CN104726444A - 一种高开环率洛伐他汀的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种高开环率洛伐他汀的生产方法，其包括紫色红曲霉诱变和该诱变菌种发酵的工艺，本发明的有益效果是：本发明的诱变菌株及其生产洛伐他汀的方法，与常规红曲霉生产菌株及生产方法相比，其获得的洛伐他汀开环率可提高1.5倍以上，达到68.9%，从而获得品质更高的洛伐他汀产品。

Description

一种高开环率洛伐他汀的生产方法

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种高开环率洛伐他汀的生产方法。

背景技术

洛伐他汀是一种能够抑制体内胆固醇合成的生理活性物质，自1987年美国Merck公司将洛伐他汀系列开发推出新一代的降胆固醇药物以来，洛伐他汀作为新型的调整血脂药，深受广大患者的欢迎。

洛伐他汀一般有两种存在形式：开环和闭环。在酸性条件下以开环为主，兼有少量的闭环形式，在一定条件下这两种形态还可以互相转换。目前市场上医药类洛伐他汀降脂药物的主要成分是闭环的洛伐他汀。闭环洛伐他汀本身无降脂活性，需经人体内的羟基酯酶水解，从而增加肝、肾负担，属美国处方药物管辖。而且，人体内羟基酯酶的能力存在个体的显著差异，有的人甚至没有，这就造成闭环洛伐他汀降脂效果的不稳定性。而开环洛伐他汀可以被人体直接利用，它一般只有在天然发酵的红曲霉中能够得到。目前红曲霉的洛伐他汀产量较低，但红曲霉发酵具有其独特的优势：其发酵产物中除了含有洛伐他汀之外，还有一系列洛伐他汀结构类似物、γ-氨基丁酸等生理活性物质存在，这些相关成分和洛伐他汀相联合，不仅具有协同调节血脂的功效，而且还极大地降低了纯品洛伐他汀的副作用。因此，以红曲霉开发的保健食品、保健药品在国内、国际市场上都非常受欢迎。

如何得到高产量的开环洛伐他汀，减少开环向闭环的转化程度成为决定红曲产品价值高低的关键因素。因此，从菌种选育及培养条件优化等方面提高红曲霉产生洛伐他汀的开环率成为提高红曲产品品质的最有效途径。

发明内容

本发明目的是提供一种高开环率洛伐他汀的生产方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种高开环率洛伐他汀的生产方法，包括如下步骤：

a、 以生理盐水从初始菌株紫色红曲霉生长斜面上将孢子洗下，制得孢子悬液，接种种子培养基，培养35-40 h，取菌悬液以无菌纱布过滤，以玻璃珠震荡打散至单孢子悬液,收集单孢子悬液备用；将孢子悬液置于10-16 W紫外灯下，垂直距离25-30cm，搅拌状态下照射；然后在红光下进行稀释涂布平板，避光培养；取紫外诱变致死率80～90%的诱变菌，富集培养36 h，取菌悬液以无菌纱布过滤，以玻璃珠震荡打散至单孢子悬液；取孢子悬液均匀涂布咋菌平板上，置于超净台内无菌风吹干制成菌膜进行氦离子束注入；选择注入能量为5～25keV，束流强度为15mA，注入剂量为7. 8×10¹⁴ ions /cm² ～ 3. 9×10¹⁵ ions /cm²，注入靶室的真空度为10^-3 Pa，采用脉冲注入，每个脉冲5s，间隔为50s，注入完成后平皿以lmL 无菌水洗下孢子；经过诱变处理后的孢子稀释至适当浓度后涂布PDA固体平板，26～32℃培养3～4 d。将长出的单菌落利用打孔器转接到固体PDA平板的一侧，26～32℃培养4～5 d后，利用打孔器在平板另一侧转接构巢曲霉，26～32℃下进行对峙培养7～8 d；

b、  选取构巢曲霉菌落直径为3.0-5.0cm的红曲霉菌株从平板上刮取并转接到种子培养基中，26-32℃培养3-4 d；按照15%的接种量，将长好的种子培养基转接到发酵培养基中，26-32℃摇床120-180 r/m培养3 -4d后，20-25℃摇床120-180 r/m培养18-25d。

上述种子培养基包括米粉2-5g、碳源1-3g、氮源  0.1-0.5g、蛋白胨1.0-2.0g、MgSO₄·7H₂O 0.02-0.08g、KH₂PO4 0.10-0.20g，加水至100 mL。

