EP1658367A2 - Sequences nucleiques et proteiques du virus hxhv et utilisations - Google Patents

Sequences nucleiques et proteiques du virus hxhv et utilisations

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Publication number
EP1658367A2
EP1658367A2 EP04767871A EP04767871A EP1658367A2 EP 1658367 A2 EP1658367 A2 EP 1658367A2 EP 04767871 A EP04767871 A EP 04767871A EP 04767871 A EP04767871 A EP 04767871A EP 1658367 A2 EP1658367 A2 EP 1658367A2
Authority
EP
European Patent Office
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fragment
seq
nucleotide
sequence
complementary
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP04767871A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Isabelle Chemin
Christian Trepo
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Original Assignee
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM filed Critical Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Publication of EP1658367A2 publication Critical patent/EP1658367A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • Hepatitis is the most important communicable disease. The mode of transmission is most often transfusion, organ transplantation and hemodialysis, but hepatitis can also be transmitted by ingestion of contaminated food or water and by contact between individuals. Viral hepatitis is induced by various viral agents which are distinguished from each other by their genomes and their modes of replication. Viral hepatitis causes damage to the liver with varying degrees of severity. Almost one billion people worldwide suffer from viral hepatitis. There are serious risks in chronic forms of hepatitis which can progress to cirrhosis or hepatocarcinoma.
  • Viral hepatitis can be diagnosed by demonstrating well-defined symptoms, such as jaundice, high levels of transaminases (aspartate transaminase or AST, alanine transaminase or ALT, lactate dehydrogenase or LDH), and liver damage.
  • transaminases aspartate transaminase or AST, alanine transaminase or ALT, lactate dehydrogenase or LDH
  • hepatitis X They are commonly called hepatitis X.
  • the recently identified hepatitis G viruses (GBV-A, GBV-B, GBV-C) and TTV do not seem to be pathogenic in humans and therefore cannot explain cases of hepatitis without known etiology or hepatitis X.
  • GBV-A, GBV-B, GBV-C hepatitis G viruses
  • TTV hepatitis G viruses
  • HXHV hepatitis X
  • the genome of the HXHV virus is a DNA genome at less partially single-stranded which comprises one or more reading frames coding for one or more protein (s) or polyprotein (s), the genome comprises a nucleotide sequence capable of hybridizing to the nucleotide sequence XH or to the nucleotide sequence complementary to the XH sequence.
  • the sequence XH is represented in the sequence identifier of the present application in SEQ ID NO: 1.
  • the XH sequence is rich in GC (62%) and has four open reading frames (ORF1, ORF2, ORF3, ORF4). This isolated sequence was characterized and no homology of sequences with human genomic DNA and with the sequences present in the databases was found.
  • XH1 is rich in GC (61.2%), which is comparable with the GC content of the previously isolated XH sequence.
  • the XH1 sequence is referenced in the sequence identifier in SEQ ID NO: 4.
  • the XH1 sequence has no significant homology or identity with all the sequences available in the databases. It has 5 open reading frames. The DNA sequences corresponding to said open reading frames are identified respectively in SEQ ID NOs 5 to 9 in the sequence identifier.
  • the present inventors have generated the DNA strand complementary to the XH1 sequence and have also investigated whether there are potential open reading frames on the complementary DNA strand. They identified 8 open reading frames which are respectively represented in SEQ ID NOs 10 to 17. The corresponding polypeptide sequences said read frames are respectively identified in SEQ ID NOs: 18 to 30 in the sequence identifier. The above sequences and their fragments are used for the detection of the HXHV virus.
  • the present invention relates to: - a nucleic acid sequence capable of being obtained from the genome of the HXHV virus, said nucleic acid sequence comprising or consisting of SEQ ID NO: 4.
  • nucleotide fragment of DNA isolated comprising or consisting of a DNA or RNA nucleotide sequence of at least 12 contiguous nucleotides, preferably at least 15 or at least 18 contiguous nucleotides, and advantageously at least 20, 21, 22, 23, 24 , 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51 or 54 contiguous nucleotides, of the DNA nucleotide sequence SEQ ID NO: 4 or of the DNA sequence complementary to SEQ ID NO: 4; or of a nucleotide sequence which has, on at least 12 contiguous nucleotides, preferably on at least 15 or at least 18 contiguous nucleotides, and advantageously on at least 20, 21, 22, 23, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51 or 54 contiguous nucleotides, at least 90%, preferably at least 92%, 95% or at least 98%, 99% of homology or identity with respect to the sequence represented in SEQ ID NO: 4 or with respect to the
  • nucleotide sequences complementary to said sequences are TAGTCGAGACTCAACCATCGC, CCCGCCCCGCTGATGAAAAG and nucleotide sequences complementary to said sequences; or on the condition that out of 20 contiguous nucleotides or 21 nucleotides said nucleotide DNA fragment does not have 100% omology or identity with a nucleotide fragment of the sequence referenced SEQ ID NO: 1 or of the sequence complementary to SEQ ID NO: 1.
  • Said fragment is in particular chosen from fragments of which said contiguous nucleotides belong to one of the following segments: a segment whose sequence begins at nucleotide 2 and ends at nucleotide 286 of SEQ ID NO: 4, a segment whose sequence begins at nucleotide 4 and ends at nucleotide 144 of SEQ ID NO: 4, a segment whose sequence begins at nucleotide 180 and ends at nucleotide 1004 of SEQ ID NO: 4, a segment whose sequence begins at nucleotide 614 and ends at nucleotide 820 of SEQ ID NO: 4, a segment whose sequence begins at nucleotide 1228 and ends at nucleotide 1314 of SEQ ID NO: 4 or the complementary fragments; a segment whose sequence begins at nucleotide 1283 and ends at nucleotide 1197 of the complementary sequence of SEQ ID NO: 4, a segment whose sequence begins at nucleotide 1264 and ends at nucleotide 1067 of
  • the invention also relates to: - a polypeptide comprising a polypeptide sequence encoded by a sequence or by a fragment as defined above or by their functional equivalents or by a nucleotide sequence which has at least 90% of omology or identity, preferably at least 92% or 95% homology or identity and advantageously at least 98% or 99% homology or identity with respect to the sequence represented in SEQ ID NO: 4 or with respect to the complementary sequence of SEQ ID NO: 4, on the condition that the sequences TAGTCGAGACTCAACCATCGC, CCCGCCCCGCTGATGAAAAG, the nucleotide sequences complementary to said sequences are excluded; or on the condition that out of 20 contiguous nucleotides or 21 nucleotides the DNA nucleotide fragment does not have 100% homology or identity with a nucleotide fragment of the sequence referenced SEQ ID NO: 1 or of the complementary sequence of SEQ ID NO: 1; a polypeptide whose polypeptide sequence comprises or consists of
  • An epitope characterized in that it comprises or consists of a peptide sequence of at least 6, 8, 9, 10, 12, 15 or 18 amino acids and at most 10, 12, 15 or 18 amino acids, particular in that its sequence consists of a peptide sequence of 6 to 10 amino acids, 6 to 12 amino acids, 6 to 15 amino acids, 6 to 18 amino acids, 8 to 10 amino acids, 8 to 12 amino acids, from 8 to 15 amino acids, from 8 to 18 amino acids and from 15 to 18 amino acids of any of the sequences represented in SEQ ID NO: 18 to 30 or of a polypeptide sequence functionally equivalent to said sequences SEQ ID NO: 18 to 30; it being understood that said epitope is recognized by antibodies directed against the HXHV virus.
  • polypeptide is meant a peptide, in the isolated state, having a sequence of a variable number of amino acids, such as an oligopeptide, a protein, a fusion protein, a fusion peptide, a peptide of synthesis.
  • a polypeptide can be obtained by various techniques well known to those skilled in the art, and in particular by chemical synthesis or by genetic recombination techniques.
  • the polypeptides according to the invention can be obtained by conventional synthesis methods, for example with an automatic peptide synthesizer, or by genetic engineering techniques comprising the insertion of a DNA sequence coding for said polypeptide into an expression vector such as a plasmid or a virus, and the transformation of cells with this expression vector and culture of these cells.
  • peptide sequence functionally equivalent to a reference peptide sequence is meant an amino acid sequence modified by insertion and / or deletion and / or substitution and / or lengthening and / or shortening and / or chemical modification of one or more acids amines, provided that these modifications substantially preserve or even develop the immunoreactive properties of said reference peptide sequence.
  • the term “functionally equivalent sequences” is understood to mean sequences which retain the immunoreactive properties of SEQ ID Nos 18 to 30 or of their fragments, in particular the sequences in which one or more amino acid (s) is or are substituted (s) with one or more other amino acids; the sequences in which one or more amino acid of the L series is replaced by an amino acid of the D series, and vice versa; the sequences into which a modification of the side chains of the amino acids has been introduced, such as acetylation of the amino functions, carboxylation of the thiol functions, esterification of the carboxylic functions; a modification of the peptide bonds such as for example carba, retro, inverso, retro-inverso, reduced and methylene-oxy bonds.
  • amino acid (s) in the sequences of the polypeptides of the invention can be substituted by one or more other amino acid (s) of similar polarity which act as of the functional equivalents.
  • substitutions for an amino acid in polypeptide sequences of interest can be determined from other members of the class to which the amino acid belongs.
  • non-polar (hydrophobic) amino acids include alanme, leucme, isoleucine, valme, proline, phenylalanme, tryptophan, methionine.
  • Polar neutral amino acids include glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparag e, glutamine.
  • the positively charged (basic) amino acids include silver, lysine and histide.
  • the negatively charged amino acids (acids) include aspartic acid and glutamic acid.
  • Other substitutions for an amino acid in polypeptide sequences of interest can be determined from the information contained in the article by Kramer A. et al. (Molecular Immunology, Vol. 32, No. 7, pp. 459-465 (1995)). These authors have created banks in which to reduce the problem of the explosive explosion in the number of molecules, they have used groups of amino acids made up of amino acids with similar physicochemical properties and these are the grouped amino acids. in each of these six groups, listed below, which are considered mainly as equivalent in the present inventio. Group 1 alan e, proline, glycine.
  • Group 3 histid e, lysine, argin e.
  • Group 4 asparagma, glutamine, serine, threonine.
  • Group 5 phenylalanme, tyrosine, tryptophan.
  • Group 6 isoleucine, leucme, valme, methionine.
  • the equivalence of a peptide sequence with respect to a reference peptide sequence can be defined by its identity or its homology, expressed as a percentage, with said reference sequence. This percentage is determined, for a sequence of a given number of contiguous amino acids, by aligning the two sequences, moving one with respect to the other, and comparing the amino acids in the two sequences.
  • the invention also relates to a functional expression cassette in a cell derived from a prokaryotic or eukaryotic organism allowing the expression of a nucleic acid sequence or of a DNA fragment or of a DNA molecule. as described above, placed under the control of the elements necessary for its expression.
  • the expression cassette is characterized in that it is functional in a cell originating from a prokaryotic organism, in particular E.
  • coli or of a eukaryotic organism in particular cells originating from animals such as mammals, reptiles, insects, in particular COS, CHO, BHK, PK 15, RK 13 cells; osteosarcoma human cell lines (cells 143 B), human HeLa cell lines and hepatoma human cell lines (of the HepG2 type); insect cell lines (e.g.
  • yeast cells such as Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kl uveromyces, Hanseluna, Yarowia, Schwamo yces, Zygosaccharomyces and Pi chia, and preferably chosen from Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Schizosaccharomyces pombe cells uveromyces lactis and Pichia pastoris.
  • yeast cells such as Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kl uveromyces, Hanseluna, Yarowia, Schwamo yces, Zygosaccharomyces and Pi chia, and preferably chosen from Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Schizosaccharomyces pombe cells uveromyces lactis and Pichia pastoris.
  • the invention further relates to a vector comprising said expression cassette; a cell from a prokaryotic, eukaryotic or lower eukaryotic organism, preferably a eukaryotic or lower eukaryotic organism as defined above or a vector as defined above; and the polypeptide capable of being produced by the expression cassette, the vector or the cell.
  • the subject of the invention is a method for preparing a polypeptide or a polypeptide fragment as defined above which consists in cultivating a host cell corresponding to the preceding definitions in an appropriate culture medium, said host cell being transformed with a vector of expression which contains a DNA nucleic acid sequence as defined above or a DNA nucleotide fragment as defined above or a DNA molecule as defined above and, to purify said polypeptide produced to a required degree of purity.
  • the subject of the invention is also an immunogenic polypeptide, said polypeptide comprising or consisting of a polypeptide or peptide sequence as defined above.
  • Such an immunogenic polypeptide is used for the production of onoclonal or polyclonal antibodies or fragments of said antibodies and the invention encompasses monoclonal or polyclonal antibodies or their fragments, being obtained by immunization of a mammalian animal (rabbit, rat, mouse) with such an immunogenic peptide.
  • a mammalian animal rabbit, rat, mouse
  • the production of monoclonal or polyclonal antibodies is well known to those skilled in the art.
  • Antibodies can also be produced by immunizing mice, rats or rabbits with the viral particles of HXHV.
  • the immunogen can be coupled to serum albumin (SA peptide) or to Lymphet Keyhole hemocyanin (KLH peptide) as a carrier for immunization.
  • SA peptide serum albumin
  • KLH peptide Lymphet Keyhole hemocyanin
  • monoclonal antibodies For the production of monoclonal antibodies the animals are subjected to an injection of immunogen using complete Freund's adjuvant. The sera and hybridoma culture supernatants from immunized animals are analyzed for their specificity and selectivity using standard techniques, such as for example ELISA or Western Blot tests. The hybridomas producing the most specific and sensitive antibodies are selected. Monoclonal antibodies can also be produced in vitro by cell culture of the hybridomas produced or by recovery of ascites fluid, after intraperitoneal injection of the hybridomas in mice. Whatever the mode of production, by supernatant or ascites, the antibodies are then purified. The purification methods used are essentially filtration on an ion exchange gel and exclusion chromatography or affinity chromatography (protein A or G).
