CN103005402A - 液体发酵生产冬虫夏草菌粉的方法 - Google Patents

Abstract

液体发酵生产冬虫夏草菌粉的方法，涉及一种菌粉。提供一种液体发酵产生冬虫夏草菌粉的方法。1）斜面菌种培养；2）大米孢子培养；3）发酵培养，包括一级种子罐培养和二级发酵培养；4）制备菌粉。能够减少种子扩级次数，发酵周期约为120～160h，能有效缩短发酵时间，提高发酵罐利用率，提高产能，节约生产成本，最终菌体产率达到4%～6%，菌体干重达到40～60g/L，能达到工业化生产的要求。

Description

液体发酵生产冬虫夏草菌粉的方法

技术领域

本发明涉及一种菌粉，尤其是涉及一种液体发酵生产冬虫夏草菌粉的方法。

背景技术

冬虫夏草，是麦角菌科真菌冬虫夏草寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体，是一种传统的名贵滋补中药材，有调节免疫系统功能、抗肿瘤、抗疲劳等多种功效。

冬虫夏草生长在寒冷高海拔的地区，其生长的环境和条件比较苛刻。由于野生虫草的生长环境不断受到破坏，虫源锐减，加上人为采集的过量过早，导致野生虫草资源日益匮乏。为了满足市场需求，人工培养冬虫夏草成为了主要的来源。

但因为其工艺复杂，生长周期长及产量低的问题就出现人工发酵冬虫夏草的方法。通过科研工作者的不断研究，发现人工发酵虫草菌丝体其主要药理药化成分基本类似于天然虫草，这就为冬虫夏草人工发酵奠定了重要的理论支持。

在国内也有很多科研工作者发表了相关的专利，中国专利CN1478886A公开一种中国被毛胞液体菌种发酵工艺方法，该申请公开了发酵所用的菌种的获取、一级固体三角瓶菌种培养、液体种子培养、液体发酵罐生产工序，其不足之处是发酵周期长，为456h。中国专利CN101134940B公开一种冬虫夏草真菌-蝙蝠蛾被毛胞的发酵方法，该申请公开了发酵所用培养基成分、发酵工艺控制参数，其不足之处是发酵周期长，发酵周期长达720h，能耗高，发酵罐利用率低。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种液体发酵产生冬虫夏草菌粉的方法，克服了现有技术中冬虫夏草液体发酵周期过长、菌丝得率低以及发酵罐利用率低等问题。

本发明包括如下步骤：

1）斜面菌种培养：

配制斜面培养基，所述斜面培养基的组分为：葡萄糖15～35g/L、蛋白胨0.5～4g/L、MgSO₄·7H₂O1～5g/L、KH₂PO₄0.5～1g/L、大豆浸汁150～250mL/L、辅液Ⅰ1～4mL/L、琼脂20～25g/L、其余为水，pH5.9～6.6，以上各组分除辅液Ⅰ外，于121℃灭菌30min，辅液Ⅰ于118℃单独灭菌22min后加入无菌培养基，接种环粘少量无菌水，把冬虫夏草菌种从保藏斜面上接入无菌斜面进行培养，待斜面长满新鲜成熟孢子即可；

在步骤1）中，所述冬虫夏草菌种为冬虫夏草（Cordycepes sinensis（Berk.）Sacc）菌种，购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏号为ACCC50562；

所述辅液Ⅰ组分可为：盐酸硫胺1～4g/L、核黄素1～4g/L、维生素B30.5～1g/L、盐酸吡哆素0.6～1.2g/L、甘氨酸0.8～1.4g/L、生物素0.08～1.2g/L、赤霉素0.02～0.04g/L、NaSeO₃0.001～0.004g/L，其余为水；

所述大豆浸汁的制备方法可为：称取150～200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水煮沸半个小时，纱布过滤，最后定容到1000mL；

