CN106381276A - 一种利用生物碳培养的枯草芽孢杆菌及其制备方法和用途 - Google Patents

一种利用生物碳培养的枯草芽孢杆菌及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用生物碳培养的枯草芽孢杆菌及其制备方法和用途，所述制备方法以生物碳作为吸附载体，例如木屑、动物骨头、植物根茎等生物碳，以任意一种枯草芽孢杆菌细菌菌种作为出发菌株，依次经过如下步骤：步骤(1)试管扩大培养；(2)液体摇瓶培养；(3)种子罐扩大培养、(4)发酵培养和(5)干燥。本发明所述的方法制备的枯草芽孢杆菌细菌菌体密度达到5×1013～1×1015cfu/mL。本发明把生物吸附与液态发酵有机结合，提高了液体发酵的菌体密度，在不添加任何设备和不使用连续培养和半连续培养实现了枯草芽孢杆菌细菌的高密度培养，且本发明所培养的枯草芽孢杆菌细菌可用作生物肥料的活菌剂或与其他菌种共同作为生物肥料的活菌剂。

Description

一种利用生物碳培养的枯草芽孢杆菌及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种利用生物碳培养的枯草芽孢杆菌及其制备方法和用途。
背景技术
所谓生物碳，是由有机垃圾，如动物粪便，动物骨头，植物根茎，木屑和麦秸秆等生物量经过热化学效应，被高温分解，成为可用做肥料的类似于碳球状的物质。其中由植物形成的，以固定碳元素为目的的木炭被称为“生物碳”。土地中自然存在大量的碳元素，但是这些碳是不稳定的，受气候影响会释放二氧化碳。而生物碳则可以固定碳元素长达几百年。
生活在巴西亚马逊河流域的人们长期使用一种特殊的肥料。这种肥料来源于当地，具有极强的恢复贫瘠土壤肥力的能力。当地人把它称为“印第安人的黑土壤”。它多产、肥沃，与当地稀疏、贫瘠的土壤形成鲜明的对比。现代研究证明，黑土壤是2500年，甚至6000年以前由生活在亚马逊流域的人们制造的。一般认为，他们使用的材料包括动物粪便，鱼，动物骨头和植物废物。但是生产黑土壤最关键的原料，也是黑土壤之所以呈现黑色的原因，是木炭的使用。黑土壤中的木炭可以使土壤肥力维持一个世纪之久。几个世纪以来，生活在南美亚马逊流域的人们都靠这些原生态材料制造“黑土壤”来肥沃土地。几千年过去了，那儿的土壤不需耕耘灌溉，依旧十分肥沃。佐治亚大学的科学家Steiner解释道：“千百年过去，这个区域依旧沃土依然，那是因为土壤中富含碳元素”。因此，生物碳使人们看到了无需砍伐森林也可开拓农耕地的希望。
生物碳可以保护环境。鉴于其高含碳量和多孔的特性，它不仅可提高土壤蓄水储养的能力，还可保护土壤中的微生物。它像一个地下碳水槽，锁住二氧化碳，最终达到增加作物产量的效果。生物碳可吸收有机物质腐烂时释放至大气的二氧化碳；并帮助植物有效储存其光合作用所需的二氧化碳。通过这两种方式，生物碳起到了洁净空气的作用生物碳是面向未来的，低成本，可持续性的环保能源。而它的起源则可追溯到几千年前。
枯草芽孢杆菌肥料发酵菌种，枯草芽孢杆菌属于芽孢杆菌属，革兰氏染色阳性，可变为阴性，芽孢为椭圆形，侧生、中生或近中生，孢囊膨大，游离芽孢一边比另一边厚(独木舟形)。枯草芽孢杆菌是经国家农业部微生物检测中心批准使用的一种天然菌种。
枯草芽孢杆菌对植物病虫害具有一定的防治作用，与传统的化学农药相比，对人畜无毒无害、不污染环境、高效广谱、无抗逆性。枯草芽孢杆菌目前已被制成粉剂、可湿性粉剂等被应用。刘振等运用枯草芽孢杆菌制成的可湿性粉剂喷施于茶树上，不仅可提高机体的免疫能力，还具有明显的提质增产作用。曹春霞等研究表明，枯草芽孢杆菌可有效防治草莓白粉病，可提高作物品质和产量。张淑梅等研究枯草芽孢杆菌TF26抗菌蛋白的抑菌活性，结果表明其可抑制葵花菌核病菌、番茄和黄瓜枯萎病菌、黄瓜菌核病菌和立枯病菌、水稻恶苗病菌和大豆根腐病菌等13种植物病原真菌的生长。由于微生物发酵易大规模生产，解决了实际生产中对原料提取的依赖性，降低了防治成本，因此，枯草芽孢杆菌在植物生防领域的应用具有广阔前景。
枯草芽孢杆菌改良土壤主要包括三个层面，第一层面，改良土壤结构，促使土壤中的有机质分解成腐殖酸。第二层面，固氮，解磷解钾，提高肥料利用率。第三层面，产生类似细胞分裂素、植物生长激活素的物质，并分解重金属、农药的残留。通过这三个层面的作用，枯草芽孢杆菌实现促根壮苗、增产提质的功能。
发明内容
本发明提供一种利用生物碳吸附，无需外加设备，而且可以实现分批高密度培养的方法，通过该方法培养枯草芽孢杆菌菌体密度可以达到1×1013～1×1015cfu/mL。现提出如下技术方案：
一种利用生物碳培养的枯草芽孢杆菌的制备方法，其所述制备方法以生物碳作为吸附载体，以枯草芽孢杆菌作为出发菌株，依次经过试管扩大培养、液体摇瓶培养和种子罐扩大培养、发酵培养、喷雾干燥和干燥工艺制备。
对上述方案的进一步改进，所使用的生物碳可以是污泥、动物粪便、动物骨头、植物根茎和木屑等生物量经过热化学效应，被高温分解得到的任意一种生物碳；所使用的菌种为枯草芽孢杆菌的任意一种。
基于上述的一种利用生物碳培养的枯草芽孢杆菌的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1)试管扩大培养：将枯草芽孢杆菌斜面菌种接种于枯草芽孢杆菌试管斜面培养基中进行培养，制得枯草芽孢杆菌试管斜面菌种；
