KR100509120B1 - 돼지 유행성 설사병 바이러스의 에피토프 단백질을발현하는 형질전환체 및 그를 포함하는 경구투여용백신조성물 - Google Patents

돼지 유행성 설사병 바이러스의 에피토프 단백질을발현하는 형질전환체 및 그를 포함하는 경구투여용백신조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR100509120B1
KR100509120B1 KR10-2002-0024424A KR20020024424A KR100509120B1 KR 100509120 B1 KR100509120 B1 KR 100509120B1 KR 20020024424 A KR20020024424 A KR 20020024424A KR 100509120 B1 KR100509120 B1 KR 100509120B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
ser
pedv
protein
epitope
gly
Prior art date
Application number
KR10-2002-0024424A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20030086062A (ko
Inventor
장용석
양문식
김대혁
Original Assignee
전북대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 전북대학교산학협력단 filed Critical 전북대학교산학협력단
Priority to KR10-2002-0024424A priority Critical patent/KR100509120B1/ko
Publication of KR20030086062A publication Critical patent/KR20030086062A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100509120B1 publication Critical patent/KR100509120B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/215—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
    • C12N15/8258—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon for the production of oral vaccines (antigens) or immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/542—Mucosal route oral/gastrointestinal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

본 발명은 돼지 유행성 설사병 바이러스의 에피토프 단백질을 발현하는 형질전환체 및 그를 포함하는 경구투여용 백신조성물에 관한 것이다. 특히 본 발명의 경구투여용 백신 조성물에 포함된 돼지 유행성 설사병 바이러스의 에피토프 단백질을 생산하는 식물 형질전환체는 쉽게 보관, 유지 및 이동시킬 수 있을 뿐만 아니라 쉽게 동물에 투여하여 돼지 유행성 설사병 감염을 예방할 수 있다.

