KR100884085B1 - 돼지 유행성설사병 바이러스를 중화하는 특이 단클론 항체단쇄가변분절 유전자 및 이를 발현한 재조합단백질 - Google Patents
돼지 유행성설사병 바이러스를 중화하는 특이 단클론 항체단쇄가변분절 유전자 및 이를 발현한 재조합단백질 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 돼지 유행성설사병 바이러스를 중화하는 특이 단클론 항체 단쇄가변분절 유전자 및 이를 발현한 재조합단백질에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 돼지 유행성설사병 바이러스를 특이적으로 중화하는 단클론 항체의 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위를 코딩하는 염기서열 및 아미노산 서열과 이를 단쇄로 연결한 단쇄가변분절 항체를 구성하는 유전자, 이를 발현한 재조합단백질 및 이를 이용한 돼지 유행성 설사병에 대한 치료제에 관한 것이다.
돼지유행성설사병(PED), 바이러스 중화항체, 단클론항체, 단쇄가변 분절(scFv), 재조합단백질, 바이러스치료제
Description
본 발명은 돼지 유행성설사병 바이러스를 중화하는 특이 단클론 항체 단쇄가변분절 유전자 및 이를 발현한 재조합단백질에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 돼지 유행성설사병 바이러스를 특이적으로 중화하는 단클론 항체의 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위를 코딩하는 염기서열 및 아미노산 서열과 이를 단쇄로 연결한 단쇄가변분절 항체를 구성하는 유전자, 이를 발현한 재조합단백질 및 이를 이용한 돼지 유행성 설사병에 대한 치료제에 관한 것이다.
돼지 유행성설사병(porcine endemic diarrhea; PED)은 어린돼지에 설사와 폐사를 일으켜 양돈 농가에 많은 경제적 피해를 주는 주요 질병으로, 원인체인 돼지 유행성설사병 바이러스(porcine endemic diarrhea virus; PEDV)에 의한 것이다.
단쇄 가변 분절(single chain variable fragment; scFv)을 기술적으로 작성 하는 방법에 대한 연구로는 Ward 등(1989)이 마우스 유래 항체의 대장균 발현 단쇄 가변(single variable) 도메인이 원래의 IgG 항체와 동일한 특이도 및 항원결합능을 가지고 있음을 보고한 이래 Holliger와 Hudson(2005, Review)이 보고한 바 scFv를 포함하여 다양한 형태의 항체분자를 활용한 바이오치료제 등 다양한 활용과 산업화 현황 및 전망을 보고한 바 있다. 수의학 관련분야에서도 병원체에 중화능이 있는 scFv를 이용한 예방 또는 치료제에 효과를 입증하는 연구는 Gould 등(2005)의 웨스트나일 바이러스(West Nile virus)에서의 치료효과 연구 등 바이러스 분야뿐만 아니라, Almquist 등(2006)의 파상풍균의 독소에 대한 중화능 연구 등 세균 등에서도 최근 까지 활발히 보고되고 있다.
특히 본 발명의 중화 대상 원인체인 PEDV와 함께 코로나바이러스(coronavirus)에 속하면서 돼지에서 설사 등을 일으키는 전염성위장염 바이러스(transmissible gastroenteritis 바이러스; 이하 "TGEV"라 한다)대하여 Veiga 등(2003)이 중화능이 있는 단클론항체의 scFv를 치료제로 활용하는 연구결과를 보고한 바 있다.
PED에 걸린 돼지는 어린 일령일수록 증상이 심해, 1주령미만 젖먹이 새끼돼지는 구토증상 및 심한 수양성 설사 증상과 함께 대부분 폐사하며, 젓을 뗀 어린돼지는 수양성 설사 4∼6일 지속 후 회복되지만 체중감소가 심하며, 비육돈·성돈 에서도 설사증상을 나타낸다.
PED 역시 대부분의 바이러스 질병들처럼 백신을 통한 예방에만 의존하고 있으며 특히 PED 발생으로 인해 직접적인 피해를 보는 대상이 매우어린 일령의 돼지 새끼로 백신접종으로 어린새끼에 대한 능동면역을 유도할 수 있는 시간적 여유가 없어 대부분 어미돼지에 백신을 접종하고 임신중 모체이행항체로서 PED를 예방하는 수동면역에 의존하고 있다. 백신을 하지 않았거나 어미돼지가 면역형성이 불완전하여 어린새끼돼지에게 모체이행항체를 충분히 전달해 주지 못한 경우 어린돼지는 쉽게 PED에 걸리게 되고 설사 및 폐사 등 심한 피해를 주게 되나 발생 후 조치할 수 있는 방법이 현재까지는 없는 실정이다.