(2)液体摇瓶培养：将步骤(1)所制得的枯草芽孢杆菌试管斜面菌种接种到装有含有生物碳的液体摇瓶培养基的摇瓶中，进行培养，制得枯草芽孢杆菌液体摇瓶菌种；
(3)种子罐扩大培养：将步骤(2)所制得的枯草芽孢杆菌液体摇瓶菌种接种到含有生物碳的种子罐培养基中进行培养，制成枯草芽孢杆菌种子罐菌种；
(4)液体发酵培养：将步骤(3)所制得的枯草芽孢杆菌种子罐菌种接种到含有生物碳的液体发酵培养基中，并混合均匀，进行发酵培养，制得枯草芽孢杆菌发酵液；
(5)干燥：经步骤(4)制得的枯草芽孢杆菌发酵液经过离心、喷雾干燥、包装制得枯草芽孢杆菌干粉。
对上述方案的进一步改进，所述制备方法具体如下：
(1)试管扩大培养：接种一环枯草芽孢杆菌斜面菌种到枯草芽孢杆菌试管斜面培养基中，25～40℃培养2～10天，制得试管斜面菌种，该试管斜面4℃保存备用；
(2)液体摇瓶培养：接种一环步骤(1)所制得的试管斜面菌种接种于装有20～150mL含有生物碳的液体摇瓶培养基的250mL三角瓶中，三角瓶在转速为10～160转/分，温度25～40℃的条件下，摇床培养18-86h，制成枯草芽孢杆菌液体摇瓶菌种；
(3)种子罐扩大培养：将步骤(2)所制得的液体摇瓶菌种接种于含有生物碳的种子罐扩大培养基中，且所述液体摇瓶菌种与含有生物碳的种子罐扩大培养基按体积比为0.2～10％的接种量接种，在温度为25～40℃，搅拌转速为10～120转/分，在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为0.2～1.8:1的通气量条件下，培养18～96h，制成枯草芽孢杆菌种子罐菌种；
(4)液体发酵培养：将步骤(3)所制得的枯草芽孢杆菌种子罐菌种按体积比为0.2～10％接种量接入含有生物碳的液体发酵培养基中，在温度25～40℃，搅拌转速为10～120转/分，在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为0.2～1.8:1的通气量条件下，培养48～96小时，制得枯草芽孢杆菌发酵液，该发酵液菌体浓度为1013～1015cfu/mL；
(5)干燥：将步骤(4)所制得的枯草芽孢杆菌发酵液4000～10000转/分钟离心10～30分钟，调节菌体浓度为1014～1016cfu/mL，进风温度110-120℃，进样速度600～800mL/h，雾化压力0.08～0.2MPa，热风流量20～40M3/h；在此条件下，喷雾干燥后产物活菌量达1015～1017cfu/g；干燥过后将产物进行包装即成成品。
对上述方案的进一步改进，步骤B2中所述液体摇瓶培养基是在100～130℃条件下灭菌10～60min制得，且每升含有生物碳的液体摇瓶培养基中含有蔗糖5～20g，蛋白胨1～10g，麸皮2～20g，牛肉浸膏1～10g，生物碳3～30克。
对上述方案的进一步改进，步骤B3中所述种子罐扩大培养基是在100～130℃条件下灭菌10～60min制得，且每升含有生物碳的种子罐培养基中含有蔗糖5～20g，蛋白胨1～10g，麸皮2～20g，牛肉浸膏1～10g，生物碳3～30克。
对上述方案的进一步改进，步骤B4中所述发酵培养基是在100～130℃条件下灭菌10～60min制得，且每升含有生物碳的发酵培养基中含有蔗糖10～50g，蛋白胨1～10g，麸皮2～20g，酵母浸膏3～20，植物油2～8g，生物碳5～50克。
一种利用生物碳培养的枯草芽孢杆菌是由上述一种利用生物碳培养的枯草芽孢杆菌的制备方法所制得。
上述方案所培养的枯草芽孢杆菌可以用作生物肥料的活菌剂或与其他菌种共同作为生物肥料的活菌剂。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明把生物吸附与液态发酵有机结合，提高了液体发酵的菌体密度，在不添加任何设备和不使用连续培养和半连续培养实现了枯草芽孢杆菌的高密度培养；
(2)本发明所述的一种利用生物碳培养的枯草芽孢杆菌的制备方法，不是单纯的利用生物碳作为吸附剂，它还利用生物碳固定二氧化碳的作用降低了发酵液中CO2的浓度，提高了培养基中的溶解氧浓度提高了菌体密度；
(3)本发明所述的一种利用生物碳吸附培养的枯草芽孢杆菌的制备方法，其发酵液菌体浓度为1×1013～1×1015cfu/mL。所制备的发酵液可以经过离心喷雾干燥，干燥的菌体粉活菌量达1015～1017cfu/g。
附图说明
图1为本发明一种利用生物碳培养的枯草芽孢杆菌的制备方法的制备流程图。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
实施例1
如图1所示，一种利用生物碳培养的枯草芽孢杆菌的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)试管扩大培养：接种一环褐球枯草芽孢杆菌(Bacillus sublitis ACCC19742)斜面菌种到枯草芽孢杆菌试管斜面培养基中，25℃培养10天，制得试管斜面菌种，该试管斜面4℃保存备用；所述的试管斜面菌种是采用的一般营养琼脂(2)培养基(陈天寿主编.微生物培养基的制造与应用，中国农业出版社，1995年p182)；