上述碳源为葡萄糖、乳糖或木糖，所述氮源为NaNO₃。

优化的，上述种子培养基包括米粉3g、葡萄糖2g、NaNO₃ 0.2g、蛋白胨1.5g、MgSO₄·7H₂O 0.05g、KH₂PO₄ 0.15g，加水至100 mL。

上述发酵培养基包括米粉5-10 g、碳源 1-5 mL、氮源 0.1-0.5 g、蛋白胨1.0-2.0g、MgSO4·7H₂O 0.02-0.08g、KH₂PO₄  0.10-0.20g、加水至100 mL。

上述碳源为甘油或葡萄糖，所述氮源为NaNO3。

上述发酵培养基包括米粉7 g、甘油 5mL、NaNO₃ 0.2 g、蛋白胨1.5g、MgSO₄·7H₂O 0.05g、KH₂PO₄  0.15g、加水至100 mL。

优化的，上述的一种高开环率洛伐他汀的生产方法，其特征在于：a、    以生理盐水从初始菌株紫色红曲霉生长斜面上将孢子洗下，制得孢子悬液，接种种子培养基，培养36 h，取菌悬液以无菌纱布过滤，以玻璃珠震荡打散至单孢子悬液,收集单孢子悬液备用；将孢子悬液置于15 W紫外灯下，垂直距离30 cm，搅拌状态下照射；然后在红光下进行稀释涂布平板，避光培养；取紫外诱变致死率85诱变菌，富集培养36 h，取菌悬液以无菌纱布过滤，以玻璃珠震荡打散至单孢子悬液；取孢子悬液均匀涂布咋菌平板上，置于超净台内无菌风吹干制成菌膜进行氦离子束注入；选择注入能量为16V，束流强度为15mA，注入剂量为1.0×1015 ions /cm²，注入靶室的真空度为10^-3 Pa，采用脉冲注入，每个脉冲5s，间隔为50s。注入完成后平皿以lmL 无菌水洗下孢子；经过诱变处理后的孢子稀释至适当浓度后涂布PDA固体平板，30℃培养3 d，将长出的单菌落利用打孔器转接到固体PDA平板的一侧，30℃培养4 d后，利用打孔器在平板另一侧转接构巢曲霉，30℃下进行对峙培养7 d；

b、 选取构巢曲霉菌落直径为3.0-5.0cm的红曲霉菌株从平板上刮取并转接到种子培养基中，30℃培养3 d；按照15%的接种量，将长好的种子培养基转接到发酵培养基中，30℃摇床150 r/m培养3 d后，24℃摇床150 r/m培养20d。

上述一种高开环率洛伐他汀的生产方法中所述的紫色红曲霉已由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.6806，保藏日期为2012年11月13日。

本发明的紫色红曲霉(Monascus purpureus)具有以下形态特征：

于400倍显微镜观察紫色红曲霉MPB2的菌丝体形态，菌株形态特征为：菌丝体分枝甚繁、有隔，直径3.0μm～7.0μm，幼时有内含物，分生孢子球形或洋梨形、无色，子囊果球形、无色、短柄，椭圆形(5.0～7.0)μm×(4.5～5.0) μm。

本发明的紫色红曲霉MPB2具有以下培养特征：

紫色红曲霉MPB2在PDA琼脂培养基中30℃培养 7d，菌落较大，稍凸起，疏松，呈绒毡状，蔓延性一般，正面中间浅粉色，背部深红色，菌落大小(3.0～4.0)cm×(4.5～5.5)cm，生长速度较快；

紫色红曲霉MPB2在察氏琼脂培养基中30℃培养7d，菌落小，凸起最高，呈绒毡状，疏松，蔓延性差，正面浅红色，背部红色，菌落大小(2.5～3.0)cm×(3.5～4.5)cm，生长速度较慢。

本发明的紫色红曲霉的生物学特性如下：

生长温度为20℃～38℃，最适生长温度为35℃～32℃，在pH2.0～7.0的范围内均能生长。在察氏培养基和PDA琼脂培养基30℃培养7d，连续传代数代培养，其培养特征及形态特征均无明显变化，该菌株的生物学性状基本稳定。

本发明的有益效果是：本发明的诱变菌株及其生产洛伐他汀的方法，与常规红曲霉生产菌株及生产方法相比，其获得的洛伐他汀开环率可提高1.5倍以上，达到68.9%，从而获得品质更高的洛伐他汀产品。