본 발명의 목적은 서열 1의 염기서열로 이루어진 돼지 유행성설사병 바이러스(PEDV)를 특이적으로 중화하는 단쇄 가변 분절(single chain variable fragment antibody)을 구성하는 유전자를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 돼지 유행성설사병 바이러스에 대한 중쇄 가변 부위 및 경쇄 가변 부위를 포함하는 단클론 항체를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 유전자를 포함하는 발현벡터를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환 된 대장균에서 발현한 것을 특징으로 하는 단백질을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 단백질을 함유하는 돼지유행성설사병(PED) 치료제를 제공하는데 있다.
상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 서열 1의 염기서열로 이루어진 돼지 유행성설사병 바이러스(PEDV)를 특이적으로 중화하는 단쇄가변분절 항체(single chain variable fragment antibody)를 구성하는 유전자를 제공한다.
본 발명에서, 상기 유전자는 서열 1의 25~330 bp의 염기서열로 이루어진 중쇄 가변(VH) 부위 및 서열 1의 436~759 bp의 염기서열로 이루어진 경쇄 가변(VL) 부위를 포함한다.
본 발명은 서열 1의 25~330 bp의 염기서열로 이루어진 중쇄 가변(VH) 부위 및 서열 1의 436~759 bp의 염기서열로 이루어진 경쇄 가변(VL) 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 단클론 항체를 제공한다.
본 발명은 서열 1의 유전자를 포함하는 도 5의 유전자 지도와 같은 특징을 갖는 발현벡터를 제공한다.
본 발명은 상기 발현 벡터로 형질전환 된 대장균에서 발현한 것을 특징으로 하는 재조합 단백질을 제공한다.
본 발명은 상기 재조합 단백질을 함유하는 돼지유행성설사병(PED) 치료제를 제공한다.
본 발명에 의한 돼지 유행성설사병 바이러스(PEDV)를 특이적으로 중화하는 단쇄 가변 분절(single chain variable fragment antibody)을 구성하는 유전자 및 이를 발현한 재조합 단백질은 PED가 발생한 농장에서 어린돼지에 직접 경구적으로 투여하여 PEDV를 직접 중화시킴으로서 PED에 의해 어린돼지의 피해를 줄일 수 있는 치료제가 될 수 있으므로 본 발병을 이용하여 제조한 단백질은 PED 돼지질병의 예방 및 치료에 크게 기여할 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명의 내용을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 어린돼지에 설사와 폐사를 일으켜 양돈 농가에 많은 경제적 피해를 주는 주요 질병인 돼지 유행성설사병(porcine endemic diarrhea; 이하 "PED"라 한다)의 원인체인 돼지 유행성설사병 바이러스(porcine endemic diarrhea virus; 이하 PEDV라 한다)를 중화할 수 있는 단쇄 가변 분절("single chain variable fragment"; 이하 scFv라 한다)을 대량으로 발현하여 치료제로 개발할 수 있는 기초물질을 확보하기 위한 것이다.
본 발명은 돼지 유행성설사병 바이러스를 특이적으로 중화하는 단클론 항체의 중쇄 가변부위(VH) 및 경쇄 가변부위(VL)를 코딩하는 염기서열 및 아미노산 서열과 이를 단쇄로 연결한 scFv 유전자(서열 1), 상기 염기서열을 가진 scFv 유전자를 삽입하여 제작한 발현벡터 및 PED에 대한 치료제로 사용할 수 있는 이를 발현한 재조합 단백질로 구성된다.
본 발명은 마우스 유래인 하이브리도마로부터 단클론 항체의 scFv를 클로닝 하는 기술을 확립하고 이를 이용하여 돼지유행성설사병 바이러스(PEDV)에 중화능이 있는 2C10 항체의 scFv 유전자를 클로닝하고 염기서열 분석하여 2C10항체의 VH 및 VL 도메인의 아미노산의 구성을 파악하였다.
본 발명에서, 상기 scFv 유전자는 서열 1의 25~330 bp의 염기서열로 이루어진 중쇄 가변(VH) 부위 및 서열 1의 436~759 bp의 염기서열로 이루어진 경쇄 가변(VL) 부위를 포함하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 서열 1의 25~330 bp의 염기서열로 이루어진 중쇄 가변(VH) 부위 및 서열 1의 436~759 bp의 염기서열로 이루어진 경쇄 가변(VL) 부위를 포함하는 단클론 항체를 제조할 수 있다.
본 발명은 서열 1의 유전자를 포함하는 발현벡터를 제조할 수 있다.
본 발명은 상기 발현 벡터로 형질전환 된 대장균을 제조할 수 있으며, 상기 형질발현 대장균으로부터 PEDV에 대하여 중화능이 우수한 scFv의 유전자를 발현한 재조합단백질을 생산할 수 있다.
본 발명에 의하면 상기 2C10 항체의 scFv 유전자를 발현한 재조합단백질이 PEDV에 대한 중화능을 가지고 있음을 증명함으로서 본 발병의 2C10 scFv 유전자 및 이를 발현한 단백질의 양돈현장에서 문제되는 돼지유행성설사병(PED)에 대한 직접적 치료제로의 가능성을 확인할 수 있다.