所述培养的条件可为：湿度控制在45%～55%，在15～18℃下恒温培养15～25天。

2）大米孢子培养：

配制固料培养基，由固料以及营养液组成，其中固料∶营养液=1g∶（0.5～0.7）mL，固料由大米和麸皮组成，其中大米∶麸皮按质量比为7∶3，营养液组分除去琼脂以外与斜面培养基的组分相同，固料与营养液混匀后75～80℃蒸或煮，冷却至室温后将成团的大米弄散，装入K瓶，121℃灭菌30～40min，灭菌完后充分抖散，使固料培养基厚度保持在1～4cm，向长满孢子的斜面加入无菌生理盐水，用接种铲将孢子刮下，将孢子浓度控制在1.0～2.5×10⁶个/mL，按固料质量体积比的3%～6%将孢子悬液均匀的喷在固料培养基的表面，抖动均匀后保持厚度在1～4cm，培养条件为湿度控制45%～55%，温度控制15～18℃，每隔6h翻抖一次固料，待长出菌丝体后静止培养，长满孢子后加入无菌生理盐水震荡制成孢子悬液，其中每粒亲米孢子数量为0.02～0.04×10⁹个/粒，按照体积比为1%～5%接入一级种子罐培养；

在步骤2）中，所述蒸或煮的时间可为30～40min；所述静止培养的时间可为5～9d；所述孢子的浓度可为0.8～1.6×10⁹个/L。

3）发酵培养：

（1）一级种子罐培养

配制一级种子培养基，其组分为：大豆浸汁200～300mL/L、葡萄糖10～30g/L、蔗糖10～30g/L、酵母浸膏5～20g/L、蛋白胨5～20g/L、KH₂PO₄1.5～4g/L、MnSO₄0.03～0.06g/L、NaCl5～20g/L、氯化铵0.2～0.6g/L、氯化钙0.01～0.06g/L、辅液Ⅱ1～4mL/L，其余为水，以上组分除辅液Ⅱ、葡萄糖外，于121℃灭菌30min，辅液Ⅱ、葡萄糖于118℃单独灭菌22min后添加到一级种子罐中，其中辅液Ⅱ的组分为：盐酸硫胺0.1～0.4g/L、核黄素0.5～2g/L、维生素B30.5～2g/L、盐酸吡哆素0.3～0.6g/L、甘氨酸0.8～1.6g/L、生物素0.04～0.08g/L、赤霉素0.02～0.06g/L、NaSeO₃0.002～0.006g/L，其余为水；把步骤2）培养好的孢子接入一级种子罐，培养条件为pH维持在5.9～6.6、温度18～20℃、罐压0.03～0.05MPa、通气比V∶V=1∶（0.5～0.8）、转速为130～170r/min、连续培养50～70h，待菌丝长稠呈丝状，菌丝团大小均一，有中小空泡即可移入二级发酵罐；

（2）二级发酵培养

配制二级发酵培养基，其组分为：大豆浸汁200～300mL/L、葡萄糖10～30g/L、蔗糖10～30g/L、酵母浸膏0.5～2g/L、蛋白胨1～4g/L、KH₂PO₄0.5～4g/L、MnSO₄0.03～0.08g/L、NaCl5～30g/L、氯化铵2～8g/L、氯化钙0.05～0.3g/L、辅液Ⅲ20～40mL/L，其余为水，以上组分除辅液Ⅲ、葡萄糖外，于121℃灭菌30min，辅液Ⅲ、葡萄糖于118℃单独灭菌22min后添加到二级种子罐中，其中辅液Ⅲ组分为：维生素B10.02～0.08g/L、维生素B20.01～0.06g/L、维生素B60.03～0.09g/L、烟酰胺0.5～1g/L、甘氨酸0.4～1g/L、生物素0.004～0.008g/L、赤霉素0.01～0.04g/L，其余为水，将一级种子发酵罐培养好的菌丝按体积百分比20%～30%的接种量移入二级发酵罐，培养条件为：pH维持在5.9～6.6、温度18～20℃、罐压0.03～0.05MPa、通气比V∶V=1∶（0.6～0.9）、转速130～150r/min，在发酵24h、40h、56h时分别补加体积比为1%～5%的全料和0.5%～2%的葡萄糖，其中全料的组分为：酵母浸膏2～6g/L、蛋白胨2～12g/L、KH₂PO₄3～10g/L、MnSO₄0.2～0.4g/L、NaCl2～5g/L、氯化铵6～15g/L、氯化钙0.2～0.4g/L，辅液Ⅲ20～40mL/L，于121℃灭菌40min，葡萄糖浓度为24～48g/L，于118℃灭菌22min；

