CA2296736A1 - Epitopes du vrs et anticorps les comportant, utiles dans le diagnostic et la therapie - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne un anticorps polyclonal ou monoclonal dirigé contre un épitope de la protéine G du VRS correspondant à une séquence choisie parmi l'une des séquences peptidiques comprises respectivement entre les résidus d'acides aminés 150-159, 176-189, 194-207 et 155-176 de la séquence totale de la protéine G du VRS A ou B, ou des séquences présentant au moins 98 % d'homologie.
Description
WO 99/03987 PCT/FR98/Oi 570 EPITOPES DU VRS ET ANTICORPS LES COMPORTANT, UTILES DANS LE DIAGNOSTIC ET LA THERAPIE.
La présente invention se rapporte au virus respiratoire sync,ytial, ct plus particulièrement à l'identification de nouveaux épitopcs et aux anticorps correspondants, utiles notamment dans le domaine du traitement, de la prophyla.~cie et du diagnostic des affections provoquées par ce virus.
Le virus Respiratoire syncytial (VRS) est l'un des agents étiologiques les plus fréquemment rencontrés chez le nourrisson et chez les personnes àgées. Les bronchiolites sont souvent graves chez l'enfant et nécessitent l'hospitalisation. Actuellement, il n'existe pas de moyens de prévention contre la maladie due au VRS, Ia première infection au VRS ne prévient pas contre la suivante. Le traitement des cas graves par antibiothcrapie (Ribavirine) et/ou associé avec l'immunothérapie (immunoglobulines humains) ne peuvent pas atténuer l'aggravation de la maladie. Néanmoins, ce type de traitement reste encore très coùteux. Les essais cliniques récents avec les anticorps monoclonaux HNK20 de ORAVAX (dirigés contre la protéine F du VRS) n'ont pas montré d'efficacité du traitement par rapport au placebo contre l'infection du VRS chez l'enfant. Dans les années 60, les tentatives d'immunisation des enfants avec un vaccin VRS inactivé
à la formalise avaient pour conséquence l'aggravation de la maladie au lieu de conférer une protection des poumons contre l'infection naturelle au VRS. Associé à ce problème, les diagnostics actuels ne permettent pas d'identifier de manière fiable L'infection au VRS, au moins chez l'adulte.
Le VRS est classé dans Ia famille des Paramyxoviridae, genre pneumovirus comportant un génome ARN non segmenté, de polarité
négative, codant pour 10 protéines spécifiques.
La présente invention se rapporte au virus respiratoire sync,ytial, ct plus particulièrement à l'identification de nouveaux épitopcs et aux anticorps correspondants, utiles notamment dans le domaine du traitement, de la prophyla.~cie et du diagnostic des affections provoquées par ce virus.
Le virus Respiratoire syncytial (VRS) est l'un des agents étiologiques les plus fréquemment rencontrés chez le nourrisson et chez les personnes àgées. Les bronchiolites sont souvent graves chez l'enfant et nécessitent l'hospitalisation. Actuellement, il n'existe pas de moyens de prévention contre la maladie due au VRS, Ia première infection au VRS ne prévient pas contre la suivante. Le traitement des cas graves par antibiothcrapie (Ribavirine) et/ou associé avec l'immunothérapie (immunoglobulines humains) ne peuvent pas atténuer l'aggravation de la maladie. Néanmoins, ce type de traitement reste encore très coùteux. Les essais cliniques récents avec les anticorps monoclonaux HNK20 de ORAVAX (dirigés contre la protéine F du VRS) n'ont pas montré d'efficacité du traitement par rapport au placebo contre l'infection du VRS chez l'enfant. Dans les années 60, les tentatives d'immunisation des enfants avec un vaccin VRS inactivé
à la formalise avaient pour conséquence l'aggravation de la maladie au lieu de conférer une protection des poumons contre l'infection naturelle au VRS. Associé à ce problème, les diagnostics actuels ne permettent pas d'identifier de manière fiable L'infection au VRS, au moins chez l'adulte.
Le VRS est classé dans Ia famille des Paramyxoviridae, genre pneumovirus comportant un génome ARN non segmenté, de polarité
négative, codant pour 10 protéines spécifiques.
2 La demande WO 87/04185 a proposé d'utiliser des protéines structurales du VRS en vue d'un vaccin, comme les protéines d'enveloppe appelées protéine l' (protéine de fusion) ou protéine G, une glycoprotéine de 22 Kd, une protéine de 9,5 Kd, ou la protéine majeure de capside (protéine N).
La demande WO 89/02935 décrit les propriétés de protection dc la protéine F entière du VRS, éventuellement modifiées sous forme monomérique ou déglycosylée.
Une série de fragments de la protéine F a été clonée en vue de rechercher leurs propriétés neutralisantes.
Dans la demande WO 95/27787, il a été montré que la protéine G
du VRS peut être utile dans la préparation de produits destinés au traitement et/ou à Ia prévention d'affections provoquées par le VRS, sous-groupe A ou B.
Dans le cadre de la présente invention, il a maintenant ctc trouvé
que des fragments de la protéine G du VRS, contenant des épitopes spécifiques, possèdent des propriétés particulièrement avantageuses. De nouveaux fragments peptidiques de la protéine G du VRS peuvent ainsi être préparés, notamment pour les applications suivantes (i) ledit fragment de peptide couplé ou fusionné, par des méthodes chimiques ou par gënie génétique, à un porteur, constitue un vaccin efficace contre l'infection au VRS, quel que soit le mode d'administration ;
(ü) les mémes fragments peptidiques peuvent servir à générer des anticorps polyclonaux et monoclonaux qui sont très efficaces dans les traitements prophylactiques ou thérapeutiques de l'hôte infecté par le VRS ;
(iii) ces fragments peptidiques et les anticorps monoclonaux peuvent ètre utilisés comme réactifs dans un Kit de diagnostic permettant
La demande WO 89/02935 décrit les propriétés de protection dc la protéine F entière du VRS, éventuellement modifiées sous forme monomérique ou déglycosylée.
Une série de fragments de la protéine F a été clonée en vue de rechercher leurs propriétés neutralisantes.
Dans la demande WO 95/27787, il a été montré que la protéine G
du VRS peut être utile dans la préparation de produits destinés au traitement et/ou à Ia prévention d'affections provoquées par le VRS, sous-groupe A ou B.
Dans le cadre de la présente invention, il a maintenant ctc trouvé
que des fragments de la protéine G du VRS, contenant des épitopes spécifiques, possèdent des propriétés particulièrement avantageuses. De nouveaux fragments peptidiques de la protéine G du VRS peuvent ainsi être préparés, notamment pour les applications suivantes (i) ledit fragment de peptide couplé ou fusionné, par des méthodes chimiques ou par gënie génétique, à un porteur, constitue un vaccin efficace contre l'infection au VRS, quel que soit le mode d'administration ;
(ü) les mémes fragments peptidiques peuvent servir à générer des anticorps polyclonaux et monoclonaux qui sont très efficaces dans les traitements prophylactiques ou thérapeutiques de l'hôte infecté par le VRS ;
(iii) ces fragments peptidiques et les anticorps monoclonaux peuvent ètre utilisés comme réactifs dans un Kit de diagnostic permettant
3 d'affirmer et d'identifier l'infection chez l'hôte infecté par Ic VRS-A ou le VRS-13.
l.'lI1VC11tI011 a donc pour objet des anticorps polyclonaux ou monoclonaux dirigés contre un épitopc de la protéine G du VRS
S correspondant à une séquence choisie parmi l'une des séclucnccs peptidiques comprises respectivement entre les résidus d'acides aminés 150-159, 176-189, 194-207 et 155-176 de la séquence totale de la protéine G du VRS A ou B, ou des séquences présentant au moins 80 %, et de préférence au moins 98 % d'homologie.
Ces anticorps reconnaîtront des peptides portés par la séquence comprise entre les résidus d'acides aminés 130 et 230 de la protéine G du VRS, sous-groupe A ou sous-groupe B.
Cette région correspondant aux acides aminés 130-230 dc la protéine G du VRS A est désignée ci-après G2Na. G2Na a été produite dans 1S une bactérie telle que E. coli, donc non glycosylée. Elle confére, notamment lorsqu'elle est couplée à un porteur comme une OmpA de bactérie gram négatif, par exemple de Klebsiella (protéine p40, décrite dans WO
96/ 14415) ou une protéine dérivée du streptocoque (comme la protéine de liaison à la sérumalbumine humaine, appelée ci-après BB, décrite dans WO 96/ 14416), une protection immunitaire contre les infections au VRS.
De manière inattendue, il a été montré qu'une série de peptides préparés selon l'invention confëre une protection croisée contre le VRS
sous-groupe A ou sous-groupe B.
En particulier, une protéine recombinante BBG2al, un dérivé de 2S BBG2Na où seulement quatre résidus ont été modifiés sur G2Na : les résidus Asn(aa191), Lys(aaI92), Gly(195) et Thr(aa198) ont été substitués par les résidus Ser, Asn, Lys et Pro respectivement, confère une protection croisée VRS-A ou VRS-8 chez la souris BALB/c. Dans le mème but de renforcer une protection croisée, deux nouvelles molécules ont été
l.'lI1VC11tI011 a donc pour objet des anticorps polyclonaux ou monoclonaux dirigés contre un épitopc de la protéine G du VRS
S correspondant à une séquence choisie parmi l'une des séclucnccs peptidiques comprises respectivement entre les résidus d'acides aminés 150-159, 176-189, 194-207 et 155-176 de la séquence totale de la protéine G du VRS A ou B, ou des séquences présentant au moins 80 %, et de préférence au moins 98 % d'homologie.
Ces anticorps reconnaîtront des peptides portés par la séquence comprise entre les résidus d'acides aminés 130 et 230 de la protéine G du VRS, sous-groupe A ou sous-groupe B.
Cette région correspondant aux acides aminés 130-230 dc la protéine G du VRS A est désignée ci-après G2Na. G2Na a été produite dans 1S une bactérie telle que E. coli, donc non glycosylée. Elle confére, notamment lorsqu'elle est couplée à un porteur comme une OmpA de bactérie gram négatif, par exemple de Klebsiella (protéine p40, décrite dans WO
96/ 14415) ou une protéine dérivée du streptocoque (comme la protéine de liaison à la sérumalbumine humaine, appelée ci-après BB, décrite dans WO 96/ 14416), une protection immunitaire contre les infections au VRS.
De manière inattendue, il a été montré qu'une série de peptides préparés selon l'invention confëre une protection croisée contre le VRS
sous-groupe A ou sous-groupe B.
En particulier, une protéine recombinante BBG2al, un dérivé de 2S BBG2Na où seulement quatre résidus ont été modifiés sur G2Na : les résidus Asn(aa191), Lys(aaI92), Gly(195) et Thr(aa198) ont été substitués par les résidus Ser, Asn, Lys et Pro respectivement, confère une protection croisée VRS-A ou VRS-8 chez la souris BALB/c. Dans le mème but de renforcer une protection croisée, deux nouvelles molécules ont été
4 produites : BBG2a2 où les résidus Asn(aa157), Asn(aal6O), Asn(aa161) ct Phe(aa163) Ont été substitués par les résidus Lys, Lys, Asp ct 'I_yr respectivement ; BBG2a3 comporte les huit rcsidus modifiés de B1:3G2a1 ct BBG2a2.
Des peptides particulièrement avantageux selOtl l'invention présentent notamment l'une des séquences choisies parmi ILS sequcnccs ID n° 1, ID n° 2, ID n° 3, ID n° 4, ID n°
Des peptides particulièrement avantageux selOtl l'invention présentent notamment l'une des séquences choisies parmi ILS sequcnccs ID n° 1, ID n° 2, ID n° 3, ID n° 4, ID n°
5, ID n° 6, ID n° 7, ID n° 8, ID n° 9, ID n° 10, ID n° 11, ID n° 12, ID n° 13, ID
n° 14, ID n° i5, ID n° 16, ID
n° 17, ID n° 18, ID n° I9, ID n° 20, ID n°
21 et/ou ID n° 22, figurant en annexe ; un teI peptide peut, en outre, comporter au moins un résidu cystéine en position N-terminale ou C-terminale.
La réactivité des peptides est mise en évidence par des sondes mono ou polyclonales. Quatre régions de G2Na ont été révélées par cette technique : G5a (aa144-159), Glla(aa164-176), G4a(aa172-187) et G9a(aa190-204).
L'invention a donc également pour objet des anticorps, monoclonaux ou polyclonaux, dirigés contre un peptide présentant au moins l'une des séquences ID n° 1 à ID n° 22.
Des peptides possédant une ou plusieurs unités correspondant aux épitopes 150-159, 176-189, 194-207 et 155-176 de la séquence de la protéine G du VRS seront très utiles pour les différents modes de mise en oeuvre de l'invention.
Des peptides selon l'invention, couplés à une protéine porteuse, sont utiles comme agents immunogènes.
La protéine porteuse est avantageusement choisie parmi les OmpA
de bactéries gram négatif et leurs fragments, la protéine TT (tetanus toxoide), la protéine de liaison à la sérumalbumine humaine du Streptocoque et ses fragments et la sous-unité B de la toxine cholérique . (CTB) ; de préférence, la protéine porteuse est 11I1C OmpA d'une bactérie du genre: Klebsiella.
Selon l'un des aspects dc l'invention, lc peptide est conjugue à la protéine porteuse par une protéine de liaison ; cette protcinc dc liaison 5 peut notamment ètre choisie parmi un récepteur de l'albumine sérique cic mammifère et les récepteurs présents à la surface des cellules mucosalcs.
Le couplage est de préférence un couplage covalent, qui peut ctre réalisé par la voie chimique ou par des techniques d'ADN recombinant.
Selon un autre de ses aspects, l'invention a donc pour objet une lU séquence nucléotidique codant pour un peptide ou un agent immunogène tels que définis précédemment. I1 peut s'agir notamment d'une molécule d'ADN hybride produite par insertion ou fusion dans la molécule d'ADN
codant pour la protéine porteuse, de l'ADN codant pour un peptide selon l'une des revendications 4 ou 5 ou l'un de leurs fragments, fusionné avec un promoteur ; il peut également s'agir d'une molécule d'ARN.
Les peptides, les anticorps, les agents immunogènes et les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent étre utilisés à titre de médicament, et plus particulièrement pour la préparation d'une composition destinée au traitement préventif ou curatif des affections provoquées par le VRS, sous-groupe A ou B.
Par exemple, des anticorps monoclonaux reconnaissant de manière spécifique les peptides G5a et Glla et GI~Ca ont été générés. Le transfert passif des anticorps monoclonaux 5C2 (anti-G5a) et 18D 1 (anti- G lOCa) chez la souris naive permet de prévenir l'infection au VRS-A d'une part. Et ' 25 d'autre part, le même monoclonal 5C2 permet d'éliminer rapidement une infection chronique au VRS-A chez la souris immunodéprimée.
L'invention a donc également pour objet une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle contient au moins un anticorps mono ou polyclonal, un peptide ou un épitope selon l'invention, un agent
n° 14, ID n° i5, ID n° 16, ID
n° 17, ID n° 18, ID n° I9, ID n° 20, ID n°
21 et/ou ID n° 22, figurant en annexe ; un teI peptide peut, en outre, comporter au moins un résidu cystéine en position N-terminale ou C-terminale.
La réactivité des peptides est mise en évidence par des sondes mono ou polyclonales. Quatre régions de G2Na ont été révélées par cette technique : G5a (aa144-159), Glla(aa164-176), G4a(aa172-187) et G9a(aa190-204).
L'invention a donc également pour objet des anticorps, monoclonaux ou polyclonaux, dirigés contre un peptide présentant au moins l'une des séquences ID n° 1 à ID n° 22.
Des peptides possédant une ou plusieurs unités correspondant aux épitopes 150-159, 176-189, 194-207 et 155-176 de la séquence de la protéine G du VRS seront très utiles pour les différents modes de mise en oeuvre de l'invention.
Des peptides selon l'invention, couplés à une protéine porteuse, sont utiles comme agents immunogènes.
La protéine porteuse est avantageusement choisie parmi les OmpA
de bactéries gram négatif et leurs fragments, la protéine TT (tetanus toxoide), la protéine de liaison à la sérumalbumine humaine du Streptocoque et ses fragments et la sous-unité B de la toxine cholérique . (CTB) ; de préférence, la protéine porteuse est 11I1C OmpA d'une bactérie du genre: Klebsiella.
Selon l'un des aspects dc l'invention, lc peptide est conjugue à la protéine porteuse par une protéine de liaison ; cette protcinc dc liaison 5 peut notamment ètre choisie parmi un récepteur de l'albumine sérique cic mammifère et les récepteurs présents à la surface des cellules mucosalcs.
Le couplage est de préférence un couplage covalent, qui peut ctre réalisé par la voie chimique ou par des techniques d'ADN recombinant.
Selon un autre de ses aspects, l'invention a donc pour objet une lU séquence nucléotidique codant pour un peptide ou un agent immunogène tels que définis précédemment. I1 peut s'agir notamment d'une molécule d'ADN hybride produite par insertion ou fusion dans la molécule d'ADN
codant pour la protéine porteuse, de l'ADN codant pour un peptide selon l'une des revendications 4 ou 5 ou l'un de leurs fragments, fusionné avec un promoteur ; il peut également s'agir d'une molécule d'ARN.
Les peptides, les anticorps, les agents immunogènes et les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent étre utilisés à titre de médicament, et plus particulièrement pour la préparation d'une composition destinée au traitement préventif ou curatif des affections provoquées par le VRS, sous-groupe A ou B.
Par exemple, des anticorps monoclonaux reconnaissant de manière spécifique les peptides G5a et Glla et GI~Ca ont été générés. Le transfert passif des anticorps monoclonaux 5C2 (anti-G5a) et 18D 1 (anti- G lOCa) chez la souris naive permet de prévenir l'infection au VRS-A d'une part. Et ' 25 d'autre part, le même monoclonal 5C2 permet d'éliminer rapidement une infection chronique au VRS-A chez la souris immunodéprimée.
L'invention a donc également pour objet une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle contient au moins un anticorps mono ou polyclonal, un peptide ou un épitope selon l'invention, un agent
6 immunogène, ou une séquence nuclcotidique tels que définis précédcmment, el des excipients phal'IlIaCCLltlqueIllC'.nt acceptables.
Les anticorps monoclonaux sont, cic préfcrcncc, h11I11anlses ct produits par la voie recombinante. Selon un autre aspect de l'invention, ils sont obtenus par la méthode de librairie de phages.
