JP3025061B2 - Ｐａｃａｐの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は脳の視床下部、精巣等由
来の、生理活性を有するペプチドの新規な製造法に関
し、特に神経細胞を用いたPituitary adenylate cyclas
e activating polypeptide (脳下垂体由来のアデニレー
トサイクラーゼ活性化ポリペプチド、以下、ＰＡＣＡＰ
と略記する）の新規な製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】脳の視床下部、下垂体から分泌されるホ
ルモンには種々のものが知られている。甲状腺刺激ホル
モン放出ホルモン（Thyrotropin releasing hormone)や
黄体形成ホルモン放出ホルモン(Leutenizing hormone r
eleasing hormone)、ソマトスタチン(Somatostatin)、
副腎皮質刺激ホルモン（Adrenocorticotropic hormon
e)、成長ホルモン(Growth hormone)、プロラクチン(Pro
lactin)などがその例で、これらの作用についてはよく
研究されている。一方、これ以外の新しい視床下部由来
の生理活性のある物質として、アデニレート サイクラ
ーゼ アクティヴィティ(adenylate cyclase activity)
を指標にしての探求の結果、それまでには報告されてい
ない、３８個のアミノ酸残基からなるペプチドが発見さ
れ、その構造が決定され、このものはＰＡＣＡＰ３８と
命名された〔バイオケミカル・バイオフィジカル・リサ
ーチ・コミュニケーション(Biochem. Biophys. Res. Co
mmun.) 164，567-574（1989）〕。本発明者等はヒツジ
ＰＡＣＡＰ３８のｃＤＮＡの特許出願（特願平１−1557
91号、同１−284771号）、およびヒトＰＡＣＡＰ３８の
ｃＤＮＡの部分構造の特許出願（特願平１−259924号）
を先に行なっており、ヒツジ、ヒト両者のＰＡＣＡＰ３
８の成熟部分のアミノ酸配列は同一、前駆体においては
アミノ酸の置換があることを見出している。また先のヒ
ツジ、ヒトに加えてラットからもＰＡＣＡＰ３８のペプ
チドをコードするｃＤＮＡを、ラット脳由来のメッセン
ジャーＲＮＡから作成したｃＤＮＡライブラリーから単
離し、その塩基配列を決定することに成功し、これら３
種のＰＡＣＡＰ３８成熟蛋白のアミノ酸配列が同一であ
ることを見出している（特願平２−39841号）。更に、
ＰＡＣＡＰ３８成熟蛋白の内の１〜２７番目のアミノ酸
配列を有するＰＡＣＡＰ２７もＰＡＣＡＰ３８と同様の
アデニレートサイクラーゼ活性を有することが見出され
た〔Miyata ら、バイオケミカル・バイオフィジカル・
リサーチ・コミュニケーション（Biochem. Biophys. Re
s. Commun.), 170, 643-648(1990)〕。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら上記のと
おりＰＡＣＡＰ３８ペプチドの存在は確認したものの、
該ペプチドおよびその前駆体を視床下部等から単離、精
製することは非常に複雑な操作を必要として困難である
上に、少量しか目的のペプチドが得られないという問題
がある。したがって、該ペプチドを容易に且つ大量に得
る方法の提供が望まれているのである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らはＰＡＣＡＰ
の効率生産のための方法を開発すべく、ＰＡＣＡＰの産
生誘導や先にクローニングしたヒトゲノムＤＮＡのプロ
モーター活性を検討することをも目的として、ヒトＰＡ
ＣＡＰ ｃＤＮＡとのノザンブロッティングやＥＩＡ系
を使用し、種々の細胞がＰＡＣＡＰを産生するのかどう
かを検討した結果、神経細胞の一種たるヒトの神経芽腫
細胞（Human neuro blastoma） ＩＭＲ−３２（ＡＴＣ
Ｃ ＣＣＬ １２７）がＰＡＣＡＰを産生している事を
見出した。このＩＭＲ−３２を大量培養し、ＰＡＣＡＰ
を製造することができると同時に、又ＩＭＲ−３２細胞
はＰＡＣＡＰの産生を促進する薬剤の開発に利用するこ
ともできると考えられる。即ち、本発明は神経細胞を培
地に培養し、培養物からＰＡＣＡＰを採取することを特
徴とするＰＡＣＡＰの製造法、詳しくは神経芽腫細胞を
培地に培養し、培養上清からＰＡＣＡＰを採取すること
からなるＰＡＣＡＰの製造法に関するものである。本発
明においてはＰＡＣＡＰ３８およびＰＡＣＡＰ２７の成
熟蛋白ならびにこれらの前駆体をＰＡＣＡＰと総称す
る。

