CN104195067B

CN104195067B - 一株解淀粉芽孢杆菌及其在水产养殖中的应用

Info

Publication number: CN104195067B
Application number: CN201410319443.7A
Authority: CN
Inventors: 王芸; 林黑着; 牛津; 王珺; 陈素文; 周传朋
Original assignee: South China Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy Fishery Sciences
Current assignee: South China Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy Fishery Sciences
Priority date: 2014-07-07
Filing date: 2014-07-07
Publication date: 2016-08-17
Anticipated expiration: 2034-07-07
Also published as: CN104195067A

Abstract

本发明公开了一株解淀粉芽孢杆菌及其在水产养殖中的应用。解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）SIP0902菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2014323。本发明的解淀粉芽孢分离自凡纳滨对虾的肠道，是一种内源性菌株，该菌株对包括副溶血弧菌、鳗弧菌、溶藻弧菌等7种水产动物致病弧菌均具有较强的拮抗效果。该菌株制备的解淀粉芽孢杆菌粉剂，可明显增强凡纳滨对虾非特性免疫功能，提高对虾抗病原菌感染能力。

Description

一株解淀粉芽孢杆菌及其在水产养殖中的应用

技术领域

本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一株解淀粉芽孢杆菌及其在水产养殖中的应用。

背景技术

水产养殖在我国农业经济中具有举足轻重的地位。但随着集约化、规模化、工厂化等高密度养殖模式的迅猛发展及整个养殖环境的持续恶化，水产养殖病害频繁爆发每年给水产养殖造成了巨大的经济损失；抗生素的使用在早期的水产养殖生产中发挥了重要作用，是人们防止水产动物病害的首选方案；但病原微生物耐药性的不断增强以及人们对抗生素滥用、水产品药物残留等关系人类健康问题的关注，迫使抗生素以及一些化学药品的在水产养殖的应用都将受到严格限制；因此开发环境友好及可持续发展战略的病害防控技术及产品是水产养殖业亟需解决的问题。

生物拮抗是自然界普遍存在的现象，某些种类的微生物通过竞争营养成分、产生抑菌物质、降解信号分子等不同方式以达到抑制其他微生物生长的目的。微生物防控技术就是基于这种自然法则，通过在饲料或养殖环境施加有益微生物控制肠道或水环境中致病微生物的数量，维持养殖动物肠道健康及良好的养殖环境。作为抗生素的一种替代方案，益生菌的使用在保证养殖动物生产性能及健康状况的同时，也能避免药物残留等潜在的水产品安全风险，可以创造较好的经济和社会效益。

现有的益生菌产品种类繁多，主要包括光合细菌、酵母菌、乳酸菌及芽孢杆菌。其中芽孢杆菌属于芽孢杆菌科，广泛分布于养殖环境及动物肠道，因为具有较强的胞外酶分泌能力以及容易生产、保存等优点，在水产养殖中具有非常广泛的应用。同时由于芽孢杆菌种类繁多，不同种属甚至同一种属不同菌株之间，其特性（如胞外酶分泌能力、拮抗物质的种类及效果）可能也千差万别。因此在众多的芽孢杆菌中筛选到具有广谱抗菌效果，来源于对虾肠道、适用于水产养殖的独特菌株尤为重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一株解淀粉芽孢杆菌及其在水产养殖中的应用。

本发明所采取的技术方案是：

解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）SIP0902，已于2014年7月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2014323。

解淀粉芽孢杆菌SIP0902在制备抑菌制剂中的应用。

解淀粉芽孢杆菌SIP0902在制备水产免疫增强剂中的应用。

解淀粉芽孢杆菌SIP0902在制备养殖水体改善剂中的应用。

一种抑菌制剂，其含有解淀粉芽孢杆菌SIP0902。

一种水产免疫增强剂，其含有解淀粉芽孢杆菌SIP0902。

一种水产养殖调水剂，其含有解淀粉芽孢杆菌SIP0902。

一种解淀粉芽孢杆菌SIP0902菌粉的制备方法，包括如下步骤：

（1）将解淀粉芽孢杆菌SIP0902菌种划线于种子固体培养基中进行种子培养；

（2）种子培养结束后，从平板挑取一个单菌落接种于解淀粉芽孢杆菌发酵液中发酵培养，培养温度控制在28-37℃；

（3）当发酵液OD600值达到1.5-2.0时，停止发酵，取发酵液离心，弃上清液获得湿菌泥，并在菌泥中加入冷冻干燥保护剂，混合均匀后进行冷冻干燥既得解淀粉芽孢杆菌SIP0902粉剂。