즉, PEDV에 대한 중화능이 확인된 본 발명의 단백질을 경제적으로 대량생산하는 방법을 통해 PED에 대한 치료제를 생산함으로서 양돈현장에서 기존 백신의 효능만으로는 질병관리가 어려운 PED를 통제할 수 있는 효과적인 방역 수단으로서의 치료제를 개발할 수 있다. 본 발명에서 사용한 기술인 단클론 항체의 scFv를 클로닝 및 발현하는 기술은 수의분야의 다른 질병에서도 적용이 가능한 활용도 높은 기술로 판단된다.
대부분의 바이러스 질병들처럼 PED 역시 백신을 통한 예방에만 의존하고 있어 모체이행항체를 충분히 전달해 주지 못한 경우 어린돼지는 쉽게 PED에 걸리게 되어 설사 및 폐사 등으로 심한 피해를 보게 된다.
본 발명의 PEDV에 대하여 중화능이 우수한 scFv의 유전자를 발현한 재조합단백질은 PED가 발생한 농장에서 어린돼지에 직접 경구적으로 투여하여 PEDV를 중화시킴으로서 PED에 의한 어린돼지의 피해를 줄일 수 있는 치료제로 적용될 수 있다. 따라서 본 발병에 의한 제조한 단백질은 PED 돼지질병의 예방 및 치료에 크게 기여할 수 있을 것으로 기대된다.
이하 각종 실시 예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 하기 실시 예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 2C10 하이브리도마(hybridoma) 세포로부터 total RNA의 분리
본 발명은 PEDV에 대하여 중화능이 우수한 2C10 단클론 항체를 선발하고, 하이브리도마(hybridoma) 세포로부터 마우스 단클론 항체의 중쇄 가변부위(variable heavy chain; VH) 및 경쇄 가변부위(variable light chain; VL)를 링커(linker)로 써 연결한 단쇄가변 분절 유전자를 클로닝하는 기술을 이용하여 PEDV에 대하여 중화능이 있는 2C10 하이브리도마로부터 scFv 유전자를 클로닝 하였다.
본 발명은 PEDV를 항원으로 면역한 Balb/c 마우스의 비장세포와 골수암세포(myeloma)를 융합하여 작성한 단클론 항체 중 PEDV에 중화능을 나타낸 2C10 항체의 VH 및 VL 유전자를 클로닝하기 위해 도 1과 같이 RT-PCR 방법을 이용하였으며 이를 위해 2C10 단클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포로부터 total RNA를 분리하여 실시예 2와 같이 cDNA를 제작하였다. Total RNA의 추출은 RNeasy mini kit(Qiagen)을 이용하여 제조사의 방법에 따라 추출하였고 추출한 total RNA는 -70℃에 보관, 사용하였다.
[실시예 2] total RNA로부터 2C10 VH 및 VL 유전자의 증폭, 클로닝
Klebber 등(1997)과 Burmester와 Pluckthun (2001)이 보고한 논문 및 Kontermann과 Dubel의 저서(antibody Engineering[Springer]; ISBN 3-540-41354-5)의 2장을 참조하여 마우스의 VH 및 VL 유전자를 증폭하기 위한 프라이머를 설계하였다. VH 센스 프라이머는 VH 유전자의 일차적 증폭을 위해 "VH1BACK" 프라이머를 설계하였으며 링커 연결 후 발현벡터로의 삽입을 위한 제한효소 싸이트인 SfiI을 5' 말단에 연장시키고 개시코돈을 삽입시킨 "VH1sfiI" 프라이머를 설계하였다. VH 안티센스 프라이머는 cDNA 합성 및 VH 유전자 일차적 증폭을 위해 "VH2FOR" 프라이머를 설계하고 각 프라이머들은 올리고핵산을 주문합성(Bioneer, Korea)하여 사용하였다.
VL 센스 프라이머는 VL 유전자의 일차적 증폭을 위해 "VL1BACK" 프라이머를 설계하였으며 VL 안티센스 프라이머는 cDNA 합성 및 VH 유전자 일차적 증폭을 위해 VL 유전자 3' 말단의 다양성에 때문에 4종의 프라이머 즉, VL2FOR1, VL2FOR2, VL2FOR3 및 VL2FOR4를 설계하였다. 또한, 링커 연결 후 발현벡터로의 삽입을 위한 제한효소 싸이트인 NotI을 각각의 VL 안티센스 프라이머의 5' 말단에 연장시키고 stop 코돈을 삽입시킨 4종의 VL2NOT1, VL2NOT2, VL2NOT3 및 VL2NOT4 프라이머를 설계하였고 올리고핵산을 주문합성(Bioneer, Korea)하여 사용하였다.