【０００５】ＩＭＲ−３２細胞としては、アメリカのＡ
ＴＣＣ（American Type Culture Collection)より購入
することができ、例えばＡＴＣＣカタログ（第６版）の
７５〜７６頁に記載のＡＴＣＣＣＣＬ１２７などが挙げ
られる。培養の際の培地としては、たとえば約５〜２０
％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Scienc
e)122,501(1952)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー(Viro
-logy),8,396(1959)〕，ＲＰＭＩ１６４０培地〔ジャー
ナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエー
ション（The Jounal of the American Medical Associa
tion) 199,519(1967)〕，199 培地〔プロシージング・オ
ブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・
メディスン（Proceeding of the Societyfor the Biolo
gical Medicine)73, 1 (1950)〕などが挙げられる。ｐ
Ｈは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約30〜40
℃で約 15〜60 時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加
える。

【０００６】上記培養物からＰＡＣＡＰ３８の成熟ペプ
チドを分離精製するには、例えば下記の方法により行な
うことができる。ＰＡＣＡＰ３８の成熟ペプチドを細胞
から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で細胞を
集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、凍結融解
などによって細胞を破壊したのち、10倍量の１Ｍ 酢酸
（10μｇ／ｍｌ ペプスタチン）を加えてホモゲナイズ
した後、100℃で10分間加熱する。その後遠心分離やろ
過によりＰＡＣＡＰの成熟ペプチドの粗抽出液を得る方
法などが適宜用い得る。培養液中にＰＡＣＡＰ前駆体た
んぱくや成熟ペプチドが分泌される場合には、培養終了
後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを
分離し、上清を集める。このようにして得られた培養上
清、あるいは抽出液中に含まれるＰＡＣＡＰ前駆体たん
ぱくや成熟ペプチドは、自体公知の分離・精製法を適切
に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分
離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を
利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およ
びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主
として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマト
グラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニテ
ィークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する
方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の
差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差
を利用する方法などが挙げられる。

【０００７】かくして生成するＰＡＣＡＰ前駆体たんぱ
くや成熟ペプチドは特異抗体を用いたエンザイムイムノ
アッセイなどにより測定することができる。またＩＭＲ
−３２細胞よりｍＲＮＡを抽出、これからｃＤＮＡライ
ブラリーを作成、その中からＰＡＣＡＰ（あるいはその
前駆体）をコードするｃＤＮＡをクローニング、該ｃＤ
ＮＡをベクターに組込んでＰＡＣＡＰ（あるいはその前
駆体）を発現させるという遺伝子工学的手法を用いて、
ＰＡＣＡＰ（前駆体）を製造することもできる。

【０００８】

【作用】ＩＭＲ−３２細胞はヒト・ＰＡＣＡＰを分泌す
るので、これを培地に培養することによりＰＡＣＡＰを
製造できる。また得られたＰＡＣＡＰはその抗体を得る
ことによってＰＡＣＡＰの精製材料とすることもでき、
ＩＭＲ−３２細胞はｉ）ＰＡＣＡＰ産生誘導剤剤の開発
のためのアッセイ細胞、ii）ヒト・ＰＡＣＡＰの前駆体
をコードするｃＤＮＡをクローニングし、ＰＡＣＡＰの
ｍＲＮＡの構造を知り、ＰＡＣＡＰの遺伝子のイントロ
ンとエクソンの相互の構造を検討するためのｍＲＮＡの
供給細胞、iii）ＰＡＣＡＰ精製取得に利用し得るＩＭ
Ｒ−３２細胞として用いることもできる。