(2)液体摇瓶培养：接种一环步骤(1)所制得的试管斜面菌种接种于装有20mL含有生物碳的液体摇瓶培养基的250mL三角瓶中，三角瓶在转速为10转/分，温度25℃的条件下，摇床培养86h，制成枯草芽孢杆菌液体摇瓶菌种；；所述含有生物碳的液体摇瓶培养基是在在100℃条件下灭菌60min制得，且每升含有生物碳的液体摇瓶培养基中含有蔗糖5g，蛋白胨1g，麸皮2g，牛肉浸膏1g，污泥生物碳3克；
(3)种子罐扩大培养：将步骤(2)所制得的液体摇瓶菌种接种于含有生物碳的种子罐扩大培养基中，且所述液体摇瓶菌种与含有生物碳的种子罐扩大培养基按体积比为0.2％的接种量接种，在温度为40℃，搅拌转速为120转/分，在每分钟通入气体的体积与含有生物碳的种子罐扩大培养基体积比为1.8:1的通气量条件下，培养18h，制成枯草芽孢杆菌种子罐菌种；所述含有生物碳的种子罐扩大培养基是在124℃条件下灭菌44min制得，且每升含有生物碳的种子罐培养基中含有蔗糖5g，蛋白胨1g，麸皮2g，牛肉浸膏1g，污泥生物碳3克；
(4)液体发酵培养：将步骤(3)所制得的枯草芽孢杆菌种子罐菌种按体积比为0.2％接种量接入含有生物碳的液体发酵培养基中，在温度40℃，搅拌转速为120转/分，在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为1.8:1的通气量条件下，培养48小时，制得枯草芽孢杆菌发酵液，该发酵液菌体浓度为5×1013cfu/mL；所述含有生物碳的液体发酵培养基是在100℃条件下灭菌60min制得，且每升含有生物碳的发酵培养基中含有蔗糖10g，蛋白胨1g，麸皮2g，酵母浸膏3g，植物油2g，污泥生物碳50克；
(5)将步骤(4)所制得的枯草芽孢杆菌发酵液4500转/分钟离心15分钟，调节菌体浓度为1014cfu/mL，进风温度112℃，进样速度620mL/h，雾化压力0.09MPa，热风流量27M3/h；在此条件下，喷雾干燥后产物活菌量达1016cfu/g；
(6)包装：将步骤(5)进行干燥过后的产物进行包装；
(7)成品：包装后即成成品。
一种利用生物碳培养的枯草芽孢杆菌是由上述实施例所述的制备方法制得的。
上述实施例所述的制备方法制得的枯草芽孢杆菌用作生物肥料的活菌剂或与其他菌种共同作为生物肥料的活菌剂。
实施例2
如图1所示，一种利用生物碳培养的枯草芽孢杆菌的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)试管扩大培养：接种一环内生枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis ACCC19743)斜面菌种到枯草芽孢杆菌试管斜面培养基中，40℃培养2天，制得试管斜面菌种，该试管斜面4℃保存备用；所述的试管斜面菌种是采用的一般枯草芽孢杆菌培养基(陈天寿主编.微生物培养基的制造与应用，中国农业出版社，1995年p182)；
(2)液体摇瓶培养：接种一环步骤(1)所制得的试管斜面菌种接种于装有150mL含有生物碳的液体摇瓶培养基的250mL三角瓶中，三角瓶在转速为160转/分，温度40℃的条件下，摇床培养18h，制成枯草芽孢杆菌液体摇瓶菌种；；所述含有生物碳的液体摇瓶培养基是在在130℃条件下灭菌10min制得，且每升液体摇瓶培养基中含有蔗糖20g，蛋白胨10g，麸皮20g，牛肉浸膏10g，动物粪便生物碳30克；
(3)种子罐扩大培养：将步骤(2)所制得的液体摇瓶菌种接种于含有生物碳的种子罐扩大培养基中，且所述液体摇瓶菌种与含有生物碳的种子罐扩大培养基按体积比为10％的接种量接种，在温度为25℃，搅拌转速为10转/分，在每分钟通入气体的体积与含有生物碳的种子罐扩大培养基体积比为0.2:1的通气量条件下，培养96h，制成枯草芽孢杆菌种子罐菌种；所述含有生物碳的种子罐扩大培养基是在103℃条件下灭菌60min制得，且每升含有生物碳的种子罐培养基中含有蔗糖20g，蛋白胨10g，麸皮20g，牛肉浸膏10g，动物粪便生物碳27.8克；
(4)液体发酵培养：将步骤(3)所制得的枯草芽孢杆菌种子罐菌种按体积比为10％接种量接入含有生物碳的液体发酵培养基中，在温度25℃，搅拌转速为10转/分，在每分钟通入气体的体积与含有生物碳的种子罐扩大培养基体积比为0.2:1的通气量条件下，培养96小时，制得枯草芽孢杆菌发酵液，该发酵液菌体浓度为1×1015cfu/mL；所述含有生物碳的液体发酵培养基是在130℃条件下灭菌10min制得，且每升含有生物碳的发酵培养基中含有蔗糖50g，蛋白胨10g，麸皮20g，酵母浸膏20，植物油8g，动物粪便生物碳5克；
(5)将步骤(4)所制得的枯草芽孢杆菌发酵液4000～10000转/分钟离心10～30分钟，调节菌体浓度为1014～1016cfu/mL，进风温度110-120℃，进样速度600～800mL/h，雾化压力0.08～0.2MPa，热风流量20～40M3/h；在此条件下，喷雾干燥后产物活菌量达1015～1017cfu/g；
(6)包装：将步骤(5)进行干燥过后的产物进行包装；
(7)成品：包装后即成成品。
一种利用生物碳培养的枯草芽孢杆菌是由上述实施例所述的制备方法制得的。