<표 1> 프라이머 설계
| 프라이머 | 염기서열 |
| VH1BACK | 5'-AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3' |
| VH1sfiI | 5'-GCAACTGCGGCCCAGCCGGCC-ATG-GCCCAGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3' |
| VH2FOR | 5'-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCC-3' |
| VL1BACK | 5'-GACATTGAGCTCACCCAGTCTCCA-3' |
| VL2FOR1 | 5'-CCGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCC-3' |
| VL2FOR2 | 5'-CCGTTTTATTTCCAGCTTGGTCCC-3' |
| VL2FOR3 | 5'-CCGTTTTATTTCCAACTTTGTCCC-3' |
| VL2FOR4 | 5'-CCGTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCC-3' |
| VL2NOT1 | 5'-GAG-TCATTCTGCGGCCGCCCGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCC-3' |
| VL2NOT2 | 5'-GAG-TCATTCTGCGGCCGCCCGTTTTATTTCCAGCTTGGTCCC -3' |
| VL2NOT3 | 5'-GAG TCATTCTGCGGCCGCCCGTTTTATTTCCAACTTTGTCCC-'3 |
| VL2NOT4 | 5'-GAGTCATTCTGCGGCCGCCCGTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCC -3' |
VH 유전자를 클로닝하기위해 우선 상기 실시예 1에서 추출한 total RNA 2㎍과 2 pmole의 VH 안티센스 프라이머 "VH2FOR"를 사용하였고, VL 유전자를 클로닝하기위해서는 실시예 1에서 추출한 total RNA 2㎍과 VL 안티센스 프라이머 "VL2FOR1", "VL2FOR2", "VL2FOR3" 및 "VL2FOR4" 4종을 각각 0.5 pmole 씩 최종농도가 2 pmole 첨가하여 SuperScriptTM II 역전사효소(Invitrogen)를 사용하여 제조사 의 방법에 따라 42℃에서 50분간 반응하여 VH 및 VL 유전자의 first-strand cDNA를 각각 작성하였다.
VH 유전자 증폭을 위해서는 작성된 VH 유전자의 cDNA 5㎕, 10 pmole/㎕의 "VH1BACK" 및 "VH2FOR" 프라이머 각 1㎕를 사용하였고, VL 유전자 증폭을 위해서는 작성된 VH 유전자의 cDNA 5㎕, 10 pmole/㎕의 "VL1BACK" 1㎕ 및 각 10 pmole/㎕의 "VH2FOR1", "VH2FOR2", "VH2FOR3" 및 "VH2FOR4" 프라이머를 동량으로 혼합한 1㎕를 사용하여 Expand Long Template PCR system (Roche, Germany)으로 제조사의 방법에 따라 PCR을 실시하였다. PCR 반응조건은 94℃ 2분 반응 후 94℃ 10초, 54℃ 30초, 68℃ 4분 조건에서 10 cycle 실시 후 94℃ 15초, 54℃ 30초, 68℃ 4분을 시작으로 매 사이클(cycle) 마다 20초를 증가시키는 조건에서 20 cycle을 실시한 후 68℃에서 8분 연장(elongation) 반응을 실시하였다.
PCR 실시 후 증폭된 VH 유전자는 도 3에서 A의 레인 1에서와 같이 약 363 bp에 해당하는 밴드(band)를 확인할 수 있었으며 VL 유전자는 도 3에서 A의 레인 3에서와 같이 약 325 bp에 해당하는 밴드를 확인할 수 있었다. 이들 VH 및 VL 유전자 각각을 pGemTeasy(Promega)에 TA 클로닝하여 "pG2C10VH" 및 "pG2C10VH" 플라스미드를 작성하고 염기서열 분석하여 확인하였다.
[실시예 3] 2C10 VH 및 VL 유전자로부터 scFv 작성 및 염기서열 분석 확인
실시예 2에서 증폭된 VH 및 VL유전자를 단쇄형으로 연결하기위하여 도 1과 같이 링커의 5'말단의 염기서열이 VH 유전자의 '3말단과 링커의 '3말단이 VL 유전 자의 5'말단 염기서열이 중첩되도록 각각 연장시킨 (Gly4Ser)3 형태의 링커를 설계하였고 이 단일쇄(single stranded)의 올리고뉴클레오타이드 링커 유전자를 이중쇄(double stranded)로 만들기 위한 센스 "LINKVH" 및 안티센스 "LINKVL" 프라이머를 설계하였고 올리고핵산을 주문합성(Bioneer, Korea)하여 사용하였다. 합성한 단일쇄의 링커 유전자를 "LINKVH" 및 "LINKVL" 프라이머를 사용하여 PCR 증폭하였고 도 3에서 B의 레인 2와 같이 약 94 bp의 밴드를 확인할 수 있었다.