附图说明

图1为紫色红曲霉在PDA培养基平板上生长时菌落形态；

图2为紫色红曲霉在查氏培养基平板上生长时菌落形态。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步作描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。

实施例1

利用构巢曲霉对峙培养对诱变后的红曲霉菌株进行初筛

以生理盐水从初始菌株生长斜面上将孢子洗下，制得孢子悬液，接种种子培养基，培养36 h，取菌悬液以无菌纱布过滤，以玻璃珠震荡打散至单孢子悬液。收集单孢子悬液备用。

将孢子悬液置于15 W紫外灯下，垂直距离30 cm，搅拌状态下照射。然后在红光下进行稀释涂布平板，避光培养。

取紫外诱变致死率85%的诱变菌，富集培养36 h，取菌悬液以无菌纱布过滤，以玻璃珠震荡打散至单孢子悬液。

取适量的孢子悬液均匀于无菌平板上，置于超净台内无菌风吹干制成菌膜进行氦离子束注入。选择注入能量为16keV，束流强度为15mA，注入剂量为1.0×10¹⁵ ions /cm²，注入靶室的真空度为10^-3 Pa，采用脉冲注入，每个脉冲5s，间隔为50s。注入完成后平皿以lmL 无菌水洗下孢子。

将经过诱变处理后的孢子稀释至适当浓度后涂布PDA固体平板，30℃培养3d。将长出的单菌落利用打孔器转接到固体PDA平板的一侧，30℃培养4d后，利用打孔器在平板另一侧转接构巢曲霉，30℃下进行对峙培养7 d后，通过比较构巢曲霉菌落直径来筛选洛伐他汀高产的红曲霉菌株，其菌落直径与洛伐他汀的产量见表1。

实施例2

红曲霉液态发酵生产洛伐他汀

发酵菌株：Monascus purpureus紫红曲菌

种子培养基：

米粉 3 g，葡萄糖 2 g，NaNO₃ 0.2 g，蛋白胨 1.5 g， MgSO₄·7H₂O  0.05 g，KH₂PO₄  0.15 g，加水至100 mL。

发酵培养基：

米粉 7 g，甘油 5 mL，NaNO₃ 0.2 g，蛋白胨 1.5 g， MgSO₄·7H₂O 0.05 g，KH₂PO₄  0.15 g，加水至100 mL。

培养条件：

从平板上刮取红曲霉孢子转接到装有50 mL种子培养基的三角瓶中，30℃培养3 d。按照15%的接种量，将长好的种子培养基转接到150 mL发酵培养基中，30℃摇床150 r/m培养3 d后，30℃摇床150 r/m培养14 d.

样品的处理与检测：

将发酵液10000 g离心10 min后，取上清250 μL，加入750 μL的无水乙醇，超声萃取20 min，使用 0.45 μm的有机微孔滤膜过滤后，进行高效液相色谱（HPLC）检测。HPLC检测条件为：色谱柱为255 mm×4.6 mm的C18柱，柱温25℃，紫外检测器，检测波长为238 nm，流动相为甲醇：水：磷酸=385:115:0.14（体积比），流速1 mL/min，进样量20 μL。

经检测得，Monascus purpureus紫红曲菌产生的洛伐他汀产量为806 mg/L，其中酸式洛伐他汀占洛伐他汀总含量的43.5%。

实施例3

诱变后红曲霉液态发酵生产洛伐他汀

发酵菌株：红曲霉MPB2

种子培养基：

米粉 3 g，葡萄糖 2 g，NaNO₃ 0.2 g，蛋白胨 1.5 g， MgSO₄·7H₂O  0.05 g，KH₂PO₄  0.15 g，加水至100 mL。

发酵培养基：

米粉 7 g，甘油 5 mL，NaNO₃ 0.2 g，蛋白胨 1.5 g， MgSO₄·7H₂O 0.05 g，KH₂PO₄  0.15 g，加水至100 mL。

培养条件：

从平板上刮取红曲霉MPB2孢子转接到装有50 mL种子培养基的三角瓶中，30℃培养3 d。按照15%的接种量，将长好的种子培养基转接到150 mL发酵培养基中，30℃摇床150 r/m培养3 d后，24℃摇床150 r/m培养20d.