Les peptides, agents immunogènes, anticorps et séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent, selon un mode de mise en oeuvrc de i'invention, entrer dans la composition d'un lcit de diagnostic.
Comme indiqué plus haut, les agents immunogènes peuvent être préparés par la technologie de l'ADN recombinant, par l'introduction d'une séquence nucléotidique selon l'invention dans une cellule hôte. Cette séquence nucléotidique peut être un gène de fusion qu'on introduit par l'intermédiaire d'un vecteur d'ADN qui provient d'un plasmide, d'un bactériophage, d'un virus et/ou d'un cosmidc. Ce gène de fusion peut, dans un mode de réalisation du procédé de préparation, étre intégré dans le génome de la cellule hôte.
Le vecteur pourra être un vecteur viral, connu de l'homme du métier.
La cellule hôte peut ètre un procaryote, notamment choisie dans le groupe comprenant : E. coli, Bacilles, Lactobacillus, Staphylococcus et Streptococcus.
Mais la cellule hôte peut également étre une levure, une cellule de mammifère, une cellule d'origine végétale ou une cellule d'insecte.
Selon l'un des aspects du procédé selon l'invention, la protéine de fusion est exprimée : sécrétée, localisée dans le cytoplasme, ou encore exposée à la membrane des cellules hôtes.
Les exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention. Dans ces exemples, on se référera aux figures suivantes.
Les anticorps monoclonaux sont, cic préfcrcncc, h11I11anlses ct produits par la voie recombinante. Selon un autre aspect de l'invention, ils sont obtenus par la méthode de librairie de phages.
Les peptides, agents immunogènes, anticorps et séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent, selon un mode de mise en oeuvrc de i'invention, entrer dans la composition d'un lcit de diagnostic.
Comme indiqué plus haut, les agents immunogènes peuvent être préparés par la technologie de l'ADN recombinant, par l'introduction d'une séquence nucléotidique selon l'invention dans une cellule hôte. Cette séquence nucléotidique peut être un gène de fusion qu'on introduit par l'intermédiaire d'un vecteur d'ADN qui provient d'un plasmide, d'un bactériophage, d'un virus et/ou d'un cosmidc. Ce gène de fusion peut, dans un mode de réalisation du procédé de préparation, étre intégré dans le génome de la cellule hôte.
Le vecteur pourra être un vecteur viral, connu de l'homme du métier.
La cellule hôte peut ètre un procaryote, notamment choisie dans le groupe comprenant : E. coli, Bacilles, Lactobacillus, Staphylococcus et Streptococcus.
Mais la cellule hôte peut également étre une levure, une cellule de mammifère, une cellule d'origine végétale ou une cellule d'insecte.
Selon l'un des aspects du procédé selon l'invention, la protéine de fusion est exprimée : sécrétée, localisée dans le cytoplasme, ou encore exposée à la membrane des cellules hôtes.
Les exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention. Dans ces exemples, on se référera aux figures suivantes.
7 PC'f/FR98/01570 Figures 1 et 2 : Principe du clonage des gènes G2al, G2a2 et G2a3 dans les vecteurs.
Figure 3 : A-Gel SDS-PAG L 20 %, coloration au Bleu dc Comassic. M=
Standards de tailles moléculaires, pistes 1 et 2 protéines B13G2a 1 (masse théorique 38,7 Kd) purifiées par affinité sur I-ISA-Sépharosc.
B- Immunoblot des protéines BBG2a 1 avec un anticorps monoclonal 18 D 1.
Figure 4 : A-Immunogénicité des peptides G5a et G9 a.
B- Efficacité protectrice des peptides G5a et G9a sur les poumons.
Figure 5 : A- Immunogénicité des peptides G7a et GBa.
B- Efficacité protectrice des peptides G7a et G8a sur les poumons.
Figure 6 : Immunogénicité de BBG2a1 vis-à-vis du VRS A (rigure 6A) et VRS B (68) et efficacité protectrice contre le VRS A (6C) et le VRS B (6D).
Figure 7 : Effet curatif des anticorps monoclonaux 18D 1 et 5C2.
Figure 8 : A- Efficacité prophylactique de l'anticorps monoclonal 18D 1.
B- Efficacité prophylactique de l'anticorps monoclonal 5C2.
Figure 9 : Identification des épitopes B de G2Na représentés dans un sérum de souris immunisées par BBG2Na. A : révélation totale ; B
absence de révélation de la région 155-176.
Figure 10 : Détermination de la zone de reconnaissance de l'anticorps monoclonal 5B7 par la méthode du Pepscan B.
EXEMPLES
Exemple 1 : Synthèse des peptides.
~ Exemple de la synthèse des peptides GSaCys et CysGSa.
Figure 3 : A-Gel SDS-PAG L 20 %, coloration au Bleu dc Comassic. M=
Standards de tailles moléculaires, pistes 1 et 2 protéines B13G2a 1 (masse théorique 38,7 Kd) purifiées par affinité sur I-ISA-Sépharosc.
B- Immunoblot des protéines BBG2a 1 avec un anticorps monoclonal 18 D 1.
Figure 4 : A-Immunogénicité des peptides G5a et G9 a.
B- Efficacité protectrice des peptides G5a et G9a sur les poumons.
Figure 5 : A- Immunogénicité des peptides G7a et GBa.
B- Efficacité protectrice des peptides G7a et G8a sur les poumons.
Figure 6 : Immunogénicité de BBG2a1 vis-à-vis du VRS A (rigure 6A) et VRS B (68) et efficacité protectrice contre le VRS A (6C) et le VRS B (6D).
Figure 7 : Effet curatif des anticorps monoclonaux 18D 1 et 5C2.
Figure 8 : A- Efficacité prophylactique de l'anticorps monoclonal 18D 1.
B- Efficacité prophylactique de l'anticorps monoclonal 5C2.
Figure 9 : Identification des épitopes B de G2Na représentés dans un sérum de souris immunisées par BBG2Na. A : révélation totale ; B
absence de révélation de la région 155-176.
Figure 10 : Détermination de la zone de reconnaissance de l'anticorps monoclonal 5B7 par la méthode du Pepscan B.
EXEMPLES
Exemple 1 : Synthèse des peptides.
~ Exemple de la synthèse des peptides GSaCys et CysGSa.
8 Abréviations AA : acide amine Boc : tert Butoxycarbonyl BHA : Bromo hydrosuccimidyl acide CE : Capillary Electrophoresis ES-MS : Electrospray - Mass spectrometry FMOC : fluorenylmethoxycarbonyl FZCE : Free Zone Capillary Electraphoresis I-IBTU : 2-(lf-I-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tétraméthyluronium hexailuorophosphate HMP : p-Hydroxyméthylphénoxyméthyl polystyrène MBHA : méthylbenzhydrylamine NMP : N-méthyle-2-pyrrolidone Pmc : 2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl RP-HPLC : Reverse Phase - High Performance Liquide Chromatography SPPS : Synthèse Peptidique en Phase Solide tBOC : t-butyloxycarbonyl tBu : tertio Butyl TFA : trifluoroacetic acid Trt : trityle Le peptide G5a est un peptide de 16 acides aminés qui correspond au fragment de la protéine G ( 144-159) du VRS-A. Il est obtenu par synthèse chimique sur phase solide en partant du coté C vers le coté N-terminal. Les peptides CysGSa et GSaCys correspondent respectivement à
ce peptide avec une Cystéine supplémentaire du côté N ou C-terminal qui est destinée à un couplage univoque sur une protéine porteuse. Ces 2 peptides permettent d'étudier l'influence que peut avoir l'orientation du
ce peptide avec une Cystéine supplémentaire du côté N ou C-terminal qui est destinée à un couplage univoque sur une protéine porteuse. Ces 2 peptides permettent d'étudier l'influence que peut avoir l'orientation du
9 peptide conjugué à une protéine porteuse sur la rcponsc immunologique obscivéc.
' Les peptides ont cté synthétises à l'aide cl'un synthétiseur automatique de peptide cn phase solide du ccité C vers le côté N-terminal (chimie FMOC à l'échelle de 0.1 ; 0.25 ou 1.0 mmole). La synthcsc du peptide CysGSa est effectuée à partir d'une Prolinc préchargéc sur une résine de type HMP, qui permet après clivage d'obtenir une fonction acide libre du côté C-terminal ou une résine de type Rinl{ amide MHBA, qui permet après clivage d'obtenir une fonction amide du coté C-terminal.
Celle du peptide GSaCys débute par une Cystéinc préchargée sur l'une ou l'autre des résines. Les fonctions réactives des chaises latérales des acides aminés utilisés, sont protégées par des groupes compatibles avec la chimie' FMOC [Cys(Trt) ; Arg(Pmc) ; Asn(Trt) ; Gln (Trt) ; Lys(Boc) ; Scr(tBu) ;
Thr(tBu)). Un cycle de couplage se déroule de la manière suivante déprotection de la fonction amine N-terminale du premier acide aminé à
l'aide de pipéridine, activation de la fonction acide du deuxième acide aminé à coupler à l'aide d'HBTU/HMP et couplage. En fin de synthése, le peptide est clivé de la résine et les chaises latérales sont déprotégécs par réaction avec un mélange eau / TFA. Le peptide est précipité à l'éther refroidi préalablement à -40°C et le mélange est centrifugé. Le culot est lavé à trois reprises avec de l'éther puis séché à l'azote. Le culot est repris avec de l'eau contenant 0.1 % de TFA. La suspension est à nouveau centrifugée et le surnageant qui contient le peptide est séparé du culot, qui contient la résine. Le peptide brut est purifié par HPLC en phase inverse semi-préparative. L'homogénétié du peptide purifié est vérifiée par HPLC
en phase inverse et par électrophorèse capillaire (FZCE). La structure théorique est confirmée par comparaison de la compatibilité de la masse mesurée par spectrométrie de masse de type ES-MS, avec la masse calculée à partir de la séquence théorique en acides aminés.
.Peptide CysG5aNH2 Synthèse Poids théorique peptide-résine en fin de synthcsc: 593 mg S Poids mesuré après séchage à l'azote : 619 mg Clivage peptide-résine et analyse du peptide brut : 200 mg (1/3 du lot) Masse de peptide brut clivé après lyophilisation : 84 mg (75 % clé
quantité nette de peptide soit 97 % de rendement) Homogéneité du peptide brut : 97 % (RP-HPLC ; UV 210 nm)
' Les peptides ont cté synthétises à l'aide cl'un synthétiseur automatique de peptide cn phase solide du ccité C vers le côté N-terminal (chimie FMOC à l'échelle de 0.1 ; 0.25 ou 1.0 mmole). La synthcsc du peptide CysGSa est effectuée à partir d'une Prolinc préchargéc sur une résine de type HMP, qui permet après clivage d'obtenir une fonction acide libre du côté C-terminal ou une résine de type Rinl{ amide MHBA, qui permet après clivage d'obtenir une fonction amide du coté C-terminal.
Celle du peptide GSaCys débute par une Cystéinc préchargée sur l'une ou l'autre des résines. Les fonctions réactives des chaises latérales des acides aminés utilisés, sont protégées par des groupes compatibles avec la chimie' FMOC [Cys(Trt) ; Arg(Pmc) ; Asn(Trt) ; Gln (Trt) ; Lys(Boc) ; Scr(tBu) ;
Thr(tBu)). Un cycle de couplage se déroule de la manière suivante déprotection de la fonction amine N-terminale du premier acide aminé à
l'aide de pipéridine, activation de la fonction acide du deuxième acide aminé à coupler à l'aide d'HBTU/HMP et couplage. En fin de synthése, le peptide est clivé de la résine et les chaises latérales sont déprotégécs par réaction avec un mélange eau / TFA. Le peptide est précipité à l'éther refroidi préalablement à -40°C et le mélange est centrifugé. Le culot est lavé à trois reprises avec de l'éther puis séché à l'azote. Le culot est repris avec de l'eau contenant 0.1 % de TFA. La suspension est à nouveau centrifugée et le surnageant qui contient le peptide est séparé du culot, qui contient la résine. Le peptide brut est purifié par HPLC en phase inverse semi-préparative. L'homogénétié du peptide purifié est vérifiée par HPLC
en phase inverse et par électrophorèse capillaire (FZCE). La structure théorique est confirmée par comparaison de la compatibilité de la masse mesurée par spectrométrie de masse de type ES-MS, avec la masse calculée à partir de la séquence théorique en acides aminés.
.Peptide CysG5aNH2 Synthèse Poids théorique peptide-résine en fin de synthcsc: 593 mg S Poids mesuré après séchage à l'azote : 619 mg Clivage peptide-résine et analyse du peptide brut : 200 mg (1/3 du lot) Masse de peptide brut clivé après lyophilisation : 84 mg (75 % clé
quantité nette de peptide soit 97 % de rendement) Homogéneité du peptide brut : 97 % (RP-HPLC ; UV 210 nm)
10 97 % (FZCE/MicrocoatT") Purification Masse de peptide purifié après lyophilisation : 50 mg (75 % de quantité
nette de peptide soit 58 % de rendement) Caractérisation Homogéneité du peptide purifié : > 99 % (RP-i-IPLC ; UV 210 nm) > 99 % (FZCE/MicrocoatT" ; UV 200 nm) Spectrométrie de masse ( ES-MS) Masse calculée : 1951.29 Da Masse mesurée : 1950.80 Da ~ 0.31 Exemple 2 : Couplage des peptides GSa, G?a, GBa, G9a, Glla et GlI~Ca sur une protéine porteuse {P40, BB, TT, KLHj.
~ Exemple du couplage du peptide G 1 lOCa sur la protéine P40.
Le peptide G 1 lOCa (Seq ID n° 14j est un peptide de 13 acides aminés issu de la protéine G du VRS. Il correspond à la séquence 164-176 de cette protéine. Lors de la synthèse, le résidu Cys en position 173 a été
nette de peptide soit 58 % de rendement) Caractérisation Homogéneité du peptide purifié : > 99 % (RP-i-IPLC ; UV 210 nm) > 99 % (FZCE/MicrocoatT" ; UV 200 nm) Spectrométrie de masse ( ES-MS) Masse calculée : 1951.29 Da Masse mesurée : 1950.80 Da ~ 0.31 Exemple 2 : Couplage des peptides GSa, G?a, GBa, G9a, Glla et GlI~Ca sur une protéine porteuse {P40, BB, TT, KLHj.
~ Exemple du couplage du peptide G 1 lOCa sur la protéine P40.
Le peptide G 1 lOCa (Seq ID n° 14j est un peptide de 13 acides aminés issu de la protéine G du VRS. Il correspond à la séquence 164-176 de cette protéine. Lors de la synthèse, le résidu Cys en position 173 a été
11 remplacé par un résidu Ser afin de ne conserver qu'un seul résidu Cys en pOSltlOn 17~ et CVItCr la fOrmatLOIl d'UIl pont (1LSUlft,lI'C 1-2 Il'('.XISIAIIt Cla3nS
la protéine G naturelle (appariement 1-4/2-3).
Ce peptide a été couplé à l'aide de glutaraldchy(lo (rcactiC
homobifonctionnel, couplage sur les fOnCt1011S amines et thiols) ou cic manière univoque à l'aide de 131-IA (r~actii' hctcrot~ii'onctionncl, couplage sur la fonction thiol de la Cystéine en position C-terminale).
~ Couplage univoque par le BHA
~ Solubilisation du peptide G110Ca.
2 mg de G110Ca sont solubilisés dans 2 ml de tampon phosphate 0,1 M pH 7 + 0,1 % Zwittergent 3-14.
~ Couplage univoque sur la protéine P40 à raide d'un réactif hétérobifonctionael ~BHAi.
3 mg de BHA en solution dans 25 ul dc DMF sont ajoutés à 2,5 mg de protéine P40 préalablement dialysés contre un tampon phosphate 0,1 M
pH7 + 0,1 % Zwittergent 3-14 et agités pendant 1 heure à température ambiante. Après dessalage sur colonne PD 10 et élution avec un tampon phosphate 0,1 M pH ? + 0,1 % Zwittergent 3-14 des fractions de 500 X11 sont collectées et les tubes contenant la protéine bromoacétylée sont rassemblées (lecture de DO à 280 nm) dans des tubes contenant 0,95 ml de solution du peptide G 1 l~Ca sont ajoutés. Le milieu réactionnel est saturé avec de l'azote et agité à l'obscurité pendant 2 heures à température ambiante. La solution est dialysée ensuite à l'aide d'un tampon phosphate 0,1 M pH 7 + 0,1 % Zwittergent 3-14 pendant une nuit à + 4°C sous agitation et la solution obtenue est conservée congelée.
la protéine G naturelle (appariement 1-4/2-3).
Ce peptide a été couplé à l'aide de glutaraldchy(lo (rcactiC
homobifonctionnel, couplage sur les fOnCt1011S amines et thiols) ou cic manière univoque à l'aide de 131-IA (r~actii' hctcrot~ii'onctionncl, couplage sur la fonction thiol de la Cystéine en position C-terminale).
~ Couplage univoque par le BHA
~ Solubilisation du peptide G110Ca.
2 mg de G110Ca sont solubilisés dans 2 ml de tampon phosphate 0,1 M pH 7 + 0,1 % Zwittergent 3-14.
~ Couplage univoque sur la protéine P40 à raide d'un réactif hétérobifonctionael ~BHAi.
3 mg de BHA en solution dans 25 ul dc DMF sont ajoutés à 2,5 mg de protéine P40 préalablement dialysés contre un tampon phosphate 0,1 M
pH7 + 0,1 % Zwittergent 3-14 et agités pendant 1 heure à température ambiante. Après dessalage sur colonne PD 10 et élution avec un tampon phosphate 0,1 M pH ? + 0,1 % Zwittergent 3-14 des fractions de 500 X11 sont collectées et les tubes contenant la protéine bromoacétylée sont rassemblées (lecture de DO à 280 nm) dans des tubes contenant 0,95 ml de solution du peptide G 1 l~Ca sont ajoutés. Le milieu réactionnel est saturé avec de l'azote et agité à l'obscurité pendant 2 heures à température ambiante. La solution est dialysée ensuite à l'aide d'un tampon phosphate 0,1 M pH 7 + 0,1 % Zwittergent 3-14 pendant une nuit à + 4°C sous agitation et la solution obtenue est conservée congelée.
12 ~ Couplage sur Ia protéine P40 à l'aide d'un réactif homobifonctionnel (glutaraldéhyde).
mg de P40 sont dialyses contre un tampon phosphate 0,1 M pl f 7 + 0,1 % Zwittergent 3-14. La concentration est ajustce a 2 mg/ml à l'aide 5 d'un tampon carbonate 0, i M pH 9 + 0,1 % Zwittergent 3-14. 200 mg clé
SDS d'une solutiuon à 4 % sont ajoutés.