(Gly4Ser)3 형태의 링커 유전자:
5'-GACCACGGTCACCGTCTCCTCA-GGTGGAGGCGGTTCA-GGCGGAGGTGGCTCT-GGCGGTGGCGGATCG-GACATTGAGCTCACCCAGTCTC-3'
센스 LINKVH: 5'-GGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA-3'
안티센스 LINKVL: '5-TGGAGACTGGGTGAGCTCAATGTC-3'
확인된 이중쇄의 링커 유전자와 실시예 2에서 증폭된 VH 및 VL 유전자를 도 1과 같이 Linker PCR하여 "VH-linker-VL" 순으로 scFv 유전자를 증폭하고 이를 주형(template)으로 실시예 2에서 작성한 SfiI을 5' 말단에 연장시키고 개시코돈을 삽입시킨 센스 프라이머 "VH1sfiI" 및 NotI을 5' 말단에 연장시키고 stop 코돈을 삽입시킨 4종의 안티센스 프라이머 4종 "VH2NOT1", "VH2NOT2", "VH2NOT3" 및 "VH2NOT4"를 사용하여 5' 말단에 SfiI과 3' 말단에 NotI 싸이트가 연장된 2C10 scFV 유전자를 증폭하였고 그 결과는 도 3에서 C의 레인 2와 같이 약 760 bp의 밴드를 확인 할 수 있었다. 증폭된 유전자는 pGemTeasy(Promega) 플라스미드에 TA 클로닝하여 "pG2C10scFvF" 플라스미드를 작성하고 염기서열 분석하여 확인하였으며 2C10 scFv의 염기서열 및 아미노산 서열은 서열 1과 서열 2에 나타내었다. VH 및 VL 유전자의 프레임 워크 부위(framwork regions; "FRs")와 상보적 결정부위(complementarity determining regions; 이하 "CDRs"라 한다), 그리고 두 유전자를 연결하는 링커 등의 구성은 도 4의 염기서열에 표시한 바와 같고, 이를 클로닝한 "pG2C10scFvF" 플라스미드의 유전자 지도를 작성하는 모식도는 도 1과 같다.
[실시예 4] 2C10 scFv 발현 대장균 벡터 작성 및 발현
실시예 3에서 "pG2C10scFvF"에 클로닝 및 염기서열 분석 확인된 2C10 scFv 유전자를 대장균 발현 벡터인 "pRSET"(Invtrogen)에 삽입시키기 위하여 도 2와 같이 개시코돈의 5' 말단 쪽에 BamHI 싸이트를 연장시킨 2C10FB (5'-CGCGGATCC-ATGGCCCAGGTCCAACTGCAG-3') 프라이머 및 XhoI 싸이트를 5' 말단에 연장시키고 스탑(stop) 코돈을 삽입시킨 2C10RX ('5-CCGCTCGAG-TCATTCTGCGGCCGCCCGTTT-3') 프라이머를 사용하여 "pG2C10scFvF"를 템플레이트로 이용하여 PCR 증폭하고 BamHI 및 XhoI으로 처리한 760 bp의 유전자 분절을 "pRSET" (Invtrogen) 플라스미드를 BamHI 및 XhoI으로 처리한 3.8 kb의 유전자 분절과 라이게이션(ligation)하여 "pRSET2C10scFv" 플라스미드를 작성하였으며 플라스미드의 유전자 지도는 도 5에 나타내었다.
2C10 scFv 유전자의 대장균에서의 발현은 "pRSET2C10scFv" 플라스미드를 E.coli BL21(DE3)pLysS 균주에 형질전환(tranformation)하여 제조사의 pRSET A, B, and C 킷트 (Invitrogen) 매뉴얼에 따라 발현하였다.
[실시예 5] 대장균 발현 2C10 scFv 단백질의 정제
실시예 4에서 발현된 2C10scFv 제조사의 pRSET A, B, and C 킷트(Invitrogen) 매뉴얼에 따라 발현하였다. 대장균에서 발현 단백질의 정제는 원형(native) 또는 변성(denaturing) 조건 모두에서 QIAexpress (Qiagen) 킷트를 사용하여 2C10의 scFv와 융합 형태로 발현된 단백질의 연속된 6개의 히스티딘(Histidine; 이하 "6x His"라 한다)과 니켈-나이트릴로트리아세틱 엑시드(nickel-nitrilotriacetic acid; 이하 "Ni-NTA"라 한다)간의 결합력을 이용하여 정제하였으며 제조사의 방법에 따라 실시하였다. 50㎍/㎖ 농도의 암피실린(ampicillin) 및 35㎍/㎖ 클로람페니콜(chloramphenicol)이 첨가된 LB배지에서 24시간 배양된 pRSET2C10scFv 플라스미드로 형질전환된 BL21(DE3)pLysS 10㎖을 100㎖의 신선한 LB배지에 37℃에서 2시간 진탕배양하고 1mM 되게 이소프로필-베타-디-티오갈락토시드(isopropyl-β-D-thiogalactoside; 이하 "IPTG"라 한다) 첨가하여 유도(induction)시킨 후 4시간 추가 진탕배양한 후, 각 50㎖을 원형(native) 및 변성(denaturing) 조건으로 정제하였다.
