致了多糖一级结构更为复杂，另外其可通过分子之间的氢键和各个基团之间的相互作用又能形成不同形式的高级结构而造成结构上的不同，因此其结构远比蛋白质和核酸复杂的多。我们运用水解、甲基化分析、气相色谱和质谱联用技术(GC-MS)、扫描电镜技术(SEM)、红外谱技术(IR)、核磁共振技术(NMR)，对华美牛肝菌纯品多糖进行结构解析。

1.3.1试剂

乙醇、氯化钠、盐酸、氢氧化钠、苯酚、硫酸、丙酮、重水、吡啶、三氟乙酸

1.3.2仪器

WZZ-2A旋光仪(上海宇隆仪器有限公司)；Vector型傅立叶变换红外光谱仪(德国BRUKER公司)；扫描式电子显微镜(AV11-600MH日本电子JEOL)；721型分光光度计(上海第三分析仪器厂)；真空冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)；GC-MS(日本岛津公司)；BRUKER ADVANCE DMX500核磁共振仪(德国BRUKER公司)；KXS恒温水浴锅：上海科析实验仪器厂；DZF-200型真空干燥箱：上海浦东东荣丰科学仪器有限公司上海浦东跃欣科学仪器厂；SH21-1恒温磁力搅拌器：上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司；J-25I高速冷冻离心机：Beckman Coulter，美国；PA 92-F112I型电子分析天平：Sartorius Limited，Germany Olympus；显微镜(BH-2型)：Japan，Tokyo；BECKMAN高速冷冻离心机(J-25I型)USA；Herine多功能食品捣碎机：上海海菱电器有限公司

1.3.3方法

1.3.3.1分子量的测定

将3mg华美牛肝菌多糖样品溶解于1mlddH2O中，超声5min，进行HPGPC分析，数据用GPC软件分析后与标准曲线对照测得分子量1.3×104D(标准品T-10，20，50，80，130)。

1.3.3.2华美牛肝菌多糖的硅烷化衍生与甲基化分析

将标准单糖和上述干燥后水解产物进行硅烷化衍生步骤如下：1.0mg的样品溶解于0.2ml的无水吡啶，然后加0.2ml的六甲基二硅氮烷和0.1mg的三甲基氯硅烷，50℃温育20min，然后10000rpm离心20min，取上层溶液用于甲基化分析。

1.3.3.3华美牛肝菌多糖GC-MS谱分析

GC条件：色谱柱：Rtx-5sil MS(5％phenylmethylsiloxane30mm×0.25mm×0.25μm)；

进样器温度、GC-MS界面温度、离子源温度和检测器温度分别为250、250、230和250℃，升温程序：

载气：高纯氦气。

1.3.3.4华美牛肝菌多糖的红外谱分析

华美牛肝菌多糖样品2mg左右，KBr压片，红外分光光度计4000cm-1-400cm-1。

1.3.3.5华美牛肝菌的核磁共振分析

取华美牛肝菌多糖样品10mg左右溶于0.5mL重水(D2O)中，在核磁共振仪上常温测定，400MHz测1HNMR谱，200MHz测13CNMR谱。

1.3.4结果

1.3.4.1华美牛肝菌多糖的基本性质结果

华美牛肝菌纯多糖分子量为1.3×104D。

1.3.4.2华美牛肝菌多糖的FTIR谱分析

如图1所示，华美牛肝菌多糖在红外谱中显示3419.18cm-1的宽吸收峰指定为O-H和N-H伸缩振动峰，存在着分子内和分子间的氢键。2933.24cm-1指定为-CH2，-CH3的伸缩振动峰。1652.14cm-1指定为C＝O，C＝C振动峰。1116.89cm-1在1200-1000cm-1范围内指定为-COOH中的C-O-H伸缩振动和吡喃环中醚键C-O-C伸缩振动。840.05cm-1指示华美牛肝菌有β型吡喃环。701.20cm-1指示华美牛肝菌有α型吡喃环。