  • humanized antibodies are chimeric antibodies which include a minimum sequence derived from a non-human immunoglobulin.
  • humanized antibodies are human immunoglobulms (receptor antibodies) in which residues of a hypervariable region of the receptor are replaced by residues of a hypervariable region of a donor species (donor antibody), such as mouse, rat, rabbit or non-human primate, having the specificity, affinity and capacity desired.
  • humanized antibodies may include residues which are not found in the recipient antibody or in the donor antibody. These modifications are made to improve the performance of the antibody.
  • the humanized antibody will comprise at least and preferably two variable domains, in which all or almost all of the hypervariable loops correspond to a non-human immunoglobulin and all or approximately all of the FR regions will be those of an immunoglobulin. human.
  • the optionally humanized antibodies may also comprise at least part of a constant region (Fc) of an immunoglobulin, such as a human immunoglobulin (Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Reichmann et al. , Nature 332: 323-329 (1988); and Presta et al., Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992).
  • Fc constant region of an immunoglobulin
  • antibody fragment by antibody fragment is meant fragments F (ab) 2, Fab, Fab ', sFv (Blazar et al., 1997, Journal of Immunology 159: 5821-5833 and Bird et al., 1988, Science 242: 423-426) of a native antibody and by derivative is understood, among others, a chimeric derivative of a native antibody (see for example Ara awa et al., 1996, J. Biochem 120: 657-662 and Chaudray et al., 1989, Nature 339: 394-397). 'antibody and Antibody derivatives retain the ability to selectively bind to the target antigen.
  • the monoclonal or polyclonal antibody thus obtained or its fragment is incorporated into a diagnostic composition which is used in a method for detecting at least one polypeptide or peptide fragment as defined above in a biological sample, according to which the biological sample with the composition under predetermined conditions which allow the formation of antibody / antigen complexes and the formation of said complexes is detected.
  • the invention also relates to a diagnostic composition which comprises a polypeptide or a peptide fragment as defined above and a method for detecting antibodies directed against the HXHV virus or at least against a polypeptide or a peptide fragment of the invention, according to which brings into contact a biological sample suspected of being or capable of having been infected with the HXHV virus with the diagnostic composition under predetermined conditions which allow the formation of antibody / antigen complexes and the formation of said complexes is detected.
  • a biological sample suspected of being or capable of having been infected with the HXHV virus
  • the diagnostic composition under predetermined conditions which allow the formation of antibody / antigen complexes and the formation of said complexes is detected.
  • the host develops antibodies directed against this viral agent (humoral response).
  • the present invention also relates to biological material for the preparation of a pharmaceutical composition intended for the treatment of humans or animals infected with at least the HXHV virus and of immunogenic or vaccine compositions which can be used to produce therapeutic vaccines against HXHV virus infection and prophylactic vaccines to prevent potential HXHV virus infection, said immunogenic preparations comprising at least one polypeptide or fragment natural, recombinant, or synthetic peptide of the invention associated with a vehicle and / or an adjuvant and / or a diluent and / or a pharmaceutically acceptable excipient.
  • a subject of the present invention is also the use of at least one monoclonal or polyclonal antibody or at least one fragment of said antibodies of the invention, specific for at least one polypeptide or a peptide fragment as defined above for the preparation of a pharmaceutical composition which administered to a patient infected with the HXHV virus has the capacity to reduce or even inhibit the proliferation and / or replication of the virus.
  • These antibodies or their fragments are called neutralizing antibodies.
  • biological sample is meant, for example, blood, serum, plasma, tissue samples, such as liver biopsy extracts.
  • the vaccines prepared are injectable, that is to say in liquid solution or in suspension.
  • the preparation can also be emulsified.
  • the antigenic molecule can be mixed with excipients which are pharmaceutically acceptable and compatible with the active ingredient.
  • the vaccine may contain minor amounts of auxiliary substances such as wetting or emulsifying agents, pH buffering agents or adjuvants such as aluminum hydroxide, dipeptide muramyl or their variations.
  • auxiliary substances such as wetting or emulsifying agents, pH buffering agents or adjuvants such as aluminum hydroxide, dipeptide muramyl or their variations.
  • peptides their coupling to a larger molecule (KLH, tetanus toxin) sometimes increases immunogenicity.
  • the vaccines are administered conventionally by injection, for example intramuscular. Additional favorable formulations with other modes administration include suppositories and sometimes oral formulations.
  • pharmaceutically acceptable vehicle is meant the supports and vehicles which can be administered to humans or animals, as described for example in Remington's Pharmaceutical Sciences 16 th ed., Mack Publishmg Co.
  • the pharmaceutically acceptable vehicle is preferably isotonic, hypotonic or has low hypertonicity and has a relatively low ionic strength.
  • the definitions of pharmaceutically acceptable excipients and adjuvants are also given in Remington's Pharmaceutical Sciences supra.
  • a probe characterized in that it is capable of hybridizing under determined conditions to a nucleic acid sequence or to a nucleotide fragment of DNA or RNA or a DNA or RNA molecule of the invention; preferably, a probe of the invention comprises at least 12 nucleotides, preferably at least 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 or 25 nucleotides and the hybridization is carried out under conditions of urgency corresponding to a combination of temperature and salt concentration chosen approximately between 12 to 20 VS C under the Tm (“melting temperature”) of the probe / nucleotide sequence complex to be detected; - A primer, characterized in that it is capable of hybridizing under determined conditions to a nucleic acid sequence or to a nucleotide fragment of DNA or RNA or to a DNA molecule or d 'RNA of the invention; preferably, a primer of the invention comprises at least 12 nucleotides, preferably at least 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 or 25 nucleotides and the hybrid
  • the primers represented in SEQ ID Nos 32 to 37 are new and as described in the experimental part of the pairs of primers are used for the amplification of the nucleic acids of the HXHV virus, said pairs of primers being preferably chosen from the following pairs: SEQ ID NO: 31 / SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 31 / SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 / SEQ ID NO: 35,, SEQ ID NO: 36 / SEQ ID NO: 37; - an anti-nucleic acid antibody, characterized in that it is capable of binding to a nucleic acid sequence or to a nucleotide fragment of DNA or RNA or to a molecule of DNA or RNA; - A diagnostic composition, characterized in that it comprises at least one probe or a primer or an anti-nucleic acid antibody as defined above; a method for detecting DNA and / or viral RNA, according to which a biological sample is taken from a patient suspected of being or being able to have been inf
  • probes and primers capable of hybridizing under stress conditions determined to a nucleotide sequence of DNA or RNA or to a nucleotide fragment as defined above are part of this definition. It is within the capacity of those skilled in the art to define the appropriate emergency conditions.
  • Characteristic stress conditions are those which correspond to a combination of the temperature and the salt concentration chosen approximately between 12 to 20 ° C below the Tm ("melt mg temperature") of the hybrid under study. We can thus refer to the work of George H. Keller and Mark M.
  • the invention also relates to: - a vaccine composition comprising a DNA sequence coding for at least one polypeptide or peptide fragment of the invention, said DNA being mixed with a vehicle and / or a diluent and / or an excipient suitable and pharmaceutically acceptable; an antisense or anti-gene oligonucleotide, characterized in that it is capable of specifically interfering with the synthesis of at least one polypeptide or peptide fragment of the invention; - A pharmaceutical composition, characterized in that it comprises at least one antisense oligonucleotide or an anti-gene oligonucleotide; - A vector, characterized in that it comprises at least one gene of therapeutic or vaccine interest, said gene encoding in particular (î) either at least for a polypeptide or a peptide fragment of the invention; (n) either at least for all or part of an antibody capable of binding to at least one polypeptide or peptide fragment defined in (î); - (m) or at least for
  • a therapeutic composition or vaccine characterized in that it comprises, inter alia, a vector as defined above and in that said gene of interest is placed under the dependence of elements ensuring its expression in vivo; a biological material for the preparation of a pharmaceutical or vaccine composition, comprising at least one cell, in particular a cell which does not naturally produce antibodies, in a form allowing its administration in a mammalian, human or animal organism, as well as possibly its prior culture, said cell being genetically modified vi by at least one nucleic acid sequence or by at least one nucleotide fragment or by at least one DNA molecule or by at least one vector of the invention, said sequences of nucleic acid, nucleotide fragment, DNA molecule and gene of the vector encoding m vi vo for at least one polypeptide or peptide
  • Zygosaccharomyces and Pichia and preferably chosen from the cells of Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carl sbergensi s, Schi zosaccharomyces po be, Kluveromyces lactis and Pichia pasto ⁇ s; prokaryotic cells, such as those from E. collar ; said cells being transformed by at least one nucleic acid sequence or by at least one nucleotide fragment or by a DNA molecule or by a vector of the invention; and a pharmaceutical or vaccine composition comprising such a cell.
  • the pharmaceutical compositions defined above are particularly advantageous DNA vaccine compositions, in particular compared to the "conventional" vaccine compositions based on recombinant protein.
  • the vaccine use of recombinant proteins is a heavy and expensive system, in particular because it requires very important steps in the purification of the recombinant antigens.
  • one of the difficulties encountered is to obtain a persistence of the vaccine long enough to maintain a good immune memory.
  • the DNA vaccination method the advantages of which are inherent in the intrinsic properties of DNA, is simple and inexpensive and is carried out simply by intramuscular or intradermal injection.
  • DNA vaccines are non-infectious / non-replicative, - that because DNA immunization is a form of transfection m vi vo, the viral antigen is expressed in mammalian cells in its native conformation, - as in the case of a viral infection, a broad immune response, both humoral and cellular is induced, and that - in addition, DNA vaccines can easily be combined due to their physico-chemical homogeneity.
  • the subject of the invention is a method for evaluating a therapeutic agent according to which a given dose is administered to an animal, in a dose or in repeated doses and at determined time intervals, at least one polypeptide or a peptide fragment of the invention, natural, recombinant or synthetic, or also obtained from a biological sample optionally after prior treatment of said biological sample infected with the HXHV virus, a biological sample from the animal is taken, preferably blood or serum and one carries out: (i) an assay of specific antibody (ies) of the polypeptide or the polypeptide fragment; and / or - (n) an assay of the cellular immune response induced against the polypeptide or the polypeptide fragment, for example by a test of activation in vi tro of T lymphocyte cells "helper" specific for the polypeptide or the fragment polypeptide.
  • a biological sample from the animal is taken, preferably blood or serum and one carries out: (i) an assay of specific antibody (ies) of the polypeptide or the poly
  • FIG. 1 The figure represents the partial sequencing of the band of approximately 1.3 Kb.
  • the positioning of the fragment of approximately 200 base pairs not sequenced is represented by the symbols (-).
  • the nucleotide fragments indicated in bold correspond to nucleotide fragments having a sequence homology or identity with SEQ ID NO: 1 of 100%. Their respective positioning in relation to SEQ ID NO: 1 are as follows: 253-233, 254-273, 273-254.
  • antisense primer Comp S6M13 5'-GCACTGCCGAGTTACATGGC-3 '(SEQ ID NO :)
  • GENEA p kit XL PCR Kit (trade name) of the Roche company was used in compliance with the protocol recommended by the supplier.
  • the composition of the 50 ⁇ l reaction mixture is as follows: 25 mM Mg (0AC) 2 2.4 ⁇ l dNTPs 2.5 mM of each 4.0 ⁇ l primer Comp S6M13 2.0 ⁇ l (20 pico moles) 3.3X XL Buffer II 15.1 ⁇ l rTth DNA polymerase (2 u / ⁇ l) 0.5 ⁇ l (1 u) DNA matrix 10 ⁇ l Distilled water 16 ⁇ l
  • the extension was carried out according to the following program: The reaction mixture was heated to 92 ° C for 2 minutes and then subjected to 35 cycles, each cycle comprising heating to 92 ° C for 30 seconds, heating to 55 ° C for 30 seconds and heating to 68 ° C for 3 minutes. The final extension was carried out by heating to 68 ° C for 10 minutes followed by cooling to 4 ° C.
  • Example 2 Capture of extended double strand DNA.
  • the extension product obtained according to the protocol described in Example 1 was isolated using the Dynabeads Kilobase BINDER kit (trade name) from the company Dynal, following the supplier's instructions.
  • the beads (5 ⁇ l) were first washed twice in the Binding Buffer and resuspended in 20 ⁇ l of this buffer.
  • a 20 ⁇ l aliquot of the extension product was added and incubated for 3 hours at room temperature on a roller to keep the beads in suspension.
  • the double-stranded DNA was purified by two washes with a washing buffer and a washing with distilled water and the beads were then resuspended in 20 ⁇ l of distilled esu and stored at 4 ° C.
  • Example 3 Digestion and circularization. 5 ⁇ l of the double stranded DNA, captured according to example 2, were digested with the enzyme Bsa WI (NEB), the cleavage site of which corresponded to position 299 of SEQ ID NO: 1, by heating to 60 ° C for 2 hours. The enzyme was then activated by heating at 80 ° C for 20 minutes. After which, the tube was cooled slowly and the digested DNA was purified using the QIA quick PCR purification Kit (trade name) from the company Qiagen. The purified DNA was then ligated at 4 ° C overnight using ligase 14 sold by Roche and the ligation was completed by heating at 65 ° C for 10 minutes.
  • Example 4 Amplification. 10 ⁇ l of the ligation product obtained according to Example 3 were used as a matrix to carry out a semi-nested PCR using the GeneAmp XL PCR Kit (trade name) from the company Roche. The two rounds of PCR were carried out in the same way, according to the following protocol: The reaction mixture was heated at 9 ° C for 2 minutes and then subjected to 35 cycles, each cycle comprising heating at 9 ° C for 30 seconds, heating to 47 ° C for 30 seconds and heating to 68 ° C for 3 minutes. The reaction mixture was then subjected to heating at 68 ° C for 10 minutes followed by cooling to 4 ° C.
