JP3565579B2

JP3565579B2 - ネコ伝染性腹膜炎ｉ型ウイルスのスパイク蛋白質遺伝子ｒｎａに対応するｄｎａ

Info

Publication number: JP3565579B2
Application number: JP12930094A
Authority: JP
Inventors: 弘之小山; 勉宝達; 紘橋本; 主税相沢
Original assignee: Kitasato Institute
Current assignee: Kitasato Institute
Priority date: 1994-06-10
Filing date: 1994-06-10
Publication date: 2004-09-15
Anticipated expiration: 2019-09-15
Also published as: JPH07327683A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ネコ伝染性腹膜炎を起こす原因となるウイルスのうちＩ型ウイルスの外被膜に存在する表面抗原であるスパイク蛋白質遺伝子ＲＮＡに対応するＤＮＡとその塩基配列に関する。さらにまた、そのＤＮＡ塩基配列によりコードされるスパイク蛋白質に関する。
【０００２】
本明細書において、アミノ酸の略号は下記の通りである。
Ａ：アラニン
Ｃ：システイン
Ｄ：アスパラギン酸
Ｅ：グルタミン酸
Ｆ：フェニルアラニン
Ｇ：グリシン
Ｈ：ヒスチジン
Ｉ：イソロイシン
Ｋ：リジン
Ｌ：ロイシン
Ｍ：メチオニン
Ｎ：アスパラギン
Ｐ：プロリン
Ｑ：グルタミン
Ｒ：アルギニン
Ｓ：セリン
Ｔ：スレオニン
Ｖ：バリン
Ｗ：トリプトフアン
Ｙ：チロシン
【０００３】
【従来の技術】
ネコの伝染性腹膜炎（ＦｅｌｉｎｅＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓｐｅｒｉｔｏｎｉｔｉｓ，以下ＦＩＰと呼称する）は、多くのネコ科動物に見られる慢性進行性のウイルス性伝染病である。この疾病はコロナウイルスであるＦＩＰウイルス（ＦＩＰＶ）の感染によって起こされ、発症した動物は腹膜炎を主とした症状を示し、腹水貯留により進行性腹位膨満を示す。このような疾病に対する治療法は未だ確立されていないため、発症すれば致死的経過をたどるしかない。
【０００４】
また、ＦＩＰＶに対する抗体を保有するネコは、保有しないネコに比べてＦＩＰＶの感染およびその発症が早まる抗体依存性の感染及び発症の増強効果が知られている〔Ｐｅｄｅｒｓｅｎら，Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．，４１巻、８６８，（１９８０）〕。従って、この点を考慮されていないワクチンが作製されたとしても、そのままでは予防のためには使用できず、却って感染や発症を促進する逆効果の危険を生ずるという困難な面を持っている。
【０００５】
このＦＩＰＶは、直径が約１００〜１５０ｎｍでスパイク（Ｓ）、メンブラン（Ｍ）、ヌクレオキャプシド（Ｎ）の３つの主要構造蛋白質を持っている。ウイルスのゲノムは約２０，０００塩基のプラス鎖の１本鎖ＲＮＡである。ＦＩＰＶは培養細胞における増殖の違いからＩ型（増殖が悪い）、ＩＩ型（増殖が良い）にそれぞれ分類されている〔Ｐｅｄｅｒｓｅｎら、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，１７３巻，３６５，（１９８４）〕。
【０００６】
上記のメンブラン（Ｍ）とヌクレオキャプシド（Ｎ）蛋白質はＩ型とＩＩ型の間で免疫学的に交差するが、感染の成立に重要な役割を果たすスパイク（Ｓ）蛋白質に関する交差性は殆ど見られなかった。また、ＦＩＰを発症したネコの７割は、Ｉ型で、残りはＩＩ型であった〔宝達ら、Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．５４巻、５５７、（１９９２）〕。
【０００７】