1.3.4.3华美牛肝菌多糖的NMR谱分析

异头氢信号δ5.091，δ5.228指示在华美牛肝菌多糖中α型异头氢存在(见图2)，且两者均与红外谱显示相一致。在碳谱中13C NMR(200MHz)98-106ppm区域的共振信号峰归属于半乳糖(Galp)和甘露糖(Manp)的碳质子信号(见图3、表3-1)。

表3-1华美牛肝菌多糖的13C NMR图中的化学位移

1.3.4.4华美牛肝菌多糖的GC-MS谱分析结果

华美牛肝菌多糖(华美牛肝菌)由两个单糖组成的杂多糖，即α-L-甘露糖和α-D-半乳糖以2∶1的比例组成，平均分子量约为1.3×104D，具有(1-4)α-L-甘露糖的骨架，6-O上连接一个→1)-α-D-半乳糖的侧链(表3-2)，综上推断华美牛肝菌多糖的结构式为；

表3-2华美牛肝菌多糖的甲基化GC-MS数据

Merhylated sugar	Linkage	m/z
			2，3，6-Me3-Man	1，4-	45，59，73，88，101，133，146，159，232
2，3-Me2-Man	1，4，6-	45，59，73，88，101，116，133，146，174，232
			2，3，4，6Me4Gal	T-	45，59，73，89，116，146，159，191，204，233

实施例2

2.华美牛肝菌多糖的抗氧化活性研究

2.1试剂

1，1-二苯基-2-苦基肼(DPPH-)；30％H2O2；维生素C(Vc)；2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)；ABTS

2.2仪器

721型分光光度计(上海第三分析仪器厂)；

2.3方法

2.3.1DPPH自由基清除能力测定

DPPH自由基清除能力测定参照Braca方法，样品提取液配置成合适浓度(0.5，1，2，3，4，5mg/mL)。取1mL待测溶液，加入2.0mL 0.2mM DPPH-溶液(用无水乙醇配制)，摇匀后放置30min。以乙醇来调零，在517nm处测定A样品的吸光值。同时测定1.0mL样品溶液与2.0mL乙醇混合液，在517nm处的吸光度作为A对照。同一测定重复三次，以Vc和BHT作为阳性对照。DPPH清除能力＝(1-A样品/A对照)×100％。

2.3.2ABTS+阳离子自由基清除能力测定

7mmol/LABTS水溶液和2.45mmol/L过硫酸钾避光还原12-16h后，ABTS溶液用PBS(pH7.4)稀释直至在酶标仪上于630nm测定值为0.50±0.05。样品用PBS溶液溶解成不同浓度溶液，取10μL样品90μLABTS溶液混合反应，置于暗处3min。用样品PBS溶液作为样品颜色空白参比，PBS溶液为空白对照，在酶标仪上于734nm处检测。依据下列公式计算清除率：

清除率(％)＝[A空白-(A样品-A对照)]/A空白×100％

以样品浓度为横坐标，清除率为纵坐标作图并计算出IC50(半数抑制率，自由基清除率为50％时所需要的抗氧化剂的浓度)作为最终结果。

2.4结果

2.4.1.华美牛肝菌多糖对DPPH-自由基清除活性

图4说明了纯化的华美牛肝菌多糖样品多DPPH自由基有很好的清除活性，其消除DPPH自由基的IC50值约为7.4mg/mL，剂量越大，效果越好。

2.4.2.华美牛肝菌多糖对ABTS+阳离子自由基清除的活性

使用分光光度计在734nm处的测定华美牛肝菌多糖对ABTS+阳离子自由基清除的活性。结果表明(图5)，华美牛肝菌多糖消除ABTS+阳离子自由基的IC50值约为5.02mg/ml，剂量越大，效果越好。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims

1.华美牛肝菌多糖，其特征在于，华美牛肝菌多糖是由两个单糖组成的杂多糖，即α-L-甘露糖和α-D-半乳糖以2∶1的比例组成，平均分子量约为1.3×104D，具有(1-4)α-L-甘露糖的骨架，6-O上连接一个→1)-α-D-半乳糖的侧链，结构式如下：