连续发酵至70～90h，待残糖＜0.5%～1%，氨态氮＜0.05%～0.1%，镜检菌丝产量大量孢子时即可出罐；

4）制备菌粉：

收集发酵液进行过滤，用无菌水洗涤菌体、过滤，重复三次，然后离心收集菌体，将菌体置于60℃烘干至衡重，用超微粉碎法将干的菌体制成菌粉。

本发明有益效果是：按照上述工艺发酵生产冬虫夏草菌粉能够有效缩短发酵时间，约为120～160h，菌体产率达到4%～6%，菌体干重达到40～60g/L，提高发酵罐利用率及产能，节约生产成本，能达到工业化生产的要求。

具体实施方式

以下实施例将对本发明作进一步的说明。

实施例1：

把冬虫夏草（Cordycepes sinensis（Berk.）Sace）菌种ACCC50562从保藏斜面上接入无菌斜面进行培养，培养条件为湿度控制在45%，15℃恒温培养15天，待斜面长满新鲜孢子即可。斜面培养基组分为：葡萄糖15g/L、蛋白胨0.5g/L、MgSO₄·7H₂O1g/L、KH₂PO40.5g/L、大豆浸汁150mL/L、辅液Ⅰ1mL/L、琼脂20g/L、其余为水，pH5.9，以上组分除辅液Ⅰ外，于121℃灭菌30min，其中辅液Ⅰ于118℃单独灭菌22min后加入培养基，辅液Ⅰ的组分为：盐酸硫胺1g/L、核黄素1g/L、维生素B30.5g/L、盐酸吡哆素0.6g/L、甘氨酸0.8g/L、生物素0.08g/L、赤霉素0.02g/L、NaSeO₃0.001g/L，其余为水。大豆浸汁制备方法：称取150g马铃薯，洗净去皮切碎，加水煮沸半个小时，纱布过滤，最后定容到1000mL。

将斜面孢子转接到固料培养基，固料培养基由固料以及营养液组成，其中固料：营养液（w/v）=1g∶0.6mL，其中固料大米：麸皮质量比为7∶3，其中营养液组分为同斜面培养基（除去琼脂），固料与营养液混匀后80℃蒸煮30min，晾干冷却,使固料培养基厚度保持约2cm。向长满孢子的斜面加入无菌生理盐水，用接种铲将孢子刮下，将孢子浓度控制在1.0×10⁶个/mL，按固料质量体积比的3%将孢子悬液均匀的喷在固料培养基的表面，充分抖动均匀后保持厚度约2cm，培养条件为湿度控制45%，温度控制15℃，每隔6h翻抖一次固料，待长出菌丝体后静止培养5～9d，长满孢子后加入无菌生理盐水震荡制成孢子悬液，孢子浓度控制在0.8×10⁹个/L，其中每粒亲米孢子数量为0.03×10⁹个/粒，按照体积比为1%接入一级种子罐培养。

一级种子培养基组分：大豆浸汁200mL/L、葡萄糖10g/L、蔗糖10g/L、酵母浸膏5g/L、蛋白胨5g/L、KH₂PO₄1.5g/L、MnSO₄0.03g/L、NaCl5g/L、氯化铵0.2g/L、氯化钙0.01g/L、辅液Ⅱ1mL/L，其余为水，以上组分除辅液Ⅱ和葡萄糖外，于121℃灭菌30min，辅液Ⅱ、葡萄糖于118℃单独灭菌22min后添加到一级种子罐中，其中辅液Ⅱ的成分为：盐酸硫胺0.1g/L、核黄素0.5g/L、维生素B30.5g/L、盐酸吡哆素0.3g/L、甘氨酸0.8g/L、生物素0.04g/L、赤霉素0.02g/L、NaSeO₃0.002g/L，其余为水，培养条件：pH5.9、温度18℃、罐压维持0.03MPa、通气比V:V=1:0.5、转速为150r/min、连续培养50h，待菌丝长稠呈丝状，菌丝团大小均一，有中小空泡即可移入200L二级发酵罐。