ＦＩＰＶのこれまでの研究は、細胞における増殖性が高く、ウイルス材料を入手しやすいＩＩ型で進められてきた。ＩＩ型のスパイク蛋白質遺伝子の塩基配列はすでに決定されている〔ｄｅＧｒｏｏｔら，Ｊ．ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，６８巻，２６３９，（１９８７）〕。一方、Ｉ型のＦＩＰＶに関してはこれまでのところ遺伝子関係の研究は全くなされていない。免疫学的な研究においてはＩ型とＩＩ型のスパイク蛋白質の交差性は殆どみられなかったことから、それらの遺伝子の塩基配列は非常に異なっていると推定される。従って、その塩基配列から推定されるＩ型ＦＩＰＶのスパイク蛋白質のアミノ酸配列は全く新規なものと考えられる。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
このように、ネコ伝染性腹膜炎を発症したネコの７割を占めるＩ型ＦＩＰＶの感染に中心的な役割を果たすスパイク蛋白質の遺伝子に関する研究はこれまで全くなされていなかった。従って、Ｉ型ＦＩＰＶの感染防止、治療に有益なワクチンが望まれていた。それ故、本発明者らはＩ型ＦＩＰＶの感染に中心的な役割を果たすスパイク蛋白質の遺伝子に関する研究を行った結果、Ｉ型ＦＩＰＶのスパイク蛋白質のアミノ酸配列を見出すことに成功した。
【０００９】
本発明の目的はネコ伝染性腹膜炎を起こす原因となるウイルスのうちＩ型ウイルスの外被膜に存在する表面抗原であるスパイク蛋白質の遺伝子ＲＮＡに対応するＤＮＡとその塩基配列を提供することにあり、さらにまた、その塩基配列によりコードされるスパイク蛋白質を提供し、Ｉ型ＦＩＰＶの感染防止、治療に有益なワクチンを提供するものである。なお、本発明における実施例で後に示される通り、スパイク蛋白質のアミノ酸配列はＩ型とＩＩ型とでは非常に異なるという結果が得られている。これは免疫学的な交差性より推測されていた結果でもある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
（１）Ｉ型ＦＩＰＶの培養、ウイルスＲＮＡ抽出
本発明では、Ｉ型ＦＩＰＶは本発明者らにより分離されたＫＵ２株を使用した〔宝達ら，Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２８巻，１３，（１９９１）〕。ウイルスの型の決定はＰｅｄｅｒｓｅｎらの方法〔Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，１７３巻、（１９８４）〕に従い行った。
【００１１】
ネコ胎児株化細胞の単層培養に約１，０００ＰＦＵのＫＵ２ウイルスを感染させ、３７℃、７日間培養後、細胞変性を生じた感染細胞を回収し、ホモジェナイザーで細胞を破砕して、３，０００ｒｐｍ、１５分で細胞核を除去した。上清を３０％ショ糖に重層して２０万×ｇ２時間でウイルス沈澱を得た。沈澱を０．１Ｍ食塩水に溶かしＳＤＳを０．５％、フェノールを等量加えて１５，０００ｒｐｍ、５分で変性蛋白質を除去した。水層にエタノールを加えて冷却しＲＮＡを１５，０００ｒｐｍ、５分で沈澱させて回収した。
【００１２】
（２）Ｉ型ＦＩＰＶのＭ遺伝子断片のｃＤＮＡクローニングと塩基配列決定
Ｉ型のＦＩＰＶは感染細胞から遊離した状態で集め難いので、感染細胞を破砕してウイルスを集めなくてはならない。そのため、出発材料中に細胞由来の不純物を含む率がＩＩ型ウイルスよりも高い。この点を考慮して、ｃＤＮＡ合成の際には非特異的なランダムプライマーを使用せずに特異的なプライマーを使用する。従って、スパイク遺伝子の下流に存在するＩ型ＦＩＰＶのＭ遺伝子の塩基配列を決定することを最初に行った。
【００１３】
図５のＦＩＰＶ遺伝子地図に示す通り、スパイク遺伝子の下流にはメンブランやヌクレオキャプシド遺伝子が存在する。これらがコードするメンブランやヌクレオキャプシド蛋白質はＩ型とＩＩ型で免疫学的によく交差することは上記した通りである。従って、この領域においてＩＩ型とＩ型の塩基配列のホモロジーは高いものと考えられる。なお、ＩＩ型ＦＩＰＶのＭ遺伝子の塩基配列はすでに論文として報告されている〔Ｖｅｎｎｅｍａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１８１巻，３２７，（１９９１）〕ので、これを参考にして下記の＋鎖、−鎖の２種類のＤＮＡプライマーを合成する。
【００１４】
ＴＧＧＧＧＡＴＣＣＧＡＴＴＴＴＡＣＧＴＡＧＴＡＡＧＣＣＣＡ（−）
ＣＡＡＧＡＡＴＴＣＧＴＧＡＡＣＧＣＴＡＣＴＧＴＧＣＣＡＴＧ（＋）