Description

돼지 유행성 설사병 바이러스의 에피토프 단백질을 발현하는 형질전환체 및 그를 포함하는 경구투여용 백신조성물{TRANSFORMANTS EXPRESSING EPITOPE PROTEIN OF PORCINE EPIDEMIC DIARRHEA VIRUS AND EDIBLE VACCINE COMPOSITION CONTAINING THE SAME}
[발명이 속하는 기술분야]
본 발명은 돼지 유행성 설사병 바이러스의 에피토프 단백질을 발현하는 형질전환체 및 그를 포함하는 경구투여용 백신조성물에 관한 것으로, 돼지 유행성 설사병 바이러스의 면역원성을 가지는 에피토프 단백질을 식물에서 발현시키고, 이를 동물에 경구용으로 투여하여 돼지 유행성 설사병 바이러스 감염을 예방할 수 있는 방법에 관한 것이다.
[종래기술]
PED(pocine epidermic diarrhea)는 돼지에서 심한 설사를 일으키는 급성바이러스성 전염병으로, 1972년 영국에서 처음 보고된 이래 1983년에 일본에서 이병의 발생이 보고되었고, 국내에서는 1992년에 수의과학검역원에서 최초로 보고하였다(Oldham J (1972). Pig Farming Suppl:72; Takahashi K., Okada K. and Ohshima K (1983) An outbreak of swine diarrhea of a new-type associated with coronavirus-like particles in Japan. Jpn. J. Vet. Sci. 45:829-832).
PED는 일령에 관계없이 모든 돼지에 감염되며, 주 증상은 구토와 설사로, 설사 시작 후 3-4일 내에 높은 폐사율을 나타낸다. 또한 PED는 TGE(Transmissible gastroenteritis) 바이러스와 복합감염이 많아, 두 바이러스의 감별진단이 어렵다(Lew YS (1999) PCR을 이용한 PED 및 TEG 감별진단. http://kkucc.konkuk.ac.kr/∼lyoo/sdd.htm).
국내에서 PED 발생이 92-94년 사이에 많이 보고되었으며, 최근 그 발생건수가 증가하는 추세를 보이고 있다. 또한, 보고되는 사례가 일부인 점으로 본다면 실제 발생건수는 더 많을 것으로 여겨진다. 1998년의 국내보고서에 따르면 PED가 발생한 9개 농장에서 평균 22.7일의 설사기간에 329.8마리의 자돈이 폐사한 것으로 확인되었다(Jeong HK (1998) 최근 문제되는 설사병(TEG, PED)에 대한 경험들. 양돈연구. http://203.255.22.240/swine/1998/03mar/9803146.htm). .
PED 바이러스(PEDV)는 코로나바이러스(Coronavirus)에 속하는 단일가닥 RNA를 유전자로 갖는 바이러스로서, 그 크기는 80-180nm 정도이다. 바이러스 단백질은 RNA에 결합하는 뉴클레오캡시드 단백질(58kDa)과 2개의 당단백질로 이루어져 있으며, 스파이크 단백질(Spike; S, 180-200kDa)과 막단백질(membrane protein: M, 27-32kDa)이 면역학적으로 검출 가능한 주된 항원으로 추정되고 있다(Egberink HF, Ederveen J, Callebaut P and Horzinek MC (1988) Characterization of the structural proteins of porcine epizootic diarrhea virus, strain CV777. Am. J. Vet. Res. 49:1320-4).
PEDV는 1988년 원숭이 신장 세포에서 증식시키는데 성공하면서 본격적인 연구가 진행되어(Hofmann M and Wyler R (1988) Propagation of the virus of porcine epidermic diarrhea in cell culture. J. Clin. Micribiol. 26:2235-9), 1992년 일본에서는 83P-5주를 베로 세포주에서 연속 계대배양에 성공하였고, 국내에서는 유행성 설사증을 보인 돼지의 가검물에서 바이러스를 베로 세포주에서 연속 계대배양한 후 플라크 분석법으로 클로닝한 KPEDV-9주를 확립하였다(Kisanagi K and Kuwahara H (1992) Isolaion and serial propagation of porcine epidermic diarrhea virus in cell cultures and partial characterization of the isolate. J. Vet. Med. Sci. 54:313-318; Kweon CH (1993) Isolation of porcine epidermic diarrhea virus (PEDV) in Korea. Korean J. Vet. Res. 33:249-254).
현재 PED를 예방하기 위하여, 임신한 모돈에게 약독화 백신을 분만 5-6주전에 1차 예방 접종한 후, 분만 2-3주전에 추가 접종하여 분만 후 초유를 통해 자돈에게 항체를 전달하는 방법이 사용되고 있으며, 실지 농가에서는 설사를 갓 시작한 자돈에서 내용물이 충분히 포함되어 있는 소장을 적출해 15-20두의 모돈에 먹여 예방시키는 방법을 사용하고 있다. 일본의 경우 83P-5주를 계대배양하여 얻은 배양액에 결정체의 트립신 양을 서서히 감소시켜 결정체 트립신 비의존성 바이러스주를 적출하여 P5-V를 만들어 경구투여가 가능한 생독백신을 개발한 바 있다. 그러나, 생독백신은 병원성이 남아있고, 병원성에 비해 면역원성이 그리 높지 않아 사용에 한계가 따른다. 이처럼 PED를 효과적으로 예방할 수 있는 근본적인 방법 및 예방백신이 아직 개발되지 않아 매해 PED에 따른 경제적 손실은 증가하고 있는 실정이다.
펜사에르트는 이전의 연구에서 모돈에 형성된 PEDV에 대한 면역반응이 락토제닉 면역에 의하여 자돈에게 이행되어 자돈을 PEDV로부터 방어할 수 있음을 보여주었는데, 이는 PEDV의 예방에는 항원유전자 형질전환 식물체를 이용한 경구백신을 이용한 점막면역의 유도가 매우 효과적인 방법임을 의미한다(Pensaert MB (1999) Porcine epidemic diarrhea; in Diseases of Swine, 8th ed., Straw, B. E., DAllaire, S., Mengeling, W. L., and Taylor, D. I. (eds.), pp. 179-185, Ames: Iowa State University Press. U.S.A.). 식물을 통해 이종 항원단백질을 발현시켜 백신으로 이용하는 것은 비용이 적게 들며, 정제가 쉽고, 이동 및 보관이 용이하며, 대량으로 투여가 용이하다는 여러 가지 장점이 있다(Gomez N, Carrillo C, Salinas J, Parra F, Borca MV and Escribano JM (1998) Virology 249:352-358). 식물을 통한 백신의 개발 가능성은 1992년 메이슨 등이 담배에 HBV(B형 간염 바이러스)의 표면 항원 유전자(HBsAg)를 도입해 항원 단백질의 생산을 확인하였고, 식물에서 발현된 항원단백질이 HBV에 감염된 사람의 혈청에 의하여 인식됨을 관찰하면서 처음으로 제시되었으며(Mason HS, Lam DM-K and Arntzen CJ (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11745-11749), 이후 이렇게 생산된 HBsAg에 의해 유도되는 면역반응이 상품화된 HBV백신과 유사함을 보여 백신으로써 사용가능성이 입증되었다(Thanavala Y, Yang YF, Lyons P, Mason HS and Arntzen C (1995) Imminogenecity of transgenic plant-derived hepatitis B surface antigen. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:3358-3361).