  • Second round of PCR Composition of the reaction mixture (50 ⁇ l): 25 mM Mg (OAC) 2 2.4 ⁇ l dNTPs 2.5 mM of each 4.0 ⁇ l primer 1M13 sense (25 ⁇ M) 1.0 ⁇ l CIRC primer 1 anti -sense (25 ⁇ M) 1.0 ⁇ l 3.3X XL Buffer II 15.1 ⁇ l rTth DNA polymerase (2 u / ⁇ l) 0.5 ⁇ l (1 u) DNA matrix 10 ⁇ l Water 16 ⁇ l
  • Antisense primer (CIRC 1) 5'-GCGATGGTTGAGTCTCGACTA-3 '(SEQ ID NO: 32)
  • Second round of PCR Composition of the reaction mixture (50 ⁇ l): 25 mM Mg (OAC) 2 2.4 ⁇ l dNTPs 2.5 mM of each
  • Sense primer (1M13) 5 '-CCCGCCCCGCTGATGAAAAG-3' (SEQ ID NO: 31)
  • the locations of the primers in the XH sequence are respectively as follows: 1M13: 254-273 CIR 1: 253-233 6BRACE5 '94-77
  • Example 5 Electrophoresis on agarose gel and hybridization.
  • the amplification products obtained according to Example 4 were separated by electrophoresis on 1.5% agarose gel. Three bands whose sizes were between 1.2 Kb and 2.5 Kb were observed on the gel.
  • the amplified products were transferred onto a Hybond-N + nylon membrane (trade name) (Amersham Biosciences UK limited). The membrane was hybridized at 42 ° C overnight with the complete XH fragment labeled at its 3 ′ end with 3Z P (generated using the Ready to Go DNA Labeling beads kit (commercial name) from the company Amersham Pharmacia Biotech Inc. ).
  • Example 6 Cloning and sequencing. The three bands were respectively cloned into the vector pCR2.1-T0P0 (Invitrogen). The clones were then screened by hybridization on colonies and identified using the enzyme EcoRI (Gibco BRL). Positive clones were selected to be sequenced. The results of the sequencing revealed a fragment of 1133 base pairs. The research carried out in the databases did not show any significant sequence homology. The fragment of 1133 base pairs is referenced in the identifier for sequences in SEQ ID NOs: 2 and 3. It is also shown in the figure.
  • Example 7 Repetition Using the same digestion and circularization product described in Example 3, a new amplification was carried out according to the protocol described in Example 4, followed by electrophoresis on agarose gel and hybridization procedure described in Example 5. In this test, a single band whose size was approximately 1.3 Kb was observed on the gel. After cloning and sequencing, as described in example 6, a fragment of 1133 base pairs corresponding to the fragment described in example 6 (SEQ ID NOs: 2, 3 and figure) was obtained.
  • Example 8 Relevance of the fragment of 1133 base pairs. To verify the relevance of the 1133 base pair fragment with respect to the HXHV virus, nested PCRs were performed in parallel.
  • First round of PCR Composition of the reaction mixture (50 ⁇ l): Taq buffer with MgC12 10X 5.0 ⁇ l dNTPs 10 mM of each 2.0 ⁇ l primer XF4 sense (25 ⁇ M) 1.0 ⁇ l primer XB12 antisense (25 ⁇ M ) 1.0 ⁇ l Taq DNA polymerase (5 u / ⁇ l) 0.5 ⁇ l DNA matrix 10 ⁇ l Water 30.5 ⁇ l
  • Sense primer 5 'CCTTCTGGAGAGGGATTTC 3' (SEQ ID NO: 34)
  • Antisense primer (XB12) 5 'TGTTACCTGCTACTTCGTGC 3' (SEQ ID NO. 35)
  • Second round of PCR Composition of the reaction mixture (50 ⁇ l): Taq buffer with MgC12 10X 5.0 ⁇ l dNTPs 10 mM of each 2.0 ⁇ l primer XF1 sense (25 ⁇ M) 1.0 ⁇ l primer XBl antisense (25 ⁇ M) 1.0 ⁇ l Taq DNA polymerase (5 u / ⁇ l) 0.5 ⁇ l Product of the 1st round 10 ⁇ l Water 35.5 ⁇ l The following pairs of primers were used: Sense primer (XF1): 5 'TAGAGTTGCGAGGCGTGACC 3' (SEQ ID NO : 36) Antisense primer (XBl): 5 'CCTTATCCAGTGGCTTTTGGC 3' (SEQID NO: 37)
  • the locations of the primers in the sequence SEQ ID NO: 4 are respectively the following: XF4: 482-500 XB12: 1255-1236 XF1: 944-963 XBl: 1186-1166
  • the amplification products obtained according to Example 4 were separated by electrophoresis on 1.5% agarose gel.
  • the amplified products were transferred onto a Hybond-N + nylon membrane (trade name) (Amersham Biosciences UK limited).
  • the membrane was hyb ⁇ dée at 42 ° C overnight with the product of the 2nd round of PCR labeled at its 3 'end with 32 P.
  • the product of turn 2 was purified with the Qiaqick Gel Extraction Kit (trade name) and marked using the Ready to Go DNA Labeling beads kit (trade name) from Amersham Pharmacia Biotech Inc.) The following washes were carried out at 65 ° C: 2X SSC, 15 minutes, twice; IX SSC, 15 minutes, twice; 0.5X SSC, 15 minutes, twice.
  • the membrane was subjected to autoradiography at -80 ° C overnight.
  • the expected size band of approximately 240 base pairs is found in the amplified nucleic acids of 3 fractions of the 10 which were positive for the ORF4 of the HXHV virus. No band was revealed for the 7 fractions which were negative for 1ORF4 of the HXHV virus. •
  • the nucleic acids extracted from 15 sera from Non A-E patients, 9 of which were positive for HXHV ORF4 and 6 of which were negative for this same ORF were amplified by nested PCR with the same protocol as that described above. The amplified products obtained were then separated by electrophoresis on agarose gel, the membranes were hyb ⁇ dées and the bands were revealed by autoradiography according to the same protocol as that described above.
  • the expected size band of approximately 240 base pairs is found in the amplified nucleic acids of 3 of the 9 sera which were positive for the ORF4 of the HXHV virus. No band was revealed for the 6 sera which were negative for 1ORF4 of the HXHV virus. The results obtained from sera and serum fractions therefore confirm that the sequence of 1133 base pairs is associated with the HXHV virus.
  • Example 9 Complete sequencing of the band of approximately 1.3 Kb.
  • the PCR products were purified by enzymatic digestion (Enzyme Exosup - trade name).
  • the quantification of the nucleic acids was carried out by fluorometric assay.
  • the sequencing reaction was carried out using an enzymatic reaction in the presence of a primer specific for the region to be sequenced.
  • the products were then injected into the Apply Biosyste 3730 XL sequencer (trade name).
  • DNA sequence obtained is a sequence of 1314 base pairs represented in SEQ ID NO: 4.

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Abstract

Séquences d'acides nucléiques isolées susceptibles d'être obtenue à partir particulier la séquence la séquence SEQ ID du génome du virus HXHV, en d'acide nucléique comprenant NO : 4 ou la séquence complémentaire de SEQ ID NO par les séquences d'acides utilisations. 4, polypeptides codés nucléiques et leurs

Description

SEQUENCES NUCLEIQUES ET FROTEIQUES DU VIRUS HXHV ET UTILISATIONS
L'hépatite est la plus importante des maladies transmissibles. Le mode de transmission est le plus souvent la transfusion, la transplantation d'organes et 1 ' hémodialyse , mais l'hépatite peut également être transmise par ingestion de nourriture ou d'eau contaminée et par contact entre individus . Les hépatites virales sont induites par divers agents viraux qui se distinguent les uns des autres par leurs génomes et leurs modes de réplication. Les hépatites virales causent des dommages au niveau du foie avec des degrés variables de sévérité. Près d'un milliard de personnes dans le monde souffrent d'hépatites virales. Il existe des risques graves dans les formes chroniques des hépatites qui peuvent évoluer en cirrhose ou hépatocarcinome . Les hépatites virales peuvent être diagnostiquées par mise en évidence de symptômes bien définis, tels que la jaunisse, des taux élevés de transaminases (aspartate transaminase ou AST, alanine transaminase ou ALT, lactate déshydrogénase ou LDH) , et des lésions hépatiques. Mais malgré la connaissance de différents virus des hépatites A, B, C, D, E, G et TTV, 5% de toutes les hépatites et 40% des hépatites fulminantes demeurent inexpliquées, d'où l'hypothèse de l'existence de virus inconnus des hépatites. Ces hépatites sans étiologie connue sont aussi bien post-transfusionnelles que sporadiques, chroniques ou fulminantes. Elles sont communément appelées hépatites X. Les virus des hépatites G (GBV-A, GBV-B, GBV-C) et TTV récemment identifiés ne semblent pas être pathogènes chez l'homme et ne peuvent donc pas expliquer les cas d'hépatites sans étiologie connue ou hépatites X. A partir d'un cas d'hépatite grave sans étiologie connue, d'un patient chez lequel un traitement à l'interféron a permis de normaliser les transaminases, un nouveau virus dénommé HXHV, associé aux hépatites X, a été décrit . Le génome du virus HXHV est un génome à ADN au moins partiellement simple brin qui comprend une ou plusieurs trames de lecture codant pour une ou des protéine (s) ou polyprotéine (s) , le génome comprend une séguence nucléotidique susceptible de s'hybπder à la séquence nucléotidique XH ou à la séquence nucléotidique complémentaire de la séquence XH. La séquence XH est représentée dans l'identificateur de séquences de la présente demande en SEQ ID NO :1. La séquence XH est riche en GC (62%) et présente quatre trames de lecture ouvertes (ORF1, ORF2, ORF3, ORF4) . Cette séquence isolée a été caractérisée et aucune homologie de séquences avec l'ADN génomique humain et avec les séquences présentes dans les bases de données n'a été retrouvée. Toutes les informations concernant le virus HXHV sont contenues dans la demande de brevet PCT/FR02/04578 déposée aux noms des demanderesses . Les présents inventeurs ont maintenant isolé et caractérisé une nouvelle séquence nucléotidique du virus HXHV. Cette séquence, dénommée XH1 est riche en GC (61,2%), ce qui est comparable avec la teneur en GC de la séquence XH isolée précédemment. La séquence XHl est référencée dans l'identificateur de séquences en SEQ ID NO : 4. La séquence XHl ne présente aucune homologie ou identité significative avec toutes les séquences disponibles dans les bases de données. Elle présente 5 trames de lecture ouvertes. Les séquences ADN correspondant auxdites trames de lecture ouvertes sont respectivement identifiées en SEQ ID NOs 5 a 9 dans l'identificateur de séquences. Comme il est de nature courante dans le domaine de la virologie, les présents inventeurs ont généré le brin ADN complémentaire de la séquence XHl et ont également recherché s'il existait de potentielles trames de lecture ouvertes sur le brin ADN complémentaire. Ils ont identifiés 8 trames de lecture ouvertes qui sont respectivement représentées en SEQ ID NOs 10 à 17. Les séquences polypeptidiques correspondant auxdites trames de lecture sont respectivement identifiées en SEQ ID NOs : 18 à 30 dans l'identificateur de séquences. Les séquences précitées et leurs fragments sont utilisés pour la détection du virus HXHV. Ainsi, la présente invention concerne : - une séquence d'acide nucléique susceptible d'être obtenue à partir du génome du virus HXHV, ladite séquence d' acide nucléique comprenant ou consistant en SEQ ID NO : 4. - un fragment nucléotidique d'ADN isolé comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique ADN ou ARN d' au moins 12 nucléotides contigus, de préférence d'au moins 15 ou d'au moins 18 nucléotides contigus, et avantageusement d'au moins 20, 21, 22, 23, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51 ou 54 nucléotides contigus, de la séquence nucléotidique ADN SEQ ID NO : 4 ou de la séquence ADN complémentaire de SEQ ID NO : 4 ; ou d'une séquence nucléotidique qui présente, sur au moins 12 nucléotides contigus, de préférence sur au moins 15 ou au moins 18 nucléotides contigus, et avantageusement sur au moins 20, 21, 22, 23, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51 ou 54 nucléotides contigus, au moins 90%, de préférence au moins 92%, 95% ou au moins 98%, 99% d' homologie ou d'identité par rapport à la séquence représentée en SEQ ID NO : 4 ou par rapport à séquence ADN complémentaire de SEQ ID NO : 4 ; à l'exclusion des fragments qui consistent en une des séquences nucléotidiques suivantes :