これらのプライマーを利用して図６に概略で示した、いわゆるＲＴ（逆転写酵素）−ＰＣＲ法によりＩ型ＦＩＰＶのメンブラン（Ｍ）遺伝子断片のｃＤＮＡを増幅して、それをクローニングし（図８におけるクローン１）、その塩基配列を決定した。
【００１５】
（３）スパイク蛋白質遺伝子のｃＤＮＡクローニング
上記した（２）で得られたＩ型ＦＩＰＶのＭ遺伝子断片の塩基配列を参考にして、それと相補性を持つ（マイナス鎖）プライマーＤＮＡである、ＣＧＡＡＧＡＡＴＴＣＡＴＡＴＣＴＧＧＡＡＡＣＴＴＧＧＴＡＣＴＣ（−）を合成した。これを用いて、図７に概略を示した方法により、スパイク蛋白質遺伝子ＲＮＡのｃＤＮＡクローニングと塩基配列の決定を行った。
【００１６】
この場合、基本的方法は前述の（２）と同様であるが、５’末端側の塩基配列が未知であるため、ｃＤＮＡにポリｄＡテイルを付加しておき、オリゴｄＴプライマー、ＣＴＧＴＧＡＡＴＴＣＴＧＣＡＧＧＡＴＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴをプラス鎖プライマーとして加えて、図６に概略で示した、いわゆるＲＴ（逆転写酵素）−ＰＣＲ法によりＩ型ＦＩＰＶの（Ｍ）遺伝子断片のｃＤＮＡを増幅して、それをクローニングし（図８におけるクローＺ２）、その塩基配列を決定した。下流の３’末端側塩基配列を決定することで、該当するｃＤＮＡクローンがＦＩＰＶの遺伝子断片であることが確認される。又、上流５’末端側の塩基配列は未知のスパイク蛋白質側の塩基配列となる。
【００１７】
得られた５’末端側の塩基配列を参考にして、さらにマイナス鎖プライマーＤＮＡを合成し、以降この方法を４回繰り返すことによって図８に示すようなＩ型ＦＩＰＶのスパイク蛋白質遺伝子の全領域をカバーするｃＤＮＡクローンを取得でき、それらの塩基配列を決定することにより、Ｉ型ＦＩＰＶスパイク蛋白質遺伝子の全塩基配列を決定することができた。
【００１８】
（４）組換え型Ｉ型スパイク蛋白質の発現
上記した（３）のＩ型スパイク蛋白質遺伝子の塩基配列を参考にして、任意の領域においてプラス鎖とマイナス鎖の１組のプライマーを合成して、ＰＣＲを行えばその領域の遺伝子断片を増幅することができる。これらには必要ならば、開始コドン（ＡＴＧ）や終了コドン（ＴＧＡなど）、あるいは制限酵素部位などを含ませることができる。こうして増幅された遺伝子断片は、公知の大腸菌、酵母、バキュロウイルス、ワクシニアウイルスなどの発現用ベクターに結合させて発現させることが可能である。
【００１９】
【実施例】
以下に本発明の実施例を具体的に説明するが、本発明はこれにより制限されるものでないことはいうまでもまない。
実施例１
Ｉ型ＦＩＰＶスパイク蛋白質遺伝子の塩基配列の決定：
本発明においては、Ｉ型ＦＩＰＶであるＫＵ２株ウイルスを使用して、上記（２）、（３）で概略を示した方法により、Ｉ型のスパイク蛋白質遺伝子のｃＤＮＡクローニングと塩基配列の決定を行った。
【００２０】
本実施例においては、ｃＤＮＡ合成の際に非特異的なランダムプライマーを使用せずに特異的なプライマーを使用した。そのためにはスパイク遺伝子の下流に存在するＩ型ＦＩＰＶのＭ遺伝子の塩基配列の決定をまず行った。図５のＦＩＰＶ遺伝子地図に示すとおり、スパイク遺伝子の下流にはメンブラン（Ｍ）やヌクレオキャプシド（Ｎ）遺伝子が存在する。
【００２１】
これらがコードするメンブランやヌクレオキャプシド蛋白質はＩ型とＩＩ型で免疫学的に良く交差することは上述した通りであるため、この領域においてはＩ型とＩＩ型の塩基配列のホモロジーは高いはずである。ＩＩ型のＦＩＰＶのメンブラン遺伝子の塩基配列はすでに報告されている〔Ｖｅｎｎｅｍａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１８１巻，ｐ３２７，（１９９１）〕ので、これを参考にして２種類のＤＮＡプライマーを合成した。それらの塩基配列は下記の通りである。
【００２２】
ＴＧＧＧＧＡＴＣＣＧＡＴＴＴＴＡＣＧＴＡＧＴＡＡＧＣＣＣＡ（−）
ＣＡＡＧＡＡＴＴＣＧＴＧＡＡＣＧＣＴＡＣＴＧＴＧＣＣＡＴＧ（＋）