步骤（1）所述种子固体培养基的组成为：葡萄糖1.0%，蛋白胨 0.5%，酵母膏 1.0%，琼脂粉 1.5%，pH 7.0，%表示质量百分比。

步骤（2）所述解淀粉芽孢杆菌发酵液的组成为：酵母膏 0.1%，蛋白胨 0.5%，淀粉1.0%，硫酸亚铁 0.001%，余量为水，%表示质量百分比。

本发明的有益效果是：

本发明的解淀粉芽孢杆菌SIP0902分离自凡纳滨对虾的肠道，是一种内源性菌株，该菌株对包括副溶血弧菌、鳗弧菌、溶藻弧菌等7种水产动物致病弧菌均具有较强的拮抗效果。该菌株制备的解淀粉芽孢杆菌粉剂，可明显增强凡纳滨对虾非特性免疫功能，提高对虾抗病原菌感染能力。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1解淀粉芽孢杆菌SIP0902

解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）SIP0902已于2014年7月4日保藏于中国典型培养物保藏中心（CHINA CENTER FOR TYPE CULTURE COLLECTION，CCTCC），地址为中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2014323。

菌株信息如下：

1、来源：解淀粉芽孢杆菌SIP0902分离自健康凡纳滨对虾的肠道，经肌肉注射实验证明对凡纳滨对虾无致病性。

2、解淀粉芽孢杆菌SIP0902的菌种形态特征：

菌落特征：在TSA培养基表明，菌落扁平、圆形，边缘整齐，表面灰白色，干燥，不透明，中间具有典型的白色圆圈。不能在TCBS培养基生长。

细胞特征：革兰氏染色阳性，短杆状，无荚膜，可形成中生芽孢，大小0.6-0.7 µm×0.8-1.0 µm。

芽孢特征：中生，孢囊不膨大，方形。

生理生化特征：见表1。

表1 解淀粉芽孢杆菌生理生化特征

3、遗传学特征：

解淀粉芽孢杆菌SIP0902的16rDNA和gryA基因碱基序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

实施例2解淀粉芽孢杆菌SIP0902菌粉的制备

步骤如下：

（1）将−80℃保存的解淀粉芽孢杆菌SIP0902菌种划线于种子固体培养基；

（2）37℃恒温培养24h后，从平板挑取一个单菌落接种于解淀粉芽孢杆菌发酵液中发酵培养，培养温度控制在28-37℃；

（3）当发酵液OD600值达到1.5-2.0时，停止发酵；取发酵液离心，弃上清液获得湿菌泥，并在菌泥中加入5%海藻糖作为冷冻干燥保护剂，混合均匀后进行冷冻干燥既得解淀粉芽孢杆菌SIP0902粉剂，其中解淀粉芽孢杆菌SIP0902孢子总数大于10¹¹CFU/g。

解淀粉芽孢杆菌种子固体培养基成分质量百分比为：葡萄糖1.0%，蛋白胨 0.5%，酵母膏 1.0%，琼脂粉 1.5%，pH 7.0。

解淀粉芽孢杆菌发酵液成分质量百分比为：酵母膏 0.1%，蛋白胨 0.5%，淀粉1.0%，硫酸亚铁 0.001%，余量为水。

实施例3解淀粉芽孢杆菌SIP0902对常见致病菌的体外抑菌效果

具体实验方法如下：

1、SIP0902菌悬液及滤液的制备：取SIP0902样品5g，加入50ml 灭菌生理盐水，充分震荡后置80℃水浴 10min；取上层液体10ml，接种至50ml 灭菌TSB液体培养基中，恒温摇床震荡培养18h（培养温度 30℃，转速140rpm）；取上述菌悬液5ml 转接入50ml 新配的TSB液体培养基中恒温摇床震荡培养18h（培养温度 30℃，转速140rpm）；取上述菌悬液一定量，离心（5000rpm，10min）取上清，上清再用0.22µm滤膜过滤，即得SIP0902滤液，置于10ml灭菌离心管中；同时将SIP0902菌悬液8ml于10ml灭菌离心管中，备用，均为现做现用。