样品的处理与检测：

将发酵液10000 g离心10 min后，取上清250 μL，加入750 μL的无水乙醇，超声萃取20 min，使用 0.45 μm的有机微孔滤膜过滤后，进行高效液相色谱（HPLC）检测。HPLC检测条件为：色谱柱为255 mm×4.6 mm的C18柱，柱温20～25℃，紫外检测器，检测波长为238 nm，流动相为甲醇：水：磷酸=385:115:0.14（体积比），流速1 mL/min，进样量20 μL。

经检测得，红曲霉MPB2产生的洛伐他汀产量为1509mg/L，其中酸式洛伐他汀占洛伐他汀总含量的68.9%。

实施例4

诱变后红曲霉液态发酵生产洛伐他汀

发酵菌株：红曲霉MPB2

种子培养基：

米粉 3 g，乳糖 2 g，NaNO₃ 0.2 g，蛋白胨 1.5 g， MgSO₄·7H₂O  0.05 g，KH₂PO₄  0.15 g，加水至100 mL。

发酵培养基：

米粉 7 g，葡萄糖 5 g，NaNO₃ 0.2 g，玉米浆5mL， MgSO₄·7H₂O 0.05 g，KH₂PO₄  0.15 g，加水至100 mL。

培养条件：

从平板上刮取红曲霉MPB2孢子转接到装有50 mL种子培养基的三角瓶中，30℃培养3 d。按照15%的接种量，将长好的种子培养基转接到150 mL发酵培养基中，30℃摇床150 r/m培养3 d后，24℃摇床150 r/m培养20d.

样品的处理与检测：

将发酵液10000 g离心10 min后，取上清250 μL，加入750 μL的无水乙醇，超声萃取30 min，使用 0.45 μm的有机微孔滤膜过滤后，进行高效液相色谱（HPLC）检测。HPLC检测条件为：色谱柱为255 mm×4.6 mm的C18柱，柱温25℃，紫外检测器，检测波长为238 nm，流动相为甲醇：水：磷酸=385:115:0.14（体积比），流速1 mL/min，进样量20 μL。

经检测得，红曲霉MPB2产生的洛伐他汀产量为1490mg/L，其中酸式洛伐他汀占洛伐他汀总含量的67.4%。

实施例5

诱变后红曲霉液态发酵生产洛伐他汀

发酵菌株：红曲霉MPB2

种子培养基：

米粉 3 g，木糖 2 g，NaNO₃ 0.2 g，蛋白胨 1.5 g， MgSO₄·7H₂O  0.05 g，KH₂PO₄  0.15 g，加水至100 mL。

发酵培养基：

米粉 7 g，甘油 5 mL，NaNO₃ 0.2 g，玉米浆5 mL， MgSO₄·7H₂O 0.05 g，KH₂PO₄  0.15 g，加水至100 mL。

培养条件：

从平板上刮取红曲霉MPB2孢子转接到装有50 mL种子培养基的三角瓶中，30℃培养2 d。按照15%的接种量，将长好的种子培养基转接到150 mL发酵培养基中，30℃摇床150 r/m培养2d后，24℃摇床150 r/m培养20 d.

样品的处理与检测：

将发酵液10000 g离心10 min后，取上清250 μL，加入750 μL的无水乙醇，超声萃取15 min，使用 0.45 μm的有机微孔滤膜过滤后，进行高效液相色谱（HPLC）检测。HPLC检测条件为：色谱柱为255 mm×4.6 mm的C18柱，柱温25℃，紫外检测器，检测波长为238 nm，流动相为甲醇：水：磷酸=385:115:0.14（体积比），流速1 mL/min，进样量20 μL。

经检测得，红曲霉MPB2产生的洛伐他汀产量为1520 mg/L，其中酸式洛伐他汀占洛伐他汀总含量的66.8%。

Claims (9)

1.一种高开环率洛伐他汀的生产方法，包括如下步骤：

a、以生理盐水从初始菌株紫色红曲霉生长斜面上将孢子洗下，制得孢子悬液，接种种子培养基，培养35-40 h，取菌悬液以无菌纱布过滤，以玻璃珠震荡打散至单孢子悬液，收集单孢子悬液备用；将孢子悬液置于10-16 W紫外灯下，垂直距离25-30cm，搅拌状态下照射；然后在红光下进行稀释涂布平板，避光培养；取紫外诱变致死率80～90%的诱变菌，富集培养36 h，取菌悬液以无菌纱布过滤，以玻璃珠震荡打散至单孢子悬液；取孢子悬液均匀涂布咋菌平板上，置于超净台内无菌风吹干制成菌膜进行氦离子束注入；选择注入能量为5～25keV，束流强度为15mA，注入剂量为7. 8×10¹⁴ ions /cm² ～ 3. 9×10¹⁵ ions /cm²，注入靶室的真空度为10^-3 Pa，采用脉冲注入，每个脉冲5s，间隔为50s，注入完成后平皿以lmL 无菌水洗下孢子；经过诱变处理后的孢子稀释至适当浓度后涂布PDA固体平板，26～32℃培养3～4 d；将长出的单菌落利用打孔器转接到固体PDA平板的一侧，26～32℃培养4～5 d后，利用打孔器在平板另一侧转接构巢曲霉，26～32℃下进行对峙培养7～8 d；