これらのＤＮＡプライマーを利用して図６に概略で示した方法によりＩ型ＦＩＰＶのＭ遺伝子断片のｃＤＮＡクローニングと塩基配列を決定した。まず、Ｉ型ＦＩＰＶ−ＲＮＡにプライマー、ＴＧＧＧＧＡＴＣＣＧＡＴＴＴＴＡＣＧＴＡＧＴＡＡＧＣＣＣＡ（マイナス鎖）を加え、逆転写酵素によりＩ型ＦＩＰＶのｃＤＮＡを合成する。
【００２３】
そして、その一部を取り、ＰＣＲ用反応液（ベーリンガー社製）と上記したマイナス鎖とプラス鎖のプライマーを加えてＰＣＲを行い、メンブラン遺伝子のＤＮＡ断片を増幅した。これをプラスミドベクターｐＵＣ１８のＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ部位にＴ４ＤＮＡライゲースで結合させ、カルシウムで処理された大腸菌ＨＢ１０１の菌液に加えてｃＤＮＡをクローニングした。このｃＤＮＡの塩基配列はＡＢＩ（アプライドバイオシステム社）のシークエンス用キットを用い、自動塩基配列決定機（アプライドバイオシステム社製）により決定した。この決定に際しては、アプライドバイオシステム社から市販されている塩基配列用のキットに記載された蛍光プライマー法に従った。
【００２４】
ここでは、Ｓａｎｇｅｒらによるジデオキシ法〔Ｐｒｏ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，７４巻，ｐ５４６３（１９７１）〕を基本として、この方法で使用されるＭ１３プライマーをＡ、Ｃ、Ｇ及びＴをそれぞれ識別できるように蛍光標識させたものである。標識されたＤＮＡを電気泳動にかけて塩基配列を決定する工程では、アプライドバイオシステム社製の自動塩基配列決定機３７３Ａを使用して行った。このようにして、決定されたＩ型ＦＩＰＶのメンブラン遺伝子断片の塩基配列をもとにして、それと相補性を持つ（マイナス鎖）プライマーＤＮＡ、すなわちＣＧＡＡＧＡＡＴＴＣＡＴＡＴＣＴＧＧＡＡＡＣＴＴＧＧＴＡＣＴＣをあらたに合成した。
【００２５】
このプライマーを用いて、図７に概略を示した方法により、スパイク蛋白質遺伝子ＲＮＡのｃＤＮＡクローニングと塩基配列の決定を行った。メンブラン遺伝子の場合と同様に、Ｉ型ウイルスＲＮＡにプライマー、すなわちＴＧＧＧＧＡＴＣＣＧＡＴＴＴＴＡＣＧＴＡＧＴＡＡＧＣＣＣＡ（−）を加えて、逆転写酵素でｃＤＮＡを合成する。これに２ＭＮａＯＨを１／１０量加えて６０℃、１時間でＦＩＰＶ−ＲＮＡを分解して合成された一本鎖のｃＤＮＡを回収する。
【００２６】
このｃＤＮＡの３’末端に末端転移酵素（ＴｄＴ）でポリｄＡ鎖を付加して、プライマー、すなわちＣＧＡＡＧＡＡＴＴＣＡＴＡＴＣＴＧＧＡＡＡＣＴＴＧＧＴＡＣＴＣ（−）とオリゴｄＴプライマー、すなわちＣＴＧＴＧＡＡＴＴＣＴＧＣＡＧＧＡＴＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ（＋）を用いてＰＣＲを行った。
【００２７】
そして、増幅したＤＮＡを低融点アガロース電気泳動にかけて、１ｋｂより長いＤＮＡ分画を回収した。これを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、プラスミドベクターのｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ部位にクローニングして、塩基配列を決定した。この場合、３’末端側であるプライマー、ＣＧＡＡＧＡＡＴＴＣＡＴＡＴＣＴＧＧＡＡＡＣＴＴＧＧＴＡＣＴＣ（−）側の塩基配列を決定することで、該当するｃＤＮＡクローンがＦＩＰＶの遺伝子断片であることが確認され、また、５’末端側であるプライマー、すなわちＣＴＧＴＧＡＡＴＴＣＴＧＣＡＧＧＡＴＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ側の塩基配列は未知のスパイク蛋白質遺伝子側の塩基配列となる。
【００２８】
これを基にして、更に下記のマイナス鎖プライマー、すなわち
ＧＡＣＴＣＴＴＣＡＡＴＡＴＣＣＡＧＣＴＧＡＡ（−）、
ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＡＧＡＧＧＴＡＡＡＴＡＡＴＡＣＴＴＴＡＡＧＴＧ（−）
を合成した。以降まったく同様にしてこの方法を４回繰り返すことによって、図８に示すようなＩ型ＦＩＰＶのスパイク蛋白質遺伝子の全領域をカバーするｃＤＮＡクローンを取得でき、それらの塩基配列を決定することで、Ｉ型ＦＩＰＶスパイク蛋白質遺伝子の全塩基配列を決定することができた。