2、鳗弧菌等七株致病性弧菌的菌悬液的制备

（1）挑取斜面菌苔一环接种至50ml TSB液体培养基，摇床震荡培养18h（培养温度 30℃，转速140rpm）；

（2）取上述菌悬液5ml 重新接种至50ml 新配TSB液体培养基，摇床震荡培养18h（培养温度 30℃，转速140rpm）；

（3）离心（5000rpm，10min）去掉上清，然后用生理盐水调整菌体浓度约0.50～2.0×10⁸ cfu/ml，取200μl均匀涂板。

3、测定方法

（1）取上述制备好的鳗弧菌菌悬液10⁶ cfu/ml（其他弧菌按同样的方法进行试验）200 μl，均匀涂布于TSA 平板表面（每个平板约30ml TSA固体培养基）；

（2）用打孔器在涂有病原弧菌的琼脂培养基上均匀的打五个孔，打孔器的直径约7mm。

（3）然后在琼脂孔中分别加入下述液体（约100 μl /孔）: SIP0902菌悬液、抗生素（氟苯尼考）阳性对照、生理盐水阴性对照；

（4）将上述平板置恒温培养箱培养24h-48h，然后观察结果测量抑菌圈直径。实验结果见表2。

表2. 解淀粉芽孢杆菌对病原菌的体外抑菌效果

实施例4解淀粉芽孢杆菌在对虾养殖中的应用

将解淀粉芽孢杆菌SIP0902菌粉50g与50g石粉均匀混合后，然后添加到南美白对虾基础饲料中，饲料中解淀粉芽孢杆菌浓度为10⁹cfu/kg。白对虾基础饲料配方如下：鱼粉25%，豆粕20%，花生粕17%，虾壳粉6%，啤酒酵母6%，高筋面粉20%，卵磷脂1.55，油（鱼油：豆油=1:1）1.5%，预混料2.23%。各原料粉碎过80目，然后准确称重，混匀，用双螺杆压条机挤出直径分别为1.0和1.5mm两种粒径的饲料，90℃熟化半小时后，自然风干后贮存在冰箱待用。

试验选用初始体重约0.4g健康南美白对虾320尾，随机分成对照组（投喂白对虾基础饲料）和实验组（投喂含有解淀粉芽孢杆菌SIP0902菌粉的白对虾基础饲料），每组4个重复，每个重复40尾虾。试验共进行8周，前三周投喂粒径1.0 mm的饲料，后5周投喂1.5mm粒径饲料。每天8:00，17:00和22:00各投喂1次，投喂量按对虾体重的6-8%计。试验期间水体盐度31-32‰，温度为30.11±0.20℃，溶解氧为4.32±0.25mg/L，连续充气，试验期间每隔2天换水1/3。饲喂8周后，每组每个重复取对虾10尾，取样测定对虾血淋巴酚氧化酶、溶菌酶及超氧化物酶活力。剩余对虾用副溶血弧菌攻毒，计算攻毒后7天各组的累计死亡率。试验结果表明：与对照组相比，饲喂解淀粉芽孢杆菌组对虾的非特异性免疫指标（酚氧化酶、溶菌酶及超氧化物歧化酶酶活）显著提高，副溶血弧菌攻毒后实验组对虾成活率显著高于对照组。