55,5 ul de glutaraldéhyde à 2,5 % sont ajoutés à 2,5 ml d'une solution de peptide Gl l~Ca à 1 mg/ml dans un tampon carbonate 0,1 M
pH 9 + 0,1 % Zwittergent 3-14 à un pl-1 se situant entre 9 et 10. Le milieu 10 réactionnel est agité à + 4°C pendant 24 heures puis ramené à
température ambiante. 25 ul de lysine 1 M sont ajoutés pour bloquer la réaction. La solution est dialysée contre du tampon phosphate 0,1 M pH 7 + 0,1 % Zwittergent 3-14 pendant 24 heures à + 4°C sous agitation. Le dialysat est récupéré et le SDS éliminé par précipitation à l'aide d'une solution de KCl 0,02 M à 6 reprises. Le dernier surnageant qui contient le conjugué P40-G 1 l~Ca glutaraldéhyde est conservé sous forme congélce à
- 20°C.
~ Stérilisation des conjugués Les conjugués sont décongelés, filtrés stérilement (0,22 um), aliquotés et conservés à + 4°C afin d'éviter les problèmes de précipitation.
~ Caractérisation analytique des conjugués Les conjugués sont caractérisés par dosage des protéines par la méthode de Lowry, électrophorèse de type SDS-PAGE (révélation au bleu de Coomassie) et par dosage des acides aminés après hydrolyse acide en phase gazeuse, dérivation par le PITC et analyse par HPLC.
mg de P40 sont dialyses contre un tampon phosphate 0,1 M pl f 7 + 0,1 % Zwittergent 3-14. La concentration est ajustce a 2 mg/ml à l'aide 5 d'un tampon carbonate 0, i M pH 9 + 0,1 % Zwittergent 3-14. 200 mg clé
SDS d'une solutiuon à 4 % sont ajoutés.
55,5 ul de glutaraldéhyde à 2,5 % sont ajoutés à 2,5 ml d'une solution de peptide Gl l~Ca à 1 mg/ml dans un tampon carbonate 0,1 M
pH 9 + 0,1 % Zwittergent 3-14 à un pl-1 se situant entre 9 et 10. Le milieu 10 réactionnel est agité à + 4°C pendant 24 heures puis ramené à
température ambiante. 25 ul de lysine 1 M sont ajoutés pour bloquer la réaction. La solution est dialysée contre du tampon phosphate 0,1 M pH 7 + 0,1 % Zwittergent 3-14 pendant 24 heures à + 4°C sous agitation. Le dialysat est récupéré et le SDS éliminé par précipitation à l'aide d'une solution de KCl 0,02 M à 6 reprises. Le dernier surnageant qui contient le conjugué P40-G 1 l~Ca glutaraldéhyde est conservé sous forme congélce à
- 20°C.
~ Stérilisation des conjugués Les conjugués sont décongelés, filtrés stérilement (0,22 um), aliquotés et conservés à + 4°C afin d'éviter les problèmes de précipitation.
~ Caractérisation analytique des conjugués Les conjugués sont caractérisés par dosage des protéines par la méthode de Lowry, électrophorèse de type SDS-PAGE (révélation au bleu de Coomassie) et par dosage des acides aminés après hydrolyse acide en phase gazeuse, dérivation par le PITC et analyse par HPLC.
13 Conjugu Volume [prot] Nb de G110C jG110C) (ml) mg/ml Fixs m /ml rP40-G110Ca 2,7 0,74 2 0,05 BHA
rP40-G110Ca 5,1 1,29 16 0,49 lutaraldh de Exemple 3 : Clonage de gène G2al, G2a2 dans vecteur d'expression pvaBB308 et production de protéines de fusion BBG2a1 et BBG2a2 dans E. coli Le principe de clonage de gène G2a1 (Seq ID n° 15), G2a2 (Seq ID
n° 16) et de G2a3 (Seq ID n° 17) dans les vecteurs est explicité
dans les figures 1 et 2.
3.1 Construction de G2a 1 Le gène codant pour la protéine G2a1 (Seq ID n° 15) est construit par mutagénèse dirigée en utilisant comme matériel de départ le plasmide pRIT28G2Na. Pour cela, deux réactions de PCR (Polymerase chain reaction) sont réalisées avec les couples d'oligonucléotides RIT29/TH 137(PCR 1) d'une part et RIT30/TH 136 (PCR 2)d'autre part dans les conditions suivantes PCR (94°C 15 secondes cycles (55°C 30 secondes (72°C 30 secondes 20 ~ Fixation sur les billes magnétiques hes fragments obtenus respectivement de 262 pb et 208 pb pour les réactions 1 et 2 sont fixés sur des billes magnétiques. 25 ~~l de billes magnétiques DYNALO M-280 couplées à la streptavidine sont préalablement rincées deux fois avec du tampon T.E. (Tris 10 mM; EDTA
25 imM, pH 7,5) puis mises à incuber 20 minutes à 37°C avec 90y1 des
rP40-G110Ca 5,1 1,29 16 0,49 lutaraldh de Exemple 3 : Clonage de gène G2al, G2a2 dans vecteur d'expression pvaBB308 et production de protéines de fusion BBG2a1 et BBG2a2 dans E. coli Le principe de clonage de gène G2a1 (Seq ID n° 15), G2a2 (Seq ID
n° 16) et de G2a3 (Seq ID n° 17) dans les vecteurs est explicité
dans les figures 1 et 2.
3.1 Construction de G2a 1 Le gène codant pour la protéine G2a1 (Seq ID n° 15) est construit par mutagénèse dirigée en utilisant comme matériel de départ le plasmide pRIT28G2Na. Pour cela, deux réactions de PCR (Polymerase chain reaction) sont réalisées avec les couples d'oligonucléotides RIT29/TH 137(PCR 1) d'une part et RIT30/TH 136 (PCR 2)d'autre part dans les conditions suivantes PCR (94°C 15 secondes cycles (55°C 30 secondes (72°C 30 secondes 20 ~ Fixation sur les billes magnétiques hes fragments obtenus respectivement de 262 pb et 208 pb pour les réactions 1 et 2 sont fixés sur des billes magnétiques. 25 ~~l de billes magnétiques DYNALO M-280 couplées à la streptavidine sont préalablement rincées deux fois avec du tampon T.E. (Tris 10 mM; EDTA
25 imM, pH 7,5) puis mises à incuber 20 minutes à 37°C avec 90y1 des
14 réactions d'amplification 1 et 2. Après fixation les fragments sont dénaturés en incubant Ics billes magnctiqucs avec 50p1 de NaOI-1 0,15 M
pendant 10 I111IlutcS a tcmpc:ralurc ambiante. LC'.S Clellx Sut'nFIgC:antS
SOIR
récupérés, précipités à l'éthanol absolu ct I'CSllspeIlCllls Clai'1S 5U yl d'I-I20.
~ Réaction d'extension Celle-ci est réalisée par PCR en prenant 10 yl de chacune des réactions d'amplification dans les conditions ci-dessous (95°C 15 secondes 5 cycles (35°C 30 secondes (72°C 30 secondes Le fragment généré est amplifié par PCR avec les oligonucléotides RIT27 et RIT28 (95°C 15 secondes 25 cycles (55°C 30 secondes (72°C 30 secondes Le fragment amplifié de 509 pb est digéré avec les enzymes de restrictions PstI et HindIIi. Le fragment généré de 169 pb est cloné dans le vecteur pRIT28 digéré par les mêmes enzymes.
Le plasmide obtenu pRIT28G2a1 down est séquencé avec la chimie des Dye Deoxy Terminator selon le protocole décrit par Applied Biosystem (Perkin Elmer) .
Le plasmide pRIT28G2a1 est obtenu en clonant le fragment PstI/HindIII de pRIT28G2aldown (fragment en aval du site Pst lj dans lc vecteur pRIT28G2Na.
Le gène G2a1 est ensuite cloné dans le vecteur d'expression pvaBB308 aux sites de restriction EcoRI/HindIII générant le vecteur pvaBBG2al.
La liste des séquences des oligonucléotides est indiquée ci-dessous RIT27: 5' - GCTTCCGGCTCGTA'fGTTGTGTCI - 3' Rl'28: 5' - AAAGGGGGnTGTGCTGCAnGGCG - 3' ' 1'I-I 136: 5'- CCGAAGAAAAAACCGlICGACCAAnCCGACC - 3' 1'1-I137: 5' - TT'T'f1'TC'I"I'CGG1"1"fG1"I'G.CfCGGG - 3' 5 RIT29 : RIT27 biotinylé en 5' RIT30 : RIT28 biotinylé en 5' 3.2 Construction de G2a2 i(Seq ID n° 16~
Le principe du clonage est schématisé en bas de la figure 2.
10 Les couples d'oligonucléotides utilisés dans cette construction sont les suivants : RIT29/TNG193(PCR 1) d'une part et TNG192/RIT30(PCR 2) d'autre part. Les séquences des oligonucléotides sont décrites ci-dessous TNG 192 : 5'- CCGCCGAAAAAACCGAAAGACGAT - 3' TNG 193 : 5' - CGAAATGGTAATCGTCTTTCGG - 3' 3.3 Construction de G2a3 I(Seq ID n° 17~
Les deux fragments en amont et en aval du site unique PstI ont été
rassemblés sur le mème vecteur pour donner pRIT28G2a3.
Les trois fragments d'inserts G2al, G2a2 et G2a3 ont été clonés dans différents vecteurs d'expression dans E. coli, en particulier dans nos exemples les vecteurs pvaBB308 où BB est le gène codant pour le récepteur d'Albumine. Les protéines de fusion obtenus BBG2al, BBG2a2 et BBG2a3 peuvent étre aisément purifiées par affinité sur colonne HSA-Sepharose (Hurnan serum Albumin).
3.4 Fermentation et purification de protéines de fusion BBG2a1 et BBG2a2 Dans deux erlenmeyers contenant 250 ml de milieu TSB (Tryptic Soy Broth, Difco) avec de l'Ampicilline (100 ug/ml, Sigma) et de la Tétracycline (8 ug/ml, Sigma), on inocule avec E. coli RV308 transformes avec les plasmides pvaBBG2a 1 et pvaBi3G2a2 respc:ctivcmcnt. On incu tee pendant 16 heures à T° = 37°C sous agitation. 200 ml de cette culture sont inoculés dans un fermcntcur {CI-IEMAP CF3000, ALFA LAVAL) contenant 2 litres cie milieu de culture. Lc milieu contient (g/1) = glycérol, S ; sulfate d'ammonium, 2,6 ; dihydrogénophosphatc de potassium, 3 ; hydro-génophosphate dipotassium, 2 ~ citrate de sodium 0,5 ; extrait de levure, 1 ; Ampicilline, 0,1 ; Tétracycline 0,008 ; Thiamine, 0,07 ; sulfate de magnésium, 1 et 1 ml/1 de solution de traces éléments et 0,65 ml/1 dc solution de vitamines. Les paramètres contrôlés durant la fermentation sont : le pH, l'agitation, la température, le taux d'oxygénation, l'alimentation de' sources combinées (glycérol ou glucose). Le pH est régulé
à 7,0. La température est fixée à 37°C. La croissance est contrôlée cn alimentant du glycérol (87 %) à un débit constant ( 12 ml/h) pour maintenir le signal de tension de l'oxygène dissous à 30 %. Lorsque la turbidité de la culture (mesurée à 580 nm) atteint la valeur de 80 (aprcs environ 24 heures de culture), la production des protéines est induite par addition de l'acide indole acrylique (IAA) à la concentration finale de mg/1. Environ 4 heures après induction, les cellules sont récoltées par 20 centrifugation. Les rendements en biomasse obtenus sont environ 200gr de biomasse humide. Les rendements de production de BBG2a1 et de BBG2a2 sont environ de 4 à 6 mgr de protéines par gr de biomasse.
Une fraction de 30 g de biomasse humide est resuspendue dans 70 ml de solution de TST (Tris-HCl 50 mM pH 8,0, NaCI 200 mM, 0,05 25 Tween 20 et EDTA 0,5 mM). Les cellules sont désintégrées par sonication (Vibracell 72401, Sonies & Materials). Après centrifugation du lysat cellulaire, le surnageant est filtré (1,2 gym) et dilué dans 500 ml de TST.
Les protéines de fusion ainsi obtenues sous forme soluble sont purifiées sur colonne d'affinité : HSA-Sepharose (human serum albumin) selon le protocole décrit par (Stahl et col, J. Immunol. Methods, 1989 ; 124 : 43-52).
Le lysat insoluble, aprcs centrifugation, est lavé une fois avec lin tampon ('tris-HCl 50 mM pl-I 8,5 ; MgCI,, 5 mM). Aprcs lavage, lc culot est S solubilisé dans 30 ml dc chlorhydrate de guaniciinc 7 M, 'fris-I-ICl 25 mM
(pH 8,5), Dithiotreitol (DT'f) 10 mM, suivi d'une incubation n 37°C
pendant 2 heures. Les protéines solubilisées sont additionnées à un tampon dc renaturation (Tris-i-ICl 25 mM (pH 8,5) ; NaCI 150 mM et 0,05 % Tween 20). La concentration du chlorhydrate de guanidine est ajustée à la concentration finale de 0,5 M dans le tampon de renaturation avant l'addition des protéines de fusion solubilisées. Le mélange est incubé à
température ambiante, sous agitation modérée, pendant 16 heures. Après centrifugation, les produits de fusion solubles dans le surnageant sont purifiés sur colonne HSA-Sepharose. Les protéines de fusion purifiées sont analysées sur gel SDS-PAGE ( 12 %), sur l'appareil MINI PROTEAN Il SYSTEM (BIORADS). Les protéines sont visualisées avec du Coomassie brilliant blue 8250. De plus, l'analyse des protéines recombinantes par Immunoblot avec des anticorps spécifiques du VRS montre que les protéines sont antigéniques.(voir exemple de gel SDS et immunoblot de BBG2a1 sur la figure 3).
Exemple 4 : Immunogénicité et efficacité protectrice des peptides G5a et G9a couplés à P40.
Matériels et méthodes.
Des groupes de 7 souris ont été immunisés 2 fois par voie i.p. avec 20 ug de P40-G9aCys, P40-CysGSa, ou P40-GSaCys. Des souris témoins ont été immunisées avec le PBS. L'Alhygrogel (20 % v/v) a été utilisé
comme adjuvant pour toutes les immunisations. Les souris ont été
prélevées au sinus rétro-orbital 2 semaines après la dernière immunisation pour confirmer leur séroconvcrsion vis-à-vis lc VRS-A, challcngécs unc semaine plus tard avec 105 TCIDSO VRS-I1 par voie i.n., ct sacrifices 5 jours post-challenge. Les poumons ont cté prclcvcs ct le turc dc virus clans les poumons détcrrniné.
Résultats Réponses immunes humorales.
Comme indiqué dans la Fig. 4A, l'immunogénicité du peptide G5a est dépendante de l'orientation du couplage au P40. Après couplage par la partie C-terminale du peptide, des titres en anticorps anti-VRS-A faibles à
modérés ont été induits dans le sérum. Par contre, après couplage par la partie N-terminale, G5a n'a pas induit de tels anticorps. En général, le peptide G9a, couplé en C-terminal à P40, a été faiblement immunogénique en terme d'induction d'anticorps anti-VRS-A. Une souris sur sept immunisées avec P40-G9acys a développé un titre d'anticorps sériques anti-VRS-A élevé.
Efficacité protectrice des poumons des peptides G5a et G9a.
Comme démontré dans la Fig. 4B, et en corrélation directe avec la détection des anticorps anti-VRS-A, le peptide G5a a induit des réponses immunes protectrices quand il était couplé en C-terminal, mais pas après couplage en N-terminal. En effet, 6 souris sur 7 immunisées avec le P40-GSacys (couplage C-terminal) ont été protégées sans évidence de virus dans les poumons, le dernier n'a eu du virus qu'à la limite de détection de l'essai. Par contre, les souris immunisées avec P40-cysGSa (couplage N-terminal) ont eu des titres de virus dans les poumons aussi élevés que les souris témoins, immunisées avec le PBS. Ces résultats confirment que l'orientation du couplage de ce peptide à une protéine porteuse est capitale pour son efficacité protectrice. La corrélation entre la protection et l'induction des anticorps asti-VRS-A sttgn~~rc: clac la prolcction pulmonnirc observce est médicc, en partie au moins, par ics anticorps.
Malgré le fait que le P40-G9aCys ait été faiblement immunogéniquc S chez la souris en termes d'induction d'anticorps sériques anti-VRS-A, les poumons de S souris sur 7 ont été protégés contre un challenge par Ic VRS-A. En effet, 1 souris sur 7 n'a pas montré d'évidence de virus dans les poumons, ni même d'anticorps anti-VRS-A dans le sérum.
Conclusions.
Les peptides GSa et G9a contiennent des épitopes protecteurs vis-à-vis d'une infection VRS-A des poumons. L'orientation du couplage de GSa à une protéine porteuse est capitale pour son efficacité protectrice.
1 S Exemple 5 : Immunogénicité et efficacité protectrice des peptîdes G7a et GBa.
Matériels et méthodes.
Des groupes de 3 à 4 souris ont été immunisés 2 fois par voie i.p.
avec 20 ug de G7a, GBa, BB-G7a, ou BB-GBa. Des souris témoins ont été
immunisées avec le PBS. L'Alhygrogel (20 % v/v) a été ulitisé comme adjuvant pour toutes les immunisations. Les souris ont été prélevées au sinus rétro-orbital 2 semaines après la dernière immunisation pour confirmer leur séroconversion vis-à-vis du VRS-A, challengées une semaine plus tard avec 105 TCIDSO VRS-A par voie i.n., et sacrifiées 5 jours post-challenge. Les poumons ont été prélevés et les voies nasales lavées.
Les titres de virus dans les poumons et les voies nasales ont été
déterminés.
Résultats.
Réponses immunes humorales.
Comme indiqué dans la Fig. 5A, les peptides G7a rt G8a sotlt LUUs cieux immunogéniques vis-à-vis du VRS-A couples ou non a 1313. Si l'on S COIlsld(:I'e les titres d'anticorps sériques, les pCptICICS nOI1 COUpIéS
SCI11u1(:Ilt être un peu plus immunogènes que les peptides couplés.
Efficacité protectrice des poumons des peptides G7a et GBa.