【００２９】
図１〜図４にＩ型ＦＩＰＶのスパイク蛋白質遺伝子に対応するＤＮＡの塩基配列とそれによりコードされるアミノ酸配列とを示す。これらは免疫学的な交差性から予想された通りｄｅＧｒｏｏｔらによりすでに報告されているＩＩ型ＦＩＰＶのもの〔Ｊ．ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，６８巻，ｐ２６３９（１９８７）〕とは非常に異なるものであった。スパイク蛋白質をコードする遺伝子は４３９２塩基長（１４６４アミノ酸残基）である。
【００３０】
Ｉ型とＩＩ型のスパイク蛋白質のアミノ酸配列のコンピューター解析を行って比較すると、全体でのホモロジーは約４６％であったが、ウイルスの感染に重要な役割を持つと考えられるスパイク蛋白質の頭部にあたるＮ末端側の方が、その部分をウイルスの外被膜に固定させる役割を持つと考えられているＣ末端側よりホモロジーは低くそれぞれ３１％、及び６０％であり、その中でもＮ末端側の２９０個のアミノ酸配列では２５％と全く異なっていた。
【００３１】
実施例２
スパイク蛋白質の発現：
実施例１で得たスパイク蛋白質のＮ末端側の２７６アミノ酸残基の配列は、Ｉ型とＩＩ型とでは全く異なることが明らかとなったので、この領域のペプタイドは両型を識別する抗原として最も有用なものとなり得ると考えられる。そこで、この領域のペプタイドの発現を大腸菌の発現ベクターｐＧＥＸ−２Ｔ（図９）を用いて行った。そのため、まず、図１におけるアミノ酸配列番号３３〜２７６のペプタイドを発現させる遺伝子断片をＰＣＲで増幅させるため以下のＤＮＡプライマーを合成した。
ＣＣＣＧＧＡＴＣＣＧＡＡＡＧＧＴＴＴＧＡＡＣＴＴＡＡＴＴＴＣ（＋）
ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＣＴＡＡＧＣＡＴＡＧＣＣＡＧＣＡＣＡＡＴ（−）
【００３２】
これらをプライマーとして、図８におけるクローン５のｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、目的とする遺伝子断片を増幅させた。低融点アガロース電気泳動により精製したＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩで切断し、同じ制限酵素で切断したｐＧＥＸ−２Ｔ（図９）にＴ４ＤＮＡライゲースで結合させ、カルシウム処理した大腸菌ＪＭ１０５株に加えて、このペプタイドを発現し得る菌株Ｉ−Ｎ２４４を得た。さらにＪＭ１０５、ｐＧＥＸ−２Ｔベクターだけを含む菌株を対象として用意した。
【００３３】
これらを対数増殖期まで培養してイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を１ｍＭとなるように加えて、目的蛋白質を発現させた。これらをＳＤＳ−１０％ポリアクリルアミド電気泳動にかけてクマシー色素で染色させた。その結果を図１０に示した。図１０において、レーンの４にＩ−２４４の目的ペプタイドが発現されていることが確認できた。
【００３４】
【発明の効果】
未知であったＩ型ＦＩＰＶのスパイク遺伝子の塩基配列が本発明により初めて決定され、そして、それは既に知られていたＩＩ型のものと非常に異なることが明らかとなった。このことは、ネコ伝染性腹膜炎の感染を防御するためにすでに知られていたＩＩ型ウイルスのワクチンだけでは不十分であることを示している。しかも発症したネコを調べた場合、Ｉ型の割合が７割を占めていることから、Ｉ型ウイルスの感染を防ぐことが非常に重要であり、これは本発明により解決し得ることが認められた。
【００３５】
また、スパイク蛋白質のＮ末端におけるＩ型とＩＩ型では全くホモロジーのない領域をコードしているＩ型のペプタイドを発現することができ、ＩＩ型についても同様な手法を実行すれば相当するＩＩ型のペプタイドを発現できるため、両者を識別する最も有用な抗原として診断等に適用すればその効果が発揮される。
【００３６】
【配列表】
【００３７】
配列の長さ：４３９２
配列の型：ＤＮＡ
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
起源
生物名：ネコ伝染性腹膜炎ウイルス
配列
【化９】