【０００９】本発明明細書および図面において、塩基や
アミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵ
Ｂ Commision on Biochemical Nomenclature による略
号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであ
り、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体
があり得る場合は、特に明示しなければＬ−体を示すも
のとする。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 ｍＲＮＡ：メッセンジャーリボ核酸 ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸 ｄＴＴＰ：デオキシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸 ｄＣＴＰ：デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム ＧｌｙまたはＧ ：グリシン ＡｌａまたはＡ ：アラニン ＶａｌまたはＶ ：バリン ＬｅｕまたはＬ ：ロイシン ＩｌｅまたはＩ ：イソロイシン ＳｅｒまたはＳ ：セリン ＴｈｒまたはＴ ：スレオニン ＣｙｓまたはＣ ：システイン ＭｅｔまたはＭ ：メチオニン ＧｌｕまたはＥ ：グルタミン酸 ＡｓｐまたはＤ ：アスパラギン酸 ＬｙｓまたはＫ ：リジン ＡｒｇまたはＲ ：アルギニン ＨｉｓまたはＨ ：ヒスチジン ＰｈｅまたはＦ ：フェニールアラニン ＴｙｒまたはＹ ：チロシン ＴｒｐまたはＷ ：トリプトファン ＰｒｏまたはＰ ：プロリン ＡｓｎまたはＮ ：アスパラギン ＧｌｎまたはＱ ：グルタミン。

【００１０】

【実施例】以下に本発明の実施例を記載するが、本発明
はこの実施例に限定されるものでないことは言うまでも
ない。なお後述の実施例６で得られたＥ．ｃｏｌｉ Ｍ
Ｖ1184／ｐｈＰＡＣＡＰ（Ｉ）は１９９１年６月２１日
から通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所にＦＥ
ＲＭ ＢＰ−３４６２としてブダペスト条約に基き寄託
されており、また該微生物は発酵研究所に１９９１年６
月２５日からＩＦＯ １５２０５として寄託されてい
る。

【００１１】

【実施例１】 細胞の培養 アメリカのＡＴＣＣより購入したＩＭＲ−３２細胞ＣＣ
Ｌ１２７を、１０％の牛胎児血清を含むＥagle's ＭＥ
Ｍ中でストレプトマイシン、カナマイシンの存在下に３
７℃、５％のＣＯ₂の存在下で、１５０cm²のプラスチッ
ク製フラスコ（ファルコン社製）で４〜５日培養する。

【００１２】

【実施例２】 ＩＭＲ−３２細胞培養液中のＰＡＣＡＰ
の測定 ＩＭＲ−３２細胞培養開始後、４〜５日に無血清培地に
交換し、３〜４日後に培養液を回収した。その培養液を
ＴＯＭＹの冷却遠心機で15,000回転、４℃で遠心した
後、その上清をＰＡＣＡＰ測定用のＥＩＡのサンプルバ
ッファーで希釈した後、免疫反応性のあるＰＡＣＡＰ活
性を検出した。その値を表１に示した。 表１ 細胞名 種 類 免疫反応陽性ＰＡＣＡＰ（ｐｇ／ｍｌ） ＩＭＲ−３２ ヒト神経芽腫細胞 ８．７５±７．６ Ａ−１７２ ヒト・グリオブラストーマ − Ｔ−９８Ｇ ヒト・グリオブラストーマ − 。