Comme indiqué dans la Fig. 5B, les poumons de toutes les souris 10 immunisées avec les peptides G7a ou GBa, couplés ou non à BB, sont protégés contre un challenge avec Ie VRS-A, sans présence de virus ou seulement à la limite de détection de l'essai.
Conclusions.
pendant 10 I111IlutcS a tcmpc:ralurc ambiante. LC'.S Clellx Sut'nFIgC:antS
SOIR
récupérés, précipités à l'éthanol absolu ct I'CSllspeIlCllls Clai'1S 5U yl d'I-I20.
~ Réaction d'extension Celle-ci est réalisée par PCR en prenant 10 yl de chacune des réactions d'amplification dans les conditions ci-dessous (95°C 15 secondes 5 cycles (35°C 30 secondes (72°C 30 secondes Le fragment généré est amplifié par PCR avec les oligonucléotides RIT27 et RIT28 (95°C 15 secondes 25 cycles (55°C 30 secondes (72°C 30 secondes Le fragment amplifié de 509 pb est digéré avec les enzymes de restrictions PstI et HindIIi. Le fragment généré de 169 pb est cloné dans le vecteur pRIT28 digéré par les mêmes enzymes.
Le plasmide obtenu pRIT28G2a1 down est séquencé avec la chimie des Dye Deoxy Terminator selon le protocole décrit par Applied Biosystem (Perkin Elmer) .
Le plasmide pRIT28G2a1 est obtenu en clonant le fragment PstI/HindIII de pRIT28G2aldown (fragment en aval du site Pst lj dans lc vecteur pRIT28G2Na.
Le gène G2a1 est ensuite cloné dans le vecteur d'expression pvaBB308 aux sites de restriction EcoRI/HindIII générant le vecteur pvaBBG2al.
La liste des séquences des oligonucléotides est indiquée ci-dessous RIT27: 5' - GCTTCCGGCTCGTA'fGTTGTGTCI - 3' Rl'28: 5' - AAAGGGGGnTGTGCTGCAnGGCG - 3' ' 1'I-I 136: 5'- CCGAAGAAAAAACCGlICGACCAAnCCGACC - 3' 1'1-I137: 5' - TT'T'f1'TC'I"I'CGG1"1"fG1"I'G.CfCGGG - 3' 5 RIT29 : RIT27 biotinylé en 5' RIT30 : RIT28 biotinylé en 5' 3.2 Construction de G2a2 i(Seq ID n° 16~
Le principe du clonage est schématisé en bas de la figure 2.
10 Les couples d'oligonucléotides utilisés dans cette construction sont les suivants : RIT29/TNG193(PCR 1) d'une part et TNG192/RIT30(PCR 2) d'autre part. Les séquences des oligonucléotides sont décrites ci-dessous TNG 192 : 5'- CCGCCGAAAAAACCGAAAGACGAT - 3' TNG 193 : 5' - CGAAATGGTAATCGTCTTTCGG - 3' 3.3 Construction de G2a3 I(Seq ID n° 17~
Les deux fragments en amont et en aval du site unique PstI ont été
rassemblés sur le mème vecteur pour donner pRIT28G2a3.
Les trois fragments d'inserts G2al, G2a2 et G2a3 ont été clonés dans différents vecteurs d'expression dans E. coli, en particulier dans nos exemples les vecteurs pvaBB308 où BB est le gène codant pour le récepteur d'Albumine. Les protéines de fusion obtenus BBG2al, BBG2a2 et BBG2a3 peuvent étre aisément purifiées par affinité sur colonne HSA-Sepharose (Hurnan serum Albumin).
3.4 Fermentation et purification de protéines de fusion BBG2a1 et BBG2a2 Dans deux erlenmeyers contenant 250 ml de milieu TSB (Tryptic Soy Broth, Difco) avec de l'Ampicilline (100 ug/ml, Sigma) et de la Tétracycline (8 ug/ml, Sigma), on inocule avec E. coli RV308 transformes avec les plasmides pvaBBG2a 1 et pvaBi3G2a2 respc:ctivcmcnt. On incu tee pendant 16 heures à T° = 37°C sous agitation. 200 ml de cette culture sont inoculés dans un fermcntcur {CI-IEMAP CF3000, ALFA LAVAL) contenant 2 litres cie milieu de culture. Lc milieu contient (g/1) = glycérol, S ; sulfate d'ammonium, 2,6 ; dihydrogénophosphatc de potassium, 3 ; hydro-génophosphate dipotassium, 2 ~ citrate de sodium 0,5 ; extrait de levure, 1 ; Ampicilline, 0,1 ; Tétracycline 0,008 ; Thiamine, 0,07 ; sulfate de magnésium, 1 et 1 ml/1 de solution de traces éléments et 0,65 ml/1 dc solution de vitamines. Les paramètres contrôlés durant la fermentation sont : le pH, l'agitation, la température, le taux d'oxygénation, l'alimentation de' sources combinées (glycérol ou glucose). Le pH est régulé
à 7,0. La température est fixée à 37°C. La croissance est contrôlée cn alimentant du glycérol (87 %) à un débit constant ( 12 ml/h) pour maintenir le signal de tension de l'oxygène dissous à 30 %. Lorsque la turbidité de la culture (mesurée à 580 nm) atteint la valeur de 80 (aprcs environ 24 heures de culture), la production des protéines est induite par addition de l'acide indole acrylique (IAA) à la concentration finale de mg/1. Environ 4 heures après induction, les cellules sont récoltées par 20 centrifugation. Les rendements en biomasse obtenus sont environ 200gr de biomasse humide. Les rendements de production de BBG2a1 et de BBG2a2 sont environ de 4 à 6 mgr de protéines par gr de biomasse.
Une fraction de 30 g de biomasse humide est resuspendue dans 70 ml de solution de TST (Tris-HCl 50 mM pH 8,0, NaCI 200 mM, 0,05 25 Tween 20 et EDTA 0,5 mM). Les cellules sont désintégrées par sonication (Vibracell 72401, Sonies & Materials). Après centrifugation du lysat cellulaire, le surnageant est filtré (1,2 gym) et dilué dans 500 ml de TST.
Les protéines de fusion ainsi obtenues sous forme soluble sont purifiées sur colonne d'affinité : HSA-Sepharose (human serum albumin) selon le protocole décrit par (Stahl et col, J. Immunol. Methods, 1989 ; 124 : 43-52).
Le lysat insoluble, aprcs centrifugation, est lavé une fois avec lin tampon ('tris-HCl 50 mM pl-I 8,5 ; MgCI,, 5 mM). Aprcs lavage, lc culot est S solubilisé dans 30 ml dc chlorhydrate de guaniciinc 7 M, 'fris-I-ICl 25 mM
(pH 8,5), Dithiotreitol (DT'f) 10 mM, suivi d'une incubation n 37°C
pendant 2 heures. Les protéines solubilisées sont additionnées à un tampon dc renaturation (Tris-i-ICl 25 mM (pH 8,5) ; NaCI 150 mM et 0,05 % Tween 20). La concentration du chlorhydrate de guanidine est ajustée à la concentration finale de 0,5 M dans le tampon de renaturation avant l'addition des protéines de fusion solubilisées. Le mélange est incubé à
température ambiante, sous agitation modérée, pendant 16 heures. Après centrifugation, les produits de fusion solubles dans le surnageant sont purifiés sur colonne HSA-Sepharose. Les protéines de fusion purifiées sont analysées sur gel SDS-PAGE ( 12 %), sur l'appareil MINI PROTEAN Il SYSTEM (BIORADS). Les protéines sont visualisées avec du Coomassie brilliant blue 8250. De plus, l'analyse des protéines recombinantes par Immunoblot avec des anticorps spécifiques du VRS montre que les protéines sont antigéniques.(voir exemple de gel SDS et immunoblot de BBG2a1 sur la figure 3).
Exemple 4 : Immunogénicité et efficacité protectrice des peptides G5a et G9a couplés à P40.
Matériels et méthodes.
Des groupes de 7 souris ont été immunisés 2 fois par voie i.p. avec 20 ug de P40-G9aCys, P40-CysGSa, ou P40-GSaCys. Des souris témoins ont été immunisées avec le PBS. L'Alhygrogel (20 % v/v) a été utilisé
comme adjuvant pour toutes les immunisations. Les souris ont été
prélevées au sinus rétro-orbital 2 semaines après la dernière immunisation pour confirmer leur séroconvcrsion vis-à-vis lc VRS-A, challcngécs unc semaine plus tard avec 105 TCIDSO VRS-I1 par voie i.n., ct sacrifices 5 jours post-challenge. Les poumons ont cté prclcvcs ct le turc dc virus clans les poumons détcrrniné.
Résultats Réponses immunes humorales.
Comme indiqué dans la Fig. 4A, l'immunogénicité du peptide G5a est dépendante de l'orientation du couplage au P40. Après couplage par la partie C-terminale du peptide, des titres en anticorps anti-VRS-A faibles à
modérés ont été induits dans le sérum. Par contre, après couplage par la partie N-terminale, G5a n'a pas induit de tels anticorps. En général, le peptide G9a, couplé en C-terminal à P40, a été faiblement immunogénique en terme d'induction d'anticorps anti-VRS-A. Une souris sur sept immunisées avec P40-G9acys a développé un titre d'anticorps sériques anti-VRS-A élevé.
Efficacité protectrice des poumons des peptides G5a et G9a.
Comme démontré dans la Fig. 4B, et en corrélation directe avec la détection des anticorps anti-VRS-A, le peptide G5a a induit des réponses immunes protectrices quand il était couplé en C-terminal, mais pas après couplage en N-terminal. En effet, 6 souris sur 7 immunisées avec le P40-GSacys (couplage C-terminal) ont été protégées sans évidence de virus dans les poumons, le dernier n'a eu du virus qu'à la limite de détection de l'essai. Par contre, les souris immunisées avec P40-cysGSa (couplage N-terminal) ont eu des titres de virus dans les poumons aussi élevés que les souris témoins, immunisées avec le PBS. Ces résultats confirment que l'orientation du couplage de ce peptide à une protéine porteuse est capitale pour son efficacité protectrice. La corrélation entre la protection et l'induction des anticorps asti-VRS-A sttgn~~rc: clac la prolcction pulmonnirc observce est médicc, en partie au moins, par ics anticorps.
Malgré le fait que le P40-G9aCys ait été faiblement immunogéniquc S chez la souris en termes d'induction d'anticorps sériques anti-VRS-A, les poumons de S souris sur 7 ont été protégés contre un challenge par Ic VRS-A. En effet, 1 souris sur 7 n'a pas montré d'évidence de virus dans les poumons, ni même d'anticorps anti-VRS-A dans le sérum.
Conclusions.
Les peptides GSa et G9a contiennent des épitopes protecteurs vis-à-vis d'une infection VRS-A des poumons. L'orientation du couplage de GSa à une protéine porteuse est capitale pour son efficacité protectrice.
1 S Exemple 5 : Immunogénicité et efficacité protectrice des peptîdes G7a et GBa.
Matériels et méthodes.
Des groupes de 3 à 4 souris ont été immunisés 2 fois par voie i.p.
avec 20 ug de G7a, GBa, BB-G7a, ou BB-GBa. Des souris témoins ont été
immunisées avec le PBS. L'Alhygrogel (20 % v/v) a été ulitisé comme adjuvant pour toutes les immunisations. Les souris ont été prélevées au sinus rétro-orbital 2 semaines après la dernière immunisation pour confirmer leur séroconversion vis-à-vis du VRS-A, challengées une semaine plus tard avec 105 TCIDSO VRS-A par voie i.n., et sacrifiées 5 jours post-challenge. Les poumons ont été prélevés et les voies nasales lavées.
Les titres de virus dans les poumons et les voies nasales ont été
déterminés.
Résultats.
Réponses immunes humorales.
Comme indiqué dans la Fig. 5A, les peptides G7a rt G8a sotlt LUUs cieux immunogéniques vis-à-vis du VRS-A couples ou non a 1313. Si l'on S COIlsld(:I'e les titres d'anticorps sériques, les pCptICICS nOI1 COUpIéS
SCI11u1(:Ilt être un peu plus immunogènes que les peptides couplés.
Efficacité protectrice des poumons des peptides G7a et GBa.
Comme indiqué dans la Fig. 5B, les poumons de toutes les souris 10 immunisées avec les peptides G7a ou GBa, couplés ou non à BB, sont protégés contre un challenge avec Ie VRS-A, sans présence de virus ou seulement à la limite de détection de l'essai.
Conclusions.
15 Les peptides G7a et G8a contiennent des épitopes protecteurs vis-à-vis des poumons. Les peptides sont efficaces couplés ou non à BB.
Exemple 6 : Immunogénicité et efficacité protectrice de la protéine de fusion BBG2a 1.
Matériels et méthodes.
Afin de déterminer l'immunogénicité et l'efficacité protectrice de BBG2a1 contre les VRS-A et B, des groupes de 3 souris ont été immunisés 2 et 3 fois, respectivement, par voie i.p. avec 20 ug de protéine à 2 semaines d'intervalle. Des souris témoins ont été immunisées avec le PBS.
L'Alhygrogel (20 % v/v) a été utilisé comme adjuvant pour toutes les immunisations. Les souris ont été prélevées au sinus rétro-orbital 2 semaines après la dernière immunisation pour confirmer leur séroconversion vis-à-vis du VRS-A, challengées une semaine plus tard avec i05 TCIDSO VRS-!1 par voie i.n., et sacrifices S jours post-challenge. Les pOL1n10I1S OIlt CtC pl'C1CVCS CL 1C tltrC C1C'. V1I'uS CIMtIS ICS pOUI110I1S
(lCtc'.I't111n('.
Résultats.
Immuno~énicité cie BBG2a 1 V1S-rl-V¿S C1CS VIES-A ct 13.
Les résutats présentés dans les Fig. f~A et B démontrent clac Ie BBG2a1 est capable d'induire des anticorps anti-VRS-A et B. Comme.
attendu, le titre en anticorps anti-VRS-A est bien supérieur au titre en anticorps anti-VRS-B. Néanmoins, des titres cn anticorps contre lcs deux souches de VRS sont élevés.
Efficacité protectrice de BBG2a1 vis-à-vis du VRS-A et du VRS-B.
Comme indiqué dans ies Fig. GC et D, l'immunisation des souris avec BBG2a1 a induit des réponses immunitaires capables de protéger les poumons contre un challenge avec le VRS-A et contre un challenge avec le VRS-B. Les souris challengées avec le VRS-A ont étc protégées sans évidence de virus dans les poumons (2 souris/3) ou seulement à la limite de détection ( 1 souris/3). Les souris challengées avec le VRS-B ont été
protégées, soit sans évidence de virus dans les poumons ( 1 souris/3) soit avec du virus qu'à la limite de détection (1 souris/3) ou juste au-dessus de cette limite (1 souris/3) de détection.
Conclusions.
La protéine de fusion BBG2a1 est très immunogénique vis-à-vis du VRS-A et vis-à-vis du VRS-B. BBG2a1 est capable d'induire des réponses qui protègent les poumons contre un challenge avec les 2 sous-groupes de VRS.
Exemple 7 : Obtention des anticorps 18D 1, 5C2 et 5B7 Peptide d'llnn1L1111S~itlOn : (i) CTIdCa couples au 1L1-i (Hcyholc Lcmpct 1-Iaomocyanin), (ü) G2nCa ct (iii) B13G2Na.
Lcs souris ont cté immunisccs à JO avec 50 pg (~'e111tIbCIIC Cil CFA
(complote Frcund Adjuvant) en ip, à J 14 avec 10 ug dc chacluo antigène on IFA (Incomplete Freund Adjuvant) en ip, puis a J38 cn iv avec lOllg cle chaque peptide sans adjuvant. Les rates sont prélevées ct fusionnées avec les cellules dc myélome SP2-O à J42 dans un rapport 1 / 1. Les hybridomcs positifs contre chaque antigène sont gardés. Ces hybridomcs ont été
injectés à des souris pour obtenir des ascites puis les différents anticorps obtenus ont été sélectionnés sur différents peptides afin de déterminer la spécificité des anticorps obtenus. Les anticorps monoclonaux 18D 1, 5C2 sélectionnés par leur spécificité contre les peptides G ldCa, GSa, reconnaissent spécifiquement le VRS-A. L'anticorps monoclonal 5B7 obtenu à partir de BBG2Na et reconnaissant lc peptide G 1 la rcconnait lc VRS-A.
Exemple 8 : Effet curatif des anticorps monoclonaux 18D 1 et 5C2 sur l'infection chronique à VRS-A obtenue chez la souris SCID.
Matériels et méthodes.
Les souris C.B-17 scid/scid ont été challengées par voie i.n. avec IOs TCIDSO de VRS-A, sous 50 ul. Vingt six jours plus tard, les souris ont reçu par voie i.n. et à raison de 7 souris par groupe, 50 ~1 d'une préparation d'anticorps 18D1 ou d'anticorps 5C2 à un titre ELISA anti-VRS-A de 104. Des souris témoins ont reçu du sérum anti-BB à un titre ELISA anti-BB de 104. Les souris ont été sacrifiées 5 jours plus tard et leurs poumons ont été prélevés pour titrage du virus.
Résu ltats.
Lcs résultats prCacntés d~lns la l'ig. 7 clémont.rcnt que ILS zntlcorps 11'lOIlOCIOnaux 18D1 Ct 5C2 SOIR Cfl~~l~lCS Cl'C11I111nCI' unC iII¿CCtlOt1 chronique avec le VRS-A chez la souris SCID et CCCI C1'unC IllalIlIC'.t'C
stérilisante. Aucune trace de virus n'a étc dctectée clans les poumons au moment du sacrifice. Les résultats obtenus dans les poumons des souris traitées avec le 5C2 correspondent à la moyenne des limites de dcacction de l'essai, limite plus élevée du fait du manque de disponibilité
d'échantillon, et non pas à la présence de virus.
Conclusions.
Les anticorps monoclonaux 5C2 et 18D 1 pourraient ètre utilisés comme traitement thérapeutique dans le cadre des infections pulmonaires à VRS-A.
Exemple 9 : Effet prophylatique de l'anticorps monoclonal 18D 1 sur l'infection à VRS-A chez la souris.
Matériels et méthodes.
Un groupe de souris BALB/c naïves, séronégatives vis-à-vis du VRS-A, ont reçu par injection intrapéritonéale 200 ul d'une préparation d'anticorps 18D 1 ajustée au titre ELISA anti-VRS-A de 105. Un groupe de souris témoins transfert i.p. ont reçu en parallële 200 ul d'une préparation de sérum anti-P40 (sérum irrelevant) ajustée au titre ELISA anti-P40 de 104. Toutes les souris sont infectées le jour suivant par voie i.n. avec 50 ~Il d'une suspension virale contenant 105 TCID50 de VRS-A. Elles sont sacrifiées 5 jours plus tard pour dosage de virus dans les poumons.