원형(native) 조건에서의 정제는 50㎖을 원침한 세균체를 8㎖의 용해 액(lysis buffer, 50mM NaH2PO4; 300mM NaCl; 10mM imidazole, pH 8.0)에 풀고 10㎎ 라이소자임(lysozyme)을 넣어 얼음에서 30분 처리 후, 초음파 파쇄(sonication) 후 원심분리 하여 상층액을 세척과정을 거친 Ni-NTA 수지(resin)에 실온에서 10분 반응시켜 결합시켰다. 반응 후 8㎖의 세척액(10mM imidazole in PBS)으로 총 4회 세척 후 8㎖의 세척분리(elution) 용액(50mM NaH2PO4; 300mM NaCl; 250mM imidazole, pH 8.0)으로 세척 분리하여 사용하였다.
변성(denatue) 조건에서의 정제는 50㎖을 원침한 세균체를 8㎖의 6M의 구아니딘 하이드로클로라이드(guanidine hydrochloride; 이하 "GuHCl"이라한다) 조건의 라이시스(lysis) 용액(100mM NaH2PO4; 10mM Tris; 6M GuHCl; pH 8)에 풀고 실온에서 5분 처리 후 초음파 파쇄(sonication)하고 원심하여 상층액을 세척과정을 거친 Ni-NTA 수지(resin)에 실온에서 10분 반응시켜 결합시켰다. 반응 후 4㎖의 pH 6의 변성(denaturing) 세척액(100mM NaH2PO4; 10mM tris·Cl; 8M Urea, pH 6.0)으로 2회 및 pH 5.3의 변성 세척액으로 2회 세척 후 0.5㎖의 pH 5.9의 세척분리 액(elution buffer, 100mM NaH2PO4; 10mM Tris·Cl; 8M Urea)으로 4회 및 pH 4.5의 세척분리 액으로 4회 세척 분리하여 사용하였다.
[실시예 6] SDS-PAGE를 이용한 대장균 발현 2C10 scFv 정제 단백질의 분자량 확인
실시예 5에서 대장균 발현 후 정제한 2C10 scFv 단백질 100 ㎕에 2X SDS-PAGE을 샘플용액 (Invitrogen)을 100 ㎕ 첨가하고 5분간 끓인 후 10 ㎕씩을 10％의 SDS-PAGE 겔에서 단백질 사이즈 마커 (Bench MarkTM prestained protein ladder)와 함께 190 볼트(volt)에서 약 4시간 전기영동을 실시하고 0.1％ 코마시 블루 (Comassie blue R-250) 염색하였다. 염색결과 도 6과 같이 정제된 2C10 scFv 단백질의 예상 분자량에 해당하는 약 30 kDa에 해당하는 밴드를 확인할 수 있었다.
[실시예 7] 대장균 발현 2C10 scFv 정제 단백질의 PEDV 중화능 분석
PEDV SM98P주: PEDV 98년 국내 야외분리주인 SM98주(참고문헌; 수의과학기술개발사업 1999년 연구보고서 p273-81)를 돼지고환(swine testicle; ST) 세포주에서 61대 계대배양하여 조직배양에 순화된 세포주를 SM98P주(참고문헌; 수의과학기술개발사업 2004년 연구보고서 p681-703)라 명명하였다.
실시예 5에서 정제된 대장균 발현 2C10 scFv 및 2C10 하이브리도마를 마우스 복강 내에 접종하여 수확한 복수액(ascite)과 함께 PEDV에 대한 중화능을 측정하였다. 먼저, 우태아혈청이 첨가되지 않은 일반배양배지 즉, 비필수아미노산(Gibco) 및 항균-항진균제(Gibco)가 첨가된 α-MEM(Gibco) 조직배양 배지를 각 웰에 50㎕씩 첨가하고, 0.39㎎/㎖의 정제된 네이티브(native) 형태의 재조합 scFv 단백질과 0.89㎎/㎖의 정제된 변성(denature) 형태의 재조합 scFv 단백질, 그리고 대조군으로 2C10 단클론 항체 복수액 및 이 복수액을 프로테인 G(protein G)를 이 용하여 정제한 0.4㎎/㎖의 2C10 단클론 항체 등 4종의 단백질 각각을 각 2개의 첫 번째 웰에 50㎕씩 첨가하고 두 배 단계로 희석하였다.