TAGTCGAGACTCAACCATCGC, CCCGCCCCGCTGATGAAAAG et des séquences nucléotidiques complémentaires desdites séquences ; ou à la condition que sur 20 nucléotides ou 21 nucléotides contigus ledit fragment nucléotidique d'ADN ne présente pas 100% d' omologie ou d'identité avec un fragment nucléotidique de la séquence référencée SEQ ID NO : 1 ou de la séquence complémentaire de SEQ ID NO : 1. Ledit fragment est en particulier choisi parmi les fragments dont lesdits nucléotides contigus appartiennent à l'un des segments suivants : un segment dont la séquence commence au nucléotide 2 et se termine au nucléotide 286 de SEQ ID NO :4, un segment dont la séquence commence au nucléotide 4 et se termine au nucléotide 144 de SEQ ID NO :4, un segment dont la séquence commence au nucléotide 180 et se termine au nucléotide 1004 de SEQ ID NO :4, un segment dont la séquence commence au nucléotide 614 et se termine au nucléotide 820 de SEQ ID NO :4, un segment dont la séquence commence au nucléotide 1228 et se termine au nucléotide 1314 de SEQ ID NO : 4 ou les fragments complémentaires ; un segment dont la séquence commence au nucléotide 1283 et se termine au nucléotide 1197 de la séquence complémentaire de SEQ ID NO :4, un segment dont la séquence commence au nucléotide 1264 et se termine au nucléotide 1067 de la séquence complémentaire de SEQ ID NO : 4, un segment dont la séquence commence au nucléotide 1209 et se termine au nucléotide 1099 de la séquence complémentaire de SEQ ID NO : 4, un segment dont la séquence commence au nucléotide 819 et se termine au nucléotide 736 de la séquence complémentaire de SEQ ID NO : 4, un segment dont la séquence commence au nucléotide 800 et se termine au nucléotide 6 de la séquence complémentaire de SEQ ID NO : 4, un segment dont la séquence commence au nucléotide 784 et se termine au nucléotide 629 de la séquence complémentaire de SEQ ID NO : 4, un segment dont la séquence commence au nucléotide 610 et se termine au nucléotide 410 de la séquence complémentaire de SEQ ID NO : 4, un segment dont la séquence commence au nucléotide 391 et se termine au nucléotide 221 de la séquence complémentaire de SEQ ID NO : 4 ou les fragments complémentaires ; et de préférence un fragment comprenant ou consistant en l'une quelconque des séquences SEQ ID NOs : 5 à 17 ou en l'une quelconque des séquences ADN complémentaires de SEQ ID NO : 5 à 17 (le segment dont la séquence commence au nucléotide 180 et se termine au nucléotide 1004 de SEQ ID NO :4 code pour une protéine des transposase/intégrases) ; - le produit de transcription la séquence comprenant ou consistant en SEQ ID NO : 4 ou le produit de transcription d'un fragment tel que défini ci-dessus, ou le produit de transcription de la séquence comprenant ou consistant en la séquence complémentaire de SEQ ID NO : 4 ; - une molécule d'ADN qui comprend ou consiste en une séquence nucléotidique ADN représentée en SEQ ID NO : 4 ou en ce qu'elle comprend au moins un fragment nucléotidique ADN tel que défini ci-dessus ou leurs séquences complémentaires ; - une molécule d'ARN qui comprend ou consiste en une séquence nucléotidique ARN qui est le produit de transcription d'une séquence nucléotidique ADN représentée en SEQ ID NO : 4 ou de la séquence complémentaire de SEQ ID NO : 4 ou qui est le produit de transcription d'au moins un fragment tel que défini ci-dessus ou leurs séquences complémentaires. L' homologie et identité ci-dessus recouvre et les équivalents fonctionnels de la séquence SEQ ID NO : 4, c' est a dire les séquences ADN dans lesquelles au moins un codon peut être remplacé par un autre codon tout en codant pour un acide aminé identique. On parle de dégénérescence du code génétique. Ainsi, les codes de l' argminme, de la serine et de la leucme présentent une dégénérescence d'ordre 6 (c'est à dire qu'il y a six codons différents pour chacune d'elle), tandis que les codes d'autres acides aminés, tels que l'acide glutamique, la glutamine, la tyrosine, l'histidme et quelques autres présentent une dégénérescence d'ordre 2. De tous les acides aminés seuls le tryptophane et la méthionine ont une dégénérescence d'ordre 1. Il est donc clair que pour l'expression d'un polypept de dont la séquence est représentée en SEQ ID NOs : 18 à 30, on peut utiliser des séquences d'acides nucléiques variantes et fonctionnelles dont les compositions en codons sont différentes de la séquence d'acide nucléique représentée en SEQ ID NO : 4 ou de sa séquence complémentaire. L' homologie ou identité définie ci-dessus vise également les variants du virus HXHV et les séquences mutantes du virus HXHV, et en particulier celles issues de la variabilité naturelle. En effet, il est bien connu des spécialistes que les virus ont des taux relativement élevés de mutations spontanées ou induites. L'invention concerne également : - un polypeptide comprenant une séquence polypeptidique codée par une séquence ou par un fragment tel (le) que défini (e) ci-dessus ou par leurs équivalents fonctionnels ou par une séquence nucléotidique qui présente au moins 90% d' omologie ou d'identité, de préférence au moins 92% ou 95% d' homologie ou d'identité et avantageusement au moins 98% ou 99% d' homologie ou d'identité par rapport à la séquence représentée en SEQ ID NO : 4 ou par rapport à la séquence complémentaire de SEQ ID NO : 4, a la condition que les séquences TAGTCGAGACTCAACCATCGC, CCCGCCCCGCTGATGAAAAG, les séquences nucléotidiques complémentaires desdites séquences soient exclues ; ou à la condition que sur 20 nucléotides ou 21 nucléotides contigus le fragment nucléotidique d'ADN ne présente pas 100% d' homologie ou d'identité avec un fragment nucléotidique de la séquence référencée SEQ ID NO : 1 ou de la séquence complémentaire de SEQ ID NO : 1; un polypeptide dont la séquence polypeptidique comprend ou consiste en l'une quelconque des séquences SEQ ID Nos 18 a 30 ou en une séquence polypetidique fonctionnellement équivalente auxdites séquences ; - un fragment polypeptidique, caractérisé en ce qu'il comprend ou consiste en une séquence peptidique d'au moins 4 acides aminés contigus, de préférence d'au moins 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 18 acides aminés de l'une quelconque des séquences peptidiques représentées en SEQ ID NO : 18 à 30 ou d'une séquence peptidique fonctionnellement équivalente auxdites séquences SEQ ID NO : 18 à 30 ; étant entendu que par séquence peptidique fonctionnellement équivalente on entend une séquence peptidique qui est reconnue par des anticorps dirigés contre le virus HXHV ; - un fragment polypeptidique qui comprend ou qui consiste en une séquence peptidique représentée en l'une quelconque des SEQ ID NOs : 18 a 30 ou une séquence peptidique fonctionnellement équivalente à l'une quelconque des SEQ ID NOs : 18 à 30 ; étant entendu que par séquence peptidique fonctionnellement équivalente on entend une séquence peptidique qui est reconnue par des anticorps dirigés contre le virus HXHV. - un epitope caractérisé en ce qu'il comprend ou consiste en une séquence peptidique d'au moins 6, 8, 9, 10, 12, 15 ou 18 acides aminés et au plus de 10, 12, 15 ou 18 acides aminés, en particulier en ce que sa séquence consiste en une séquence peptidique de 6 à 10 acides aminés, de 6 à 12 acides aminés, de 6 a 15 acides aminés, de 6 à 18 acides aminés, de 8 à 10 acides aminés, de 8 à 12 acides aminés, de 8 à 15 acides aminés, de 8 à 18 acides aminés et de 15 a 18 acides aminés de l'une quelconque des séquences représentées en SEQ ID NO : 18 à 30 ou d'une séquence polypeptidique fonctionnellement équivalente auxdites séquences SEQ ID NO : 18 a 30 ; étant entendu que ledit épitope est reconnu par des anticorps dirigés contre le virus HXHV. Par "polypeptide", on désigne un peptide, a l'état isolé, présentant un enchaînement d'un nombre variable d'acides aminés, tel qu'un oligopeptide, une protéine, une protéine de fusion, un peptide de fusion, un peptide de synthèse. Un polypeptide peut être obtenu par différentes techniques bien connues de l'homme du métier, et notamment par synthèse chimique ou par des techniques de recombinaison génétique. Les polypeptides selon l'invention peuvent être obtenus par des méthodes de synthèse classique, par exemple avec un synthétiseur automatique de peptides, ou par les techniques de génie génétique comprenant l'insertion d'une séquence d'ADN codant pour ledit polypeptide dans un vecteur d'expression tel qu'un plasmide ou un virus, et la transformation de cellules avec ce vecteur d'expression et culture de ces cellules . Par séquence peptidique fonctionnellement équivalente à une séquence peptidique de référence, on entend une séquence d'acides aminés modifiée par insertion et/ou délétion et/ou substitution et/ou allongement et/ou raccourcissement et/ou modification chimique d'un ou plusieurs acides aminés, pour autant que ces modifications préservent substantiellement voire développent les propriétés îmmunoréactives de ladite séquence peptidique de référence. Ainsi, on entend par séquences fonctionnellement équivalentes des séquences qui conservent les propriétés immunoréactives de SEQ ID Nos 18 à 30 ou de leurs fragments, notamment les séquences dans lesquelles un ou plusieurs acide (s) aminé (s) est ou sont substitué (s) par un ou plusieurs autres acides ammes ; les séquences dans lesquelles un ou plusieurs acide aminé de la série L est remplacé par un acide aminé de la série D, et vice-versa ; les séquences dans lesquelles on a introduit une modification des chaînes latérales des acides aminés, telle qu'une acétylation des fonctions aminés, une carboxylation des fonctions thiols, une estérification des fonctions carboxyliques ; une modification des liaisons peptidiques telles que par exemple des liaisons carba, rétro, inverso, retro-inverso, réduites et méthylène-oxy . Par exemple un ou plusieurs acide (s) aminé (s) dans les séquences des polypeptides de l' invention peuvent être substitué (s) par un ou plusieurs autre (s) acide (s) aminé (s) de polarité similaire qui agissent comme des équivalents fonctionnels. Des substitutions pour un acide aminé dans des séquences polypeptiques d'intérêt peuvent être déterminées a partir d' autres membres de la classe auquel l'acide aminé appartient. Par exemple, les acides aminés non polaires (hydrophobes) comprennent l'alanme, la leucme, l' isoleucine, la valme, la proline, la phenylalanme, la tryptophane, la methionine. Les acides aminés neutres polaires comprennent la glycine, la serine, la thréonine, la cystéine, la tyrosine, l' asparag e, la glutamine. Les acides aminés chargés positivement (basiques) comprennent l'arg me, la lysine et l'histid e. Les acides aminés chargés négativement (acides) comprennent l'acide aspartique et l'acide glutamique. D'autres substitutions pour un acide aminé dans des séquences polypeptidiques d'intérêt peuvent être déterminées a partir des informations contenues dans l'article de Kramer A. et al. (Molecular Immunology, Vol. 32, N°7, pp. 459-465 (1995)). Ces auteurs ont constitué des banques dans lesquelles pour réduire le problème de l'explosion combmatoire du nombre de molécules, ils ont utilisés des groupes d'acides aminés constitués d'acides aminés ayant des propriétés physico-chimiques similaires et ce sont les acides aminés regroupés dans chacun de ces six groupes, listés ci-dessous, qui sont considérés principalement comme équivalents dans la présente inventio . Groupe 1 alan e, proline, glycine. Groupe 2 acide aspartique, acide glutamique. Groupe 3 histid e, lysine, argin e. Groupe 4 asparagme, glutamine, serine, thréonine. Groupe 5 phenylalanme, tyrosine, tryptophane. Groupe 6 isoleucine, leucme, valme, methionine. L'équivalence d'une séquence peptidique par rapport à une séquence peptidique de référence peut être définie par son identité ou son homologie, exprimée en pourcentage, avec ladite séquence de référence. Ce pourcentage est déterminé, pour une suite d'un nombre donné d'acides aminés contigus, par alignement des deux séquences, déplacement de l'une par rapport à l'autre, et comparaison des acides aminés dans les deux séquences. Le pourcentage d'identité est déterminé a partir du nombre d'acides aminés qui sont identiques à des acides aminés de la séquence de référence, dans la même position. Le pourcentage d' homologie est déterminé a partir du nombre d'acides aminés qui sont équivalents à des acides aminés de la séquence de référence, dans la même position. L'invention concerne aussi une cassette d'expression fonctionnelle dans une cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote permettant l'expression d'une séquence d'acide nucléique ou d'un fragment d'ADN ou d'une molécule d'ADN tels que décrits ci-dessus, placé sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression. La cassette d'expression est caractérisée en ce qu'elle est fonctionnelle dans une cellule issue d'un organisme procaryote, en particulier E . coli ou d'un organisme eucaryote, en particulier les cellules provenant d'animaux tels que les mammifères, les reptiles, les insectes, en particulier les cellules COS, CHO, BHK, PK 15, RK 13 ; les lignées cellulaires humâmes de l' ostéosarcorme (cellules 143 B) , les lignées cellulaires humaines HeLa et les lignées cellulaires humâmes de l'hépatome (du type HepG2) ; les lignées cellulaires d'insecte (par exemple de Spodoptera frugiperda) ; ou eucaryote inférieur, en particulier les cellules de levures, telles que Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kl uveromyces, Hanseluna , Yarowia, Schwamo yces, Zygosaccharomyces et Pi chia, et de préférence choisi parmi les cellules de Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Schizosaccharomyces pombe, Kl uveromyces lactis et de Pichia pastoris . L' invention concerne encore un vecteur comprenant ladite cassette d'expression ; une cellule issue d'un organisme procaryote, eucaryote ou eucaryote inférieur , de préférence un organisme eucaryote ou eucaryote inférieur tel que défini ci-dessus ou un vecteur tel que défini ci-dessus ; et le polypeptide susceptible d'être produit par la cassette d'expression, le vecteur ou la cellule. L'invention a pour objet un procédé pour préparer un polypeptide ou un fragment polypeptidique tel que défini ci-dessus qui consiste à cultiver une cellule hôte répondant aux définitions précédentes dans un milieu de culture approprié, ladite cellule hôte étant transformée avec un vecteur d'expression qui contient une séquence d' acide nucléique ADN telle que définie précédemment ou un fragment nucléotidique ADN tel que défini précédemment ou une molécule d'ADN telle que définie précédemment et, a purifier ledit polypeptide produit jusqu'à un degré de pureté requis. L'invention a aussi pour objet un polypeptide immunogène, ledit polypeptide comprenant ou consistant en une séquence