_. _ ___ _.____. _ , _ .__.
t~~~" if.,t~
Comme indique clans la f ig. 8A, l'anticorps 18I~ I est: calrWlc apres tI'flnSfel't i.p. d'induire une protection <.~u niveau d<~.s pOL11110I1S CIC
sUUI'1S
naïves lors d'un challenge avec Ie VRS-A. 'foutes lc~s souris sonl protcgcos après injection dc 200 ul de 18D 1 au titre dc 105. 'I~I'O1S sOLII'1S SL1I' 7 sUIII.
protégées sans évidence de virus dans les poumons. Lcs aLltres Illonll'cnl des traces de virus seulement à la Iimite dc dètection de l'essai (3 souris/7), ou juste au-dessus de cette limite ( 1 souris/7). Les souris témoins ont des titres compris entre logl0 3.70 et 4.45 par gramme cie IO poumons.
Conclu sion.
L'anticorps 18D 1 est capable de prévenir une infection pulmonaire à VRS-A chez la souris BALB/c. Il démontre une efficacitc prophylactique importante.
Exemple 10 : Effet prophylatique d'anticorps monoclonal 5C2 sur l'infection à VRS-A chez Ia souris.
Matériels et méthodes.
Des souris naïves séronégatives vis-à-vis du VRS-A reçoivent par transfert i.n., 50 ~1 d'une préparation de 5C2 ajustée au titre ELISA anti-VRS-A de 104. Des souris témoins reçoivent en parallèle du sérum anti-BB
ajusté au titre ELISA anti-BB de 104.
Toutes les souris sont infectées le jour suivant par voie i.n. avec 50 ul d'une suspension virale contenant 105 TCID50 de VRS-A. Elles sont sacrifiées 5 jours plus tard pour titrage de virus dans les poumons.
W O 99/03987 PCT/FR98/Ol 570 Résu ltats.
Comme le montre la l~ ig. 813, toutes ILS souris traitcca avec Ie 5C2 à
104 ont cté protcgccs au niveau pulmonaire. Seule 1 souris sur 7 montre des traces de virus. Lcs souris tcmoins ont clos titres compris entre loglt) 5 3.70 et 4.70 par gramme dc poumons.
Conclusion.
L'anticorps 5C2 est capable de prévenir une infection pulmonaire à
VRS-A chez la souris BALB/c. I1 démontre une efficacité prophylactique 10 importante.
Exemple 11 . Pepscan . exemple de la synthèse muliple de 94 octapeptides couvrant la séquence de l'aa 130-230 de G2Na et se chevauchant par un acide aminé.
15 Une plaque "PEPSCAN" de 96 octapeptidcs synthétisés en parrallcle (2 peptides de contrôle + 94 peptides couvrant la séquence 130-230 de la protéine G du VRS-A) est préparée selon la technique MULTIPINT'" décrite par Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1984, 81, 3998-4002.
Ces peptides sont synthétisés sur support solide à l'extrémité de 96 20 "pins" (8 x 12) complémentaires d'une plaque de microtitration ELISA dans laquelle sera effectuée directement le criblage d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux (sera).
~ Système de repérage des positions des pins et des puits 25 Le système de numérotation utilisé est le suivant position A 1 ( 1 ) = Plaque n°A, ligne 1 ( 12 lignes) colonne 1 (position H 1 en ELISA) position A2( 1) = Plaque n°A, ligne 2, colonne 1 (position H2 en ELISA) A 1 ( 1 ) : peptide de contrôle # 1 : PLAQGGGG
A2(1) : peptide de contrôle # 2: GLAQGGGG
A3( 1) : octapcptide # 1 : TVhThN1"f A4( 1) : octapcptidc # 2 : VK'fi~N'Cl"f ctc.
A 12(8) : oclapcptidc # 94 : I'EVPT'fKI' ~ Synthèse La synthèse correspond à plusieurs cycles de déprotcction, de lavages et de couplage jusqu'à obtention des séquences peptidiques désirées. A la fin de la synthèse, les peptides sont N-acétylés, avant l'étape de déprotection des chaines latérales.
Les acides aminés utilisés pour la synthèse sur pins sont protégés par un groupement Fmoc (9-Fluorénylméthoxycarbonyl) et les groupements protecteurs des chaines latérales suivants : t-Butyle éther (tBu) pour la Sérine, la Thréonine et la Tyrosine, t-Butyle ester (OtBu) pour les Acides Aspartique et Glutamique, t-Butoxycarbonyle (Boc) pour la Lysinc, l'I-Iistidine et le Tryptophane, 2,2,5,7,8-pcntaméthylchroman-6-sulfonyle (Pmc) pour l'Arginine, Trityle (Trt) pour la Cystéine, l'Asparagine et la Glutamine. L'activation de la fonction acide est effectuée avec de la Düsopropylcarbodümide (DIC) et du 1-hydroxybenzotriazole (HOBt) dissouts dans du DMF.
~ Fmoc-dëprotection et lavages : La plaque de pins est immergée dans un bain contenant 200 ml d'une solution de pipéridine à 20 °.ô dans le DMF (40/ 160 ml) pendant 20 min. à température ambiante sous agitation.
Les pins sont ensuite retirés du bain. L'excès de solvant est éliminé en frappant le bloc de pins sur du papier-linge. Les pins sont lavés dans 200 ml de DMF pendant 2 min. à température ambiante sous agitation. Le bloc est frappé sur du papier-Iinge et immergé complètement dans un bain dc MeOI-I pendant 2 min. sans agitation. I,es pins sont imlncrgcs dans 200 nll dc MeOI-I eriSUllC (3 bains dc 2 I111I1Lll.CS, 200 I111~1J~11t1~. L~l pl~iqL1(' est séchcc pendant 30 min.
~ Couplage des Fmoc-amino acides : Lcs Fmoc-amino-acides subissent une étape d'activation avant de pouvoir être couplés. La durée d'une étape de couplage est de 2 heures pour une concentration de 100 mM avec 1.5 équivalent d'HOBt et 1.2 équivalent de DIC. Un logiciel permet de calculer les quantités de réactifs nécessaires pour l'étape de couplage. Les pesées sont effectuées dans des tubes classés par ordre alphabétique du code a une lettre des acides aminés. Les tubes sont remplis en dehors de la balance sur une feuille de papier-linge, puis pesés jusqu'à l'obtention d'une masse proche de celle indiquée sur la feuille de pesée. La masse ne doit pas être inférieure de 0.2 mg ni supérieure dc 0.9 mg par rapport à la quantité théorique.
~ Etape de couplage : Les pins sont introduits délicatement dans les puits. La boîte est fermée soigneusement et laissée sous une hotte pendant la durée du couplage pendant 2 h pour une concentration en acides aminés de 100 mM. Un couplage de 2 h permet de réaliser 3 couplages par jour.
~ Traitement des blocs de pins après couplage : Les pins sont retirés de la plaque contenant les solutions de couplage et lavés avec 200 ml de MeOH sous agitation pendant 5 min. Le bloc est frappé sur du papier-linge et laissé sécher pendant 2 min. Le bloc est placé dans 200 ml de DMF et lavé pendant 5 min. sous agitation avant d'effectuer le cycle suivant de déprotection. La plaque est lavée classiquement et subit l'étape de clivage des groupements Fmoc comme décrit ci-dessus après le dernier couplage.
WO 99/03987 PC'r/FR98/01570 ~ Acétylation des amines terminales : Ics tétcs tlc pins sont mises Z
incuber dans les puits d'une plaque contenant 150 ul du mélange rc<~ctif suivant : DMF/Anhydridc acctiquc/trictylaminc SONS/ 1 (v/v/v). I,c bloc est enfermé dans une boîte pendant 90 min. à tempcraturc ambiante. Lc bloc est lavé ensuite avec 200 ml de McOI-I pendant 15 min. puis séchc pendant 15 min.
~ Déprotection des chaînes latérales : les groupements protecteurs des chaînes latérales sont éliminés en immergeant Ies pins dans 200 ml d'un lU mélange TFA/anisole/IJthanedithiol 190/5/5 ml pendant 2 h 30 à
température ambiante. Après cette étape de déprotection, le bloc de pins est retiré de la solution acide. La boîte est rincée une fois au MeOI-I, puis remplie de MeOI-I pour y immerger complètement le bloc de pins pendant min. Le bloc est alors frappé sur du papier-linge puis immergé dans 200 ml d'un mélange MeOi-I/eau/acide acétique ( 100/ 100/ 1 ml) pendant 1 heure et frappé à nouveau sur du papier-linge. Le bloc est mis sous-vide dans un dessiccateur pendant une nuit.
Exemple 12 : ELISA
La plaque portant les pins est saturée 1 heure à 37°C en tampon de saturation (PBS, Tween 0,1 %, gélatine 1%), lavée 10 min en PBS et incubée une nuit à 4°C sous agitation avec le sérum à analyser préalablement dilué. La plaque est ensuite lavée 4 fois 10 min en PBS et incubée une heure à température ambiante avec un anticorps secondaire marqué à la péroxydase, dilué au 1/5000 e. Après 4 lavages en PBS, le substrat TMB est ajouté. L'arrét de la réaction est effectué par addition d'acide sulfurique.
Le résumé des données résultant de l'analyse d'un sérum murin anti BBG2Na par la méthode du Pepscan B est représenté sur la figure 9.
Les figures 9A et 9B montrent une réactivité du sérum de souris anti-BBG2Na contre 4 régions dc la molécule G2Na (Ics résidus en trait ' gras représentent les acides aminés jouant un rôle important dans la reconnaissance Ae/Ag) - la région 1 située entre les résidus 150 et 159 dont la séquence est QRQNKPPNKP. Cette région est comprise dans le peptide G5a ( 144-15~)) et correspond à la zone de réactivité de l'anticorps monoclonal 5C2 ;
- la région 2 située entre les résidus 176 et 189 dont la séquence est CSNNP'I'CWAICKRI. I1 s'agit d'une région localisée au niveau du peptide G lOCa ( 174-187) et correspondant à la réactivité des anticorps monoclonaux 18D 1 et 5D3 ;
- la région 3 située entre les résidus 194 et 207 dont la séquence est PGKKTTTKPTKKPT. Cette séquence correspond à une réactivité au niveau du peptide G9 ( 194-204), réactivité déjà mise en évidence lors de la production d'anticorps monoclonaux dirigés contre BBG2Na ;
- la région 4 qui s'étend sur une large zone allant du résidu 155 au résidu 176 semble étre le résultat de différentes réactivités. L'une de ces réactivités qui couvre une région très hydrophobe de la molécule G2Na (Glla) correspond à la zone de reconnaissance de l'anticorps monoclonal 5B7 (obtenu après immunisation de souris BALB/c par le candidat vaccin BBG2Na) dont le pepscan B est représenté ci-dessous dans la figure 10.
Cet anticorps monoclonal reconnaît la séquence FEVFNFVP ( 165-172).
L'ensemble des quatre réactivités ci-dessus a par ailleurs été
confirmé par la titration du sérum anti-BBG2Na au moyen de différents ELISA mis au point pour chacune des réactivités. Le tableau I montre que le sérum anti-BBG2Na présente bien des activités "anti-G4a, G5a cys, G9a cys et Glla".
Tableau I : Titres anti-G4a, GSaCys, G9aCys et Gll~Ca exprimés en 1og10 du sérum anti-BBG2Na ref. BE-02.
Titre(loglo) BE - 02 G2Na 5.9 KLH-G4a 4.7 KLH-G9aCys 5.0 KLH-GS aCys 3 , $
P40-G 11 ~Ca 3 .5 5 Conclusion L'étude d'un sérum anti-BBG2Na par la technique du Pepscan montre que l'immunisation de souris avec BBG2Na génère des anticorps contre 4 épitopes B situés respectivement dans les régions 150-159, 176-189, 194-207 et 155-176. Cette technique permet donc de confirmer 10 l'importance de la région 164-176 (G 1 lOCa).
Ces résultats sont, par ailleurs, en parfait accord avec les donnces ELISA concernant la réactivité d'un sérum anti-BBG2Na sur ies peptides G4a, GSaCys, G9aCys et G 1 laCa.
T~T~ DE
Infa~naticn pour la SD~ m NO : 1 C~,Ca TYPE DE SES : acides aminés et nucléotides I~C~E(1R DE LA SD~UE~E : 14 acides aminés, 42 nucléotides N~RE DE BRINS : simple O~VF'IC~Jf~ATI~1 : linéaire TYPE DE NDI~t.~E : peptide N - Ser Ile Cys Ser Asn Asn Pn~ Thr Cys Trp Ala Ile Ser Lys - C
5' - AGC AT~ TGC AGC AAC AAC CC7G ACC ZGC 'ICI GC~ A~ AC~C AAA - 3' ?~fomnatian pour la SaQ m NO : 2 Q'OCa TYPE DE SD: acides aminés LDE LA S: 14 acides am;r~és NCZ~RE DE BRINS : simple 0~1FIC~AZTC~T : linêaire TYPE ~ ~3CC11.~E : peptide N - Ser Ile Asp Ser Asn Asn Pro Thr Czn Trp Ala Ile Ser Lys - C
Info~c~at3.an pour la S~ ID NO : 3 Gl~Cb TYPE DE SD: acides aminés et nucl~tides L~JEIkt ~ LA SD: 14 acides am>.r~és, 42 nucléotides NC~RE DE BRIrIS : simple CJ~1FIC~RA~TCY~1 : linéaire TYPE DE NDLECi~E : peptide N - Ser Ile Cys Gly Asn Asn Gln Leu Cys Lys Ser Ile Ser Lys - C
5' - AOC AZL~ 'IC~C 03C AAC AAC CAG C'IG TC3C AAA AOC ATC AOC AAA - 3' Z~afo~nation paur la SaQ m NO : 4 Gl'ACb TYPE DE SF7: acides aminés Ll~7EUR DE LA SF7: 14 acides aminés NC~RE DE BRIS : simple 03~1F'IC~7RATIC~1 : linéaire TYPE L~ M~LECL~E : peptide N - Ser Ile Asp Gly Asn Asn Gln Leu Orn Lys Ser Ile Ser Lys - C
fEüILLE DE REMPLACEMENT (REt~LE 26) zhfaxa~ticn pour la SDQ ID NO : 5 G5a TYPE DE S: acides aminés et nucléotides Uft DE LA SE~J~'E : 16 acides aminés, 48 nuclêotides NC~RE DE BRINS : simple CxNF'IG(k~ATICN : linéaire TYPE DE Nt3LECL~.Ir : peptide N - Ser Lys Pro Thr Thr Lys Gln Azg Gln Asn Lys Pn~ Pn~ Asn Lys Pro - C
5' - ACC AAA CCN ACC ACar AAA CAG CCT CAG AAC AAA CGJ GC~ AAC AAA CCN - 5' 7~nfa~uation pour la SDQ Zn NO : 6 Gôb TYPE DE SD: acides aminés et nucléotides IGNGC~kt DE LA E : 16 acides aminés, 48 nucléotides NC~RE DE SR~IS : simple O~k'IG'üRATICB~T : linéaire TYPE DE NDL~~E : peptide N - Asn Lys Pzt~ Ser Thr Lys Ser Atg Ser Lys Asn Pn~ Pro Lys Lys Pro - C
5' - AAC AAA ~ AOC AGA AAA .SOC CCT AOC AAA AAC Cû~ C0.G AAA AAA OCG - 3' Tnfoarmat3on pour la SEQ ID NO : 7 Gla TYPE DE SD~7E~E : acides am~r~és et nucléotides L~~1R ~ LA S: 33 acides aminés, 99 nucl.éotides NC~RE DE BRINS : simple Q~1FICCN : linéaire TYPE DE N~JL~7CL~E : pirotêine N - Lys Pro Asn Asn Asp Phe His Phe Glu Val Phe As~n Pige Val Pro Cys Ser Ile 5' -AAA CL'~ AAC AAC GAT T'IC CAT TIC GàA GIS TIC AAC TIC GTG ~ ~C AOC P.'Ilr Cys Ser A9n Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys Azg Ile Pn~ - C
TGC AOC AAC AAC CCN AOC TC3C TGG GCx A'I~ 'I'U"~C AAA C~T A'IC CCN - 3' ~fcrmation pour la S~7Q m N0 : 8 G'lb TYPE DE SD: acides aminés et r:ucléotides It DE LA SD~~ : 33 acides aminés, 99 rnzcléatides NC~RE DE BRIUS : simple CE~1F'IC~ktP.TICN : linéaire TYPE DE M~LDCiJLE : prntéirbe N - Lys Pro h~s As~ Asp Tyr His Fhe Glu Val Phe A~ Aie Val Pm Cys Ser Ile Cys Gly 5' - ApA fJT AAA GRT GAT T~tC CEC TIç G7.1A GIG TIC AAC TIC GIG O~ ~ FL3C A'IC