上述实施例所述的制备方法制得的枯草芽孢杆菌用作生物肥料的活菌剂或与其他菌种共同作为生物肥料的活菌剂。
实施例3
如图1所示，一种利用生物碳培养的枯草芽孢杆菌的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)试管扩大培养：接种一环枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis CICC 20034)斜面菌种到枯草芽孢杆菌试管斜面培养基中，32℃培养6天，制得试管斜面菌种，该试管斜面4℃保存备用；所述的试管斜面菌种是采用的一般枯草芽孢杆菌培养基(陈天寿主编.微生物培养基的制造与应用，中国农业出版社，1995年p182)；
(2)液体摇瓶培养：接种一环步骤(1)所制得的试管斜面菌种接种于装有80mL含有生物碳的液体摇瓶培养基的250mL三角瓶中，三角瓶在转速为85转/分，温度32℃的条件下，摇床培养52h，制成枯草芽孢杆菌液体摇瓶菌种；；所述含有生物碳的液体摇瓶培养基是在在120℃条件下灭菌30min制得，且每升含有生物碳的液体摇瓶培养基中含有蔗糖12g，蛋白胨6g，麸皮11g，牛肉浸膏6g，动物骨头生物碳16克；
(3)种子罐扩大培养：将步骤(2)所制得的液体摇瓶菌种接种于含有生物碳的种子罐扩大培养基中，且所述液体摇瓶菌种与含有生物碳的种子罐扩大培养基按体积比为5％的接种量接种，在温度为32℃，搅拌转速为70转/分，在每分钟通入气体的体积与含有生物碳的种子罐扩大培养基体积比为1:1的通气量条件下，培养56h，制成枯草芽孢杆菌种子罐菌种；所述含有生物碳的种子罐扩大培养基是在118℃条件下灭菌30min制得，且每升含有生物碳的种子罐培养基中含有蔗糖13g，蛋白胨6g，麸皮11g，牛肉浸膏6g，动物骨头生物碳18克；
(4)液体发酵培养：将步骤(3)所制得的枯草芽孢杆菌种子罐菌种按体积比为5％接种量接入含有生物碳的液体发酵培养基中，在温度为32℃，搅拌转速为70转/分，在每分钟通入气体的体积与含有生物碳的种子罐扩大培养基体积比为1:1的通气量条件下，培养72小时，制得枯草芽孢杆菌发酵液，该发酵液菌体浓度为6×1014cfu/mL；所述含有生物碳的液体发酵培养基是在120℃条件下灭菌30min制得，且每升含有生物碳的发酵培养基中含有蔗糖30g，蛋白胨6g，麸皮11g，酵母浸膏12g，植物油5g，动物骨头生物碳26克；
(5)将步骤(4)所制得的枯草芽孢杆菌发酵液8500转/分钟离心27分钟，调节菌体浓度为1016cfu/mL，进风温度118℃，进样速度750mL/h，雾化压力0.16MPa，热风流量37M3/h；在此条件下，喷雾干燥后产物活菌量达1017cfu/g。
(6)包装：将步骤(5)进行干燥过后的产物进行包装；
(7)成品：包装后即成成品。
一种利用生物碳培养的枯草芽孢杆菌是由上述实施例所述的制备方法制得的。
上述实施例所述的制备方法制得的枯草芽孢杆菌用作生物肥料的活菌剂或与其他菌种共同作为生物肥料的活菌剂。
实施例4
如图1所示，一种利用生物碳培养的枯草芽孢杆菌的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)试管扩大培养：接种一环枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis ATCC2233)斜面菌种到枯草芽孢杆菌试管斜面培养基中，29℃培养8天，制得试管斜面菌种，该试管斜面4℃保存备用；所述的试管斜面菌种是采用的一般枯草芽孢杆菌培养基(陈天寿主编.微生物培养基的制造与应用，中国农业出版社，1995年p182)；
(2)液体摇瓶培养：接种一环步骤(1)所制得的试管斜面菌种接种于装有130mL含有生物碳的液体摇瓶培养基的250mL三角瓶中，三角瓶在转速为140转/分，温度35℃的条件下，摇床培养25h，制成枯草芽孢杆菌液体摇瓶菌种；；所述含有生物碳的液体摇瓶培养基是在在125℃条件下灭菌15min制得，且每升含有生物碳的液体摇瓶培养基中含有蔗糖18g，蛋白胨8g，麸皮18g，牛肉浸膏9g，植物根茎生物碳28克；
(3)种子罐扩大培养：将步骤(2)所制得的液体摇瓶菌种接种于含有生物碳的种子罐扩大培养基中，且所述液体摇瓶菌种与种子罐扩大培养基按体积比为0.2％的接种量接种，在温度为25℃，搅拌转速为10转/分，在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为0.2:1的通气量条件下，培养18h，制成枯草芽孢杆菌种子罐菌种；所述含有生物碳的种子罐扩大培养基是在110℃条件下灭菌50min制得，且每升含有生物碳的种子罐培养基中含有蔗糖18g，蛋白胨8g，麸皮18g，牛肉浸膏9g，，植物根茎生物碳13克；
(4)液体发酵培养：将步骤(3)所制得的枯草芽孢杆菌种子罐菌种按体积比为0.2％的接种量接入含有生物碳的液体发酵培养基中，在温度为25℃，搅拌转速为10转/分，在每分钟通入气体的体积与含有生物碳的种子罐扩大培养基体积比为0.2:1的通气量条件下，培养48小时，制得枯草芽孢杆菌发酵液，该发酵液菌体浓度为6×1013cfu/mL；所述含有生物碳的液体发酵培养基是在120℃条件下灭菌30min制得，且每升发酵培养基中含有蔗糖45g，蛋白胨8g，麸皮18g，酵母浸膏18g，植物油7g，植物根茎生物碳7克；