以上实验表明，解淀粉芽孢杆菌SIP0902可提高对虾非特异免疫功能，增强对虾抗细菌性疾病能力，因而可用于制备水产免疫增强剂。

<110> 中国水产科学研究院南海水产研究所

<120> 一株解淀粉芽孢杆菌及其在水产养殖中的应用

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1454

<212> DNA

<213> Bacillus amyloliquefaciens

<400> 1

ccacttctgt cacttcggcg gctggctcca taaaggttac ctcaccgact tcgggtgtta 60

caaactctcg tggtgtgacg ggcggtgtgt acaaggcccg ggaacgtatt caccgcggca 120

tgctgatccg cgattactag cgattccagc ttcacgcagt cgagttgcag actgcgatcc 180

gaactgagaa cagatttgtg ggattggctt aacctcgcgg tttcgctgcc ctttgttctg 240

tccattgtag cacgtgtgta gcccaggtca taaggggcat gatgatttga cgtcatcccc 300

accttcctcc ggtttgtcac cggcagtcac cttagagtgc ccaactgaat gctggcaact 360

aagatcaagg gttgcgctcg ttgcgggact taacccaaca tctcacgaca cgagctgacg 420

acaaccatgc accacctgtc actctgcccc cgaaggggac gtcctatctc taggattgtc 480

agaggatgtc aagacctggt aaggttcttc gcgttgcttc gaattaaacc acatgctcca 540

ccgcttgtgc gggcccccgt caattccttt gagtttcagt cttgcgaccg tactccccag 600

gcggagtgct taatgcgtta gctgcagcac taaggggcgg aaacccccta acacttagca 660

ctcatcgttt acggcgtgga ctaccagggt atctaatcct gttcgctccc cacgctttcg 720

ctcctcagcg tcagttacag accagagagt cgccttcgcc actggtgttc ctccacatct 780

ctacgcattt caccgctaca cgtggaattc cactctcctc ttctgcactc aagttcccca 840

gtttccaatg accctccccg gttgagccgg gggctttcac atcagactta agaaaccgcc 900

tgcgagccct ttacgcccaa taattccgga caacgcttgc cacctacgta ttaccgcggc 960

tgctggcacg tagttagccg tggctttctg gttaggtacc gtcaaggtgc cgccctattt 1020

gaacggcact tgttcttccc taacaacaga gctttacgat ccgaaaacct tcatcactca 1080

cgcggcgttg ctccgtcaga ctttcgtcca ttgcggaaga ttccctactg ctgcctcccg 1140

taggagtctg ggccgtgtct cagtcccagt gtggccgatc accctctcag gtcggctacg 1200

catcgtcgcc ttggtgagcc gttacctcac caactagcta atgcgccgcg ggtccatctg 1260

taagtggtag ccgaagccac cttttatgtc tgaaccatgc ggttcagaca accatccggt 1320

attagccccg gtttcccgga gttatcccag tcttacaggc aggttaccca cgtgttactc 1380

acccgtccgc cgctaacatc agggagcaag ctcccatctg tccgctcgac tgcatgtata 1440

gctgccgcac tcaa 1454

<210> 2

<211> 732

<212> DNA

<213> Bacillus amyloliquefaciens

<400> 2

tatatatttt ccccccttcg tcggtgaagt tatcggtaag taccacccgc acggtgactc 60

agcggtttac gaatcaatgg tcagaatggc gcaggatttt aactaccgct acatgcttgt 120

tgacggacac ggcaacttcg gttcggttga cggcgactca gcggccgcga tgcgttacac 180

agaagcgaga atgtcaaaaa tcgcaatgga aattctgcgt gacattacga aagacacgat 240

tgactatcaa gataactatg acggttcaga aagagagcct gccgtcatgc cttcgagatt 300

tccgaatctg ctcgtaaacg gggctgccgg tattgcggtc ggaatggcga caaacattcc 360

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tccttatcag gtgaacaaag cgagattaat tgaaaaaatc gcggatcttg tccgagacaa 660

aaaaatcgaa ggaattaccg atctgcgaga cgaatccgac cgtaacggaa tgagaatcgt 720

cattgagtcc cc 732

Claims

1.解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）SIP0902，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2014323。

2.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌SIP0902在制备抑菌制剂中的应用。

3.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌SIP0902在制备水产免疫增强剂中的应用。

4.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌SIP0902在制备养殖水体改善剂中的应用。

5.一种抑菌制剂，其含有权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌SIP0902。

6.一种水产免疫增强剂，其含有权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌SIP0902。

7.一种水产养殖调水剂，其含有权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌SIP0902。

8.一种解淀粉芽孢杆菌SIP0902菌粉的制备方法，包括如下步骤：

（3）当发酵液OD₆₀₀值达到1.5-2.0时，停止发酵，取发酵液离心，弃上清液获得湿菌泥，并在菌泥中加入冷冻干燥保护剂，混合均匀后进行冷冻干燥既得解淀粉芽孢杆菌SIP0902粉剂；

所述解淀粉芽孢杆菌SIP0902的保藏编号为CCTCC NO：M 2014323。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述种子固体培养基的组成为：葡萄糖1.0%，蛋白胨 0.5%，酵母膏 1.0%，琼脂粉 1.5%，pH 7.0，%表示质量百分比。

10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述解淀粉芽孢杆菌发酵液的组成为：酵母膏 0.1%，蛋白胨 0.5%，淀粉1.0%，硫酸亚铁 0.001%，余量为水，%表示质量百分比。