3L~C G~
Asn A~ Gln Leu Cys Lys Ser 11e Cys I~rs ~ Ile Pro - C
AAC ApC CFG CIG TG~ AAA PG~ AZC ~ A~1A ~ ATC OT - 3' FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) L-ifornnaticn pour la SDQ ID NO : 9 G8a TYPE DE SD: acides aminés et nuclêotides L~C~'t DE LA SE1~IJENCE : 43 acides aminés, 129 nucléotides NC~RE DE SRINSS : simple Ct~TFIC'~ATICl~1 : linéaire TYPE DE M~LECt~.~E : plrotéine N - Lys Pro Agn Ain A~p I~ I~ Ft:e Glu Val Phe A~ Plie Val Pzo Cya Ser Ile Cyg Ser 5' - AAA aT ~i~AC J4FC GAT TIC CCT TI~ G0. C1IG TI~ AF~C TIC GIG OT TCCIr )1C3C ATC TC~ M3C
A~ P.sn Pro 'Ihr Cys Trp Ale Ile Cys Lys Azg Ile Pm A~ Lys Lys Pro Gly Lys Iys Zhr AAC A~1C QT~ ~ 2ï'~ 2C~ C~G ATC 'Iï~ AAA Qsi' A'1C QT AAC AAA J4AA ~ CI:,1C
AAA AAA ~
~' 'Ihr - C
PS 14~ - 3' Irifo~naticn peur la SDQ 1D N0 : 10 G8b TYPE ~ S~~ : acides aminée et nucléotides L~k.'CØZ DE L~ SD: 43 acides am;x:és, 129 nucléotides NC~RE DE HR'~S : simple ûNFIC~ktATICN : lir:éaire TYPE DE NDLFX.'L~E : p~r~téine N - ~ ~ ~ ~P ~P ZYr'~ Phe Glu Val F~he Asn Phe Val Piv Cys Ser Ile Cys Gly 5' - AAA QT AAF1 G'AT G7.1T ThC CAC TIC GP~A GIG TI~ ApC TIC GIG CJJC 'IDC ~
AT~ TOC Q~
178 182 186 l9g a~ A~ Gln Leu Cys Lys Ser Ile Cys Lys Ztsr Ile Pro Ser n~ Lys Pro Lys Lys Lys Pro ~c sac c~ cic ~ ~ x~ ~c ~c ~ soc azc a~ x~ arc ,~a mc ~ ~ ~ o~c Zhr Ile - C
AOC A'IC - 3' Iafa~aatiai pour la SDQ ID N0 : 11 G9a TYPE DE SES : acides aminés et rnlcléotides LDE LA SD: 15 acides aminés, 45 nucléotides N~tE DE ~ : simple C~NFIQ7~ATIC~1 : linéaize TYPE DE N~ : plvtéine N - Pro Asn Lys Lys Pzro Gly Lys Lys Ttlr Thr 'Iizr Lys Plro Thr Lys - C
5' - CCN AAC .'~AA AAA ~ C~C~C AAA AAA. ACE A~ AOC AAA C'CZ3 ACC AAA -3' Ihfoa~atian pour la SDQ m NO : 12 G9b TYPE ~ SD~C1E,'NC'3J : acides aminés et nucléotides LCrIG(~(kt L~ LA : 15 acides aminés, 45 nucléotides NDE BRINS : simple FEUILLE DE REMPLAÇ~M~N'~ (REGLE 2fi) O~1F'IC~tATICN : linéaire TYPE DE M~LDCIJLE : protéine N - Pro Ser Asn Lys Pro Lys Lys Lys Pro Thr Ile Lys Pro Thr Asn - C
5' - CCN P~OC AAC AAA C1'~ AAA AAG AAA CGs ~1C~ ATC AAA CtT ACC AF~C - 3' ~foa~,tian pour la SDQ m NO : 13 Cxll.a TYPE DE SD: acides aminés et nucléotides L.''I7R ~ LA : 13 acides aminés, 39 nucléotides NC~RE DE HR~S : simple 0.'âsF'IC~ATTCi~1 : linéaire TYPE L1E NIaL~E : protéine N - His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys -C
5' - CAT TIC GAA GIG TIC AAC TIC GTG CCN 'IC3C ACC ATL ~ -3' Ihfo~ation pour la SnQ m NO : 14 ~ll~Ca TYPE ~ SD: acides aminés et nucléotides II7E LA 1CE : 13 acides aminés, 39 nuclëotides NC~~2E DE BIt~S : eic~ple O~TFIQ.k~ATI~1 : linéaire 'TYPE DE NDI,~X~E : protéine N - His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Ser Ser Ile Cys -C
5' - CAT TIC GAP. GIG ThC AAC TIC G'I~ (33J AGC AOC P.TC TC3C -3' Tnfca~ticn peur la SDQ TD NO : 15 G2a1 TYPE DE SD~I~ : acides amir~,s et nucléotides Ikt I7E LA SE7: 101 acides aminés, 303 nucléotides NC~,RE DE BRAS : simple C~1FIC~)RATICi~1 : linéaire TYPE DE NDLEGLIGr : protéine ~o N - ~r Val Lys ~ Lys A~1 Trx ~ 'mr 'mr Gln Thr CsLn Pro Ser Lys Pro ~r Zhr Lys 5' - POC GIG J4AA ACE AAA AAC Fl'~ AcT FL~ ~ CàG ~ C~G OT Pte AAA US PLZ i~
AAA
Gln Atg GLn A9n Lys Pm Pso A~ Lys Pro Asn A~ Asp Fhe Füs Phe Glu Val Aie Asn Plie c~c~ra~»cr~a~ac~~c~o~~c~cc~~c~~c~cr~T~~cTTc Val Pm G~s Ser Ile Cys Ser Aga A~ Pm 'Ihr Cys ZYp Ala Ile Cys Lys Azg Ile Pm Ser GIG OT Tt.~' » ATC 'IC~C J~OC 74~iC RAC QT P~ 'ILS '1~, (~1T A1C Zi3C AAA QTa AZC aTa FOC
A~ Lys Pm Zys IFS Lys Pxn T~ ~ hys Pm ~r Zys Iys Ps~ ~ phe Lors 'll~ 71~r Lys AAC AAA QT AFG AAA AAA QT, ACr; Plx AAA 0.~ 7~ A~1A 7~1A ~ ~ TtC A~1A ALE Af~
AAA
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 2ô) 2L' 230 Lys Asp Hi9 Lys Pro Gln Zhr Zhr Lys Pro Lys Qu Val Pro Zhr Zhr Lys Psv - C
AAF~ G4T CAT AAF1 nT., CAG ACE ACE AAi.1 C1~T, A~4A C~1A GIr QT l~ 1.1C'Zr AAA
CrT - 3' Ihf~ticn pour la SEQ m NO : 16 C~32a2 TYPE DE STE : aCldes anLl~S et nuCléOtlde9 L~JECk~ DE LA SD: 101 acides aminés, 303 nucléotides NC~RE DE 8R'~S : simple ü,NF'IC~IC7I~1 : linéaire TYPE DE M~LDCL~E : protéine N - Thr Val Lys 'Ihr Lys Agn Thr Thr Zhr Zhr Gln 'Ihr G1n Pro Ser LYs Pro Zhr Zhr Lys 5' - ALZ G'IG AAA ~ AAA AAC ~ ACG ACE AGC CPG ACC C~GG fJT P13C AAA CvT, 7iC' l~ AAA
Gln Azg Qn Asn Lys Pro Pm Lys l.~ys Pro Lys Asp A9P ~'r' His Phe Glu Val Phe Agn F~he CPG ~T CFG AAC AAA CT ~ AAA AAA QT, AAA LAC GAT ~1C CAT TIC C~AA GIG Tir AF~
TIC
Val Pro Cys Ser Ile Cys Ser Ain Asn Pro ~ Cys Tip Ala Ile Cys Lys Azg Ile Pro A~
GIG Q3; ~ FL~ A'IC TOC PL~C AAC AAC ~ l~ TDC TC~G C~7G ATC TC~ AAA Q~T AZC Of~
AAC
Lis Lys Pro Gly Lys Lys Thr ~' 'Ihr Lys Pzo 'll~ Lors Lys Pro Tt~' Phe Lys 1hr Thr hys AAA AAA ~,a C~ AAA AAA l~ ACTa Ff.~ AAA ~, l~ AAA J4AA CTïâ ~ TIC AAA ~tOC PQ
AAA
Lys Asp iLis L:ys Pro Gln T~ ~r Lrys Pra hys Glu Val Pro 'Its ~ Iys Pro - C
Ai~A G4T CAT AAA C4C"a CpG Pû: ACT' iWA QTi ApJ4 G~1A GIG OT'i N.I~ 7~ ~1AA 0T
- 3' ?nfo~ti~ pour la SDQ m NO : 17 Qa3 TYPE DE SD~(7FNCE : acides aminés et nucléotides L~C'~Ckt DE LA SDQL~ : 101 acides aminés, 303 nucléotides IVRE DE BRAS : simple CJSTFIC~RATICN : linéaize TYPE DE N~ : plrotéine N - Trir Val Lys ~ Irys Asn Thr ~ Tla 'Ihr Gln ~r Gln Pro Ser Lys Pm Tts 'üsr Lys 5' - P~ GIG J4AA I~ AW~1 AAC ~ 74~ L1CC AC' CFG ~ CpG QT l~ AAA OT, l~ AI>r AAA
G1n Azg Gln A~ Lis Pro Pro hys Ifs Pro Lys A9p Asp Tyr His Phe GLu Val Phe A9n Phe CPG Q;T CAG AAC A~1A OT OT AAA AAA OT, AAA CEC GAT 7~1C CAT TIC C~1A GIG TIC
Val Pro Cys Ser Ile Cys Ser Asn Asn Pro Tlzr Cys Tip Ala Ile Cys Lys Axg Ile Pro Ser GIG OS TC~ l~ AT~ TL~ FL~ AAC AAC aT 7àCC TL~ 1L~ OT ATC ~ AF~A Q~T ATC OT PLI
A~ Lys Pro Lis Ifs Lys Pro 'Ihr' ~' Lt~s Pro 'ü~ Iys L:ys Pro ~ F~he Rys ~r T1~ Lys ATaC AAA QT A~ AF~i.1 A~4A 0.'G ~ ~ 1~1A OT 7~ ACP. AAA QT, l~ TIC 3WA ~ 3~
A~4A
hys Asp His Lys Pro C~ln 2hr Thr Lrys Pro Iys Glu Val Pro ~ T>~ Lys Pro - C
AAA G4T CAT AAA C1T CAG PLT FROC AAA CCT AAA C~AA GTG OT äCC I~ AAA OT - 3' FEUILLE DE REMPLACEMEf~T (REGLE 26) Tnfau~ation pour la SDQ m NO : 18 G9v TYPE DE SD~t.IEI~CE : acides aminés et nucléotides L~1EUR DE LA S~UEI~C'~ : 15 acides aminés, 45 nucléotides NC~RE DE BRINS : sitrple a~LVF'zc~ATrc~1 : linéaire TYPE DE M~L~CL~E : protéine N - Thr Glu And Ala Piro Ser Azg Ala Fzo Thr Ile Thr Leu Lys Lys - C
5' - ACE GAA AGA GC'A CC'A F~C~C AGA GC~. COP. ACE ARC AGC C'IC AAA A~1G - 3' I~afa~natian pour la SDQ In N0 : 19 GSv TYPE DE SES : acides aminés et rmcléotic~es ~JEUR DE LA ~NC~ : 16 acides amir~s, 48 nucléotiâes NC~RE DE BRII~iS : simple CCB~'IC,~ATICi~1 : linéaire TYPE DE Nt~LECULE : peptide N - Arg Lys Pro Pro Ile Asn Pro Ser Gly Ser Ile Pro Pro Glu Asn His - C
5' - AGA AGA CC~1 C~'A ATT AAT CrA ~ 0.1 .àGC ATC aA GCA GAA A~ CAT - 3' Iynfo~ation pour la SDQ m N0 : 20 G4A
TYPE DE : aciàes aminés et nucléotides I~JDUR DE LA SE~I,IEt~ : 17 aciàes aminés, 42 nucléotides NC~RE DE BRAIS : single Q.NF'IC~AT"ICN : linéaire TYPE DE NDL~7CULE : peptide N - Val Pro Cys Ser Ile Cys Ser Asn Asn Pro Tizr Cys Tzp Ala Ile Cys Lys - C
5' - GIG CCN 'Ir~IC FOC ATC 'IGC AOC AAC AAC CL~ AGC ~GC 'IC3G GCG ATC TC3C
AAA - 3' ISnfo~maticn peur la SDQ m NO : 21 G4B
TYPE DE SD: acides aminés et nucléatides ICNC'~7~,~lJR DE LA : 17 acides aminés, 42 nucléotides NC~tE DE BRINS : sitrple 0~1F'IC~'.>RATIC~I : linéaire TYPE DE NDLDC~E : peptide N - Val Pzro Cys Ser Ile Cys Gly Asn Asn Gln Leu Cys Lys Ser Ile Cys Lys - C
5' -GTG CnC ZC3C 1~('~C A1~ 'InC 03C A~1C AAC CAG CIWC~C AAA PGC ATC 'I~C AAA -3' FfUILLE QE REMPLACEMENT (REGLE 26) lüfaamti.cn peur la SDQ m NO : 22 G4V
TYPE DE SDE : acides aminés et nucléotides I.ZJR DE LA : 17 acides aminés, S1 nucléotides N~BRE DE BRINS : single Oâ~TF'IC~tATICN : linéaire TYPE DE Nt~L~X.,ï~E : peptide N - Val Pm Cys Ser Thr Ces Glu Gly Asn Leu Ala Cys Leu Ser ~u 186 187 S' - GTr CJC~ 'IGC AGT ACA 'IGT GAA CCT AAT CIT GC~1 TAC TTA TC~1 C'IC ZL;C
C~1T - 3' FEüILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
Exemple 6 : Immunogénicité et efficacité protectrice de la protéine de fusion BBG2a 1.
Matériels et méthodes.
Afin de déterminer l'immunogénicité et l'efficacité protectrice de BBG2a1 contre les VRS-A et B, des groupes de 3 souris ont été immunisés 2 et 3 fois, respectivement, par voie i.p. avec 20 ug de protéine à 2 semaines d'intervalle. Des souris témoins ont été immunisées avec le PBS.
L'Alhygrogel (20 % v/v) a été utilisé comme adjuvant pour toutes les immunisations. Les souris ont été prélevées au sinus rétro-orbital 2 semaines après la dernière immunisation pour confirmer leur séroconversion vis-à-vis du VRS-A, challengées une semaine plus tard avec i05 TCIDSO VRS-!1 par voie i.n., et sacrifices S jours post-challenge. Les pOL1n10I1S OIlt CtC pl'C1CVCS CL 1C tltrC C1C'. V1I'uS CIMtIS ICS pOUI110I1S
(lCtc'.I't111n('.
Résultats.
Immuno~énicité cie BBG2a 1 V1S-rl-V¿S C1CS VIES-A ct 13.
Les résutats présentés dans les Fig. f~A et B démontrent clac Ie BBG2a1 est capable d'induire des anticorps anti-VRS-A et B. Comme.
attendu, le titre en anticorps anti-VRS-A est bien supérieur au titre en anticorps anti-VRS-B. Néanmoins, des titres cn anticorps contre lcs deux souches de VRS sont élevés.
Efficacité protectrice de BBG2a1 vis-à-vis du VRS-A et du VRS-B.
Comme indiqué dans ies Fig. GC et D, l'immunisation des souris avec BBG2a1 a induit des réponses immunitaires capables de protéger les poumons contre un challenge avec le VRS-A et contre un challenge avec le VRS-B. Les souris challengées avec le VRS-A ont étc protégées sans évidence de virus dans les poumons (2 souris/3) ou seulement à la limite de détection ( 1 souris/3). Les souris challengées avec le VRS-B ont été
protégées, soit sans évidence de virus dans les poumons ( 1 souris/3) soit avec du virus qu'à la limite de détection (1 souris/3) ou juste au-dessus de cette limite (1 souris/3) de détection.
Conclusions.
La protéine de fusion BBG2a1 est très immunogénique vis-à-vis du VRS-A et vis-à-vis du VRS-B. BBG2a1 est capable d'induire des réponses qui protègent les poumons contre un challenge avec les 2 sous-groupes de VRS.
Exemple 7 : Obtention des anticorps 18D 1, 5C2 et 5B7 Peptide d'llnn1L1111S~itlOn : (i) CTIdCa couples au 1L1-i (Hcyholc Lcmpct 1-Iaomocyanin), (ü) G2nCa ct (iii) B13G2Na.
Lcs souris ont cté immunisccs à JO avec 50 pg (~'e111tIbCIIC Cil CFA
(complote Frcund Adjuvant) en ip, à J 14 avec 10 ug dc chacluo antigène on IFA (Incomplete Freund Adjuvant) en ip, puis a J38 cn iv avec lOllg cle chaque peptide sans adjuvant. Les rates sont prélevées ct fusionnées avec les cellules dc myélome SP2-O à J42 dans un rapport 1 / 1. Les hybridomcs positifs contre chaque antigène sont gardés. Ces hybridomcs ont été
injectés à des souris pour obtenir des ascites puis les différents anticorps obtenus ont été sélectionnés sur différents peptides afin de déterminer la spécificité des anticorps obtenus. Les anticorps monoclonaux 18D 1, 5C2 sélectionnés par leur spécificité contre les peptides G ldCa, GSa, reconnaissent spécifiquement le VRS-A. L'anticorps monoclonal 5B7 obtenu à partir de BBG2Na et reconnaissant lc peptide G 1 la rcconnait lc VRS-A.
Exemple 8 : Effet curatif des anticorps monoclonaux 18D 1 et 5C2 sur l'infection chronique à VRS-A obtenue chez la souris SCID.
Matériels et méthodes.
Les souris C.B-17 scid/scid ont été challengées par voie i.n. avec IOs TCIDSO de VRS-A, sous 50 ul. Vingt six jours plus tard, les souris ont reçu par voie i.n. et à raison de 7 souris par groupe, 50 ~1 d'une préparation d'anticorps 18D1 ou d'anticorps 5C2 à un titre ELISA anti-VRS-A de 104. Des souris témoins ont reçu du sérum anti-BB à un titre ELISA anti-BB de 104. Les souris ont été sacrifiées 5 jours plus tard et leurs poumons ont été prélevés pour titrage du virus.
Résu ltats.
Lcs résultats prCacntés d~lns la l'ig. 7 clémont.rcnt que ILS zntlcorps 11'lOIlOCIOnaux 18D1 Ct 5C2 SOIR Cfl~~l~lCS Cl'C11I111nCI' unC iII¿CCtlOt1 chronique avec le VRS-A chez la souris SCID et CCCI C1'unC IllalIlIC'.t'C
stérilisante. Aucune trace de virus n'a étc dctectée clans les poumons au moment du sacrifice. Les résultats obtenus dans les poumons des souris traitées avec le 5C2 correspondent à la moyenne des limites de dcacction de l'essai, limite plus élevée du fait du manque de disponibilité
d'échantillon, et non pas à la présence de virus.
Conclusions.
Les anticorps monoclonaux 5C2 et 18D 1 pourraient ètre utilisés comme traitement thérapeutique dans le cadre des infections pulmonaires à VRS-A.
Exemple 9 : Effet prophylatique de l'anticorps monoclonal 18D 1 sur l'infection à VRS-A chez la souris.
Matériels et méthodes.
Un groupe de souris BALB/c naïves, séronégatives vis-à-vis du VRS-A, ont reçu par injection intrapéritonéale 200 ul d'une préparation d'anticorps 18D 1 ajustée au titre ELISA anti-VRS-A de 105. Un groupe de souris témoins transfert i.p. ont reçu en parallële 200 ul d'une préparation de sérum anti-P40 (sérum irrelevant) ajustée au titre ELISA anti-P40 de 104. Toutes les souris sont infectées le jour suivant par voie i.n. avec 50 ~Il d'une suspension virale contenant 105 TCID50 de VRS-A. Elles sont sacrifiées 5 jours plus tard pour dosage de virus dans les poumons.