polypeptidique ou peptidique telle que définie précédemment. Un tel polypeptide immunogène est utilisé pour la production d'anticorps onoclonaux ou polyclonaux ou de fragments desdits anticorps et l'invention englobe les anticorps monoclonaux ou polyclonaux ou leurs fragments, étant obtenus par immunisation d'un animal mammifère (lapin, rat, souris) avec un tel peptide immunogène. La production d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux est bien connue de l'homme du métier. On peut citer a titre de référence Kohler G. et Milste C. (1975) : Continuous culture of fused cells secretmg antibody of predefined spec ficity, Nature 256 : 495-497 et Galfre G. et al. (1977) Nature, 266 : 522-550 pour la production d'anticorps monoclonaux et Roda A., Bolelli G. F. : Production of high-titer antibody to bile acids, Journal of Steroid B ochemistry, Vol. 13, pp 449-454 (1980) pour la production d'anticorps polyclonaux. Des anticorps peuvent également être produits par immunisation de souris, de rat ou de lapins avec les particules virales de HXHV. Pour la production d'anticorps polyclonaux et monoclonaux, l' immunogène peut être couplé à de l'albumine sérique (peptide SA) ou à l' hémocyanine de Lymphet Keyhole (peptide KLH) comme support pour l'immunisation. Les anticorps sont ensuite criblés pour leur spécificité en utilisant les techniques habituelles, telles que des tests ELISA ou de Western Blot. Pour la production d'anticorps monoclonaux les animaux sont soumis à une injection d' immunogène en utilisant de l'adjuvant complet de Freund. Les sérums et les surnageants de culture d'hybridome issus des animaux immunisés sont analysés pour leur spécificité et leur sélectivité en utilisant des techniques classiques, telles que par exemple des tests ELISA ou de Western Blot. Les hybridomes produisant les anticorps les plus spécifiques et les plus sensibles sont sélectionnés. Des anticorps monoclonaux peuvent également être produits in vitro par culture cellulaire des hybridomes produits ou par récupération de liquide d'ascite, après injection intrapéritonéale des hybridomes chez la souris. Quel que soit le mode de production, en surnageant ou en ascite, les anticorps sont ensuite purifiés. Les méthodes de purification utilisées sont essentiellement la filtration sur gel échangeur d'ions et la chromatographie d'exclusion ou la chromatographie d' affinité (protéine A ou G) . Un nombre suffisant d'anticorps sont criblés dans des tests fonctionnels pour identifier les anticorps les plus performants. La production in vi tro d'anticorps, de fragments d'anticorps ou de dérivés d'anticorps, tels que des anticorps chimères produits par génie génétique est bien connue de l'homme du métier. Il est avantageux d'utiliser des anticorps humanisés. Les formes " humanisées " d'anticorps non humains, par exemple murins, sont des anticorps chimères qui comprennent une séquence minimale dérivée d'une immunoglobuline non humaine. Pour la plupart, les anticorps humanisés sont des immunoglobulmes humaines (anticorps récepteur) dans lesquelles des résidus d'une région hypervariable du récepteur sont remplacés par des résidus d'une région hypervariable d'une espèce donneur (anticorps donneur) non humaine, telle que souris, rat, lapin ou primate non humain, ayant la spécificité, l'affinité et la capacité souhaitées. Dans certains cas, les résidus (FR) de la région Fv de l' immunoglobuline humaine sont remplacés par des résidus correspondants non humains. De plus, les anticorps humanisés peuvent comprendre des résidus qui ne sont pas trouvés dans l'anticorps receveur ou dans l'anticorps donneur. Ces modifications sont effectuées pour améliorer les performances de l'anticorps. En général, l'anticorps humanisé comprendra au moins et de préférence deux domaines variables, dans lesquels tout ou à peu près tout des boucles hypervariables correspondent à une immunoglobuline non humaine et tout ou à peu près tour des régions FR seront celles d'une immunoglobuline humaine. Les anticorps humanisés facultativement pourront aussi comprendre au moins une partie d'une région constante (Fc) d'une immunoglobuline, telle qu'une immunoglobuline humaine (Jones et al., Nature 321 : 522- 525 (1986) ; Reichmann et al., Nature 332 : 323-329 (1988) ; et Presta et al., Curr. Op. Struct. Biol. 2 : 593-596 (1992) . Plus particulièrement, par fragment d'anticorps on entend les fragments F(ab)2, Fab, Fab' , sFv (Blazar et al., 1997, Journal of Immunology 159 : 5821-5833 et Bird et al., 1988, Science 242 : 423-426) d'un anticorps natif et par dérivé on entend, entre autres, un dérivé chimérique d'un anticorps natif (voir par exemple Ara awa et al., 1996, J. Biochem 120 : 657-662 et Chaudray et al., 1989, Nature 339 : 394-397). Ces fragments d'anticorps et dérivés d'anticorps conservent la capacité de se l er sélectivement à l'antigène cible. L'anticorps monoclonal ou polyclonal ainsi obtenu ou son fragment est incorporé dans une composition diagnostique qui est utilisée dans un procédé pour détecter au moins un polypeptide ou un fragment peptidique tel que défini précédemment dans un échantillon biologique, selon lequel on met en contact l'échantillon biologique avec la composition dans des conditions prédéterminées qui permettent la formation de complexes anticorps/antigène et on détecte la formation desdits complexes . _' invention a également pour objet une composition diagnostique qui comprend un polypeptide ou un fragment peptidique tel que défini précédemment et un procédé pour détecter des anticorps dirigés contre le virus HXHV ou au moins contre un polypeptide ou un fragment peptidique de l'invention, selon lequel on met en contact un échantillon biologique suspecté être ou pouvoir avoir été infecté par le virus HXHV avec la composition diagnostique dans des conditions prédéterminées qui permettent la formation de complexes anticorps/antigène et on détecte la formation desdits complexes. En effet, il est connu que lors d'une infection par un agent viral, l'hôte développe des anticorps dirigés contre cet agent viral (réponse humorale) . La présente invention a aussi pour objet le matériel biologique pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement des êtres humains ou des animaux infectés par au moins le virus HXHV et des compositions immunogènes ou vaccinales qui peuvent être utilisées pour produire des vaccins thérapeutiques contre une infection par le virus HXHV et des vaccins prophylactiques pour prévenir une potentielle infection par le virus HXHV, lesdites préparations immunogènes comprenant au moins un polypeptide ou un fragment peptidique naturel, recombinant, ou de synthèse de l'invention associé à un véhicule et/ou un adjuvant et/ou un diluant et/ou un excipient pharmaceutiquement acceptable. La présente invention a aussi pour objet l'utilisation d'au moins un anticorps monoclonal ou polyclonal ou d'au moins un fragment desdits anticorps de l'invention, spécifique d'au moins un polypeptide ou un fragment peptidique tel que défini ci-dessus pour la préparation d'une composition pharmaceutique qui administrée à un patient infecté par le virus HXHV a la capacité de réduire voire d'inhiber la prolifération et/ou la replication du virus. Ces anticorps ou leurs fragments sont appelés anticorps neutralisants. Par échantillon biologique, on entend par exemple le sang, le sérum, le plasma, les prélèvements tissulaires, tels que les extraits de biopsie du foie. Les vaccins préparés sont injectables, c'est-à-dire en solution liquide ou en suspension. En option, la préparation peut aussi être émulsifiée. La molécule antigénique peut être mélangée avec des excipients qui sont pharmaceutiquement acceptables et compatibles avec l'ingrédient actif. Des exemples d'excipients favorables sont l'eau, une solution saline, le dextrose, le glycérol, l'éthanol ou des équivalents et leurs combinaisons. Si désiré, le vaccin peut contenir des quantités mineures de substances auxiliaires comme des agents mouillants ou émulsifîants, des agents qui tamponnent le pH ou des adjuvants comme l'hydroxide d'aluminium, le dipeptide muramyl ou leurs variations. Dans le cas des peptides, leur couplage à une plus grosse molécule (KLH, toxine tétanique) augmente quelquefois l' îmmunogénicité. Les vaccins sont administres conventionnellement par injection par exemple intramusculaire. Des formulations additionnelles favorables avec d'autres modes d'administration incluent des suppositoires et quelquefois des formulations orales. Par " véhicule pharmaceutiquement acceptable " on entend les supports et véhicules admmistrables a l'être humain ou à un animal, tels que décrits par exemple dans Remington's Pharmaceutical Sciences 16th éd., Mack Publishmg Co. Le véhicule pharmaceutiquement acceptable est de préférence isotonique, hypotonique ou présente une faible hypertonicité et a une force ionique relativement basse. Les définitions des excipients et adjuvants pharmaceutiquement acceptables sont également données dans Remington's Pharmaceutical Sciences précité. L'invention a encore pour objet : - une sonde, caractérisée en ce qu'elle est susceptible de s'hybrider dans des conditions de strmgence déterminées a une séquence d'acide nucléique ou à un fragment nucléotidique d'ADN ou d'ARN ou à une molécule d'ADN ou d'ARN de l'invention ; de préférence, une sonde de l'invention comprend au moins 12 nucléotides, de préférence au moins 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 nucléotides et l'hybridation est réalisée dans des conditions de strmgence correspondant à une combinaison de la température et de la concentration saline choisie approximativement entre 12 a 20CC sous le Tm (« melting température ») du complexe sonde / séquence nucléotidique a détecter ; - une amorce, caractérisée en ce qu'elle est susceptible de s'hybrider dans des conditions de strmgence déterminées a une séquence d'acide nucléique ou à un fragment nucléotidique d'ADN ou d'ARN ou à une molécule d'ADN ou d'ARN de l'invention ; de préférence, une amorce de l' invention comprend au moins 12 nucléotides, de préférence au moins 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 nucléotides et l'hybridation est réalisée dans des conditions de strmgence correspondant à une combinaison de la température et de la concentration saline choisie approximativement entre 12 à 20 °C sous le Tm (« melting température ») du complexe amorce / séquence nucléotidique à amplifier et/ou détecter. Les amorces représentées en SEQ ID Nos 32 à 37 sont nouvelles et comme décrit dans la partie expérimentale des couples d'amorces sont utilisés pour l'amplification des acides nucléiques du virus HXHV, lesdits couples d'amorces étant choisis préférentiellement parmi les couples suivants : SEQ ID NO : 31 / SEQ ID NO : 32, SEQ ID NO : 31 / SEQ ID NO : 33, SEQ ID NO : 34 / SEQ ID NO : 35, , SEQ ID NO : 36 / SEQ ID NO : 37 ; - un anticorps anti-acide nucléique, caractérisé en ce qu'il est susceptible de se lier à une séquence d'acide nucléique ou à un fragment nucléotidique d'ADN ou d'ARN ou à une molécule d'ADN ou d'ARN ; - une composition diagnostique, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une sonde ou une amorce ou un anticorps anti-acide nucléique tel que défini ci-dessus ; - un procédé de détection d'ADN et/ou d'ARN viral, selon lequel on prélève un échantillon biologique d' un patient suspecté être ou pouvoir avoir été infecté par le virus HXHV, on traite si nécessaire ledit échantillon pour en extraire l'ADN et/ou l'ARN, on met en contact ledit échantillon avec au moins une sonde ou une amorce de l'invention, dans des conditions de strmgence déterminées et on détecte la présence d'ADN et/ou d'ARN viral dans l'échantillon soit par mise en évidence d'une hybridation dudit ADN et/ou ARN viral avec au moins une sonde, soit par amplification dudit ADN et/ou ARN (par exemple comme décrit dans la partie expérimentale de l'invention) ; et - un procédé de détection d'ADN et/ou d'ARN viral, selon lequel on prélève un échantillon de sérum ou de plasma d'un patient, on traite si nécessaire ledit échantillon pour en extraire l'ADN et/ou l'ARN, on met en contact ledit échantillon avec au moins un anticorps antiacide nucléique, ledit anticorps étant éventuellement marqué par tout marqueur approprié et on met en évidence la formation d'un complexe acide nucléique/anticorps. La production de polynucléotides, sondes ou amorces fait partie des connaissances générales de l'homme du métier. On peut notamment citer l'utilisation d'enzymes de restriction, et la synthèse chimique sur synthétiseur automatique. Les sondes et amorces susceptibles de s'hybrider dans des conditions de strmgence déterminées à une séquence nucléotidique d'ADN ou d'ARN ou à un fragment nucléotidigue tel que défini précédemment font partie de cette définition. Il est à la portée de l'homme du métier de définir les conditions de strmgence appropriées. Des conditions de strmgence caractéristiques sont celles qui correspondent à une combinaison de la température et de la concentration saline choisie approximativement entre 12 à 20°C sous le Tm (" meltmg température ") de l'hybride à l'étude. On peut ainsi se référer à l'ouvrage de George H. Keller et Mark M. Manak, DNA PROBES, second édition, Stockton Press, 1993, 49 West 24Lh St., New York, N.Y. 10010 USA. Les conditions de str gence pour discriminer même une seule mutation ponctuelle dans une séquence nucléique sont connues depuis au moins les années 1979 ; On peut citer a titre d'exemples Wallace R. B et al., DNA. Nucleic. Acids. Res. 6, 3543-3557 (1979), Wallace R. B et al., Science, 209, 1396-1400 (1980), Itakura K. and Riggs A.D., Science, 209, 1401-1405 (1980), Suggs S.V. et al., PNAS, 78, 6613-6617 (1981), Wallace R.B et al. DNA. Nucleic. Acids. Res., 9, 3647-3656 (1981), Wallace R.B et al. DNA. Nucleic. Acids. Res., 9, 879-894 (1981) et Conner B.J. étal, PNAS, 80, 278-282 (1983). Par ailleurs, on connaît des techniques pour la production d' anticorps anti-acides nucléiques. On peut citer à titre d'exemples Philippe Cros et al., Nucleic Acides Researc, 1994, Vol. 22, N°. 