상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명은 PEDV 감염을 예방할 수 있는 경구용 백신 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 PEDV의 에피토프 단백질을 포함하는 식물발현용 재조합 벡터를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 PEDV의 에피토프 단백질을 발현하는 형질전환체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 PEDV의 에피토프 단백질을 발현하는 형질전환체를 포함하는 백신조성물 및 상기 백신조성물을 동물에 경구 투여하여 PED을 예방할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1의 PEDV 에피토프 단백질을 암호하는 PEDV 에피토프 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 서열번호 1에서, X22는 Asp 또는 Gly이고, X23은 Ser 또는 Leu이고, X24는 Ser 또는 Gly이고, X25는 Ser 또는 Gly이고, X51은 Thr 또는 Arg이고, X58은 Asn 또는 Ser이고, X114는 Leu 또는 Phe이고, 및 X137은 Ile 또는 Val이다.
또한 본 발명의 상기의 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
또한 본 발명은 상기의 형질전환체로부터 발현된 재조합 PEDV 에피토프 단백질을 제공한다.
또한 본 발명은 상기의 형질전환체, 상기 형질전환체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전환체로부터 분리된 재조합 PEDV 에피토프 단백질을 포함하는 경구투여용 백신조성물을 제공한다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명자들은 PEDV 항원으로 작용하는 서열번호 1의 PEDV 에피토프 단백질을 발현하는 재조합 벡터 및 형질전환체를 제조하였으며, 이를 이용한 경구 백신 조성물을 개발하였다.
본 발명의 재조합 벡터는 서열번호 1의 PEDV 에피토프 단백질을 암호하는 유전자서열을 포함하는 것으로, 원핵생물 또는 진핵생물에서 발현가능하도록 제작된 것이다.
상기 PEDV 에피토프는 PEDV 스파이크 단백질의 코어부분에 해당한다.
서열번호 1에 기재된 "X"는 PEDV의 서브타입별로 다양성을 나타내는 아미노산으로, 알라닌, 알기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소루신, 루신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤닌, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이 사용될 수 있다.
본 발명에서는 서열번호 1의 아미노산에서 22번에 기재된 X를 편의상 X22로, 23번의 X는 X23, 24번의 X는 X24, 25번의 X는 X25, 51번의 X는 X51, 58번의 X는 X58, 114번의 X는 X114 및 137번의 X는 X137로 나타낸다.
바람직한 서열번호 1의 PEDV 에피토프 단백질은
X22는 Asp 또는 Gly이고,
X23은 Ser 또는 Leu이고,
X24는 Ser 또는 Gly이고.
X25는 Ser 또는 Gly이고,
X51은 Thr 또는 Arg이고,
X58은 Asn 또는 Ser이고,
X114는 Leu 또는 Phe이고, 및
X137은 Ile 또는 Val이다.
더욱 바람직하게는 X22 내지 X25는 "DSGG" 또는 "GLSS"이고, X51은 "T" 또는 "R", X58은 "N" 또는 "S", X114는 "L" 또는 "F" 이며, X137은 "I" 또는 "V"이다.
또한 본 발명의 재조합 벡터는 PEDV 에피토프 단백질이 포함된 스파이크 단백질(GeneBank No. Z25483)을 암호하는 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서 일예로 제조한 재조합 벡터는 pMYO39이다. pMYO39벡터는 도 1에 도시한 바와 같이, CaMV 35s 프로모터(P35s), 서열번호 2의 PEDV 에피토프 유전자 및 노팔린 합성효소 종결자(nopaline synthase terminator; Tnos)를 포함하며, 식물에서 PEDV 에피토프 단백질을 생산한다.
또한 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다. 상기 형질전환체는 식물, 아그로박테리움 및 대장균 등의 원핵생물 또는 진핵생물 모두 가능하나, 더욱 바람직하게는 식물, 식물세포 또는 식물조직이다. 상기 식물은 모든 종류의 식물이 바람직하나, 더욱 구체적으로는 담배(Nicotiana tabaccum), 애기장대, 감자, 상추, 무, 배추, 당근, 토마토, 콩, 쌀, 보리, 밀, 및 옥수수 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터를 식물, 식물세포 또는 식물조직에 도입하는 방법은 통상의 방법으로 실시할 수 있으며, 바람직하게는 아그로박테리움을 매개로한 형질전환방법이 좋다. 본 발명에서는 pMYO39벡터를 아그로박테리움에 형질전환하여 형질전환된 아그로박테리움을 제조하였으며, pMY039를 포함하는 대장균을 대한민국 대전시 유성구에 소재한 한국생명과학연구소 유전자은행에 2002년 3월 5일에 KCTC 10194BP로 기탁하였다.
본 발명에서 제조한 형질전환체의 일예로 제조한 형질전환 담배는 PEDV 에피토프 유전자를 발현하여 PEDV 단백질을 생산할 뿐만 아니라 생산된 PEDV 단백질은 면역원성을 가져 PEDV에 대하여 중화활성을 가지는 항체를 생산할 수 있다.
또한 본 발명은 PEDV에 대한 항혈청 또는 항체를 제공한다. 상기 항체는 재조합 PEDV 에피토프 단백질을 항원으로 사용하여 제조한 것으로, 통상적인 실험동물에 주입하여 제조할 수 있다. 본 발명의 PEDV에 대한 항혈청 및 항체는 PEDV에 감염된 것으로 추정되는 동물을 진단하기 위한 용도로 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 사료나 식수에 혼합하여 동물에 투여할 수 있다.