_. _ ___ _.____. _ , _ .__.
t~~~" if.,t~
Comme indique clans la f ig. 8A, l'anticorps 18I~ I est: calrWlc apres tI'flnSfel't i.p. d'induire une protection <.~u niveau d<~.s pOL11110I1S CIC
sUUI'1S
naïves lors d'un challenge avec Ie VRS-A. 'foutes lc~s souris sonl protcgcos après injection dc 200 ul de 18D 1 au titre dc 105. 'I~I'O1S sOLII'1S SL1I' 7 sUIII.
protégées sans évidence de virus dans les poumons. Lcs aLltres Illonll'cnl des traces de virus seulement à la Iimite dc dètection de l'essai (3 souris/7), ou juste au-dessus de cette limite ( 1 souris/7). Les souris témoins ont des titres compris entre logl0 3.70 et 4.45 par gramme cie IO poumons.
Conclu sion.
L'anticorps 18D 1 est capable de prévenir une infection pulmonaire à VRS-A chez la souris BALB/c. Il démontre une efficacitc prophylactique importante.
Exemple 10 : Effet prophylatique d'anticorps monoclonal 5C2 sur l'infection à VRS-A chez Ia souris.
Matériels et méthodes.
Des souris naïves séronégatives vis-à-vis du VRS-A reçoivent par transfert i.n., 50 ~1 d'une préparation de 5C2 ajustée au titre ELISA anti-VRS-A de 104. Des souris témoins reçoivent en parallèle du sérum anti-BB
ajusté au titre ELISA anti-BB de 104.
Toutes les souris sont infectées le jour suivant par voie i.n. avec 50 ul d'une suspension virale contenant 105 TCID50 de VRS-A. Elles sont sacrifiées 5 jours plus tard pour titrage de virus dans les poumons.
W O 99/03987 PCT/FR98/Ol 570 Résu ltats.
Comme le montre la l~ ig. 813, toutes ILS souris traitcca avec Ie 5C2 à
104 ont cté protcgccs au niveau pulmonaire. Seule 1 souris sur 7 montre des traces de virus. Lcs souris tcmoins ont clos titres compris entre loglt) 5 3.70 et 4.70 par gramme dc poumons.
Conclusion.
L'anticorps 5C2 est capable de prévenir une infection pulmonaire à
VRS-A chez la souris BALB/c. I1 démontre une efficacité prophylactique 10 importante.
Exemple 11 . Pepscan . exemple de la synthèse muliple de 94 octapeptides couvrant la séquence de l'aa 130-230 de G2Na et se chevauchant par un acide aminé.
15 Une plaque "PEPSCAN" de 96 octapeptidcs synthétisés en parrallcle (2 peptides de contrôle + 94 peptides couvrant la séquence 130-230 de la protéine G du VRS-A) est préparée selon la technique MULTIPINT'" décrite par Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1984, 81, 3998-4002.
Ces peptides sont synthétisés sur support solide à l'extrémité de 96 20 "pins" (8 x 12) complémentaires d'une plaque de microtitration ELISA dans laquelle sera effectuée directement le criblage d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux (sera).
~ Système de repérage des positions des pins et des puits 25 Le système de numérotation utilisé est le suivant position A 1 ( 1 ) = Plaque n°A, ligne 1 ( 12 lignes) colonne 1 (position H 1 en ELISA) position A2( 1) = Plaque n°A, ligne 2, colonne 1 (position H2 en ELISA) A 1 ( 1 ) : peptide de contrôle # 1 : PLAQGGGG
A2(1) : peptide de contrôle # 2: GLAQGGGG
A3( 1) : octapcptide # 1 : TVhThN1"f A4( 1) : octapcptidc # 2 : VK'fi~N'Cl"f ctc.
A 12(8) : oclapcptidc # 94 : I'EVPT'fKI' ~ Synthèse La synthèse correspond à plusieurs cycles de déprotcction, de lavages et de couplage jusqu'à obtention des séquences peptidiques désirées. A la fin de la synthèse, les peptides sont N-acétylés, avant l'étape de déprotection des chaines latérales.
Les acides aminés utilisés pour la synthèse sur pins sont protégés par un groupement Fmoc (9-Fluorénylméthoxycarbonyl) et les groupements protecteurs des chaines latérales suivants : t-Butyle éther (tBu) pour la Sérine, la Thréonine et la Tyrosine, t-Butyle ester (OtBu) pour les Acides Aspartique et Glutamique, t-Butoxycarbonyle (Boc) pour la Lysinc, l'I-Iistidine et le Tryptophane, 2,2,5,7,8-pcntaméthylchroman-6-sulfonyle (Pmc) pour l'Arginine, Trityle (Trt) pour la Cystéine, l'Asparagine et la Glutamine. L'activation de la fonction acide est effectuée avec de la Düsopropylcarbodümide (DIC) et du 1-hydroxybenzotriazole (HOBt) dissouts dans du DMF.
~ Fmoc-dëprotection et lavages : La plaque de pins est immergée dans un bain contenant 200 ml d'une solution de pipéridine à 20 °.ô dans le DMF (40/ 160 ml) pendant 20 min. à température ambiante sous agitation.
Les pins sont ensuite retirés du bain. L'excès de solvant est éliminé en frappant le bloc de pins sur du papier-linge. Les pins sont lavés dans 200 ml de DMF pendant 2 min. à température ambiante sous agitation. Le bloc est frappé sur du papier-Iinge et immergé complètement dans un bain dc MeOI-I pendant 2 min. sans agitation. I,es pins sont imlncrgcs dans 200 nll dc MeOI-I eriSUllC (3 bains dc 2 I111I1Lll.CS, 200 I111~1J~11t1~. L~l pl~iqL1(' est séchcc pendant 30 min.
~ Couplage des Fmoc-amino acides : Lcs Fmoc-amino-acides subissent une étape d'activation avant de pouvoir être couplés. La durée d'une étape de couplage est de 2 heures pour une concentration de 100 mM avec 1.5 équivalent d'HOBt et 1.2 équivalent de DIC. Un logiciel permet de calculer les quantités de réactifs nécessaires pour l'étape de couplage. Les pesées sont effectuées dans des tubes classés par ordre alphabétique du code a une lettre des acides aminés. Les tubes sont remplis en dehors de la balance sur une feuille de papier-linge, puis pesés jusqu'à l'obtention d'une masse proche de celle indiquée sur la feuille de pesée. La masse ne doit pas être inférieure de 0.2 mg ni supérieure dc 0.9 mg par rapport à la quantité théorique.
~ Etape de couplage : Les pins sont introduits délicatement dans les puits. La boîte est fermée soigneusement et laissée sous une hotte pendant la durée du couplage pendant 2 h pour une concentration en acides aminés de 100 mM. Un couplage de 2 h permet de réaliser 3 couplages par jour.
~ Traitement des blocs de pins après couplage : Les pins sont retirés de la plaque contenant les solutions de couplage et lavés avec 200 ml de MeOH sous agitation pendant 5 min. Le bloc est frappé sur du papier-linge et laissé sécher pendant 2 min. Le bloc est placé dans 200 ml de DMF et lavé pendant 5 min. sous agitation avant d'effectuer le cycle suivant de déprotection. La plaque est lavée classiquement et subit l'étape de clivage des groupements Fmoc comme décrit ci-dessus après le dernier couplage.
WO 99/03987 PC'r/FR98/01570 ~ Acétylation des amines terminales : Ics tétcs tlc pins sont mises Z
incuber dans les puits d'une plaque contenant 150 ul du mélange rc<~ctif suivant : DMF/Anhydridc acctiquc/trictylaminc SONS/ 1 (v/v/v). I,c bloc est enfermé dans une boîte pendant 90 min. à tempcraturc ambiante. Lc bloc est lavé ensuite avec 200 ml de McOI-I pendant 15 min. puis séchc pendant 15 min.
~ Déprotection des chaînes latérales : les groupements protecteurs des chaînes latérales sont éliminés en immergeant Ies pins dans 200 ml d'un lU mélange TFA/anisole/IJthanedithiol 190/5/5 ml pendant 2 h 30 à
température ambiante. Après cette étape de déprotection, le bloc de pins est retiré de la solution acide. La boîte est rincée une fois au MeOI-I, puis remplie de MeOI-I pour y immerger complètement le bloc de pins pendant min. Le bloc est alors frappé sur du papier-linge puis immergé dans 200 ml d'un mélange MeOi-I/eau/acide acétique ( 100/ 100/ 1 ml) pendant 1 heure et frappé à nouveau sur du papier-linge. Le bloc est mis sous-vide dans un dessiccateur pendant une nuit.
Exemple 12 : ELISA
La plaque portant les pins est saturée 1 heure à 37°C en tampon de saturation (PBS, Tween 0,1 %, gélatine 1%), lavée 10 min en PBS et incubée une nuit à 4°C sous agitation avec le sérum à analyser préalablement dilué. La plaque est ensuite lavée 4 fois 10 min en PBS et incubée une heure à température ambiante avec un anticorps secondaire marqué à la péroxydase, dilué au 1/5000 e. Après 4 lavages en PBS, le substrat TMB est ajouté. L'arrét de la réaction est effectué par addition d'acide sulfurique.
Le résumé des données résultant de l'analyse d'un sérum murin anti BBG2Na par la méthode du Pepscan B est représenté sur la figure 9.
Les figures 9A et 9B montrent une réactivité du sérum de souris anti-BBG2Na contre 4 régions dc la molécule G2Na (Ics résidus en trait ' gras représentent les acides aminés jouant un rôle important dans la reconnaissance Ae/Ag) - la région 1 située entre les résidus 150 et 159 dont la séquence est QRQNKPPNKP. Cette région est comprise dans le peptide G5a ( 144-15~)) et correspond à la zone de réactivité de l'anticorps monoclonal 5C2 ;
- la région 2 située entre les résidus 176 et 189 dont la séquence est CSNNP'I'CWAICKRI. I1 s'agit d'une région localisée au niveau du peptide G lOCa ( 174-187) et correspondant à la réactivité des anticorps monoclonaux 18D 1 et 5D3 ;
- la région 3 située entre les résidus 194 et 207 dont la séquence est PGKKTTTKPTKKPT. Cette séquence correspond à une réactivité au niveau du peptide G9 ( 194-204), réactivité déjà mise en évidence lors de la production d'anticorps monoclonaux dirigés contre BBG2Na ;
- la région 4 qui s'étend sur une large zone allant du résidu 155 au résidu 176 semble étre le résultat de différentes réactivités. L'une de ces réactivités qui couvre une région très hydrophobe de la molécule G2Na (Glla) correspond à la zone de reconnaissance de l'anticorps monoclonal 5B7 (obtenu après immunisation de souris BALB/c par le candidat vaccin BBG2Na) dont le pepscan B est représenté ci-dessous dans la figure 10.
Cet anticorps monoclonal reconnaît la séquence FEVFNFVP ( 165-172).
L'ensemble des quatre réactivités ci-dessus a par ailleurs été
confirmé par la titration du sérum anti-BBG2Na au moyen de différents ELISA mis au point pour chacune des réactivités. Le tableau I montre que le sérum anti-BBG2Na présente bien des activités "anti-G4a, G5a cys, G9a cys et Glla".
Tableau I : Titres anti-G4a, GSaCys, G9aCys et Gll~Ca exprimés en 1og10 du sérum anti-BBG2Na ref. BE-02.
Titre(loglo) BE - 02 G2Na 5.9 KLH-G4a 4.7 KLH-G9aCys 5.0 KLH-GS aCys 3 , $
P40-G 11 ~Ca 3 .5 5 Conclusion L'étude d'un sérum anti-BBG2Na par la technique du Pepscan montre que l'immunisation de souris avec BBG2Na génère des anticorps contre 4 épitopes B situés respectivement dans les régions 150-159, 176-189, 194-207 et 155-176. Cette technique permet donc de confirmer 10 l'importance de la région 164-176 (G 1 lOCa).
Ces résultats sont, par ailleurs, en parfait accord avec les donnces ELISA concernant la réactivité d'un sérum anti-BBG2Na sur ies peptides G4a, GSaCys, G9aCys et G 1 laCa.
T~T~ DE
Infa~naticn pour la SD~ m NO : 1 C~,Ca TYPE DE SES : acides aminés et nucléotides I~C~E(1R DE LA SD~UE~E : 14 acides aminés, 42 nucléotides N~RE DE BRINS : simple O~VF'IC~Jf~ATI~1 : linéaire TYPE DE NDI~t.~E : peptide N - Ser Ile Cys Ser Asn Asn Pn~ Thr Cys Trp Ala Ile Ser Lys - C
5' - AGC AT~ TGC AGC AAC AAC CC7G ACC ZGC 'ICI GC~ A~ AC~C AAA - 3' ?~fomnatian pour la SaQ m NO : 2 Q'OCa TYPE DE SD: acides aminés LDE LA S: 14 acides am;r~és NCZ~RE DE BRINS : simple 0~1FIC~AZTC~T : linêaire TYPE ~ ~3CC11.~E : peptide N - Ser Ile Asp Ser Asn Asn Pro Thr Czn Trp Ala Ile Ser Lys - C
Info~c~at3.an pour la S~ ID NO : 3 Gl~Cb TYPE DE SD: acides aminés et nucl~tides L~JEIkt ~ LA SD: 14 acides am>.r~és, 42 nucléotides NC~RE DE BRIrIS : simple CJ~1FIC~RA~TCY~1 : linéaire TYPE DE NDLECi~E : peptide N - Ser Ile Cys Gly Asn Asn Gln Leu Cys Lys Ser Ile Ser Lys - C
5' - AOC AZL~ 'IC~C 03C AAC AAC CAG C'IG TC3C AAA AOC ATC AOC AAA - 3' Z~afo~nation paur la SaQ m NO : 4 Gl'ACb TYPE DE SF7: acides aminés Ll~7EUR DE LA SF7: 14 acides aminés NC~RE DE BRIS : simple 03~1F'IC~7RATIC~1 : linéaire TYPE L~ M~LECL~E : peptide N - Ser Ile Asp Gly Asn Asn Gln Leu Orn Lys Ser Ile Ser Lys - C
fEüILLE DE REMPLACEMENT (REt~LE 26) zhfaxa~ticn pour la SDQ ID NO : 5 G5a TYPE DE S: acides aminés et nucléotides Uft DE LA SE~J~'E : 16 acides aminés, 48 nuclêotides NC~RE DE BRINS : simple CxNF'IG(k~ATICN : linéaire TYPE DE Nt3LECL~.Ir : peptide N - Ser Lys Pro Thr Thr Lys Gln Azg Gln Asn Lys Pn~ Pn~ Asn Lys Pro - C
5' - ACC AAA CCN ACC ACar AAA CAG CCT CAG AAC AAA CGJ GC~ AAC AAA CCN - 5' 7~nfa~uation pour la SDQ Zn NO : 6 Gôb TYPE DE SD: acides aminés et nucléotides IGNGC~kt DE LA E : 16 acides aminés, 48 nucléotides NC~RE DE SR~IS : simple O~k'IG'üRATICB~T : linéaire TYPE DE NDL~~E : peptide N - Asn Lys Pzt~ Ser Thr Lys Ser Atg Ser Lys Asn Pn~ Pro Lys Lys Pro - C
5' - AAC AAA ~ AOC AGA AAA .SOC CCT AOC AAA AAC Cû~ C0.G AAA AAA OCG - 3' Tnfoarmat3on pour la SEQ ID NO : 7 Gla TYPE DE SD~7E~E : acides am~r~és et nucléotides L~~1R ~ LA S: 33 acides aminés, 99 nucl.éotides NC~RE DE BRINS : simple Q~1FICCN : linéaire TYPE DE N~JL~7CL~E : pirotêine N - Lys Pro Asn Asn Asp Phe His Phe Glu Val Phe As~n Pige Val Pro Cys Ser Ile 5' -AAA CL'~ AAC AAC GAT T'IC CAT TIC GàA GIS TIC AAC TIC GTG ~ ~C AOC P.'Ilr Cys Ser A9n Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys Azg Ile Pn~ - C
TGC AOC AAC AAC CCN AOC TC3C TGG GCx A'I~ 'I'U"~C AAA C~T A'IC CCN - 3' ~fcrmation pour la S~7Q m N0 : 8 G'lb TYPE DE SD: acides aminés et r:ucléotides It DE LA SD~~ : 33 acides aminés, 99 rnzcléatides NC~RE DE BRIUS : simple CE~1F'IC~ktP.TICN : linéaire TYPE DE M~LDCiJLE : prntéirbe N - Lys Pro h~s As~ Asp Tyr His Fhe Glu Val Phe A~ Aie Val Pm Cys Ser Ile Cys Gly 5' - ApA fJT AAA GRT GAT T~tC CEC TIç G7.1A GIG TIC AAC TIC GIG O~ ~ FL3C A'IC
3L~C G~
Asn A~ Gln Leu Cys Lys Ser 11e Cys I~rs ~ Ile Pro - C
AAC ApC CFG CIG TG~ AAA PG~ AZC ~ A~1A ~ ATC OT - 3' FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) L-ifornnaticn pour la SDQ ID NO : 9 G8a TYPE DE SD: acides aminés et nuclêotides L~C~'t DE LA SE1~IJENCE : 43 acides aminés, 129 nucléotides NC~RE DE SRINSS : simple Ct~TFIC'~ATICl~1 : linéaire TYPE DE M~LECt~.~E : plrotéine N - Lys Pro Agn Ain A~p I~ I~ Ft:e Glu Val Phe A~ Plie Val Pzo Cya Ser Ile Cyg Ser 5' - AAA aT ~i~AC J4FC GAT TIC CCT TI~ G0. C1IG TI~ AF~C TIC GIG OT TCCIr )1C3C ATC TC~ M3C
A~ P.sn Pro 'Ihr Cys Trp Ale Ile Cys Lys Azg Ile Pm A~ Lys Lys Pro Gly Lys Iys Zhr AAC A~1C QT~ ~ 2ï'~ 2C~ C~G ATC 'Iï~ AAA Qsi' A'1C QT AAC AAA J4AA ~ CI:,1C
AAA AAA ~
~' 'Ihr - C