15, 2951-2957 ; Anderson, W.F. et al. (1988) Bioessays, 8 (2), 69-74 ; Lee, J.S. et al. (1984) FEBS Lett., 168, 303-306 ; Malfoy, B. et al. (1982) Biocheimstry, 21(22), 5463-5467 ; Stollar, B.D. et al-, J.J. (eds) Methods in Enzymology, Académie Press, pp 70- 85 ; Traincard, F. et al. (1989) J. Immunol. Meth., 123, 83-91 et Iraincar , F. et al. (1989) Mol. Cell . Probes, 3, 27-38). L' invention se rapporte aussi à : - une composition vaccinale comprenant une séquence d'ADN codant pour au moins un polypeptide ou un fragment peptidique de l'invention, ledit ADN étant mélangé avec un véhicule et/ou un diluant et/ou un excipient approprie et pharmaceutiquement acceptable ; un oligonucléotide anti-sens ou anti-gène, caractérisé en ce qu'il est capable d'interférer spécifiquement avec la synthèse d' au moins un polypeptide ou un fragment peptidique de l'invention ; - une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un oligonucléotide anti-sens ou un oligonucléotide anti-gène ; - un vecteur, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un gène d'intérêt thérapeutique ou vaccinal, ledit gène codant notamment (î) soit au moins pour un polypeptide ou un fragment peptidique de l'invention; (n) soit au moins pour tout ou partie d'un anticorps capable de se fixer à au moins un polypeptide ou fragment peptidique défini en (î) ; - (m) soit au moins pour une molécule mhibitrice d'au moins un polypeptide ou fragment peptidique défini en
(D ; - (ιv) soit au moins pour un ligand ou toute partie d'un ligand capable de se fixer à au moins un polypeptide ou fragment peptidique défini en (î) et/ou d'inhiber sa fonction ; une composition thérapeutique ou vaccinale, caractérisée en ce qu' elle comprend, entre autre, un vecteur tel que défini ci-dessus et en ce que ledit gène d'intérêt est placé sous la dépendance d'éléments assurant son expression m vivo ; - un matériel biologique pour la préparation d'une composition pharmaceutique ou vaccinale, comprenant au moins une cellule, notamment une cellule ne produisant pas naturellement des anticorps, sous une forme permettant son administration dans un organisme mammifère, humain ou animal, ainsi qu'éventuellement sa culture préalable, ladite cellule étant génétiquement modifiée m vi tro par au moins une séquence d'acide nucléique ou par au moins un fragment nucléotidique ou par au moins une molécule d'ADN ou par au moins un vecteur de l'invention, lesdits séquence d'acide nucléique, fragment nucléotidique, molécule d'ADN et gène du vecteur codant m vi vo pour au moins un polypeptide ou un fragment peptidique de l'invention ou codant pour au moins tout ou partie d'un anticorps qu est capable de se lier à un polypeptide ou fragment peptidique de l'invention ou codant pour au moins une molécule inhibitrice de la fonction et/ou de la fixation et/ou de l'expression d'au moins un polypeptide ou d' un fragment peptidique ; une composition thérapeutique ou vaccinale comprenant ledit matériel biologique ; - une cellule génétiquement modifiée, en particulier choisie parmi les cellules d' eucaryotes, telles que les cellules COS, CHO, Vero, BHK, PK 15, RK 13 ; les lignées cellulaires humaines de l' osteosarcorme, les lignées cellulaires humaines HeLa et les lignées cellulaires humâmes de l'hépatome, les lignées cellulaires d' insecte ; les cellules d' eucaryotes inférieurs, telles que les cellules de levure, en particulier les cellules issues de Saccharomyces, Schizosaccharomyces,
Kl uveromyces, Hanseluna, Yarowia, Schwaniomyces,
Zygosaccharomyces et Pichia , et de préférence choisi parmi les cellules de Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carl sbergensi s, Schi zosaccharomyces po be, Kluveromyces lactis et de Pichia pastoπs ; les cellules de procaryotes, telles que celles issues de E . col ; lesdites cellules étant transformées par au moins une séquence d'acide nucléique ou par au moins un fragment nucléotidique ou par une molécule d'ADN ou par un vecteur de l'invention; et une composition pharmaceutique ou vaccinale comprenant une telle cellule. Les compositions pharmaceutiques définies ci-dessus sont des compositions vaccinales a ADN particulièrement avantageuses, en particulier par rapport aux compositions vaccinales " classiques " a base de protéine recombinante. En effet, l'utilisation a visée vaccinale de protéines recombinantes est un système lourd et onéreux, notamment parce qu'il exige de très importantes étapes de purification des antigènes recombinants. De plus, une des difficultés rencontrées est d'obtenir une persistance du vaccin suffisamment longue pour maintenir une bonne mémoire immunitaire. Au contraire, la méthode de vaccination par l'ADN, dont les avantages sont inhérents aux propriétés intrinsèques de l'ADN, est simple et peu coûteuse et est effectuée simplement par injection intramusculaire ou intradermique. De plus, il convient de noter que : - les vaccins a ADN sont non infectieux/non réplicatifs, - que du fait que l'immunisation par l'ADN est une forme de transfection m vi vo, l'antigène viral est exprimé dans les cellules mammifères sous sa conformation native, - comme dans le cas d'une infection virale, une large réponse immune, a la fois humorale et cellulaire est induite, et que - de plus, les vaccins à ADN peuvent facilement être combinés en raison de leur homogénéité physico-chimique. Enfin, l'invention a pour objet un procédé d'évaluation d'un agent thérapeutique selon lequel on administre à un animal des doses déterminées, en une dose ou en des doses répétées et à des intervalles de temps déterminés, au moins un polypeptide ou un fragment peptidique de l'invention, naturel, recombinant ou de synthèse, ou encore obtenu à partir d'un échantillon biologique éventuellement après un traitement préalable dudit échantillon biologique infecté par le virus HXHV, on prélève un échantillon biologique de l'animal, de préférence du sang ou du sérum et on réalise : (i) un dosage d'anticorps spécifique (s) du polypeptide ou du fragment polypeptidique ; et/ou - (n) un dosage de la réponse immune cellulaire induite contre le polypeptide ou le fragment polypeptidique, par exemple par un test d' activation in vi tro de cellules lymphocytes T " helper " spécifique (s) du polypeptide ou du fragment polypeptidique. Figure : La figure représente le séquençage partiel de la bande d'environ 1,3 Kb. Dans la figure, le positionnement du fragment d'environ 200 paires de bases non séquence est représenté par les symboles (-) .Dans la figure, les fragments nucléotidiques indiqués en gras correspondent à des fragments nucléotidiques présentant une homologie ou identité de séquence avec SEQ ID NO : 1 de 100%. Leur positionnement respectifs par rapport à SEQ ID NO : 1 sont les suivants : 253-233, 254-273, 273-254.
Exemples Exemple 1 : Extraction et extension Les acides nucléiques ont été extraits a partir de
140 μl d'un échantillon de sérum d'un patient caractérisé comme étant HXHV positif par amplifications par PCR
(Polymerase Chain Reaction) , comme décrit dans la demande de brevet PCT/FR02/04578, en utilisant le kit QIAamp Viral mini spin Kit (nom commercial) de la société Qiagen, en suivant le protocole préconisé par le fournisseur. Une amorce biotinylée (Comp S6M13-bιotm) , dont la séquence est représentée ci-dessous, a ensuite été utilisée pour allonger la séquence SEQ ID NO : 1 d'intérêt. L'amorce biotinylée anti-sens utilisée correspond aux nucléotides 494-475 de SEQ ID NO : 1. amorce anti-sens Comp S6M13: 5'-GCACTGCCGAGTTACATGGC-3' (SEQ ID NO :) Pour l'extension, le kit GENEA p XL PCR Kit (nom commercial) de la société Roche a été utilisé en respectant le protocole préconisé par le fournisseur. La composition du mélange réactionnel de 50 μl est la suivante : 25 mM Mg(0AC)2 2, 4 μl dNTPs 2,5 mM de chaque 4,0 μl amorce Comp S6M13 2,0 μl (20 pico moles) 3.3X XL Buffer II 15,1 μl rTth ADN polymerase (2 u/μl) 0,5 μl (1 u) Matrice ADN 10 μl Eau distillée 16 μl L'extension a été réalisée selon le programme suivant : Le mélange réactionnel a été chauffé à 92 °C pendant 2 minutes et soumis ensuite à 35 cycles, chaque cycle comprenant un chauffage à 92°C pendant 30 secondes, un chauffage à 55°C pendant 30 secondes et un chauffage à 68°C pendant 3 minutes. L'extension finale a été réalisée par chauffage à 68 °C pendant 10 minutes suivi d'un refroidissement à 4°C.
Exemple 2 : Capture de l'ADN double brin étendu. Le produit d'extension obtenu selon le protocole décrit dans l'exemple 1 a été isolé en utilisant le kit Dynabeads Kilobase BINDER (nom commercial) de la société Dynal, en suivant les instructions du fournisseur. Les billes (5 μl) ont premièrement été lavées deux fois dans le tampon Binding Buffer et resuspendues dans 20 μl de ce tampon. Un aliquot de 20 μl du produit d'extension a été ajouté et incubé pendant 3 heures a température ambiante sur un rouleau pour conserver les billes en suspension. L'ADN double brin a été purifie par deux lavages avec un tampon de lavage et un lavage à l'eau distillée et les billes ont ensuite été resuspendues dans 20 μl d' esu distillée et conservée a 4°C.
Exemple 3 : Digestion et circularisation. 5 μl de l'ADN double brin, capturé selon l'exemple 2, ont été digères par l'enzyme Bsa WI (NEB) , dont le site de clivage correspondait à la position 299 de SEQ ID NO : 1, par chauffage à 60°C pendant 2 heures. L'enzyme a ensuite été mactivée par chauffage à 80°C pendant 20 minutes. Apres quoi, le tube a été refroidi lentement et l'ADN digéré a été purifié en utilisant le kit QIA quick PCR purification Kit (nom commercial) de la société Qiagen. L'ADN purifié a ensuite été soumis a ligation à 4°C pendant une nuit en utilisant la ligase 14 commercialisée par la société Roche et la ligation a été achevée par chauffage a 65°C pendant 10 minutes.
Exemple 4 : Amplification. 10 μl du produit de ligation obtenu selon l'exemple 3 ont été utilisés comme matrice pour réaliser une PCR semi- nichée en utilisant le kit GeneAmp XL PCR Kit (nom commercial) de la société Roche. Les deux tours de PCR ont été réalisés de la même la façon, selon le protocole suivant : Le mélange réactionnel a été chauffé a 9 °C pendant 2 minutes et soumis ensuite à 35 cycles, chaque cycle comprenant un chauffage à 9 °C pendant 30 secondes, un chauffage à 47°C pendant 30 secondes et un chauffage à 68°C pendant 3 minutes. Le mélange réactionnel a ensuite été soumis à un chauffage à 68 °C pendant 10 minutes suivi d'un refroidissement a 4°C. Premier tour de PCR : Composition du mélange réactionnel (50 μl) : 25 mM Mg(OAC)2 2, 4 μl dNTPs 2,5 mM de chaque 4,0 μl amorce 1M13 sens (25μM) 1, 0 μl amorce CIRC 1 anti-sens (25 μM) 1,0 μl 3.3X XL Buffer II 15,1 μl rTth ADN polymerase (2 u/μl) 0,5 μl (1 u) Matrice ADN 10 μl Eau 16 μl Les couples d'amorces suivants ont été utilisés : Amorce sens (1M13) : 5' -CCCGCCCCGCTGATGAAAAG-3' (SEQ ID NO : 31) Amorce anti-sens (CIRC 1) 5'-GCGATGGTTGAGTCTCGACTA-3' (SEQ ID NO: 32) Deuxième tour de PCR : Composition du mélange réactionnel (50 μl) : 25 mM Mg(OAC)2 2,4 μl dNTPs 2,5 M de chaque 4,0 μl amorce 1M13 sens (25μM) 1,0 μl amorce 6BRACE5' anti-sens (25 μM) 1,0 μl 3.3X XL Buffer II 15,1 μl rTth ADN polymerase (2 u/μl) 0,5 μl (1 u) Produit du leι tour 10 μl Eau 16 μl
Les couples d'amorces suivants ont été utilisés : Amorce sens (1M13) : 5' -CCCGCCCCGCTGATGAAAAG-3' (SEQ ID NO : 31) Amorce antisens (6BRACE5'): 5'-AGGTAGCAGGCGATATC-3' (SEQ ID NO: 33) Les localisations des amorces dans la séquence XH (SEQ ID NO : 1) sont respectivement les suivantes : 1M13 : 254-273 CIR 1 : 253-233 6BRACE5' 94-77
Exemple 5 : Electrophorèse sur gel d' agarose et hybridation . Les produits d'amplification obtenus selon l'exemple 4 ont été séparés par électrophorèse sur gel d'agarose 1,5%. Trois bandes dont les tailles étaient comprises entre 1,2 Kb et 2,5 Kb ont été observées sur le gel. Les produits amplifiés ont été transférés sur une membrane de nylon Hybond-N+ (nom commercial) (Amersham Biosciences UK limited) . La membrane a été hybridée à 42 °C pendant une nuit avec le fragment XH complet marqué à son extrémité 3' au 3ZP (généré en utilisant le kit Ready to Go DNA Labelling beads (nom commercial) de la société Amersham Pharmacia Biotech Inc.). Les lavages suivants ont été réalisés à 65°C : 2X SSC, 15 minutes, deux fois ; IX SSC, 15 minutes, deux fois ; 0,5X SSC, 15 minutes, deux fois. La membrane a été soumise à autoradiographie à -80°C pendant une nuit. Les trois bandes présentaient des signaux faibles sur le film-X après développement.