【００１３】

【実施例３】 各種細胞から抽出したＲＮＡのノーザン
・ブロッティング ヒトのグリオブラストーマ Ａ１７２細胞（Ａ）、ヒト
神経芽腫細胞 ＩＭＲ−３２（Ｉ）、ヒトグリオブラス
トーマ Ｔ−９８Ｇ（Ｔ）を実施例５に記載の方法によ
りｍＲＮＡを抽出し、Thomas ら〔プロシージングス・
オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Pr
oc. N. A. S. U.S.A.) 77, 5201（1980）〕のグリオキ
サールを使用する方法によりノーザン・ブロッティング
を行なった。プローブとしてヒトＰＡＣＡＰ ｃＤＮＡ
フラグメント（ｐＨＴ３８ＰのＰＡＣＡＰの領域を含
む）を³²Ｐ−ｄＣＴＰで標識して使用した。図１に示し
た如く、ＩＭＲ−３２細胞（Ｉ）から抽出したｍＲＮＡ
のみが強くハイブリダイズすることからヒト神経芽腫細
胞ＩＭＲ−３２はＰＡＣＡＰを合成していることがわか
る。ｍＲＮＡの大きさは平均で４．５ｋｂと推定され
た。

【００１４】

【実施例４】 ヒト・ＰＡＣＡＰ ｃＤＮＡの一部をコ
ードするＤＮＡプローブの作製 ヒト・ＰＡＣＡＰ ｃＤＮＡの配列の一部のＤＮＡプロ
ーブ、ＥｃｏＲ１フラグメント１．２ｋｂをｐＨＴ３８
から切り出し、ＩＭＲ−３２細胞由来のｃＤＮＡライブ
ラリーとのハイブリダイゼーションに用いた。

【００１５】

【実施例５】 ｍＲＮＡの抽出とｃＤＮＡライブラリー
の作製 ＩＭＲ−３２細胞からtotal ＲＮＡの抽出 ヒト神経芽腫細胞ＩＭＲ−３２（ＡＴＣＣ，ＣＣＬ １
２７）を10％子牛血清を含むダルベッコ 最少必須培地
（Dulbecco's minimum essential medium, Ｄ−ＭＥ
Ｍ）で５％ＣＯ₂、95％Ａｉｒ、37℃の条件で〔150cm²
のフラスコ（ファルコン社）で10本分〕培養し、３〜４
日後、培養液を除き、リン酸塩緩衝生理食塩水（phosph
ate buffered saline,ＰＢＳ）で洗浄した。次いで、フ
ラスコ１本に付き１０mlのグアニジン・イソチオシアネ
ート液（5M グアニジン・チオシアネート、50mM Tris-H
Cl、10mM EDTA、５％メルカプトエタノール）を加え、
細胞を溶解した後、150mlのガラス製ホモゲナイザーに
集め、よく磨砕した。20％のザルコシン酸ソーダ液（20
％ N-ラウロイル ザルコシン酸ナトリウム、50mM Tris-
HCl(pH7.6)、10mM EDTA、５％メルカプトエタノール）
を最終濃度が５％となるように加えた後、さらによく磨
砕した。セシウムクロライドを、0.2gram/mlとなるよう
に加え、さらによく溶かしながら磨砕した。次いで、0.
5Ｍのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）に溶解した
5.2Ｍのセシウムクロライド溶液をベックマン社のＳＷ2
8ローター用のチューブに５ｍｌ入れ、この上層に上記
の細胞溶解液を30ｍｌ重層し、22℃、28,000回転で48時
間、ＳＷ28ローターで遠心した。ＲＮＡをチューブのペ
レットに集め、上層の液を吸収して除いた後〔Kaplain
の方法、バイオケミカル・ジャーナル（Biochem.
J.），183, 181-184(1979)〕、ＲＮＡを0.4％のザルコ
シン溶液に溶解した後、食塩を最終濃度0.25Ｍとなるよ
うに加え、冷エタノールを2.5容加えて−20℃に貯蔵し
た。