(5)将步骤(4)所制得的枯草芽孢杆菌发酵液7000转/分钟离心30分钟，调节菌体浓度为1016cfu/mL，进风温度120℃，进样速度800mL/h，雾化压力0.08MPa，热风流量40M3/h；在此条件下，喷雾干燥后产物活菌量达1015cfu/g；
(6)包装：将步骤(5)进行干燥过后的产物进行包装；
(7)成品：包装后即成成品。
一种利用生物碳培养的枯草芽孢杆菌是由上述实施例所述的制备方法制得的。
上述实施例所述的制备方法制得的枯草芽孢杆菌用作生物肥料的活菌剂或与其他菌种共同作为生物肥料的活菌剂。
实施例5
如图1所示，一种利用生物碳培养的枯草芽孢杆菌的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)试管扩大培养：接种一环枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis CCTCC M208157)斜面菌种到枯草芽孢杆菌试管斜面培养基中，37℃培养4天，制得试管斜面菌种，该试管斜面4℃保存备用；所述的试管斜面菌种是采用的一般枯草芽孢杆菌培养基(陈天寿主编.微生物培养基的制造与应用，中国农业出版社，1995年p182)；
(2)液体摇瓶培养：接种一环步骤B1所制得的试管斜面菌种接种于装有35mL含有生物碳的液体摇瓶培养基的250mL三角瓶中，三角瓶在转速为25转/分，温度28℃的条件下，摇床培养24h，制成枯草芽孢杆菌液体摇瓶菌种；所述含有生物碳的液体摇瓶培养基是在在105℃条件下灭菌50min制得，且每升含有生物碳的液体摇瓶培养基中含有蔗糖6g，蛋白胨2g，麸皮3g，牛肉浸膏2g，木屑生物碳5克；
(3)种子罐扩大培养：将步骤(2)所制得的液体摇瓶菌种接种于含有生物碳的种子罐扩大培养基中，且所述液体摇瓶菌种与种子罐扩大培养基按体积比为10％的接种量接种，在温度为40℃，搅拌转速为120转/分，在每分钟通入气体的体积与含有生物碳的种子罐扩大培养基体积比为1.8:1的通气量条件下，培养96h，制成枯草芽孢杆菌种子罐菌种；所述种子罐扩大培养基是在105℃条件下灭菌50min制得，且每升含有生物碳的种子罐培养基中含有蔗糖6g，蛋白胨2g，麸皮3g，牛肉浸膏2g，，木屑生物碳20克；
(4)液体发酵培养：将步骤(3)所制得的枯草芽孢杆菌种子罐菌种按体积比为10％的接种量接入含有生物碳的液体发酵培养基中，在温度为40℃，搅拌转速为120转/分，在每分钟通入气体的体积与含有生物碳的种子罐扩大培养基体积比为1.8:1的通气量条件下，培养96h，制得枯草芽孢杆菌发酵液，该发酵液菌体浓度为8×1014cfu/mL；所述液体发酵培养基是在120℃条件下灭菌30min制得，且每升含有生物碳的发酵培养基中含有蔗糖12g，蛋白胨2g，麸皮3g，酵母浸膏4，植物油2g，木屑生物碳49克；
(5)将步骤(4)所制得的枯草芽孢杆菌发酵液6000转/分钟离心23分钟，调节菌体浓度为1016cfu/mL，进风温度120℃，进样速度600mL/h，雾化压力0.08MPa，热风流量36M3/h；在此条件下，喷雾干燥后产物活菌量达1017cfu/g；
(6)包装：将步骤(5)进行干燥过后的产物进行包装；
(7)成品：包装后即成成品。
一种利用生物碳培养的枯草芽孢杆菌是由上述实施例所述的制备方法制得的。
上述实施例所述的制备方法制得的枯草芽孢杆菌用作生物肥料的活菌剂或与其他菌种共同作为生物肥料的活菌剂。
实施例6
如图1所示，一种利用生物碳培养的枯草芽孢杆菌的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)试管扩大培养：接种一环枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis ATCC2233)斜面菌种到枯草芽孢杆菌试管斜面培养基中，40℃培养4天，制得试管斜面菌种，该试管斜面4℃保存备用；所述的试管斜面菌种是采用的一般枯草芽孢杆菌培养基(陈天寿主编.微生物培养基的制造与应用，中国农业出版社，1995年p182)；
(2)液体摇瓶培养：接种一环步骤(1)所制得的试管斜面菌种接种于装有110mL含有生物碳的液体摇瓶培养基的250mL三角瓶中，三角瓶在转速为100转/分，温度35℃的条件下，摇床培养29h，制成枯草芽孢杆菌液体摇瓶菌种；；所述含有生物碳的液体摇瓶培养基是在在110℃条件下灭菌40min制得，且每升含有生物碳的液体摇瓶培养基中含有蔗糖6g，蛋白胨2g，麸皮18g，牛肉浸膏10g，植物根茎生物碳19克；
(3)种子罐扩大培养：将步骤(2)所制得的液体摇瓶菌种接种于含有生物碳的种子罐扩大培养基中，且所述液体摇瓶菌种与含有生物碳的种子罐扩大培养基按体积比为8％的接种量接种，在温度为37℃，搅拌转速为80转/分，在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为1.4:1的通气量条件下，培养84h，制成枯草芽孢杆菌种子罐菌种；所述含有生物碳的种子罐扩大培养基是在125℃条件下灭菌15min制得，且每升含有生物碳的种子罐培养基中含有蔗糖6g，蛋白胨2g，麸皮18g，牛肉浸膏10g，植物根茎生物碳26克；