Exemple 6 : Clonage et séquençage. Les trois bandes ont respectivement été clonées dans le vecteur pCR2.1-T0P0 (Invitrogen) . Les clones ont ensuite été criblés par hybridation sur colonies et identifies en utilisant l'enzymze EcoRI (Gibco BRL). Les clones positifs ont été sélectionnés pour être séquences. Les résultats du séquençage ont mis en évidence un fragment de 1133 paires de bases. La recherche effectuée dans les banques des bases de données n' a montré aucune homologie de séquences significative. Le fragment de 1133 paires de bases est référencé dans l'identificateur de séquences en SEQ ID NOs : 2 et 3. Il est également représenté à la figure.
Exemple 7 : Répétition En utilisant le même produit de digestion et de circularisation décrit dans l'exemple 3, une nouvelle amplification a été réalisée selon le protocole décrit dans l'exemple 4, suivi d'une électrophorèse sur gel d'agarose et de la procédure d'hybridation décrites dans l'exemple 5. Dans cet essai, une seule bande dont la taille était d'environ 1,3 Kb a été observée sur le gel. Après clonage et séquençage, comme décrit dans l'exemple 6, un fragment de 1133 paires de bases correspondant au fragment décrit dans l'exemple 6 (SEQ ID NOs : 2, 3 et figure) a été obtenu.
La pertinence de ce fragment de 1133 paires de bases par rapport au virus HXHV a été vérifiée comme décrit ci- dessous. Dû aux limitations inhérentes au séquençage utilisé, la séquence de la bande d'environ 1,3 Kb visualisée sur gel s'est révélée être incomplète. En effet, un fragment d'environ 1300 paires de bases était attendu. Aussi, les présents inventeurs ont alors réalisé, avec une nouvelle procédure, un séquençage complet de la bande d'environ 1,3 Kb, comme décrit ci-dessous. La partie non séquencée dans le séquençage initial qui correspond à un fragment d'environ 200 paires de bases est représenté, pour sa localisation, dans la figure par les symboles (-) . Le premier fragment séquence est représenté en SEQ ID NO : 2 et le deuxième fragment séquence est représenté en SEQ ID NO : 3 dans l'identificateur de séquences.
Exemple 8 : Pertinence du fragment de 1133 paires de bases . Pour vérifier la pertinence du fragment de 1133 paires de bases par rapport au virus HXHV, des PCR nichées ont été réalisées en parallèle.
• A partir de fractions obtenues sur gradient de sucrose de 17 sérums, dont 10 étaient positifs pour l'0RF4 du virus HXHV décrite dans la demande de brevet PCT/FR02/04578 et 7 étaient négatifs pour cette même ORF4, les acides nucléiques ont été extraits et des PCR nichées ont été effectuées selon le protocole suivant en utilisant la Taq ADN polymerase de la société Promega : Le mélange réactionnel a été chauffé à 94 °C pendant 5 minutes et soumis ensuite à 35 cycles, chaque cycle comprenant un chauffage à 94°C pendant 45 secondes, un chauffage à 43°C pendant 45 secondes et un chauffage a 72°C pendant 1 minute. Le mélange réactionnel a ensuite été soumis à un chauffage à 72 °C pendant 10 minutes suivi d'un refroidissement à 4°C.
Premier tour de PCR : Composition du mélange réactionnel (50 μl) : Tampon Taq avec MgC12 10X 5,0 μl dNTPs 10 mM de chaque 2,0 μl amorce XF4 sens (25μM) 1,0 μl amorce XB12 anti-sens (25 μM) 1,0 μl Taq ADN polymerase (5 u/μl) 0,5 μl Matrice ADN 10 μl Eau 30,5 μl
Les couples d'amorces suivants ont été utilisés
Amorce sens (XF4) : 5 ' CCTTCTGGAGAGGGATTTC 3 ' ( SEQ ID NO : 34 ) Amorce ant i-sens ( XB12 ) 5' TGTTACCTGCTACTTCGTGC 3' (SEQ ID NO. 35)
Deuxième tour de PCR : Composition du mélange réactionnel (50 μl) : Tampon Taq avec MgC12 10X 5,0 μl dNTPs 10 mM de chaque 2,0 μl amorce XF1 sens (25μM) 1,0 μl amorce XBl anti-sens (25 μM) 1,0 μl Taq ADN polymerase (5 u/μl) 0,5 μl Produit du 1er tour 10 μl Eau 35,5 μl Les couples d'amorces suivants ont été utilisés : Amorce sens (XF1) : 5' TAGAGTTGCGAGGCGTGACC 3' (SEQ ID NO : 36) Amorce antisens (XBl) : 5' CCTTATCCAGTGGCTTTTGGC 3' (SEQID NO: 37)
Les localisations des amorces dans la séquence SEQ ID NO : 4 sont respectivement les suivantes : XF4: 482-500 XB12: 1255-1236 XF1: 944-963 XBl: 1186-1166
Les produits d'amplification obtenus selon l'exemple 4 ont été séparés par électrophorèse sur gel d'agarose 1,5%. Les produits amplifiés ont été transférés sur une membrane de nylon Hybond-N+ (nom commercial) (Amersham Biosciences UK limited) . La membrane a été hybπdée à 42°C pendant une nuit avec le produit du 2eme tour de PCR marqué à son extrémité 3' au 32P . Le produit du tour 2 a été purifié avec le kit Qiaqick Gel Extraction Kit (nom commercial) et marqué en utilisant le kit Ready to Go DNA Labelling beads (nom commercial) de la société Amersham Pharmacia Biotech Inc.) Les lavages suivants ont été réalisés à 65°C : 2X SSC, 15 minutes, deux fois ; IX SSC, 15 minutes, deux fois ; 0,5X SSC, 15 minutes, deux fois. La membrane a été soumise à autoradiographie à -80°C pendant une nuit .
La bande de taille attendue d'environ 240 paires de bases est retrouvée dans les acides nucléiques amplifiés de 3 fractions sur les 10 qui étaient positives pour l'0RF4 du virus HXHV. Aucune bande n'a été révélée pour les 7 fractions qui étaient négatives pour 1ORF4 du virus HXHV. • Les acides nucléiques extraits de 15 sérums de patients Non A-E, dont 9 étaient positifs pour l'0RF4 de HXHV et 6 étaient négatifs pour cette même ORF ont été amplifiés par PCR nichée avec le même protocole que celui décrit ci-dessus. Les produits amplifiés obtenus ont ensuite été séparés par électrophorèse sur gel d'agarose, les membranes ont été hybπdées et les bandes ont été révélées par autoradiographie selon le même protocole que celui décrit ci-dessus. La bande de taille attendue d'environ 240 paires de bases est retrouvée dans les acides nucléiques amplifiés de 3 sérums sur les 9 qui étaient positifs pour l'ORF4 du virus HXHV. Aucune bande n'a été révélée pour les 6 sérums qui étaient négatifs pour 1ORF4 du virus HXHV. Les résultats obtenus à partir de fractions de sérums et de sérums confirment donc que la séquence de 1133 paires de bases est associée au virus HXHV.
Exemple 9 : Séquençage complet de la bande d'environ 1,3 Kb. Les produits PCR ont été purifiés par digestion enzymatique (Enzyme Exosup - nom commercial) . La quantification des acides nucléiques a été réalisée par dosage fluorométπque. La réaction de séquençage a été réalisée grâce a une réaction enzymatique en présence d'une amorce spécifique de la région à séquencer. Les produits ont ensuite été injectés dans le séquenceur Apply Biosyste 3730 XL (nom commercial) . La séquence ADN obtenue est une séquence de 1314 paires de bases représentée en SEQ ID NO : 4.

Claims

REVENDICATIONS
1. Séquence d'acide nucléique isolée susceptible d'être obtenue à partir du génome du virus HXHV, ladite séquence d'acide nucléique comprenant la séquence SEQ ID NO : 4 ou la séquence complémentaire de SEQ ID NO : 4.
2. Séquence d'acide nucléique isolée susceptible d'être obtenue à partir du génome du virus HXHV, ladite séquence d'acide nucléique consistant en la séquence SEQ ID NO : 4 ou en la séquence complémentaire de SEQ ID NO : 4.
3. Fragment nucléotidique d'ADN, caractérisé en ce qu'il comprend ou consiste en une séquence nucléotidique d'au moins 12 nucléotides contigus appartenant à SEQ ID NO : 4 ou à son complémentaire.
4. Fragment selon la revendication 3, caractérise en ce qu'il comprend ou consiste en une séquence d'au moins 15 nucléotides contigus appartenant à SEQ ID NO : 4 ou à son complémentaire.
5. Fragment selon la revendication 3 ou 4, caractérisé en ce qu'il comprend ou consiste en une séquence d'au moins 18 nucléotides contigus appartenant à SEQ ID NO : 4 ou à son complémentaire.
6. Fragment selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend ou consiste en une séquence d'au moins 20, 21, 22, 23, 24, 27, 30, 33,36, 39, 42, 45, 48 51 ou 54 nucléotides contigus appartenant à SEQ ID NO : 4 ou a son complémentaire.
7. Fragment nucléotidique d'ADN, caractérisé en ce qu'il comprend ou consiste en une séquence nucléotidique qui sur au moins 12 nucléotides contigus présente au moins 90% d'identité, de préférence au moins 95% d'identité et avantageusement au moins 98% ou 99% d'identité avec la SEQ ID NO : 4 ou avec la séquence complémentaire de SEQ ID NO : 4, à l'exclusion des séquences TAGTCGAGACTCAACCATCGC et CCCGCCCCGCTGATGAAAAG et des séquences nucléotidiques complémentaires desdites séquences.
8. Fragment nucléotidique d'ADN, caractérisé en ce qu'il comprend ou consiste en une séquence nucléotidique qui sur au moins 15 nucléotides contigus présente au moins 90% d'identité, de préférence au moins 95% d'identité et avantageusement au moins 98% ou 99% d'identité avec la SEQ ID NO : 4 ou avec la séquence complémentaire de SEQ ID NO : 4, à l'exclusion des séquences TAGTCGAGACTCAACCATCGC et CCCGCCCCGCTGATGAAAAG, et des séquences nucléotidiques complémentaires desdites séquences.
9. Fragment nucléotidique d'ADN, caractérisé en ce qu'il comprend ou consiste en une séquence nucléotidique qui sur au moins 18 nucléotides contigus présente au moins 90% d'identité, de préférence au moins 95% d'identité et avantageusement au moins 98% ou 99% d' identité avec la SEQ ID NO : 4 ou avec la séquence complémentaire de SEQ ID NO : 4, à l'exclusion des séquences TAGTCGAGACTCAACCATCGC et CCCGCCCCGCTGATGAAAAG, et des séquences nucléotidiques complémentaires desdites séquences.
10. Fragment nucléotidique d'ADN, caractérisé en ce qu'il comprend ou consiste en une séquence nucléotidique qui sur au moins 20, 21, 22, 23, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51 ou 54 nucléotides contigus présente au moins 90% d'identité, de préférence au moins 95% d'identité et avantageusement au moins 98% ou 99%d' identité avec la SEQ ID NO : 4 ou avec la séquence complémentaire de SEQ ID NO : 4, à l'exclusion des séquences TAGTCGAGACTCAACCATCGC et CCCGCCCCGCTGATGAAAAG, et des séquences nucléotidiques complémentaires desdites séquences .
11. Fragment selon l'une quelconque des revendications 3 à 10, caractérisé en ce que lesdits nucléotides contigus appartiennent au segment commençant au nucléotide 2 et se terminant au nucléotide 286 de SEQ ID NO : 4 ou fragment complémentaire dudit fragment.
12. Fragment selon l'une quelconque des revendications 3 à 10, caractérisé en ce que lesdits nucléotides contigus appartiennent au segment commençant au nucléotide 4 et se terminant au nucléotide 144 de SEQ ID NO : 4 ou fragment complémentaire dudit fragment.
13. Fragment selon l'une quelconque des revendications 3 à 10, caractérisé en ce que lesdits nucléotides contiqus appartiennent au segment commençant au nucléotide 180 et se terminant au nucléotide 1004 de SEQ ID NO : 4 ou fragment complémentaire dudit fragment.
14. Fragment selon l'une quelconque des revendications 3 à 10, caractérisé en ce que lesdits nucléotides contigus appartiennent au segment commençant au nucléotide 614 et se terminant au nucléotide 820 de SEQ ID NO : 4 ou fragment complémentaire dudit fragment.
15. Fragment selon l'une quelconque des revendications 3 à 10, caractérisé en ce que lesdits nucléotides contigus appartiennent au segment commençant au nucléotide 1228 et se terminant au nucléotide 1314 de SEQ ID NO : 4 ou fragment complémentaire dudit fragment.
16. Fragment selon l'une quelconque des revendications 3 à 10, caractérisé en ce que lesdits nucléotides contigus appartiennent au segment commençant au nucléotide 1283 et se terminant au nucléotide 1197 de la séquence complémentaire de SEQ ID NO : 4 ou fragment complémentaire dudit fragment.
17. Fragment selon l'une quelconque des revendications 3 à 10, caractérisé en ce que lesdits nucléotides contigus appartiennent au segment commençant au nucléotide 1264 et se terminant au nucléotide 1067 de la séquence complémentaire de SEQ ID NO : 4 ou fragment complémentaire dudit fragment.
18. Fragment selon l'une quelconque des revendications 3 à 10, caractérisé en ce que lesdits nucléotides contigus appartiennent au segment commençant au nucléotide 1209 et se terminant au nucléotide 1099 de la séquence complémentaire de SEQ ID NO : 4 ou fragment complémentaire dudit fragment.
19. Fragment selon l'une quelconque des revendications 3 à 10, caractérisé en ce que lesdits nucléotides contigus appartiennent au segment commençant au nucléotide 819 et se terminant au nucléotide 736 de la séquence complémentaire de SEQ ID NO : 4 ou fragment complémentaire dudit fragment.