二级发酵培养基：大豆浸汁200mL/L、葡萄糖10g/L、蔗糖10g/L、酵母浸膏0.5g/L、蛋白胨1g/L、KH₂PO₄0.5g/L、MnSO₄0.03g/L、NaCl5g/L、氯化铵2g/L、氯化钙0.05g/L、辅液Ⅲ20mL/L，其余为水，以上组分除辅液Ⅲ和葡萄糖外，于121℃灭菌30min，辅液Ⅲ和葡萄糖于118℃单独灭菌22min后添加到二级种子罐中，其中辅液Ⅲ的成分为：维生素B10.02g/L、维生素B20.01g/L、维生素B60.03g/L、烟酰胺0.5g/L、甘氨酸0.4g/L、生物素0.004g/L、赤霉素0.01g/L，NaSeO₃0.001g/L，其余为水，用压差法将一级种子罐培养好的菌丝体按照体积百分比20%的接种量移入200L二级发酵罐培养，培养条件为：pH5.9、温度18℃、罐压0.03MPa、通气比V：V=1：0.6、转速130r/min，在发酵24h、40h、56h时分别补加体积比为1%的全料和0.5%的葡萄糖，其中全料的组分为：酵母浸膏2g/L、蛋白胨2g/L、KH₂PO₄3g/L、MnSO₄0.2g/L、NaCl2g/L、氯化铵6g/L、氯化钙0.2g/L，辅液Ⅲ20mL/L，于121℃灭菌40min，葡萄浓度为24g/L，118℃灭菌22min。

连续发酵至70h，待残糖＜0.5%，氨态氮＜0.05%，镜检菌丝产量大量孢子时即可出罐收集发酵液进行过滤，用无菌水洗涤菌体、过滤，重复3次，然后离心收集菌体，将菌体置于60℃烘干至衡重，测的干重达到41g/L，菌体得率为4.1%，发酵周期为120h，用超微粉碎法将干的菌体制成菌粉。

实施例2：

把冬虫夏草（Cordycepes sinensis（Berk.）Sace）菌种ACCC50562从保藏斜面上接入无菌斜面进行培养，培养条件为湿度控制在50%，16℃恒温培养20天，待斜面长满新鲜孢子即可。斜面培养基组分为：葡萄糖25g/L、蛋白胨2g/L、MgSO₄·7H₂O3g/L、KH₂PO40.75g/L、大豆浸汁200mL/L、辅液Ⅰ3g/L、琼脂20g/L、其余为水，pH6.2，以上组分除辅液Ⅰ外，于121℃灭菌30min，其中辅液Ⅰ118℃单独灭菌22min后加入培养基，辅液Ⅰ的组分为：盐酸硫胺3g/L、核黄素3g/L、维生素B30.75g/L、盐酸吡哆素0.9g/L、甘氨酸1g/L、生物素0.1g/L、赤霉素0.03g/L、NaSeO₃0.003g/L，其余为水。大豆浸汁制备方法：称取180g马铃薯，洗净去皮切碎，加水煮沸0.5h，纱布过滤，最后定容到1000mL。

将斜面孢子转接到固料培养基，固料培养基由固料以及营养液组成，其中固料∶营养液（w/v）=1g∶0.6mL，其中固料大米：麸皮质量比为7：3，其中营养液组分为同斜面培养基（除去琼脂），固料与营养液混匀后80℃蒸煮30min，晾干冷却，然后按照规格为每1000mL的K氏瓶装130g固料培养基，121℃灭菌40min，灭完后充分抖散，使固料培养基厚度保持约2cm左右。向长满孢子的斜面加入无菌生理盐水，用接种铲将孢子刮下，将孢子浓度控制在1.8×10⁶个/mL，按固料质量体积比的4.5%将孢子悬液均匀的喷在固料培养基的表面，充分抖动均匀后保持厚度约2cm，培养条件为湿度控制50%，温度控制16℃，每隔6h翻抖一次固料，待长出菌丝体后静止培养7d，长满孢子后加入无菌生理盐水震荡制成孢子悬液，孢子浓度控制在1.2×10⁹个/L，其中每粒亲米孢子数量为0.03×10⁹个/粒，按照体积比为3%接入一级种子罐培养。