(4)液体发酵培养：将步骤(3)所制得的枯草芽孢杆菌种子罐菌种按体积比为8％的接种量接入含有生物碳的液体发酵培养基中，在温度为37℃，搅拌转速为80转/分，在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为1.4:1的通气量条件下，培养84h，制得枯草芽孢杆菌发酵液，该发酵液菌体浓度为3×1014cfu/mL；所述含有生物碳的液体发酵培养基是在100℃条件下灭菌10min制得，且每升发酵培养基中含有蔗糖12g，蛋白胨2g，麸皮11g，酵母浸膏19g，植物油8g，植物根茎生物碳30克；
(5)将步骤(4)所制得的枯草芽孢杆菌发酵液10000转/分钟离心10分钟，调节菌体浓度为1014cfu/mL，进风温度120℃，进样速度800mL/h，雾化压力0.2MPa，热风流量40M3/h；在此条件下，喷雾干燥后产物活菌量达1015cfu/g；
(6)包装：将步骤(5)进行干燥过后的产物进行包装；
(7)成品：包装后即成成品。
一种利用生物碳培养的枯草芽孢杆菌是由上述实施例所述的制备方法制得的。
上述实施例所述的制备方法制得的枯草芽孢杆菌用作生物肥料的活菌剂或与其他菌种共同作为生物肥料的活菌剂。
实施例7
如图1所示，一种利用生物碳培养的枯草芽孢杆菌的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)试管扩大培养：接种一环枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis CICC 20034)斜面菌种到枯草芽孢杆菌试管斜面培养基中，27℃培养9天，制得试管斜面菌种，该试管斜面4℃保存备用；所述的试管斜面菌种是采用的一般枯草芽孢杆菌培养基(陈天寿主编.微生物培养基的制造与应用，中国农业出版社，1995年p182)；
(2)液体摇瓶培养：接种一环步骤(1)所制得的试管斜面菌种接种于装有100mL含有生物碳的液体摇瓶培养基的250mL三角瓶中，三角瓶在转速为120转/分，温度29℃的条件下，摇床培养58h，制成枯草芽孢杆菌液体摇瓶菌种；所述含有生物碳的液体摇瓶培养基是在在125℃条件下灭菌40min制得，且每升含有生物碳的液体摇瓶培养基中含有蔗糖20g，蛋白胨10g，麸皮2g，牛肉浸膏1g，动物骨头生物碳28克；
(3)种子罐扩大培养：将步骤(2)所制得的液体摇瓶菌种接种于含有生物碳的种子罐扩大培养基中，且所述液体摇瓶菌种与含有生物碳的种子罐扩大培养基按体积比为3％的接种量接种，在温度为30℃，搅拌转速为25转/分，在每分钟通入气体的体积与含有生物碳的种子罐扩大培养基体积比为0.5:1的通气量条件下，培养35h，制成枯草芽孢杆菌种子罐菌种；所述种子罐扩大培养基是在115℃条件下灭菌30min制得，且每升含有生物碳的种子罐培养基中含有蔗糖20g，蛋白胨10g，麸皮2g，牛肉浸膏1g，动物骨头生物碳16克；
(4)液体发酵培养：将步骤(3)所制得的枯草芽孢杆菌种子罐菌种3％的接种量接入含有生物碳的液体发酵培养基中，在温度为30℃，搅拌转速为25转/分，在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为0.5:1的通气量条件下，培养54h，制得枯草芽孢杆菌发酵液，该发酵液菌体浓度为7×1013cfu/mL；所述含有生物碳的液体发酵培养基是在130℃条件下灭菌60min制得，且每升含有生物碳的发酵培养基中含有蔗糖50g，蛋白胨10g，麸皮13g，酵母浸膏3g，植物油2g，动物骨头生物碳26克；
(5)将步骤(4)所制得的枯草芽孢杆菌发酵液4000转/分钟离心30分钟，调节菌体浓度为1016cfu/mL，进风温度110℃，进样速度600mL/h，雾化压力0.08MPa，热风流量20M3/h；在此条件下，喷雾干燥后产物活菌量达1017cfu/g；
(6)包装：将步骤(5)进行干燥过后的产物进行包装；
(7)成品：包装后即成成品。
一种利用生物碳培养的枯草芽孢杆菌是由上述实施例所述的制备方法制得的。
上述实施例所述的制备方法制得的枯草芽孢杆菌用作生物肥料的活菌剂或与其他菌种共同作为生物肥料的活菌剂。
实施例8
如图1所示，一种利用生物碳培养的枯草芽孢杆菌的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)试管扩大培养：接种一环内生枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis ACCC19743)斜面菌种到枯草芽孢杆菌试管斜面培养基中，34℃培养4天，制得试管斜面菌种，该试管斜面4℃保存备用；所述的试管斜面菌种是采用的一般枯草芽孢杆菌培养基(陈天寿主编.微生物培养基的制造与应用，中国农业出版社，1995年p182)；
(2)液体摇瓶培养：接种一环步骤B1所制得的试管斜面菌种接种于装有48mL含有生物碳的液体摇瓶培养基的250mL三角瓶中，三角瓶在转速为70转/分，温度31℃的条件下，摇床培养57h，制成枯草芽孢杆菌液体摇瓶菌种；；所述含有生物碳的液体摇瓶培养基是在在108℃条件下灭菌50min制得，且每升含有生物碳的液体摇瓶培养基中含有蔗糖13g，蛋白胨10g，麸皮20g，牛肉浸膏6g，污泥生物碳6克；