PEDV는 국내분리주로 조직배양에 순화(adaptation)된 200 TCID50(Tissue culture infective dose 50 ; 50％ 조직배양 감염량)/㎖의 SM98P주를 마이크로 플레이트의 각 웰에 50㎕ 첨가하고 37℃에서 1시간 반응하였다. 이때 바이러스 희석액이 각 웰에 100 TCID50/㎖가 되도록 정확히 첨가되었는지 확인하기 위하여 200 TCID50/㎖ 바이러스를 10배, 100배, 및 1,000배로 희석하여 최종적으로 100, 10, 1 및 0.1 TCID50/㎖이 되도록 첨가한 역상 역가측정(back titration)을 두었다. 1시간 반응 후 10％의 우태아 혈청이 포함된 배지에 Vero 세포를 2×105/㎖ 되게 희석하여 각 웰에 100㎕ 씩 첨가하고 37℃, 5％ CO2 조건하에서 72시간 배양하여 결과를 도립현미경하에서 세포변성효과(Cytopathic effect: CPE) 여부를 판독하여 중화능의 정도를 확인하였다. 그 결과 원형(native) 형태의 정제된 재조합 scFv 단백질은 4배, 변성(denature) 형태로 정제된 재조합 scFv 단백질은 6배, 그리고 대조군인 2C10 단클론 항체 복수액은 128배 및 이 복수액을 프로테인(protein) G를 이용하여 정제한 2C10 단클론 항체는 64배의 중화능을 확인할 수 있었고, 그 결과를 요약하여 중화 역가는 log2로 환산하여 도 6과 같이 그래프로 나타내었다.
대장균 발현 2C10 scFv 단백질의 PEDV에 대한 중화능을 확인하는 또 다른 방법으로 2×104 PFU/㎖ 역가의 PEDV SM98P주 0.5 ㎖를 실시 예 5에서 정제된 native 형태 2C10 scFv 단백질(0.39㎎/㎖)과 동량으로 혼합 후 37℃에서 1시간 반응하고 12웰의 플레이트에 각각 10배 단계로 희석하여 접종하였고 대조군은 2C10 scFv 대신 동량의 PBS와 동일한 방법으로 반응하고 희석하여 접종하였다. 접종 72시간 후 세포변성이 관찰될 때 -20℃에서 보관한 아세톤 및 메탄올 1:1 혼합액인 고정액을 이용하여 실온에서 5분간 고정하고 건조시켰다.
이후 발색은 VECTASTAIN ABC (VECTOR, PK-4002, CA) 킷트를 사용하여 제조사의 방법에 따라 고정된 세포단층에서 바이러스에 의한 플라그(plaque)를 염색하였다. 고정된 세포를 PBS용액으로 적신 후 2％ 정상 마혈청(normal horse serum)으로 37℃에서 30분 비특이 반응을 줄이기 위한 블로킹(blocking)을 실시하고 항 PEDV(anti-PEDV) 단클론항체를 1차 항체(primary antibody)로 이용하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 1차 반응 항체액을 제거하고 PBS 용액으로 5분간 세척 후 바이오티닐래이티드(Biotinylated) 항 마우스 항체를 2차 항체(secondary antibody)로 30분간 반응 후 세척하고 바이오티닐래이티드(Biotinylated) 호오스라디쉬 퍼록시다아제(horseradish Peroxidase)와 아비딘(avidine)을 반응액 10㎖에 각각 50㎕씩 동량으로 미리 반응시킨 용액을 첨가 후 30분간 반응하고 세척하였다. 마지막단계로 최종적으로 다이아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드 (diaminobenzidine tetrahydrochioride; 이하 "DAB"라 한다)를 기질(substrate)로 니켈(nickel) 이온을 첨가하여 암회색(gray/black)으로 발색하였다.
발색결과 도 8과 같이 세포변성 효과를 나타낸 각각의 최종 희석 웰에서 볼 때 10배 이상의 희석 단계 차이를 나타내 정제된 0.2㎎/0.5㎖의 2C10 scFv 단백질 은 동량으로 혼합한 바이러스 즉 104 PFU/㎖를 90％ 이상 중화함을 알 수 있었다.
도 1은 PEDV에 중화능이 있는 2C10 항체의 VH 및 VL 유전자의 개별 증폭 및 2C10 scFv 유전자를 클로닝하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 클로닝된 2C10 scFv 유전자를 발현벡터에 삽입, 발현 및 정제 과정을 나타낸 모식도이다.
도 3은 2C10 항체의 VH 및 VL 유전자와 링커 유전자를 각각 PCR 증폭하고 전기영동한 사진이다.
(A, 2C10항체의 VH 및 VL 유전자를 PCR 증폭하여 확인한 사진(레인 1: PCR 증폭한 2C10 항체의 VH 유전자; 레인 2: 사이즈 마커; 레인 3: PCR 증폭한 2C10 항체의 VL 유전자); B, 2C10항체의 링커 유전자를 PCR 증폭하여 확인한 사진(레인 1: 사이즈 마커; 레인 2: PCR 증폭한 링커 유전자); C, 2C10항체의 scFv 유전자를 PCR 증폭하여 확인한 사진(레인 1: 사이즈 마커; 레인 2: PCR 증폭한 2C10 scFv 유전자)).