또한 본 발명은 PEDV 에피토프 단백질을 포함하는 백신 조성물을 제공한다. 바람직한 백신 조성물은 본 발명의 형질전환체로부터 생산된 재조합 PEDV 에피토프 단백질, 형질전환체로부터 추출한 단백질 추출물 또는 형질전환체 자체를 포함하는 백신이다. 본 발명의 백신 조성물은 경구용 또는 비경구용으로 적용할 수 있으며, 동물에 경구 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 백신 조성물은 약리학적으로 허용가능한 희석제 또는 부형제를 더욱 포함할 수 있다. 본 발명의 백신 조성물은 유효성분으로 재조합 PEDV 에피토프 단백질을 100 내지 1,000 mg/l로 포함할 수 있으며, 투여량으로 50 내지 500 mg을 투여할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 백신 조성물은 본 발명의 식물 형질전환체를 분쇄하여 동물의 사료나 식수에 첨가하여 투여할 수 있으며, 상기한 방법으로 투여하였을 경우 PEDV에 대하여 점막면역반응 뿐만 아니라 전신면역반응을 유도할 수 있다. 또한 식물 형질전환체를 경구용으로 사용할 경우 동물성 바이러스 오염 가능성이 낮고, 생산되는 재조합 PEDV 에피토프 단백질이 식물에 함유되어 있으므로 장기간 보관 및 이동이 가능할 뿐만 아니라, 주사접종으로 인한 비용소모를 대폭 절감시킬 수 있다.
이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 보정범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 형질전환 담배 제조
1. 재조합 벡터의 제조
허버트 라우드 박사(Dr. Hubert Laude, I.N.R.A., France)로부터 제공받은 pBES 플라스미드(Duarte M and Laude H (1994) J. Gen. Virol. 75:1195-1200)를 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트로 PCR(94 ℃, 7분 -> 94 ℃, 1분 -> 55 ℃, 1분, 72 ℃, 45초, 30회 반복 -> 72 ℃, 7분)하여 460 bp의 PCR 산물(PEDV 에피토프 유전자)을 분리하였다.
PCR 산물을 pBlueScript KS 벡터에 클로닝하여 염기서열을 확인하였고, XbaⅠ/KpnⅠ로 절단하여 수득한 DNA 단편을 pMY28 벡터에 삽입하여 pMYO39를 제조하였다(도 1).
2. 아그로박테리움을 이용한 형질전환
pMYO39 벡터는 아그로박테리움을 이용한 형질전환방법으로 담배에 도입시켰다(Hooykaas PJ (1994) The virulence system of Agrobacterium tumefaciens. Annu. Rev. Phytopathol. 32:157-179).
트리페렌탈 메이팅법(Kim Y-H (1998) Iron accumulation in transgenic red pepper plant: Introduced FP1 gene encoding the iron storage protein. Plant Resource 1:6-12)을 이용해 아그로박테리움에 pMYO39를 도입하였다.
먼저 아그로박테리움 튜메파시엔스 LBA4404를 리팜피신 100 ㎎/ℓ를 포함한 LB배지에 접종하여 28 ℃에서 48시간 배양하였고, pMYO39와 pRK2013이 들어있는 E. coli는 카나마이신 50 ㎎/ℓ을 포함한 LB배지에 접종하여 37 ℃에서 16시간 배양하였다. 각각의 균을 5,000rpm에서 5분간 원심분리하여 상층액을 버린 후, LB배지를 가해 다시 5,000rmp에서 5분간 원심분리하였다. 상기 과정을 2회 반복하여 배지에 포함되어 있던 항생제를 제거하고, 최종적으로 LB배지 1 ㎖에 희석하였다. 이렇게 준비된 3종류의 균을 100 ㎕씩 LB배지에 접종한 후 28 ℃의 암상태에서 48시간 배양했다. 배양된 균에 3 ㎖의 10 mM MgSO4를 가해 현탁시킨 후, 원액에서 10-4까지 희석시켜 리팜피신 100㎎/ℓ와 카나마이신 50 ㎎/ℓ을 포함한 LB배지에 접종하여 28 ℃의 암상태에서 48시간 배양하여 형질전환체를 선발하였다. 형질전환체는 리팜피신 100 ㎎/ℓ와 카나마이신 50 ㎎/ℓ을 포함한 LB배지에 접종하고 플라스미드를 각각 분리해 유전자를 확인하였다.
형질전환된 아그로박테리움을 리팜피신 100 ㎎/와 카나마이신 50 ㎎/ℓ를 포함한 LB배지에 접종하여 28 ℃에서 48시간 배양하고, 5000rpm에서 5분간 원심분리하여 아그로박테리움을 수확하였다. 멸균상태에서 키운 담배(Nicotiana tabaccum cv. Havana)의 어린 잎을 절단(0.5×0.5㎜)하고 아그로박테리움이 포함된 MSO 액체배지에서 15분간 감염시켰다. 감염 후 여과지에서 블롯팅하여 표면에 묻어있을 수 있는 아그로박테리움을 제거하고, MS104배지에 치상하여 차광된 상태로 25 ℃에서 2일간 배양한 후 MS104 선택배지에 옮겨 25 ℃에서 발아를 유도하였다. 담배가 2∼3 ㎝정도 자랐을 때, 지상부만을 잘라 MS 뿌리발생(rooting) 배지에 옮겨 주었다. 배지에서 뿌리가 충분히 형성되면 화분에 이식하여 온실에서 재배하였다.
3. 형질전환체 검증
3-1. RT-PCR
형질전환 담배에서 도입된 유전자가 정상적으로 발현되는지를 알아보기 위하여 RNA를 추출해 RT-PCR을 수행하였다.
담배에서 RNA를 추출하기 위해 담배 잎 1ｇ을 미리 차갑게 한 막자사발에서 액체질소로 충분히 얼린 후 곱게 분쇄하였다. 여기에 5 ㎖의 RNA Zol(4 M guanidiumthiocyanate, 25 mM sodiumcitrate pH7.0, 0.5 % N-lauroylsarcosine, 0.1 % 2-mercaptoethanol)을 첨가하여 균일하게 혼합하였다. 그리고 TE 완충액으로 포화시킨 페놀 5 ㎖을 넣고 잘 섞은 후 클로로포름 1 ㎖을 첨가하여 혼합하였다. 얼음에 15분간 방치한 후 4 ℃, 12,000g에서 15분간 원심분리하여 상층액을 새로운 튜브에 옮겼다. 여기에 1/10배의 3 M NaOAc(pH5.2)와 2배의 에탄올을 가하여 -20 ℃에서 20분간 방치한 후 4 ℃, 12,000rpm, 15분간 원심분리하였다. 상층액은 제거하고 70 % 에탄올로 한 번 세척하고 건조시킨 다음 DEPC-H2O에 녹여 260㎚에서 OD값으로 RNA를 정량하였다.
정제된 전체 RNA 8 ㎍을 반응액(100mM NaOAc pH5.0, 5mM MnSO4)에 넣고, 5U의 DNaseⅠ을 첨가해 37 ℃에서 2시간 반응시킨 후 페놀추출 및 에탄올 침전과정을 실시하여 DEPC-H2O 8 ㎕에 녹였다.
정제한 RNA는 서열번호 4의 프라이머 및 1st cDNA 합성키트(Amersham-Pharmacia Biotech)로 1st cDNA를 합성하였고, 이 중 5 ㎕를 취해 서열번호 3의 프라이머/서열번호 4의 프라이머로 PCR을 수행하였다: 94 ℃, 7 -> 94 ℃, 1분 -> 55 ℃, 1분 -> 72 ℃, 1분 30초, 30회 반복 -> 72 ℃, 7분.
PCR 산물은 아가로즈 겔에 전기영동하여 PEDV 에피토프 유전자의 발현을 확인하였다. 도 2는 형질전환 담배로부터 추출한 RNA를 RT-PCR한 다음 PCR 산물을 전기영동한 사진으로, "M"은 사이즈마커이고, "P"는 pMYO39이고, "N"은 벡터만으로 형질전환된 담배이고, "1" 내지 "7"은 형질전환 담배1 내지 7이다.