20. Fragment selon l'une quelconque des revendications 3 à 10, caractérisé en ce que lesdits nucléotides contigus appartiennent au segment commençant au nucléotide 800 et se terminant au nucléotide 6 de la séquence complémentaire de SEQ ID NO : 4 ou fragment complémentaire dudit fragment.
21. Fragment selon l'une quelconque des revendications 3 à 10, caractérisé en ce que lesdits nucléotides contigus appartiennent au segment commençant au nucléotide 784 et se terminant au nucléotide 629 de la séquence complémentaire de SEQ ID NO : 4 ou fragment complémentaire dudit fragment.
22. Fragment selon l'une quelconque des revendications 3 à 10, caractérisé en ce que lesdits nucléotides contigus appartiennent au segment commençant au nucléotide 610 et se terminant au nucléotide 410 de la séquence complémentaire de SEQ ID NO : 4 ou fragment complémentaire dudit fragment.
23. Fragment selon l'une quelconque des revendications 3 à 10, caractérisé en ce que lesdits nucléotides contigus appartiennent au segment commençant au nucléotide 391 et se terminant au nucléotide 221 de la séquence complémentaire de SEQ ID NO : 4 ou fragment complémentaire dudit fragment.
24. Fragment selon l'une quelconque des revendications 3 à 6, caractérisé en ce qu'il comprend ou consiste en l'une quelconque des séquences SEQ ID NOs 5 a 17 ou l'une quelconque des séquences complémentaires des séquences SEQ ID Nos 5 à 17.
25. Produit de transcription d'une séquence telle que définie dans l'une quelconque des revendications 1 et 2 ou d'un fragment tel que défini dans l'une quelconque des revendications 3 à 24.
26. Molécule d'ADN, caractérisée en ce qu'elle comprend ou consiste en une séquence telle que définie dans l'une quelconque des revendications 1 et 2 ou un fragment tel que défini à l'une quelconque des revendications 3 à 24.
27. Molécule d'ARN, caractérisée en ce qu'elle comprend ou consiste en un produit de transcription d'une molécule d'ADN telle que définie à la revendication 26.
28. Polypeptide dont la séquence polypeptidique est codée par une séquence telle que définie dans l'une quelconque des revendications 1 et 2 ou par un fragment tel que défini dans l'une quelconque des revendications 3 à 24.
29. Polypeptide selon la revendication 28, dont la séquence polypeptidique comprend ou consiste en l'une quelconque des séquences SEQ ID NO : 18 à 30 ou en une séquence polypeptidique équivalente à l'une quelconque des séquences SEQ ID NO : 18 à 30 dans laquelle d) les acides aminés alanme, proline, glycine sont des équivalents, (n) les acides aminés acide aspartique, acide glutamique sont des équivalents, (m) les acides aminés histidine, lysine, arginine sont des équivalents, (îv) les acides aminés asparagme, glutamine, senne, thréonine sont des équivalents, (v) les acides aminés phenylalanme, tyrosine, tryptophane sont des équivalents et (vi) les acides aminés isoleucine, leucme, valme, methionine sont des équivalents.
30. Fragment polypeptidique selon la revendication 28, comprenant ou consistant en une séquence peptidique d'au moins 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou acides aminés appartenant à l'une quelconque des séquences SEQ ID NOs : 18 à 30 ou à une séquence équivalente a l'une quelconque des séquences SEQ ID NO :
18 à 30 dans laquelle (î) les acides aminés alanine, proline, glycine sont des équivalents, (ιi) les acides aminés acide aspartique, acide glutamique sont des équivalents, (m) les acides aminés histidine, lysine, arginine sont des équivalents, (iv) les acides aminés asparagme, glutamine, serine, thréonine sont des équivalents, (v) les acides aminés phenylalanme, tyrosine, tryptophane sont des équivalents et (vi) les acides aminés isoleucine, leucine, valme, methionine sont des équivalents.
31. Epitope caractérisé en ce qu'il comprend ou consiste en une séquence peptidique d'au moins 6, 8, 9,
10, 12, 15 ou 18 acides aminés et au plus de 10, 12, 15 ou 18 acides aminés, en particulier en ce que sa séquence consiste en une séquence peptidique de 6 à 10 acides aminés, de 6 à 12 acides aminés, de 6 à 15 acides aminés, de 6 à 18 acides aminés, de 8 a 10 acides aminés, de 8 à 12 acides aminés, de 8 à 15 acides aminés, de 8 à 18 acides aminés et de 15 à 18 acides aminés de l'une quelconque des séquences représentées en SEQ ID NO : 18 à 30 ou d'une séquence polypeptidique fonctionnellement équivalente auxdites séquences SEQ ID NO : 18 à 30.
32. Cassette d'expression fonctionnelle dans une cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote, permettant l'expression d'une séquence d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, ou d'un fragment selon l'une quelconque des revendications 3 à 24, ou d'une molécule d'ADN selon la revendications 26, placée sous le contrôle des éléments nécessaires a son expression .
33. Vecteur comprenant une cassette d'expression selon la revendication 32.
34. Cellule issue d'un organisme eucaryote ou procaryote comprenant une cassette d'expression selon la revendication 32 ou un vecteur d'expression selon la revendication 33.
35. Cellule selon la revendication 34, caractérisée en ce qu'elle est issue d'un organisme eucaryote, en particulier les cellules provenant d'animaux tels que les mammifères, les reptiles, les insectes, de préférence les cellules choisies parmi les cellules COS, CHO, Vero, BHK, PK 15, RK 13 ; les lignées cellulaires humaines de
1' ostéosarcor e, les lignées cellulaires humaines HeLa et les lignées cellulaires humaines de l'hépatome ; les lignées cellulaires d' insecte.
36. Cellule selon la revendication 34, caractérisée en ce qu'elle est issue d'un organisme eucaryote inférieur, en particulier issue de levures, telles que Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluveromyces,
Hanseluna , Yarowia, Schwamo yces, Zygosaccharomyces et Pichia, et de préférence choisi parmi les cellules de Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Schizosaccharomyces pombe, Kluveromyces lactis et de Pichia pastoπs .
37. Cellule selon la revendication 34, caractérisée en ce qu'elle est issue d'un organisme procaryote de préférence E. coll .
38. Polypeptide susceptible d'être produit par une cassette d'expression selon la revendication 32, un vecteur selon la revendication 33, ou une cellule selon l'une quelconque des revendications 34 à 37.
39. Procédé pour préparer un polypeptide selon la revendication 28 ou 29 ou un fragment peptidique selon la revendication 30, selon lequel on cultive une cellule hôte telle que définie a l'une quelconque des revendications 34 à 37 dans un milieu de culture approprié, et on purifie ledit polypeptide ou ledit fragment peptidique produit jusqu'à un degré de pureté requis.
40. Polypeptide immunogène comprenant ou consistant en un polypeptide tel que défini à la revendication 28 ou 29 ou un fragment peptidique tel que défini à la revendication 30.
41. Anticorps monoclonal ou polyclonal susceptible d'être obtenu par immunisation d'un animal mammifère avec un polypeptide immunogène tel que défini dans la revendication 40.
42. Composition diagnostique, caractérisée en ce qu'elle comprend un polypeptide tel que défini à la revendication 28 ou 29 ou un fragment polypeptidique tel que défini à la revendication 30.
43. Composition diagnostique, caractérisée en ce qu'elle comprend un anticorps monoclonal ou un anticorps polyclonal tel que défini dans la revendication 41.
44. Procédé pour détecter des anticorps dirigés contre le virus HXHV ou au moins un polypeptide tel que défini à la revendication 28 ou 29 ou un fragment peptidique tel que défini dans la revendications 30, selon lequel on met en contact un échantillon biologique d'un patient suspecté être infecté par le virus HXHV avec une composition diagnostique telle que définie dans la revendication 42, dans des conditions prédéterminées qui permettent la formation de complexes anticorps/antigène et on détecte la formation desdits complexes.
45. Procédé pour détecter un polypeptide tel que défini à la revendication 28 ou 29 ou un fragment peptidique tel que défini à la revendication 30, dans un échantillon biologique d'un patient suspecté être infecté par le virus HXHV, selon lequel on met en contact l'échantillon biologique avec une composition diagnostique telle que définie dans la revendication 43, dans des conditions prédéterminées qui permettent la formation de complexes anticorps/antigène et on détecte la formation desdits complexes.
46. Composition immunogène ou vaccinale, caractérisée en ce qu'elle comprend un polypeptide tel que défini à la revendication 28 ou 29 ou un fragment peptidique tel que défini dans la revendication 30, associé à un véhicule et/ou adjuvant et/ou diluant approprié et/ou à un excipient pharmaceutiquement acceptable.
47. Sonde d'au moins 12 nucléotides, caractérisée en ce qu'elle est susceptible de s'hybrider à une séquence d' acide nucléique telle que définie dans la revendication 1 ou 2, ou à un fragment nucléotidique tel que défini dans l'une quelconque des revendications 3 à 24, ou à une molécule d'ADN ou d'ARN telle que définie dans les revendications 26 ou 27, l'hybridation étant réalisée dans des conditions de strmgence déterminées.
48. Amorce d'au moins 12 nucléotides, caractérisée en ce qu'elle est susceptible de s'hybrider à une séquence d' acide nucléique telle que définie dans la revendication 1 ou 2 , ou à un fragment nucléotidique tel que défini dans l'une quelconque des revendications 3 à 24, ou à une molécule d'ADN ou d'ARN telle que définie dans la revendication 26 ou 27 l'hybridation étant réalisée dans des conditions de strmgence déterminées.
49. Amorce selon la revendication 48, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les amorces SEQ ID Nos 32 à 37.
50. Couple d'amorces selon la revendication 48, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi un des couples suivants : SEQ ID NO : 31 / SEQ ID NO : 32, SEQ ID NO : 31 / SEQ ID NO : 33, SEQ ID NO : 34 / SEQ ID NO : 35, , SEQ ID NO : 36 / SEQ ID NO : 37.
51. Anticorps anti-acide nucléique, caractérisé en ce qu'il est susceptible de se lier à une séquence d'acide nucléique telle que définie dans la revendication 1 ou 2, ou a un fragment nucléotidique tel que défini dans l'une quelconque des revendications 3 à 24, ou à une molécule d'ADN ou d'ARN telle que définie dans la revendication 26 ou 27.
52. Composition diagnostique, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une sonde ou au moins une amorce ou au moins un couple d'amorces ou un anticorps anti-acide nucléique tel (le) que défini (e) dans les revendications 47, 48, 49, 50 ou 51.
53. Procédé de détection d'un ADN ou d'un ARN viral, dans un échantillon biologique d'un patient suspecté être infecté par le virus HXHV, selon lequel on traite si nécessaire ledit échantillon pour en extraire l'ADN ou l'ARN, on met en contact ledit ADN ou ARN avec au moins une sonde ou avec au moins une amorce ou avec au moins un couple d'amorces tel (le) que défini (e) dans les revendications 47, 48, 49 ou 50, dans des conditions de strmgence déterminées, et on détecte la présence d'ADN ou d'ARN viral dans l'échantillon soit par mise en évidence d'une hybridation dudit ADN ou ARN viral avec au moins une sonde telle que définie dans la revendication 47, soit par amplification dudit ADN ou ARN à l'aide d'au moins une amorce telle que définie dans la revendication 48 ou 49 ou d' au moins un couple d' amorces tel que défini dans la revendication 50.
54. Procédé de détection d'ADN et/ou d'ARN viral du virus HXHV, selon lequel on prélève un échantillon biologique, tel que du sérum, plasma ou sang d'un patient, on traite si nécessaire ledit échantillon pour en extraite l'ADN et/ou l'ARN, on met en contact ledit échantillon avec au moins un anticorps anti-acide nucléique tel que défini dans la revendication 51, ledit anticorps étant éventuellement marqué par tout marqueur approprié et on met en évidence la formation d'un complexe acide nucléique/anticorps .
55. Composition vaccinale comprenant une séquence d'ADN codant pour au moins un polypeptide tel que défini dans la revendication 28 ou 29 ou codant pour au moins un fragment peptidique tel que défini dans la revendication 30, ledit ADN étant mélangé avec un véhicule et/ou un diluant et/ou un excipient pharmaceutiquement acceptable.
56. Vecteur comprenant au moins un gène d'intérêt thérapeutique ou vaccinal, ledit gène codant notamment au moins pour un polypeptide ou un fragment peptidique tel que défini dans l'une quelconque des revendications 28, 29 et 30.
57. Composition thérapeutique ou vaccinale, caractérisée en ce qu'elle comprend un vecteur tel que défini dans la revendication 56 et en ce que ledit gène d'intérêt est placé sous la dépendance d'éléments assurant son expression m v vo .
58. Cellule génétiquement modifiée, en particulier choisie parmi les cellules d' eucaryotes, telles que les cellules COS, CHO, Vero, BHK, PK 15, RK 13 ; les lignées cellulaires humâmes de l' ostéosarcorme, les lignées cellulaires humaines HeLa et les lignées cellulaires humaines de l'hépatome, les lignées cellulaires d'insecte ; les cellules d' eucaryotes inférieurs, telles que les cellules de levure, en particulier les cellules issues de Saccharomyces, Schi zosaccharomyces,
Kl uveromyces , Hansel una, Yarowi a, Schwamomyces, Zygosaccharomyces et Pichia , et de préférence choisi parmi les cellules de Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensi s, Schi zosaccharomyces pombe, Kl uveromyces lactis et de Pichia past oπs ; les cellules de procaryotes, telles que celles issues de E. col ; lesdites cellules étant transformées par au moins une séquence d'acide nucléique selon la revendication 1 ou 2 ou par au moins un fragment nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 3 à 24 ou par une molécule d'ADN selon la revendication 26 ou par un vecteur selon la revendication 56.
59. Composition pharmaceutique ou vaccinale, caractérisée en ce qu'elle comprend une cellule telle que définie dans la revendication 58.
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