一级种子培养基组分：大豆浸汁200mL/L、葡萄糖20g/L、蔗糖20g/L、酵母浸膏1g/L、蛋白胨1g/L、KH₂PO₄2g/L、MnSO₄0.04g/L、NaCl10g/L、氯化铵0.4g/L、氯化钙0.03g/L、辅液Ⅱ3mL/L，其余为水，以上组分除辅液Ⅱ、葡萄糖外，于121℃灭菌30min，辅液Ⅱ、葡萄糖于118℃单独灭菌22min后添加到一级种子罐中，辅液Ⅱ的成分为：盐酸硫胺0.2g/L、核黄素1g/L、维生素B31g/L、盐酸吡哆素0.4g/L、甘氨酸1g/L、生物素0.06g/L、赤霉素0.04g/L、NaSeO₃0.004g/L，其余为水，培养条件为pH6.2、温度19℃、罐压维持0.04MPa、通气比V∶V=1∶0.6、转速为150r/min、连续培养60h，待菌丝长稠呈丝状，菌丝团大小均一，有中小空泡即可移入200L二级发酵罐。

二级发酵培养基大豆浸汁250mL/L、葡萄糖20g/L、蔗糖20g/L、酵母浸膏1g/L、蛋白胨3g/L、KH₂PO₄2g/L、MnSO₄0.06g/L、NaCl10g/L、氯化铵6g/L、氯化钙0.1g/L、辅液Ⅲ30mL/L，其余为水，以上组分除辅液Ⅲ、葡萄糖外，于121℃灭菌30min，辅液Ⅲ、葡萄糖于118℃单独灭菌22min后添加到二级种子罐中，辅液Ⅲ的成分：维生素B10.06g/L、维生素B20.04g/L、维生素B60.06g/L、烟酰胺0.75g/L、甘氨酸0.8g/L、生物素0.006g/L、赤霉素0.02g/L，NaSeO₃0.002g/L，其余为水，用压差法将一级种子罐培养好的菌丝体按照体积百分比25%的接种量移入200L二级发酵罐培养，培养条件为：pH6.2、温度19℃、罐压0.04MPa、通气比V∶V=1∶0.7、转速140r/min，在发酵24h、40h、56h时分别补加体积比3%的全料和1%的葡萄糖，其中全料的组分为：酵母浸膏4g/L、蛋白胨8g/L、KH2PO₄6g/L、MnSO₄0.3g/L、NaCl4g/L、氯化铵10g/L、氯化钙0.3g/L，辅液Ⅲ30mL/L，于121℃灭菌40min，葡萄糖浓度36g/L，于118℃灭菌22min。

连续发酵至80h，待残糖＜0.8%，氨态氮＜0.08%，镜检菌丝产量大量孢子时即可出罐收集发酵液进行过滤，用无菌水洗涤菌体、过滤，重复3次，然后离心收集菌体，将菌体置于60℃烘干至衡重，测的干重达到54g/L,菌体得率为5.4%，发酵周期为140h，用超微粉碎法将干的菌体制成菌粉。

实施例3：

把冬虫夏草（Cordycepes sinensis（Berk.）Sacc）菌种ACCC50562从保藏斜面上接入无菌斜面进行培养，培养条件为湿度控制在55%，18℃恒温培养25天，待斜面长满新鲜孢子即可。斜面培养基组成为：葡萄糖35g/L、蛋白胨4g/L、MgSO₄·7H₂O5g/L、KH₂PO₄1g/L、大豆浸汁250mL/L、辅液Ⅰ4mL/L、琼脂25g/L、其余为水，pH6.6，以上组分除辅液Ⅰ外于121℃灭菌30min，其中辅液Ⅰ118℃单独灭菌22min后加入培养基，辅液体Ⅰ组分为：盐酸硫胺4g/L、核黄素4g/L、维生素B31g/L、盐酸吡哆素1.2g/L、甘氨酸1.4g/L、生物素1.2g/L、赤霉素0.04g/L、NaSeO₃0.004g/L，其余为水。大豆浸汁制备方法：称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水煮沸0.5h，纱布过滤，最后定容到1000mL。