PS 14~ - 3' Irifo~naticn peur la SDQ 1D N0 : 10 G8b TYPE ~ S~~ : acides aminée et nucléotides L~k.'CØZ DE L~ SD: 43 acides am;x:és, 129 nucléotides NC~RE DE HR'~S : simple ûNFIC~ktATICN : lir:éaire TYPE DE NDLFX.'L~E : p~r~téine N - ~ ~ ~ ~P ~P ZYr'~ Phe Glu Val F~he Asn Phe Val Piv Cys Ser Ile Cys Gly 5' - AAA QT AAF1 G'AT G7.1T ThC CAC TIC GP~A GIG TI~ ApC TIC GIG CJJC 'IDC ~
AT~ TOC Q~
178 182 186 l9g a~ A~ Gln Leu Cys Lys Ser Ile Cys Lys Ztsr Ile Pro Ser n~ Lys Pro Lys Lys Lys Pro ~c sac c~ cic ~ ~ x~ ~c ~c ~ soc azc a~ x~ arc ,~a mc ~ ~ ~ o~c Zhr Ile - C
AOC A'IC - 3' Iafa~aatiai pour la SDQ ID N0 : 11 G9a TYPE DE SES : acides aminés et rnlcléotides LDE LA SD: 15 acides aminés, 45 nucléotides N~tE DE ~ : simple C~NFIQ7~ATIC~1 : linéaize TYPE DE N~ : plvtéine N - Pro Asn Lys Lys Pzro Gly Lys Lys Ttlr Thr 'Iizr Lys Plro Thr Lys - C
5' - CCN AAC .'~AA AAA ~ C~C~C AAA AAA. ACE A~ AOC AAA C'CZ3 ACC AAA -3' Ihfoa~atian pour la SDQ m NO : 12 G9b TYPE ~ SD~C1E,'NC'3J : acides aminés et nucléotides LCrIG(~(kt L~ LA : 15 acides aminés, 45 nucléotides NDE BRINS : simple FEUILLE DE REMPLAÇ~M~N'~ (REGLE 2fi) O~1F'IC~tATICN : linéaire TYPE DE M~LDCIJLE : protéine N - Pro Ser Asn Lys Pro Lys Lys Lys Pro Thr Ile Lys Pro Thr Asn - C
5' - CCN P~OC AAC AAA C1'~ AAA AAG AAA CGs ~1C~ ATC AAA CtT ACC AF~C - 3' ~foa~,tian pour la SDQ m NO : 13 Cxll.a TYPE DE SD: acides aminés et nucléotides L.''I7R ~ LA : 13 acides aminés, 39 nucléotides NC~RE DE HR~S : simple 0.'âsF'IC~ATTCi~1 : linéaire TYPE L1E NIaL~E : protéine N - His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys -C
5' - CAT TIC GAA GIG TIC AAC TIC GTG CCN 'IC3C ACC ATL ~ -3' Ihfo~ation pour la SnQ m NO : 14 ~ll~Ca TYPE ~ SD: acides aminés et nucléotides II7E LA 1CE : 13 acides aminés, 39 nuclëotides NC~~2E DE BIt~S : eic~ple O~TFIQ.k~ATI~1 : linéaire 'TYPE DE NDI,~X~E : protéine N - His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Ser Ser Ile Cys -C
5' - CAT TIC GAP. GIG ThC AAC TIC G'I~ (33J AGC AOC P.TC TC3C -3' Tnfca~ticn peur la SDQ TD NO : 15 G2a1 TYPE DE SD~I~ : acides amir~,s et nucléotides Ikt I7E LA SE7: 101 acides aminés, 303 nucléotides NC~,RE DE BRAS : simple C~1FIC~)RATICi~1 : linéaire TYPE DE NDLEGLIGr : protéine ~o N - ~r Val Lys ~ Lys A~1 Trx ~ 'mr 'mr Gln Thr CsLn Pro Ser Lys Pro ~r Zhr Lys 5' - POC GIG J4AA ACE AAA AAC Fl'~ AcT FL~ ~ CàG ~ C~G OT Pte AAA US PLZ i~
AAA
Gln Atg GLn A9n Lys Pm Pso A~ Lys Pro Asn A~ Asp Fhe Füs Phe Glu Val Aie Asn Plie c~c~ra~»cr~a~ac~~c~o~~c~cc~~c~~c~cr~T~~cTTc Val Pm G~s Ser Ile Cys Ser Aga A~ Pm 'Ihr Cys ZYp Ala Ile Cys Lys Azg Ile Pm Ser GIG OT Tt.~' » ATC 'IC~C J~OC 74~iC RAC QT P~ 'ILS '1~, (~1T A1C Zi3C AAA QTa AZC aTa FOC
A~ Lys Pm Zys IFS Lys Pxn T~ ~ hys Pm ~r Zys Iys Ps~ ~ phe Lors 'll~ 71~r Lys AAC AAA QT AFG AAA AAA QT, ACr; Plx AAA 0.~ 7~ A~1A 7~1A ~ ~ TtC A~1A ALE Af~
AAA
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 2ô) 2L' 230 Lys Asp Hi9 Lys Pro Gln Zhr Zhr Lys Pro Lys Qu Val Pro Zhr Zhr Lys Psv - C
AAF~ G4T CAT AAF1 nT., CAG ACE ACE AAi.1 C1~T, A~4A C~1A GIr QT l~ 1.1C'Zr AAA
CrT - 3' Ihf~ticn pour la SEQ m NO : 16 C~32a2 TYPE DE STE : aCldes anLl~S et nuCléOtlde9 L~JECk~ DE LA SD: 101 acides aminés, 303 nucléotides NC~RE DE 8R'~S : simple ü,NF'IC~IC7I~1 : linéaire TYPE DE M~LDCL~E : protéine N - Thr Val Lys 'Ihr Lys Agn Thr Thr Zhr Zhr Gln 'Ihr G1n Pro Ser LYs Pro Zhr Zhr Lys 5' - ALZ G'IG AAA ~ AAA AAC ~ ACG ACE AGC CPG ACC C~GG fJT P13C AAA CvT, 7iC' l~ AAA
Gln Azg Qn Asn Lys Pro Pm Lys l.~ys Pro Lys Asp A9P ~'r' His Phe Glu Val Phe Agn F~he CPG ~T CFG AAC AAA CT ~ AAA AAA QT, AAA LAC GAT ~1C CAT TIC C~AA GIG Tir AF~
TIC
Val Pro Cys Ser Ile Cys Ser Ain Asn Pro ~ Cys Tip Ala Ile Cys Lys Azg Ile Pro A~
GIG Q3; ~ FL~ A'IC TOC PL~C AAC AAC ~ l~ TDC TC~G C~7G ATC TC~ AAA Q~T AZC Of~
AAC
Lis Lys Pro Gly Lys Lys Thr ~' 'Ihr Lys Pzo 'll~ Lors Lys Pro Tt~' Phe Lys 1hr Thr hys AAA AAA ~,a C~ AAA AAA l~ ACTa Ff.~ AAA ~, l~ AAA J4AA CTïâ ~ TIC AAA ~tOC PQ
AAA
Lys Asp iLis L:ys Pro Gln T~ ~r Lrys Pra hys Glu Val Pro 'Its ~ Iys Pro - C
Ai~A G4T CAT AAA C4C"a CpG Pû: ACT' iWA QTi ApJ4 G~1A GIG OT'i N.I~ 7~ ~1AA 0T
- 3' ?nfo~ti~ pour la SDQ m NO : 17 Qa3 TYPE DE SD~(7FNCE : acides aminés et nucléotides L~C'~Ckt DE LA SDQL~ : 101 acides aminés, 303 nucléotides IVRE DE BRAS : simple CJSTFIC~RATICN : linéaize TYPE DE N~ : plrotéine N - Trir Val Lys ~ Irys Asn Thr ~ Tla 'Ihr Gln ~r Gln Pro Ser Lys Pm Tts 'üsr Lys 5' - P~ GIG J4AA I~ AW~1 AAC ~ 74~ L1CC AC' CFG ~ CpG QT l~ AAA OT, l~ AI>r AAA
G1n Azg Gln A~ Lis Pro Pro hys Ifs Pro Lys A9p Asp Tyr His Phe GLu Val Phe A9n Phe CPG Q;T CAG AAC A~1A OT OT AAA AAA OT, AAA CEC GAT 7~1C CAT TIC C~1A GIG TIC
Val Pro Cys Ser Ile Cys Ser Asn Asn Pro Tlzr Cys Tip Ala Ile Cys Lys Axg Ile Pro Ser GIG OS TC~ l~ AT~ TL~ FL~ AAC AAC aT 7àCC TL~ 1L~ OT ATC ~ AF~A Q~T ATC OT PLI
A~ Lys Pro Lis Ifs Lys Pro 'Ihr' ~' Lt~s Pro 'ü~ Iys L:ys Pro ~ F~he Rys ~r T1~ Lys ATaC AAA QT A~ AF~i.1 A~4A 0.'G ~ ~ 1~1A OT 7~ ACP. AAA QT, l~ TIC 3WA ~ 3~
A~4A
hys Asp His Lys Pro C~ln 2hr Thr Lrys Pro Iys Glu Val Pro ~ T>~ Lys Pro - C
AAA G4T CAT AAA C1T CAG PLT FROC AAA CCT AAA C~AA GTG OT äCC I~ AAA OT - 3' FEUILLE DE REMPLACEMEf~T (REGLE 26) Tnfau~ation pour la SDQ m NO : 18 G9v TYPE DE SD~t.IEI~CE : acides aminés et nucléotides L~1EUR DE LA S~UEI~C'~ : 15 acides aminés, 45 nucléotides NC~RE DE BRINS : sitrple a~LVF'zc~ATrc~1 : linéaire TYPE DE M~L~CL~E : protéine N - Thr Glu And Ala Piro Ser Azg Ala Fzo Thr Ile Thr Leu Lys Lys - C
5' - ACE GAA AGA GC'A CC'A F~C~C AGA GC~. COP. ACE ARC AGC C'IC AAA A~1G - 3' I~afa~natian pour la SDQ In N0 : 19 GSv TYPE DE SES : acides aminés et rmcléotic~es ~JEUR DE LA ~NC~ : 16 acides amir~s, 48 nucléotiâes NC~RE DE BRII~iS : simple CCB~'IC,~ATICi~1 : linéaire TYPE DE Nt~LECULE : peptide N - Arg Lys Pro Pro Ile Asn Pro Ser Gly Ser Ile Pro Pro Glu Asn His - C
5' - AGA AGA CC~1 C~'A ATT AAT CrA ~ 0.1 .àGC ATC aA GCA GAA A~ CAT - 3' Iynfo~ation pour la SDQ m N0 : 20 G4A
TYPE DE : aciàes aminés et nucléotides I~JDUR DE LA SE~I,IEt~ : 17 aciàes aminés, 42 nucléotides NC~RE DE BRAIS : single Q.NF'IC~AT"ICN : linéaire TYPE DE NDL~7CULE : peptide N - Val Pro Cys Ser Ile Cys Ser Asn Asn Pro Tizr Cys Tzp Ala Ile Cys Lys - C
5' - GIG CCN 'Ir~IC FOC ATC 'IGC AOC AAC AAC CL~ AGC ~GC 'IC3G GCG ATC TC3C
AAA - 3' ISnfo~maticn peur la SDQ m NO : 21 G4B
TYPE DE SD: acides aminés et nucléatides ICNC'~7~,~lJR DE LA : 17 acides aminés, 42 nucléotides NC~tE DE BRINS : sitrple 0~1F'IC~'.>RATIC~I : linéaire TYPE DE NDLDC~E : peptide N - Val Pzro Cys Ser Ile Cys Gly Asn Asn Gln Leu Cys Lys Ser Ile Cys Lys - C
5' -GTG CnC ZC3C 1~('~C A1~ 'InC 03C A~1C AAC CAG CIWC~C AAA PGC ATC 'I~C AAA -3' FfUILLE QE REMPLACEMENT (REGLE 26) lüfaamti.cn peur la SDQ m NO : 22 G4V
TYPE DE SDE : acides aminés et nucléotides I.ZJR DE LA : 17 acides aminés, S1 nucléotides N~BRE DE BRINS : single Oâ~TF'IC~tATICN : linéaire TYPE DE Nt~L~X.,ï~E : peptide N - Val Pm Cys Ser Thr Ces Glu Gly Asn Leu Ala Cys Leu Ser ~u 186 187 S' - GTr CJC~ 'IGC AGT ACA 'IGT GAA CCT AAT CIT GC~1 TAC TTA TC~1 C'IC ZL;C
C~1T - 3' FEüILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
Claims (34)
1. Anticorps polyclonaux ou monoclonaux capables d'exercer un effet curatif ou prophylactique chez un hôte infecté ou susceptible d'être infecté par le VRS, caractérisés en ce qu'ils sont dirigés contre un épitoge de la protéine G du VRS
correspondant à une séquence choisie parmi l'une des séquences peptidiques comprise respectivement entre les résidus d'acides aminés 150-159, 176-189, et 155-176 de la séquence totale de la protéine G du VRS A ou B, ou des séquences présentant au moins 80 % d'homologie.
correspondant à une séquence choisie parmi l'une des séquences peptidiques comprise respectivement entre les résidus d'acides aminés 150-159, 176-189, et 155-176 de la séquence totale de la protéine G du VRS A ou B, ou des séquences présentant au moins 80 % d'homologie.
2. Anticorps selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils sont dirigés contre un peptide dont la séquence est choisie parmi le groupe de séquences SEQ ID
n°2 à SEQ ID n°22.
n°2 à SEQ ID n°22.
3. Agent immunogène pour la préparation d'anticorps selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un peptide dont la séquence est choisie parmi le groupe de séquences SEQ ID n° 2 à SEQ ID n° 22.
4. Peptide susceptible de générer un anticorps selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que sa séquence est choisie parmi le groupe de séquences SEQ
ID
n° 6 et SEQ ID n° 9 à SEQ ID n° 19.
ID
n° 6 et SEQ ID n° 9 à SEQ ID n° 19.
5. Agent immunogène pour la préparation d'une composition vaccinale, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un peptide selon la revendication 4.
6. Agent immunogène selon la revendication 3 ou 5, caractérisé en ce que ledit peptide comporte en outre au moins un résidu cystéine en position N-terminale ou C-terminale.
7. Agent immunogène selon l'une des revendications 3, 5 ou 6, caractérisé en ce que ledit peptide est couplé à une protéine porteuse.
8. Agent immunogène selon la revendication 7, caractérisé en ce que la protéine porteuse est choisie parmi les OmpA de bactéries gram négatif et leurs fragments, la protéine TT, la protéine de liaison à la sérumalbumine humaine du Streptocoque et ses fragments et la sous-unité B de la toxine cholérique (CTB).
9. Agent immunogène selon l'une des revendications 7 ou 8, caractérisé en ce que la protéine porteuse est une OmpA d'une bactérie du genre Klebsiella.
10. Agent immunogène selon l'une des revendications 7 à 9, caractérisé en ce que le peptide est conjugué à la protéine porteuse par une protéine de liaison.
11. Agent immunogène selon la revendication 10, caractérisé en ce que la protéine de liaison est choisie parmi un récepteur de l'albumine sérique de mammifère et les récepteurs présents à la surface des cellules mucosales.
12. Agent immunogène selon l'une des revendications 7 à 11, caractérisé en ce que le couplage est un couplage covalent.
13. Séquence nucléotidique codant pour un agent immunogène selon l'une des revendications 7 à 12.
14. Séquence nuciéotidique selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une molécule d'ADN hybride produite par insertion ou fusion dans la molécule d'ADN codant pour la protéine porteuse, de l'ADN codant pour ledit peptide fusionné
avec un promoteur.
avec un promoteur.
15. Séquence nucléotidique selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une molécule d'ARN.
16. A titre de médicament, anticorps selon la revendication 1 ou 2, peptide selon la revendication 4, agent immunogène selon l'une des revendications 3 et 5 à 12, ou séquence nucléotidique selon l'une des revendications 13 à 15.
17. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle contient au moins un anticorps selon la revendication 1 ou 2, un peptide selon la revendication 4, un agent immunogène selon l'une des revendications 3 et 5 à 12, ou une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 13 à 15, et des excipients pharmaceutiquement acceptables.
18. Utilisation d'au moins un anticorps selon la revendication 1 ou 2, d'au moins un peptide selon la revendication 4, un agent immunogène selon l'une des revendications 3 et 5 à 12, ou une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 13 à 15, pour la préparation d'une composition destinée au traitement préventif ou curatif des affections provoquées par le VRS, sous-groupe A ou B.
19. Kit de diagnostic, caractérisé en ce qu'il comprend un anticorps selon la revendication 1 ou 2, un peptide selon la revendication 4, un agent selon l'une des revendications 3 et 5 à 12 ou une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 13 à 15.
20. Procédé de préparation d'un agent immunogène selon l'une des revendications 7 à 12, caractérisé en ce que le couplage entre le peptide et la protéine porteuse est réalisé par voie chimique.
21. Procédé de préparation d'un agent immunogène selon l'une des revendications 7 à 12, caractérisé en ce que le couplage est réalisé par la technologie de l'ADN recombinant.
22. Procédé de préparation selon la revendication 20, caractérisé en ce qu'il comprend une étape au cours de laquelle on introduit une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 13 à 15 dans une cellule hôte.
23. Procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce que la séquence nucléotidique est un gène de fusion qu'on introduit par l'intermédiaire d'un vecteur d'ADN qui provient d'un plasmide, d'un bactériophage, d'un virus et/ou d'un cosmide.
24. Procédé selon l'une des revendications 22 ou 23, caractérisé en ce que le gène de fusion est intégré dans le génome de la cellule hôte.
25. Procédé selon l'une des revendications 22 à 24, caractérisé en ce que la cellule hôte est un procaryote.
26. Procédé selon la revendication 25, caractérisé en ce que la cellule hôte est choisie dans le groupe comprenant : E. coli, Bacillus, Lactobacillus, Staphylococcus et Strepfococcus.
27. Procédé selon les revendications 22 à 24, caractérisé en ce que la cellule hôte est une levure.
28. Procédé selon les revendications 22 à 24, caractérisé en ce que la cellule hôte est une cellule de mammifère.
29. Procédé selon les revendications 22 à 24, caractérisé en ce que la cellule hôte est une cellule d'origine végétale.
30. Procédé selon les revendications 22 à 24, caractérisé en ce que la cellule hôte est une cellule d'insecte.
31. Procédé selon les revendications 22 à 24, caractérisé en ce que l'on utilise un vecteur viral.
32. Procédé selon l'une des revendications 21 à 28, caractérisé en ce que la molécule de fusion est exprimée, ancrée et exposée à la membrane des cellules hôtes.
33. Composition utile selon la revendication 17, caractérisée en ce que les anticorps monoclonaux sont humanisés et produits par la voie recombinante.
34. Composition utile selon la revendication 17, caractérisée en ce que les anticorps monoclonaux sont obtenus par la méthode de librairie de phages.
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