b、选取构巢曲霉菌落直径为3.0-5.0cm的红曲霉菌株从平板上刮取并转接到种子培养基中，26-32℃培养3-4 d；按照15%的接种量，将长好的种子培养基转接到发酵培养基中，26-32℃摇床120-180 r/m培养3 -4d后，20-25℃摇床120-180 r/m培养18-25d。

2.根据权利要求1所述的一种高开环率洛伐他汀的生产方法，其特征在于：所述种子培养基包括米粉2-5g、碳源1-3g、氮源  0.1-0.5g、蛋白胨1.0-2.0g、MgSO₄·7H₂O 0.02-0.08g、KH₂PO₄ 0.10-0.20g，加水至100 mL。

3.根据权利要求2所述的一种高开环率洛伐他汀的生产方法， 其特征在于：所述碳源为葡萄糖、乳糖或木糖，所述氮源为NaNO₃。

4.根据权利要求3所述的一种高开环率洛伐他汀的生产方法，其特征在于：所述种子培养基包括米粉3g、葡萄糖2g、NaNO₃ 0.2g、蛋白胨1.5g、MgSO₄·7H₂O 0.05g、KH₂PO₄ 0.15g，加水至100 mL。

5.根据权利要求1所述的一种高开环率洛伐他汀的生产方法，其特征在于：所述发酵培养基包括米粉5-10 g、碳源 1-5 mL、氮源 0.1-0.5 g、蛋白胨1.0-2.0g、MgSO4·7H₂O 0.02-0.08g、KH₂PO₄  0.10-0.20g、加水至100 mL。

6.根据权利要求5所述的一种高开环率洛伐他汀的生产方法，其特征在于：所述碳源为甘油或葡萄糖，所述氮源为NaNO3。

7.根据权利要求6所述的一种高开环率洛伐他汀的生产方法，其特征在于：所述发酵培养基包括米粉7 g、甘油 5mL、NaNO₃ 0.2 g、蛋白胨1.5g、MgSO₄·7H₂O 0.05g、KH₂PO₄  0.15g、加水至100 mL。

8.根据权利要求1所述的一种高开环率洛伐他汀的生产方法，其特征在于：

a、 以生理盐水从初始菌株紫色红曲霉生长斜面上将孢子洗下，制得孢子悬液，接种种子培养基，培养36 h，取菌悬液以无菌纱布过滤，以玻璃珠震荡打散至单孢子悬液,收集单孢子悬液备用；将孢子悬液置于15 W紫外灯下，垂直距离30 cm，搅拌状态下照射；然后在红光下进行稀释涂布平板，避光培养；取紫外诱变致死率85%的诱变菌，富集培养36 h，取菌悬液以无菌纱布过滤，以玻璃珠震荡打散至单孢子悬液；取孢子悬液均匀涂布咋菌平板上，置于超净台内无菌风吹干制成菌膜进行氦离子束注入；选择注入能量为16keV，束流强度为15mA，注入剂量为1.0×10¹⁵ ions /cm²，注入靶室的真空度为10^-3 Pa，采用脉冲注入，每个脉冲5s，间隔为50s，注入完成后平皿以lmL 无菌水洗下孢子；经过诱变处理后的孢子稀释至适当浓度后涂布PDA固体平板，30℃培养3d，将长出的单菌落利用打孔器转接到固体PDA平板的一侧，30℃培养4 d后，利用打孔器在平板另一侧转接构巢曲霉，30℃下进行对峙培养7 d；

b、选取构巢曲霉菌落直径为3.0-5.0cm的红曲霉菌株从平板上刮取并转接到种子培养基中，30℃培养3 d；按照15%的接种量，将长好的种子培养基转接到发酵培养基中，30℃摇床150 r/m培养3 d后，24℃摇床150 r/m培养20d。

9.根据权利要求1或8所述的一种高开环率洛伐他汀的生产方法，其特征在于：所述初始菌株紫色红曲霉Monascus  sp.于2012年11月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.6806。