将斜面孢子转接到固料培养基，固料培养基由固料以及营养液组成，其中固料∶营养液（w/v）=1g∶0.7mL，其中固料由大米：麸皮质量比为7：3，其中营养液组分为同斜面培养基（除去琼脂），固料与营养液混匀后80℃蒸煮40min，冷却至室温后将成团大米的弄散，装入K瓶，121℃灭菌30～40min，灭菌完后充分抖散，使固料培养基厚度保持约3cm左右，向长满孢子的斜面加入无菌生理水，用接种铲将孢子刮下，将孢子浓度控制在2.5×10₆个/mL，按固料质量体积比的6%将孢子悬液均匀的喷在固料培养基的表面，然后充分抖动均匀后保持厚度约3cm，培养条件为湿度控制55%，温度控制18℃，每隔6h进行抖动，待长出菌丝体后静止培养至8d后长满新鲜孢子后加入无菌水生理盐水制备成孢子悬液，孢子浓度控制在1.6×10₉个/L，其中每粒亲米孢子数量为0.04×10₉个/粒，按照体积比为5%接入一级种子罐培养。

一级种子培养基组分：大豆浸汁300mL/L、葡萄糖30g/L、蔗糖30g/L、酵母浸膏20g/L、蛋白胨20g/L、KH₂PO₄4g/L、MnSO₄0.06g/L、NaCl20g/L、氯化铵0.6g/L、氯化钙0.06g/L、辅液Ⅱ4mL/L，其余为水，以上组分除辅液Ⅱ、葡萄糖外，于121℃灭菌30min，辅液Ⅱ、葡萄糖于118℃单独灭菌22min后添加到一级种子罐中，辅液Ⅱ的成分为：盐酸硫胺0.4g/L、核黄素2g/L、维生素B₃2g/L、盐酸吡哆素0.6g/L、甘氨酸1.6g/L、生物素0.08g/L、赤霉素0.06g/L、NaSeO₃0.006g/L，其余为水，培养条件为pH6.6、温度20℃、罐压维持0.05MPa、通气比V∶V=1∶0.8、转速为170r/min、连续培养70h，待菌丝长稠呈丝状，菌丝团大小均一，有中小空泡即可按30%接种量移入200L二级发酵罐。

二级发酵培养基组分：大豆浸汁300mL/L、葡萄糖30g/L、蔗糖30g/L、酵母浸膏2g/L、蛋白胨4g/L、KH₂PO₄4g/L、MnSO₄0.08g/L、NaCl30g/L、氯化铵8g/L、氯化钙0.3g/L、辅液Ⅲ40mL/L，其余为水，以上组分除辅液Ⅲ、葡萄糖外，于121℃灭菌30min，辅液Ⅲ、葡萄糖于118℃单独灭菌22min后添加到二级种子罐中，其辅液Ⅲ的成分：维生素B10.08g/L、维生素B20.06g/L、维生素B60.09g/L、烟酰胺1g/L、甘氨酸1g/L、生物素0.008g/L、赤霉素0.04g/L，其余为水，用压差法移入将一级种子发酵罐培养好的菌丝按接种量为30%移入200L发酵罐进行培养，培养条件为：pH6.6、温度20℃、罐压0.05MPa、通气比V∶V=1∶0.9、转速150r/min，在发酵24h、40h、56h时分别补加体积比为5%的全料和2%的葡萄糖，其中全料的组分为：酵母浸膏6g/L、蛋白胨12g/L、KH₂PO₄10g/L、MnSO₄0.4g/L、NaCl5g/L、氯化铵15g/L、氯化钙0.4g/L，辅液Ⅲ40mL/L，于121℃灭菌40min，葡萄糖浓度为48g/L，于118℃灭菌22min。