(3)种子罐扩大培养：将步骤(2)所制得的液体摇瓶菌种接种于含有生物碳的种子罐扩大培养基中，且所述液体摇瓶菌种与含有生物碳的种子罐扩大培养基按体积比为6％的接种量接种，在温度为36℃，搅拌转速为60转/分，在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为0.4的通气量条件下，培养72h，制成枯草芽孢杆菌种子罐菌种；所述含有生物碳的种子罐扩大培养基是在130℃条件下灭菌10min制得，且每升含有生物碳的种子罐培养基中含有蔗糖13g，蛋白胨10g，麸皮20g，牛肉浸膏6g，污泥生物碳30克；
(4)液体发酵培养：将步骤(3)所制得的枯草芽孢杆菌种子罐菌种按体积比为6％的接种量接入含有生物碳的液体发酵培养基中，在温度为36℃，搅拌转速为60转/分，在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为0.4的通气量条件下，培养72小时，制得枯草芽孢杆菌发酵液，该发酵液菌体浓度为2×1014cfu/mL；所述液体发酵培养基是在100℃条件下灭菌60min制得，且每升含有生物碳的发酵培养基中含有蔗糖30g，蛋白胨10g，麸皮20g，酵母浸膏3g，植物油5g，污泥生物碳26克；
(5)将步骤(4)所制得的枯草芽孢杆菌发酵液7000转/分钟离心20分钟，调节菌体浓度为1015cfu/mL，进风温度115℃，进样速度700mL/h，雾化压力0.13MPa，热风流量30M3/h；在此条件下，喷雾干燥后产物活菌量达1016cfu/g；
(6)包装：将步骤(5)进行干燥过后的产物进行包装；
(7)成品：包装后即成成品。
一种利用生物碳培养的枯草芽孢杆菌是由上述实施例所述的制备方法制得的。
上述实施例所述的制备方法制得的枯草芽孢杆菌用作生物肥料的活菌剂或与其他菌种共同作为生物肥料的活菌剂。
实施例9
如图1所示，一种利用生物碳培养的枯草芽孢杆菌的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)试管扩大培养：接种一环褐球Bacillus sublitis ACCC 19742斜面菌种到枯草芽孢杆菌试管斜面培养基中，30℃培养9天，制得试管斜面菌种，该试管斜面4℃保存备用；所述的试管斜面菌种是采用的一般枯草芽孢杆菌培养基(陈天寿主编.微生物培养基的制造与应用，中国农业出版社，1995年p182)
(2)液体摇瓶培养：接种一环步骤(1)所制得的试管斜面菌种接种于装有90mL含有生物碳的液体摇瓶培养基的250mL三角瓶中，三角瓶在转速为60转/分，温度31℃的条件下，摇床培养27h，制成枯草芽孢杆菌液体摇瓶菌种；；所述含有生物碳的液体摇瓶培养基是在在120℃条件下灭菌30min制得，且每升含有生物碳的液体摇瓶培养基中含有蔗糖11g，蛋白胨1g，麸皮20g，牛肉浸膏6g，动物粪便生物碳18克。
(3)种子罐扩大培养：将步骤(2)所制得的液体摇瓶菌种接种于含有生物碳的种子罐扩大培养基中，且所述液体摇瓶菌种与含有生物碳的种子罐扩大培养基按体积比为6％的接种量接种，在温度为29℃，搅拌转速为22转/分，在每分钟通入气体的体积与含有生物碳的种子罐扩大培养基体积比为1.3:1的通气量条件下，培养76h，制成枯草芽孢杆菌种子罐菌种；所述种子罐扩大培养基是在100℃条件下灭菌60min制得，且每升含有生物碳的种子罐培养基中含有蔗糖11g，蛋白胨1g，麸皮20g，牛肉浸膏6g，动物粪便生物碳3克；
(4)液体发酵培养：将步骤(3)所制得的枯草芽孢杆菌种子罐菌种按体积比为6％的接种量接入含有生物碳的液体发酵培养基中，在温度为34℃，搅拌转速为62转/分，在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为1.3:1的通气量条件下，培养80h，制得枯草芽孢杆菌发酵液，该发酵液菌体浓度为9×1013cfu/mL；所述含有生物碳的液体发酵培养基是在130℃条件下灭菌10min制得，且每升含有生物碳的发酵培养基中含有蔗糖37g，蛋白胨10g，麸皮20g，酵母浸膏3g，植物油6g，动物粪便生物碳26克；
(5)将步骤(4)所制得的枯草芽孢杆菌发酵液9000转/分钟离心13分钟，调节菌体浓度为1014cfu/mL，进风温度112℃，进样速度670mL/h，雾化压力0.12MPa，热风流量25M3/h；在此条件下，喷雾干燥后产物活菌量达1015cfu/g；
(6)包装：将步骤(5)进行干燥过后的产物进行包装；
(7)成品：包装后即成成品。
一种利用生物碳培养的枯草芽孢杆菌是由上述实施例所述的制备方法制得的。
上述实施例所述的制备方法制得的枯草芽孢杆菌用作生物肥料的活菌剂或与其他菌种共同作为生物肥料的活菌剂。
本技术领域中的普通技术人员应当认识到，以上的实施例仅是用来说明本发明，而并非用作为对本发明的限定，只要在本发明的实质精神范围内，对以上所述实施例的变化、变型都将落在本发明的权利要求范围内。

Claims (9)