그 결과 형질전환 담배 1, 2, 5, 6 및 7에서 약 460 bp로 증폭된 PCR 산물을 확인할 수 있었다. 이를 재확인하기 위하여 PCR 산물을 HincII 제한효소로 절단한 결과 약 460 bp의 DNA 단편이 분리됨을 관찰하였다. 이는 RT-PCR에 의해서 얻어진 산물들이 도입된 PEDV의 에피토프 유전자가 발현된 mRNA에서 유래된 것임을 입증하는 것이며, 담배에 도입된 PEDV의 에피토프 유전자가 정상적으로 발현되고 있다는 것을 의미한다.
3-2. 노던 블롯 분석
RT-PCR에서 다량 증폭된 것으로 확인된 형질전환 담배 6 및 7, 증폭되지 않은 형질전환 담배 4를 선택하고, 각각의 RNA에 대한 노던블롯을 실시하였다.
RNA 40 ㎍을 포름알데하이드 아가로즈 겔상에 전기영동하였다. 전기영동된 RNA 밴드들을 Hybond N+ 막에 이동시키고, 2000J로 UV 교차반응을 실시하여 RNA 밴드들을 막에 고정시켰다. 막을 하이브리디제이션 병에 넣은 후 5 ㎖의 완충액(1 mM EDTA, 250 mM Na2HPO4, 1 % hydrolysated casein, 7 % SDS)을 넣어 65 ℃에서 2시간 전처리한 다음 α32P-dCTP로 표지된 프로브를 첨가하여 65 ℃에서 18시간 반응시켰다. 사용한 프로브는 pMYO39를 PCR하여 얻어진 460 bp의 PCR 산물을 정제한 것이다. 이후 막은 세척한 다음 X-레이 필름에 감광하여 현상하였다.
도 3은 형질전환 담배로부터 추출한 RNA에 대하여 노던블롯을 실시한 사진으로, "P"는 pMYO39이고, "N"은 벡터만으로 형질전환된 담배이고, "4", "6" 및 "7"은 형질전환 담배이다.
도 3에서, RT-PCR에서 밴드가 관찰되지 않았던 형질전환 담배 4에서는 하이브리디제이션 신호가 나타나지 않았지만, 형질전환 담배6 및 7에서는 약 460 bp 크기의 신호가 관찰되었다. 따라서 RT-PCR 결과와 함께 식물체 내로 도입된 PEDV 에피토프 유전자가 mRNA 상태로 전사되고 있음을 확인할 수 있다.
3-3. 웨스턴 블롯 분석
형질전환 담배에서 발현된 PEDV 에피토프 mRNA가 정상적인 단백질로 발현되는지 여부를 웨스턴 블롯으로 확인하였다.
형질전환 담배에서 단백질을 추출하기 위하여, 담배 잎 1 g을 차가운 막자사발에서 액체질소를 이용하여 곱게 분쇄하였다. 여기에 단백질 추출 완충액(10 mM MES pH6.0, 10 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.6 % Triton X-100, 0.25 M sucrose, 10 mM DTT, 1 mM PMSF) 4 ㎖을 넣어 추출한 후, 12,000g 4 ℃에서 15분간 원심분리하여 상층액만을 취하였다. 이를 스피드-벡 건조기에서 2시간 동안 농축하여 브래드포드법으로 단백질을 정량하였다.
단백질 60 ㎍을 12 % SDS-PAGE 겔에서 전기영동하여 니트로셀룰로즈 막에 블롯팅시킨 다음 3 % BSA로 하룻밤동안 블롯킹시켰다. 이후 막을 TBST(100 mM Tris pH7.5, 0.9 % NaCl, 0.1 % Tween20)로 3번 세척하고, 일차 항체로 실온에서 4시간동안 반응시킨 다음 TBST로 3차례 세척하였다. 일차항체는 PEDV 에피토프 유전자를 E. coli에서 발현시킨 다음 마우스에 주입하여 면역화된 마우스로부터 수득한 혈청이다. 여기에 마우스 IgG 이차항체를 5 ㎖의 TBST에 1:7000으로 희석하여 희석액을 막에 2시간동안 반응시켰다. 막은 TBST로 3차례 세척하고, TMN(100 mM Tris pH9.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2)로 1차례 세척한 다음 BCIP(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate)와 NBT(nitro blue tetrazolium)으로 발색반응을 유도하였다.
도 4는 형질전환 담배로부터 추출한 단백질에 대하여 웨스턴 블롯한 사진으로, "P"는 양성대조군으로 PEDV 에피토프 유전자를 E. coli에서 발현시킨 것이고, "N"은 벡터만으로 형질전환된 담배이고, "7"은 형질전환 담배이다. 도 4에서, 형질전환 담배 7에서 도입된 항원유전자로부터 항원단백질이 발현되었음을 확인할 수 있다. 확인된 밴드 크기는 약 26 kDa으로 대장균에서 발현된 PEDV 에피토프 단백질보다는 크지만 이는 항원단백질이 당으로 수식되어 일어나는 차이로 추정된다.
실시예 2: PEDV 중화활성
형질전환 담배에서 발현된 PEDV 에피토프 단백질이 면역원성을 갖는지 알아보기 위하여, 형질전환 담배의 단백질 추출물을 시료로 실험을 실시하였다.
형질전환 담배로부터 PEDV 에피토프 단백질을 추출하기 위하여 식물체를 액체질소를 이용하여 잘게 만든 후 추출용 완충용액을 이용하여 단백질을 추출하고 투석 및 동결건조를 통하여 시료를 준비하였다. 시료는 1 ㎎/㎖ 농도로 PBS 완충용액에 녹인 후 완전체 프레운드스 보조체(complete Freund's adjuvant; CFA)와 동비율로 섞어 4-6주령의 BALB/c 생쥐의 근육과 피하에 50 ㎍씩 주사하고, 7-10일 후 동일한 항원을 불완전체 프레운드스 보조체(incomplete Freund's adjuvant; IFA)에 섞어 주입한 다음 4일 후에 눈안의 정맥에서 혈액을 채취하여 혈청을 준비하였다. 혈청은 웨스턴 블롯 분석 및 ELISA 등을 통하여 혈청 내 면역반응을 측정하였다(Haq TA, Mason HS, Clements JD and Arntzen CJ (1995) Science 268:714-716).
마우스 혈청을 이용하여 바이러스 중화실험을 통하여 수행하였다. 5 ×1013 pfu/㎖의 바이러스 원액 900 ㎕에 혈청 및 대조군인 신제닉 혈청을 각각 100 ㎕씩 섞은 후 37 ℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 바이러스 용액을 VM1(0.3% TPB, 0.02 % YE, 30 mM HEPES, 1 ㎍/㎖ trypsin/MEM)으로 10-8 내지 10-9 로 연속희석하고, MEM으로 세척한 다음 베로 세포 층에 1 ㎖ 씩 첨가하였다. 실온에서 2시간 동안 반응을 시켜 바이러스의 흡착을 유도한 다음 바이러스 용액을 제거하고, 베로 세포에 VM1 배지 1 ㎖을 넣고 실온에서 2시간 배양하였다. 이후 VM3(0.3 % TPB, 0.0 2% YE, 30 M HEPES, 4 % FBS/MEM) 4 ㎖을 넣고 CO2 배양기에서 2일 동안 배양한 다음 배지를 완전히 제거하였다. 바이러스가 감염된 베로 세포 위에 0.9 % 노블 아가/MEM 4 ㎖을 넣고, 24시간 배양한 다음 0.1 % 중성 레드염색액을 넣고 배양하여 바이러스 플라크 형성을 관찰하였다(Hofmann M and Wyler R (1989) Vet. Microbiol. 20:131-142).