【化１０】

【化１１】

【化１２】

【図面の簡単な説明】
【図１】Ｉ型ＦＩＰＶスパイク蛋白質遺伝子の塩基配列と、それによりコードされるアミノ酸配列とを示すものである。
【図２】図１に続くＩ型ＦＩＰＶスパイク蛋白質遺伝子の塩基配列と、それによりコードされるアミノ酸配列とを示すものである。
【図３】図２に続くＩ型ＦＩＰＶスパイク蛋白質遺伝子の塩基配列と、それによりコードされるアミノ酸配列とを示すものである。
【図４】図３に続くＩ型ＦＩＰＶスパイク蛋白質遺伝子の塩基配列と、それによりコードされるアミノ酸配列とを示すものである。
【図５】ＦＩＰＶのウイルス構成蛋白質遺伝子に関する遺伝子地図である。
【図６】メンブラン遺伝子断片をＲＴ（逆転写酵素）−ＰＣＲ法によるｃＤＮＡクローニングの工程の概略である。
【図７】スパイク蛋白質遺伝子をＴｄＴ（末端転位酵素）を用いてｐｏｌｙｄＡ鎖を付加してＰＣＲをかける方法による、ｃＤＮＡクローニングの工程の概略である。
【図８】本発明で取得されたｃＤＮＡを遺伝子地図上に配置させたものである。
【図９】大腸菌における発現ベクターｐＧＥＸ−２Ｔの遺伝子地図である。
【図１０】実施例２においてＩ型およびＩＩ型のスパイク蛋白質の一部の領域をｐＧＥＸ−２Ｔを用いて発現されていることを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動により確認した結果である。

Claims

下記の配列

に示されるネコ伝染性腹膜炎Ｉ型ウイルスのスパイク蛋白質遺伝子ＲＮＡに対応するＤＮＡ。
下記の配列

に示されるネコ伝染性腹膜炎Ｉ型ウイルスのスパイク蛋白質、それに糖鎖が付加されたポリペプチド。
ネコ伝染性腹膜炎Ｉ型ウイルスのスパイク蛋白質遺伝子ＲＮＡに対応するＤＮＡであり、請求項２に記載された蛋白質を発現せしめ得るように構築された発現用プラスミドのベクターＤＮＡ構造物。
ネコ伝染性腹膜炎Ｉ型ウイルスのスパイク蛋白質であり、請求項３記載の発現用ベクターＤＮＡを含む菌あるいは動物の細胞の培養によって生産された蛋白質。
アミノ酸配列が請求項２で示される蛋白質を発現し得るように構築されたプラスミドにより形質転換された形質転換体。
形質転換体が微生物あるいは動物細胞である請求項５記載の形質転換体。
微生物が、Ｅ．ｃｏｌｉである請求項５記載の形質転換体。
微生物が酵母である請求項５記載の形質転換体。