连续发酵至90h，待残糖＜1%，氨态氮＜0.1%，镜检菌丝产量大量孢子时即可出罐收集发酵液进行过滤，用无菌水洗涤菌体、过滤，重复3次，然后离心收集菌体，将菌体置于60℃烘干至衡重，测的干重达到61.3g/L，菌体得率为6.1%，发酵周期为160h，用超微粉碎法将干的菌体制成菌粉。

Claims (10)

1.液体发酵生产冬虫夏草菌粉的方法，其特征在于包括如下步骤：

1）斜面菌种培养；

2）大米孢子培养；

3）发酵培养，包括一级种子罐培养和二级发酵培养；

4）制备菌粉。

2.如权利要求1所述的液体发酵生产冬虫夏草菌粉的方法，其特征在于在步骤1）中，所述斜面菌种培养的具体方法如下：配制斜面培养基，所述斜面培养基的组分为：葡萄糖15～35g/L、蛋白胨0.5～4g/L、MgSO₄·7H₂O1～5g/L、KH₂PO₄0.5～1g/L、大豆浸汁150～250mL/L、辅液Ⅰ1～4mL/L、琼脂20～25g/L、其余为水，pH5.9～6.6，以上各组分除辅液Ⅰ外，于121℃灭菌30min，辅液Ⅰ于118℃单独灭菌22min后加入无菌培养基，接种环粘少量无菌水，把冬虫夏草菌种从保藏斜面上接入无菌斜面进行培养，待斜面长满新鲜成熟孢子即可；所述冬虫夏草菌种为冬虫夏草（Cordycepes sinensis(Berk.）Sacc），购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏号为ACCC50562。

3.如权利要求2所述的液体发酵生产冬虫夏草菌粉的方法，其特征在于所述辅液Ⅰ组分为：盐酸硫胺1～4g/L、核黄素1～4g/L、维生素B30.5～1g/L、盐酸吡哆素0.6～1.2g/L、甘氨酸0.8～1.4g/L、生物素0.08～1.2g/L、赤霉素0.02～0.04g/L、NaSeO₃0.001～0.004g/L，其余为水。

4.如权利要求2所述的液体发酵生产冬虫夏草菌粉的方法，其特征在于所述大豆浸汁的制备方法为：称取150～200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水煮沸半个小时，纱布过滤，最后定容到1000mL。

5.如权利要求2所述的液体发酵生产冬虫夏草菌粉的方法，其特征在于所述培养的条件为：湿度控制在45%～55%，在15～18℃下恒温培养15～25天。

6.如权利要求1所述的液体发酵生产冬虫夏草菌粉的方法，其特征在于在步骤2）中，所述大米孢子培养的具体方法如下：配制固料培养基，由固料以及营养液组成，其中固料∶营养液=1g∶（0.5～0.7）mL，固料由大米和麸皮组成，其中大米∶麸皮按质量比为7∶3，营养液组分除去琼脂以外与斜面培养基的组分相同，固料与营养液混匀后75～80℃蒸或煮，冷却至室温后将成团的大米弄散，装入K瓶，121℃灭菌30～40min，灭菌完后充分抖散，使固料培养基厚度保持在1～4cm，向长满孢子的斜面加入无菌生理盐水，用接种铲将孢子刮下，将孢子浓度控制在1.0～2.5×10⁶个/mL，按固料质量体积比的3%～6%将孢子悬液均匀的喷在固料培养基的表面，抖动均匀后保持厚度在1～4cm，培养条件为湿度控制45%～55%，温度控制15～18℃，每隔6h翻抖一次固料，待长出菌丝体后静止培养，长满孢子后加入无菌生理盐水震荡制成孢子悬液，其中每粒亲米孢子数量为0.02～0.04×10⁹个/粒，按照体积比为1%～5%接入一级种子罐培养。

7.如权利要求4所述的液体发酵生产冬虫夏草菌粉的方法，其特征在于所述蒸或煮的时间为30～40min；所述静止培养的时间为5～9d；所述孢子的浓度可为0.8～1.6×10⁹个/L。