【００１６】ポリＡ+ ＲＮＡの分離 Total ＲＮＡを遠心（25,000回転で20分間）して集め、
ファルマシア製のpolyＡ+ ＲＮＡ精製法マニュアルに従
ってオリゴｄＴカラムクロマト法でpolyＡ+ ＲＮＡを部
分精製した。Total ＲＮＡ含有の約５％をpolyＡ+ ＲＮ
Ａとして回収した。 ｃＤＮＡの合成とファージλｇｔ１１を用いたｃＤＮ
Ａライブラリーの作製 上記５で得られたpolyＡ+ ＲＮＡ ５μｇをAmersham社
のｃＤＮＡ合成キットを使用し、マニュアルに従って、
³²Ｐ−ｄＣＴＰをｃＤＮＡ合成のマーカーとして用い
て、ｃＤＮＡの合成を行った。使用したpolyＡ+ ＲＮＡ
5μｇの約10％を二本鎖ＤＮＡ(double-stranded DNA,
ds DNA)として得た。同じく、Amersham社のｃＤＮＡク
ローニングキットを使用して、このｄｓＤＮＡに制限酵
素ＥｃｏＲＩのアダプターをligation反応により結合
し、ＥｃｏＲＩで処理してｄｓ ＤＮＡの５’，３’端
にＥｃｏＲＩアダプターが結合したｄｓＤＮＡを得た。
このＥｃｏＲＩアダプターが結合したｃＤＮＡをファー
ジλｇｔ１１ＤＮＡのＥｃｏＲＩサイトに組み込み、フ
ァージ粒子に再構築し、ファージλｇｔ１１のｃＤＮＡ
ライブラリーとして得た。得られたファージλｇｔ１１
のｃＤＮＡライブラリーの感染価は約２×１０⁶プラー
ク形成単位／ｍｌであった。

【００１７】

【実施例６】 ヒト・ＰＡＣＡＰ ｃＤＮＡのクローニ
ング ヒト・ＰＡＣＡＰ ｃＤＮＡを持つファージクローンの
単離 実施例５で得られた組み換えファージ（λｇｔ１１）を
ペントンおよびデービス（Pentone and Davis） の方法
〔サイエンス（Science),196,180-182(1977)〕により１
シャーレ当り15,000プラークの条件で大腸菌Ｙ1090に感
染させた後、ニトロセルロースにファージを移しとり、
常法どおりフィルターを処理した。ヒト・ｃＤＮＡのＰ
ＡＣＡＰをコードする核酸配列〔Kimura ら、バイオケ
ミカル・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーシ
ョン(Biochem. Biophys. Res. Commun.)（B.B.R.C.） 1
66， 81-89（1990）〕の部分ＤＮＡ断片ＥｃｏＲＩフラ
グメントをα−³²Ｐ・ｄＣＴＰを用いてランダムプライ
ム法によって³²Ｐ−標識プローブを作成した。ニトロセ
ルロースに移した組み換えファージＤＮＡとこの³²Ｐ−
標識ＰＡＣＡＰプローブとをペントンとデービスの方法
〔サイエンス（Science),196,180-182(1977)〕によりハ
イブリダイゼーションを行ない、ハイブリッドを形成し
たファージクローンをスクリーニングして、陽性のプラ
ークを数個得た。単一化したファージを大腸菌Ｙ1090に
感染させ（37℃、ＬＢブロス、５〜６時間）、遠心して
大腸菌を除いた後、培養液１ｍｌに20％ポリエチレング
リコール・0.15Ｍ食塩溶液を200μｌ添加して、４℃、
２〜３時間静置してファージ粒子を15,000回転で20分間
遠心して沈殿させた。100μｌの蒸留水を加えてファー
ジ粒子を懸濁し、95℃で10分間加熱した。この組み換え
ファージＤＮＡはλｇｔ１１であるので、ｃＤＮＡの組
み換え部位であるＥｃｏＲＩサイトの近くの５’ＧＧＴ
ＧＧＣＧＡＣＧＡＣＴＣＣＴＧＧＡＧＣＣＣＧ（配列番
号：１）と５’ＴＴＧＡＣＡＣＣＡＧＡＣＣＡＡＣＴＧ
ＧＴＡＡＴＧ（配列番号：２）のＤＮＡ断片をλｇｔ１
１のプライマーとして用いて、ポリマーチェインリアク
ション（ＰＣＲ）法〔Michael I.A. Iunis, ＰＣＲプロ
トコールズ（ＰＣＲ Protocols)(Academic Press, 199
0)〕で、このｃＤＮＡ部分を増巾合成した。ＰＣＲ法で
増巾合成したＤＮＡをＥｃｏＲＩで処理した後、プラス
ミドｐＵＣ１１８のＥｃｏＲＩ部位にligation により
結合し、大腸菌ＤＨ５αを形質転換して数個のクローン
を得た。この中の２種類をＥ．ｃｏｌｉ ＭＶ1184／ｐ
ｈＰＡＣＡＰ（Ｃ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＶ1184／ｐｈＰ
ＡＣＡＰ（Ｉ）とした。