1.一种利用生物碳培养的枯草芽孢杆菌的制备方法，其特征在于，所述制备方法以生物碳作为吸附载体，以枯草芽孢杆菌作为出发菌株，依次经过试管扩大培养、液体摇瓶培养和种子罐扩大培养、发酵培养、干燥工艺制得。
2.根据权利要求1所述的一种利用生物碳培养的枯草芽孢杆菌的制备方法，其特征在于，所使用的生物碳是污泥、动物粪便、动物骨头、植物根茎和木屑的任意一种生物碳；所使用的菌种为枯草芽孢杆菌的任意一种。
3.根据权利要求1所述的一种利用生物碳培养的枯草芽孢杆菌的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)试管扩大培养：将枯草芽孢杆菌斜面菌种接种于枯草芽孢杆菌试管斜面培养基中进行培养，制得枯草芽孢杆菌试管斜面菌种；
(2)液体摇瓶培养：将步骤(1)所制得的枯草芽孢杆菌试管斜面菌种接种到装有含有生物碳的液体摇瓶培养基的摇瓶中，进行培养，制得枯草芽孢杆菌液体摇瓶菌种；
(3)种子罐扩大培养：将步骤(2)所制得的枯草芽孢杆菌液体摇瓶菌种接种到含有生物碳的种子罐培养基中进行培养，制成枯草芽孢杆菌种子罐菌种；
(4)液体发酵培养：将步骤(3)所制得的枯草芽孢杆菌种子罐菌种接种到含有生物碳的液体发酵培养基中，并混合均匀，进行发酵培养，制得枯草芽孢杆菌发酵液；
(5)干燥：经步骤(4)制得的枯草芽孢杆菌发酵液经过离心、喷雾干燥、包装制得枯草芽孢杆菌干粉。
4.根据权利要求3所述的一种利用生物碳培养的枯草芽孢杆菌的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体如下：
(1)试管扩大培养：接种一环枯草芽孢杆菌斜面菌种到枯草芽孢杆菌试管斜面培养基中，25～40℃培养2～10天，制得试管斜面菌种，该试管斜面4℃保存备用；
(2)液体摇瓶培养：接种一环步骤(1)所制得的试管斜面菌种接种于装有20～150mL含有生物碳的液体摇瓶培养基的250mL三角瓶中，三角瓶在转速为10～160转/分，温度25～40℃的条件下，摇床培养18-86h，制成枯草芽孢杆菌液体摇瓶菌种；
(3)种子罐扩大培养：将步骤(2)所制得的液体摇瓶菌种接种于含有生物碳的种子罐扩大培养基中，且所述液体摇瓶菌种与含有生物碳的种子罐扩大培养基按体积比为0.2～10％的接种量接种，在温度为25～40℃，搅拌转速为10～120转/分，在每分钟通入气体的体积与含有生物碳的种子罐扩大培养基体积比为0.2～1.8:1的通气量条件下，培养18～96h，制成枯草芽孢杆菌种子罐菌种；
(4)液体发酵培养：将步骤(3)所制得的枯草芽孢杆菌种子罐菌种按体积比为0.2～10％接种量接入含有生物碳的液体发酵培养基中，在温度25～40℃，搅拌转速为10～120转/分，在每分钟通入气体的体积与含有生物碳的种子罐扩大培养基体积比为0.2～1.8:1的通气量条件下，培养48～96小时，制得枯草芽孢杆菌发酵液，该发酵液菌体浓度为1013～1015cfu/mL；
(5)干燥：将步骤(4)所制得的枯草芽孢杆菌发酵液4000～10000转/分钟离心10～30分钟，调节菌体浓度为1014～1016cfu/mL，进风温度110-120℃，进样速度600～800mL/h，雾化压力0.08～0.2MPa，热风流量20～40M3/h；在此条件下，喷雾干燥后产物活菌量达1015～1017cfu/g；干燥过后将产物进行包装集成成品。
5.根据权利要求4所述的一种利用生物碳培养的枯草芽孢杆菌的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述含有生物碳的液体摇瓶培养基是在100～130℃条件下灭菌10～60min制得，且每升含有生物碳的液体摇瓶培养基中含有蔗糖5～20g，蛋白胨1～10g，麸皮2～20g，牛肉浸膏1～10g，生物碳3～30克。
6.根据权利要求4所述的一种利用生物碳培养的枯草芽孢杆菌的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述含有生物碳的种子罐扩大培养基是在100～130℃条件下灭菌10～60min制得，且每升含有生物碳的种子罐培养基中含有蔗糖5～20g，蛋白胨1～10g，麸皮2～20g，牛肉浸膏1～10g，生物碳3～30克。
7.根据权利要求4所述的一种利用生物碳培养的枯草芽孢杆菌的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述含有生物碳的发酵培养基是在100～130℃条件下灭菌10～60min制得，且每升含有生物碳的发酵培养基中含有蔗糖10～50g，蛋白胨1～10g，麸皮2～20g，酵母浸膏3～20，植物油2～8g，生物碳5～50克。
8.一种利用生物碳培养的枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌是由权利要求1-7任一项所述的一种利用生物碳培养的枯草芽孢杆菌的制备方法所制得。
9.一种权利要求8所述的利用生物碳培养的枯草芽孢杆菌的用途，其特征在于：培养的枯草芽孢杆菌可以用作生物肥料的活菌剂或与其他菌种共同作为生物肥料的活菌剂。
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