도 5는 형질전환 담배 단백질 추출물로 면역화된 마우스로부터 추출한 혈청에 의한 바이러스 플라그 형성 저해정도를 나타낸 그래프이다. 그래프에서 "None"은 혈청을 처리하지 않은 베로 세포이고, "Vector Control"은 빈 벡터로 형질전환시킨 담배의 단백질 추출물에 대한 혈청을 처리한 베로 세포이고, "#6" 및 "#7" 각각은 형질전환 담배 6 및 7의 단백질 추출물에 대한 혈청을 처리한 베로 세포이다. 각각의 시료를 처리하였을 때 바이러스의 활성을 나타내는 플라크의 수를 측정한 결과, 형질전환 담배 6 및 형질전환 담배 7로 면역화된 마우스로부터 추출한 혈청은 각각 60 % 및 70 %의 PEDV 플라그 형성 저해율을 나타내었다.
실시예 3: 형질전환 담배 분말 구강투여를 통한 PEDV 중화반응 측정
빈 벡터로 형질전환된 담배(대조군), 형질전환 담배 6 및 형질전환 담배 7 각각의 식물체를 동결건조하여 분쇄한 다음 각각 5 ㎎/㎖ 및 25 ㎎/㎖ 농도로 PBS 완충용액에 녹인 후 위관영양법으로 각각 200 ㎕씩 5마리의 생쥐에 투여하였다(Gomez N, Wigdorovitz A, Castanon S, Gil F, Ordas R, Borca MV and Escribano JM (2000) Arch. Virol. 145: 1725-1732).
경구 투여 후 3일 간격으로 배설물을 채취하여 IgA의 변화를 관찰한 결과 점막면역이 유도됨을 확인하였다. 또한 1주일 간격으로 식물체 분말을 투여하고, 2회 투여 때부터 혈액을 채취하여 항체의 변화를 측정하여 전신면역 반응의 유도를 확인하였으며, 항체의 변화를 측정한 후 생성된 항체에 의한 바이러스 중화정도는 상기와 동일한 방법으로 확인하였다.
도 6은 형질전환 담배를 분말상태로 동물에 경구투여하고, 면역화된 동물로부터 분리한 혈청에 의한 바이러스 플라그 형성 저해정도를 나타낸 그래프이다. 그래프에서 "None"은 혈청을 처리하지 않은 베로 세포이고, "Vector Control"은 빈 벡터로 형질전환시킨 담배를 경구투여한 동물로부터 수득한 혈청을 처리한 베로 세포이고, "#6" 및 "#7" 각각은 형질전환 담배 6 및 7를 각각 경구투여한 동물로부터 수득한 혈청을 처리한 베로 세포이다.
도 6에서 "None"에서 생성된 플라크 수보다 "Vector Control"은 6 %, 형질전환 담배 6은 44 %, 형질전환 담배 7은 53 %의 플라크 형성 감소율을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 형질전환 담배를 경구로 동물에 투여하였을 때 PEDV에 대하여 항체 형성을 유도할 뿐만 아니라 바이러스 중화활성을 가진다.
상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 PEDV 에피토프 단백질을 생산하는 식물 형질전환체는 경구 백신으로 사용하여 PEDV에 대하여 중화활성을 가지는 항체형성을 유도할 수 있어 PEDV 감염을 예방할 수 있다. 또한 본 발명의 경구 백신은 동물성 바이러스 오염 가능성이 낮아 안전하며, 식물 형질전환체의 장기간 보관 및 이동이 가능하여 백신 제조가 용이할 뿐만 아니라 경구투여로 주사접종으로 인한 비용소모를 대폭 절감시킬 수 있다.
도 1은 pMYO39 벡터의 구조도를 나타낸 것이고,
도 2는 형질전환 담배식물로부터 추출한 RNA를 RT-PCR 한 다음 PCR 산물을 전기영동한 사진이고,
도 3은 형질전환 담배식물로부터 추출한 RNA에 대하여 노던블롯을 실시한 사진이고,
도 4는 형질전환 담배식물로부터 추출한 단백질에 대하여 웨스턴블롯한 사진이고,
도 5는 형질전환 담배식물 단백질 추출물로 면역화된 마우스로부터 추출한 혈청에 의한 바이러스 플라크 형성 저해정도를 나타낸 그래프이고,
도 6은 형질전환 담배식물을 분말상태로 동물에 경구투여하여 면역화된 동물로부터 분리한 혈청에 의한 바이러스 플라크 형성 저해정도를 나타낸 그래프이다.
<110> JANG, Yong Suk YANG, Moon Sik KIM, Dae Hyuk <120> TRANSFORMANTS EXPRESSING EPITOPE PROTEIN OF PORCINE EPIDEMIC DIARRHEA VIRUS AND EDIBLE VACCINE COMPOSITION CONTAINING THE SAME <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 140 <212> PRT <213> PEDV epitope protein <400> 1 Val Thr Leu Pro Ser Phe Asn Asp His Ser Phe Val Asn Ile Thr Val 1 5 10 15 Ser Ala Ala Phe Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Asn Leu Val Ala Ser Asp 20 25 30 Thr Thr Ile Asn Gly Phe Ser Ser Phe Cys Val Asp Thr Arg Gln Phe 35 40 45 Thr Ile Xaa Leu Phe Tyr Asn Val Thr Xaa Ser Tyr Gly Tyr Val Ser 50 55 60 Lys Ser Gln Asp Ser Asn Cys Pro Phe Thr Leu Gln Ser Val Asn Asp 65 70 75 80 Tyr Leu Ser Phe Ser Lys Phe Cys Val Ser Thr Ser Leu Leu Ala Gly 85 90 95 Ala Cys Thr Ile Asp Leu Phe Gly Tyr Pro Ala Phe Gly Ser Gly Val 100 105 110 Lys Xaa Thr Ser Leu Tyr Phe Gln Phe Thr Lys Gly Glu Leu Ile Thr 115 120 125 Gly Thr Pro Lys Pro Leu Glu Gly Xaa Thr Asp Val 130 135 140 <210> 2 <211> 420 <212> DNA <213> PEDV epitope gene <400> 2 gttactttgc catcatttaa tgatcattct tttgttaata ttactgtctc tgcggctttt 60 ggtggtctta gtagtgccaa tctcgttgca tctgacacta ctatcaatgg gtttagttct 120 ttctgtgttg acactagaca atttaccatt acactgtttt ataatgttac aaacagttat 180 ggttatgtgt ctaaatcaca ggatagtaat tgtcctttca ccttgcaatc tgttaatgat 240 tacctgtctt ttagcaaatt ttgtgtttca accagccttt tggctggtgc ttgtaccata 300 gatctttttg gttaccctgc gttcggtagt ggtgttaagt tgacgtccct ttattttcaa 360 ttcacaaaag gtgagttgat tactggcacg cctaaaccac ttgaaggtat cacagacgtt 420 420 <210> 3 <211> 39 <212> DNA <213> primer <400> 3 gagtctagaa cagccaattt ctatggttac tttgccatc 39 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> primer <400> 4 ctggatccta aattaaacgt ctgtgatacc 30