【００１８】

【実施例７】 クローン化したＤＮＡの塩基配列の決定 上記実施例６で得られたプラスミドＤＮＡを精製し、ジ
デオキシ鎖ターミネーション法によりＤＮＡの塩基配列
を決定した〔サンガー、プロシージング・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Nat
l. Acad. Sci. U.S.A.) 74, 5463〜5467(1977)〕。図２
にその決定方向と塩基配列の一部を示した。

【００１９】ヒト・ＰＡＣＡＰの前駆体をコードするｃ
ＤＮＡ ｐｈＰＡＣＡＰ（Ｃ）は１．８ｋｂからなり、
ＰＡＣＡＰの前駆体１７６個のアミノ酸をコードしてい
る。白抜きの枠で示しているヒト・ＰＡＣＡＰ部分およ
びその前に同様に枠で囲んだＰＡＣＡＰ Ｒｅｌａｔｅ
ｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ（ＰＲＰ）部分が存在する。さらに
ｃＤＮＡ ｐｈＰＡＣＡＰ（Ｉ）は約１．８ｋｂで、Ｐ
ＲＰの部分が完全に欠損した構造を持つものである（図
２）。以上より、ヒト・ＰＡＣＡＰの前駆体をコードす
るｃＤＮＡをクローニングし、その構造を決定した。こ
のｃＤＮＡを発現ベクターに組み込み、ＰＡＣＡＰおよ
びその前駆体を発現させることが可能となった。

【００２０】

【発明の効果】本発明でヒト・神経芽腫のＩＭＲ−３２
細胞を培養することにより、ヒト・ＰＡＣＡＰを製造す
ることができ、ヒト・ＰＡＣＡＰの大量生産及びＰＡＣ
ＡＰ産生の誘導効果のある薬剤をアッセイする道が拓け
たものである。

【００２１】

【配列表】配列番号：1 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：フラグメント型 配列の特徴：primer 配列 GGTGGCGACG ACTCCTGGAG CCCG 24。

【００２２】配列番号：2 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：フラグメント型 配列の特徴：primer 配列 TTGACACCAG ACCAACTGGT AATG 24。

【図面の簡単な説明】

【図１】各種細胞から抽出したpoly Ａ+ ＲＮＡのノザ
ン・ブロッティングを示した図である。

【図２】クローン化したＰＡＣＡＰの前駆体をコードす
るｃＤＮＡと、ＰＡＣＡＰ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｅｐｔｉ
ｄｅ（ＰＲＰ）部分を欠損しているが ＰＡＣＡＰの部
分を持つプラスミドｃＤＮＡの模式図を示す。

【図３】ＰＲＰを欠損したプラスミドｐｈＰＡＣＡＰ
（Ｉ）の詳細な配列を示す。いずれのｃＤＮＡも３’側
の一部の配列を示してある。

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】神経芽腫細胞を培地に培養し、培養物から
   ＰＡＣＡＰを採取することを特徴とするＰＡＣＡＰの製
   造法。
2. 【請求項２】培養上清よりＰＡＣＡＰを回収する請求項
   １記載のＰＡＣＡＰの製造法。