8.如权利要求1所述的液体发酵生产冬虫夏草菌粉的方法，其特征在于在步骤3）中，所述一级种子罐培养的具体方法如下：配制一级种子培养基，其组分为：大豆浸汁200～300mL/L、葡萄糖10～30g/L、蔗糖10～30g/L、酵母浸膏5～20g/L、蛋白胨5～20g/L、KH₂PO₄1.5～4g/L、MnSO₄0.03～0.06g/L、NaCl5～20g/L、氯化铵0.2～0.6g/L、氯化钙0.01～0.06g/L、辅液Ⅱ1～4mL/L，其余为水，以上组分除辅液Ⅱ、葡萄糖外，于121℃灭菌30min，辅液Ⅱ、葡萄糖于118℃单独灭菌22min后添加到一级种子罐中，其中辅液Ⅱ的组分为：盐酸硫胺0.1～0.4g/L、核黄素0.5～2g/L、维生素B30.5～2g/L、盐酸吡哆素0.3～0.6g/L、甘氨酸0.8～1.6g/L、生物素0.04～0.08g/L、赤霉素0.02～0.06g/L、NaSeO₃0.002～0.006g/L，其余为水；把步骤2）培养好的孢子接入一级种子罐，培养条件为pH维持在5.9～6.6、温度18～20℃、罐压0.03～0.05MPa、通气比V∶V=1∶（0.5～0.8）、转速为130～170r/min、连续培养50～70h，待菌丝长稠呈丝状，菌丝团大小均一，有中小空泡即可移入二级发酵罐。

9.如权利要求1所述的液体发酵生产冬虫夏草菌粉的方法，其特征在于在步骤3）中，所述二级发酵培养的具体方法如下：配制二级发酵培养基，其组分为：大豆浸汁200～300mL/L、葡萄糖10～30g/L、蔗糖10～30g/L、酵母浸膏0.5～2g/L、蛋白胨1～4g/L、KH₂PO₄0.5～4g/L、MnSO₄0.03～0.08g/L、NaCl5～30g/L、氯化铵2～8g/L、氯化钙0.05～0.3g/L、辅液Ⅲ20～40mL/L，其余为水，以上组分除辅液Ⅲ、葡萄糖外，于121℃灭菌30min，辅液Ⅲ、葡萄糖于118℃单独灭菌22min后添加到二级种子罐中，其中辅液Ⅲ组分为：维生素B10.02～0.08g/L、维生素B20.01～0.06g/L、维生素B60.03～0.09g/L、烟酰胺0.5～1g/L、甘氨酸0.4～1g/L、生物素0.004～0.008g/L、赤霉素0.01～0.04g/L，其余为水，将一级种子发酵罐培养好的菌丝按体积百分比20%～30%的接种量移入二级发酵罐，培养条件为：pH维持在5.9～6.6、温度18～20℃、罐压0.03～0.05MPa、通气比V∶V=1∶（0.6～0.9）、转速130～150r/min，在发酵24h、40h、56h时分别补加体积比为1%～5%的全料和0.5%～2%的葡萄糖，其中全料的组分为：酵母浸膏2～6g/L、蛋白胨2～12g/L、KH₂PO₄3～10g/L、MnSO₄0.2～0.4g/L、NaCl2～5g/L、氯化铵6～15g/L、氯化钙0.2～0.4g/L，辅液Ⅲ20～40mL/L，于121℃灭菌40min，葡萄糖浓度为24～48g/L，于118℃灭菌22min；

连续发酵至70～90h，待残糖＜0.5%～1%，氨态氮＜0.05%～0.1%，镜检菌丝产量大量孢子时即可出罐。

10.如权利要求1所述的液体发酵生产冬虫夏草菌粉的方法，其特征在于在步骤4）中，所述制备菌粉的具体方法如下：收集发酵液进行过滤，用无菌水洗涤菌体、过滤，重复3次，然后离心收集菌体，将菌体置于60℃烘干至衡重，用超微粉碎法将干的菌体制成菌粉。