Claims (9)

  1. 서열번호 1의 PEDV(pocine epidermic diarrhea virus) 에피토프 단백질을 암호하는 PEDV(pocine epidermic diarrhea virus) 에피토프 유전자를 포함하는 재조합 벡터:
    상기 서열번호 1에서, X22는 Asp 또는 Gly이고, X23은 Ser 또는 Leu이고, X24는 Ser 또는 Gly이고, X25는 Ser 또는 Gly이고, X51은 Thr 또는 Arg이고, X58은 Asn 또는 Ser이고, X114는 Leu 또는 Phe이고, 및 X137은 Ile 또는 Val이다.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 2의 서열을 갖는 것인 재조합 벡터.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 식물발현용 프로모터, PEDV 에피토프 유전자 및 전사종결자를 포함하는 것인 재조합 벡터.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 pMYO39(KCTC10194BP)인 것인 재조합 벡터.
  5. 제 1항의 재조합벡터로 형질전환된 형질전환체로서, 상기 형질전환체는 아그로박테리움, 대장균 및 식물세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 형질전환체.
  6. 삭제
  7. 제 5항에 있어서, 상기 식물세포는 담배, 애기장대, 감자, 상추, 무, 배추, 당근, 토마토, 콩, 쌀, 보리, 밀, 및 옥수수로 이루어진 군으로부터 선택되는 식물로부터 유래된 것인 형질전환체.
  8. 서열번호 1의 서열로 이루어지는 PEDV(pocine epidermic diarrhea virus) 에피토프 단백질:
    상기 서열번호 1은, X22는 Asp 또는 Gly이고, X23은 Ser 또는 Leu이고, X24는 Ser 또는 Gly이고, X25는 Ser 또는 Gly이고, X51은 Thr 또는 Arg이고, X58은 Asn 또는 Ser이고, X114는 Leu 또는 Phe이고, 및 X137은 Ile 또는 Val이다.
  9. 제 8항의 PEDV(pocine epidermic diarrhea virus) 에피토프 단백질, 제 5항 또는 7항에 따른 형질전환체의 단백질 추출물, 또는 상기 형질전환체로부터 분리된 재조합 PEDV(pocine epidermic diarrhea virus) 에피토프 단백질을 포함하는 경구투여용 백신조성물.
KR10-2002-0024424A 2002-05-03 2002-05-03 돼지 유행성 설사병 바이러스의 에피토프 단백질을발현하는 형질전환체 및 그를 포함하는 경구투여용백신조성물 KR100509120B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2002-0024424A KR100509120B1 (ko) 2002-05-03 2002-05-03 돼지 유행성 설사병 바이러스의 에피토프 단백질을발현하는 형질전환체 및 그를 포함하는 경구투여용백신조성물