도 4는 2C10 scFv 단백질 발현을 위하여 5' 말단에 SfiI 싸이트, 및 개시코돈(ATG)과 3' 말단에 NotI 싸이트 및 stop 코돈(TGA)을 삽입하여 클로닝된 2C10 항체의 scFV 유전자의 구성부위를 표시한 염기 및 아미노산 서열이다. ("FR"은 "framework region"을 나타내며 "CDR"은 "complementarity determining region"을 나타낸다.)
도 5는 클로닝한 2C10 scFv 유전자를 대장균에서 발현하기 위한 "pRSET2C10scFV" 플라스미드의 개열지도이다.
도 6은 대장균에서 발현한 2C10 scFv 단백질을 정제한 후 SDS-PAGE한 사진 이다(레인 1: 염색(pre-stained) 단백질 사이즈 마커; 레인 2 : 정제한 2C10 scFv 재조합단백질).
도 7은 2C10 scFv 및 2C10 복수 항체액의 PEDV에 대한 중화능을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 2C10 scFv의 PEDV에 대한 중화능에 의해 PEDV 플라그가 감소되었음을 확인한 조직배양 세포의 플라그를 염색한 사진이다(No scFv: 2C10 scFv 단백질 비처리군; 2C10 scFv: 2C10 scFv 단백질 처리군).
<110> National Veterinary Research Quarantine Service
<120> scFv gene and its recombinant protein of monoclonal antibody 2C10
neutralizing porcine epidemic diarrhea virus
<160> 2
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 777
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> single chain variable fragment antibody
<400> 1
gcaactgcgg cccagccggc catggcccag gtccaactgc agcagtctgg agctgagctg 60
gtaaggcctg ggacttcagt gaaggtgtcc tgcaaggctt ctggatacgc cttcacaaat 120
tacttgatag agtggataaa gcagaggcct ggacaggtcc ttgagtggat tggagtgatt 180
aatcctggga gtggtggtac taactacaat gagaaattca agggcaaggc aacactgact 240
gcagacaaat cctccagcac tgcctacatg cagctcagca gcctgacatc tgatgactct 300
gcggtctatt tctgtgcaag aaggggttac tacgtggggg gttatgctat ggactactgg 360
ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggctct 420
ggcggtggcg gatcagacat tgagctcacc cagtctccag cctccctatc tgcatctgtg 480
ggagaaactg tcaccatcac atgtcgagca agtgagaata tttacagtta tttagcatgg 540
tatcagcaga aacagggaaa atctcctcag ctcctggtct ataatggaaa aacctttccg 600
gaaggtgtgc cgtcaaggtt cactggcagt ggatcaggca cacagttttc tctgaagatc 660
aacagcctgc agcctgaaga ttttgggagt tattactgtc aacatcatta tggtagtccg 720
ctcacgttcg gtgctgggac caagctggaa ataaaacggg cggccgcaga atgactc 777
<210> 2
<211> 250
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> single chain variable fragment antibody
<400> 2
Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro
1 5 10 15
Gly Thr Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr
20 25 30
Asn Tyr Leu Ile Glu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Val Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu
50 55 60
Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr
85 90 95
Phe Cys Ala Arg Arg Gly Tyr Tyr Val Gly Gly Tyr Ala Met Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln
130 135 140
Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr
145 150 155 160
Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln
165 170 175
Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val Tyr Asn Gly Lys Thr Phe
180 185 190
Pro Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln
195 200 205
Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Ser Tyr
210 215 220
Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Ser Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr
225 230 235 240
Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala Glu
245 250
Claims (6)
- 서열 1의 염기서열로 이루어진 돼지 유행성설사병 바이러스(PEDV)를 특이적으로 중화하는 단쇄 가변 분절(single chain variable fragment antibody)을 구성하는 유전자.
- 제1항에 있어서, 상기 유전자는 서열 1의 25~330 bp의 염기서열로 이루어진 중쇄 가변(VH) 부위 및 서열 1의 436~759 bp의 염기서열로 이루어진 경쇄 가변(VL) 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 단쇄 가변 분절을 구성하는 유전자.
- 서열 1의 25~330 bp의 염기서열로 이루어진 중쇄 가변(VH) 부위 및 서열 1의 436~759 bp의 염기서열로 이루어진 경쇄 가변(VL) 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 단클론 항체.
- 서열 1의 유전자를 포함하는 도 5의 유전자 지도와 같은 특징을 갖는 발현벡터.
- 제4항의 발현 벡터로 형질전환 된 대장균에서 돼지 유행성설사병 바이러스에 대하여 중화능이 우수한 단쇄 가변 분절 유전자를 발현한 것을 특징으로 하는 재조합 단백질.
- 제5항의 재조합 단백질을 함유하는 돼지유행성설사병(PED) 치료제.
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|---|---|---|---|---|
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| KR20030086062A (ko) * | 2002-05-03 | 2003-11-07 | 장용석 | 돼지 유행성 설사병 바이러스의 에피토프 단백질을발현하는 형질전환체 및 그를 포함하는 경구투여용백신조성물 |
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