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2002-0024424A KR100509120B1 (ko) 2002-05-03 2002-05-03 돼지 유행성 설사병 바이러스의 에피토프 단백질을발현하는 형질전환체 및 그를 포함하는 경구투여용백신조성물

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20030086062A KR20030086062A (ko) 2003-11-07
KR100509120B1 true KR100509120B1 (ko) 2005-08-18

Family

ID=32381429

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR10-2002-0024424A KR100509120B1 (ko) 2002-05-03 2002-05-03 돼지 유행성 설사병 바이러스의 에피토프 단백질을발현하는 형질전환체 및 그를 포함하는 경구투여용백신조성물

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR100509120B1 (ko)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100884085B1 (ko) * 2007-07-25 2009-02-18 대한민국 돼지 유행성설사병 바이러스를 중화하는 특이 단클론 항체단쇄가변분절 유전자 및 이를 발현한 재조합단백질
KR101671528B1 (ko) * 2010-12-14 2016-11-01 단국대학교 산학협력단 돼지 유행성 설사병 바이러스의 에피토프와 점막면역보조제를 발현하는 형질전환체 및 이를 포함하는 백신 조성물
CN103013895B (zh) * 2011-09-23 2014-07-16 华中农业大学 猪流行性腹泻病毒重组猪霍乱沙门氏菌基因工程活疫苗及制备与应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20000003767A (ko) * 1998-06-29 2000-01-25 이재진 돼지 아데노바이러스 4형 으로부터 제작한 재조합 발현벡터 및그를 이용하여 유전자 재조합 돼지 아데노바이러스 4형을 제조하는 방법
KR20030012280A (ko) * 2001-07-31 2003-02-12 주식회사 바이오비전텍 돼지 유행성 설사병 바이러스에 대한 백신효과를 유도하는형질전환 감자 및 이의 제조방법

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20000003767A (ko) * 1998-06-29 2000-01-25 이재진 돼지 아데노바이러스 4형 으로부터 제작한 재조합 발현벡터 및그를 이용하여 유전자 재조합 돼지 아데노바이러스 4형을 제조하는 방법
KR20030012280A (ko) * 2001-07-31 2003-02-12 주식회사 바이오비전텍 돼지 유행성 설사병 바이러스에 대한 백신효과를 유도하는형질전환 감자 및 이의 제조방법

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J Gen Virol. 1993 Sep;74 ( Pt 9):1795-804, Bridgen A *
J Gen Virol. 1994 May;75 ( Pt 5):1195-200, Duarte M *
NCBI GeneBank Accesion NO. AF353511 *
NCBI GeneBank Accesion NO. Z25483 *
Virology. 1994 Feb;198(2):466-76, Duarte M *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20030086062A (ko) 2003-11-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Marquet-Blouin et al. Neutralizing immunogenicity of transgenic carrot (Daucus carota L.)-derived measles virus hemagglutinin
KR102199018B1 (ko) 식물에서 인플루엔자 바이러스-유사 입자 생산
Zheng et al. Boosted expression of the SARS-CoV nucleocapsid protein in tobacco and its immunogenicity in mice
KR20080091759A (ko) 신규 식물 바이러스 입자 및 그의 불활성화 방법
Bouche et al. Neutralising immunogenicity of a polyepitope antigen expressed in a transgenic food plant: a novel antigen to protect against measles
JP2001500487A (ja) 植物ウイルスコートタンパク質と融合したポリペプチド
WO1999003987A2 (fr) Epitopes du vrs et anticorps les comportant, utiles dans le diagnostic et la therapie
KR100964462B1 (ko) 형질전환 식물 유래의 조류독감 바이러스 백신 및 그 제조방법
US11332754B2 (en) Codon optimization for increasing transgene expression in chloroplasts of higher seed plants
KR20110037880A (ko) 형질전환 식물 유래의 고병원성 조류독감 바이러스 단백질 백신 및 그 제조방법
US20210388366A1 (en) Plant-produced chimaeric orbivirus vlps
KR20210062015A (ko) 변형된 pedv 스파이크 단백질
Andrianova et al. Foot and mouth disease virus polyepitope protein produced in bacteria and plants induces protective immunity in guinea pigs
KR100509120B1 (ko) 돼지 유행성 설사병 바이러스의 에피토프 단백질을발현하는 형질전환체 및 그를 포함하는 경구투여용백신조성물
US20170239345A1 (en) Methods and compositions to produce vaccines against smallpox in plants
CN105749267B (zh) 一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征标记疫苗及其血清学鉴别方法
CN111565747A (zh) 与猪fc片段融合的抗原，以及包含该抗原的疫苗组合物
KR101757331B1 (ko) 신규한 돼지 유행성설사 바이러스 및 그의 이용
CN115867662A (zh) 形成三聚体的新型冠状病毒肺炎(covid-19)重组刺突蛋白、在植物中大量产生重组刺突蛋白的方法和基于其制备疫苗组合物的方法
US20130156805A1 (en) Chimeric momp antigen
US8591915B2 (en) Plant-derived vaccines against respiratory syncytial virus
WO2010085162A2 (en) Expression cassettes, T-DNA molecules, plant expression vectors, transgenic plant cells as well as the use thereof in the production of a vaccine
WO2017029619A1 (en) Synthetic btv vp2 multiepitope peptide vaccine
WO1989006971A1 (en) Conserved rotavirus gene segments and use in immunization and neutralization
KR101783677B1 (ko) 식물 바이러스 발현 시스템을 이용한 재조합 뎅기 바이러스 백신을 대량 생산하는 방법

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E90F Notification of reason for final refusal
N231 Notification of change of applicant
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20120802

Year of fee payment: 8

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20130821

Year of fee payment: 9

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20150810

Year of fee payment: 11

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160825

Year of fee payment: 12

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170719

Year of fee payment: 13

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180717

Year of fee payment: 14