KR19990065235A

KR19990065235A - 돼지 유행성설사병 바이러스의 특이 중화항체 검출방법

Info

Publication number: KR19990065235A
Application number: KR1019980000447A
Authority: KR
Inventors: 박종현; 송재영; 안동준; 현방훈; 차상호; 안수환; 권준헌
Original assignee: 김강권; 대한민국(관리부서:농촌진흥청)
Priority date: 1998-01-10
Filing date: 1998-01-10
Publication date: 1999-08-05
Also published as: KR100267745B1

Abstract

본 발명은 돼지 유행성설사바이러스의 스파이크(spike) 단백질이 중화항체를 유발하므로 이 스파이크 유전자를 곤충 바이러스인 베큘로바이러스에 삽입하여 발현된 스파이크 단백질(한국종균협회 균주기탁번호 KFCC-11014)을 이용하여 돼지유행성설사병 바이러스의 특이 중화항체검출방법에 관한 발명이다. 유전자재조합 방법으로 대량 생산된 돼지 유행성 설사바이러스 spike 단백질을 이용하여 간접 효소면역학적 측정법(IS-ELISA)으로 돼지 유행성설사바이러스 중화항체를 검출하는 방법을 제공하는 발명이다.

본 발명의 방법으로 보다 신속하고 정확하게 다수의 혈청을 사용하여 동시에 돼지 유행성설사바이러스 중화항체를 검사할 수 있다.

Description

돼지 유행성설사병 바이러스의 특이 중화항체 검출방법

본 발명은 돼지 유행성설사병바이러스(porcine epidemic diarrhea vrius; 이하 PEDV라함)의 스파이크 유전자를 클로닝하여 곤충 바이러스인 베큘로바이러스에서 발현된 유전자재조합 spike 단백질(한국종균협회 균주기탁번호 KFCC-11014)을 이용하여 PEDV에 대한 중화항체를 신속하게 검사하는 방법이다.

PEDV는 코로나비리데(Coronaviridae)에 속하는 모든 년령의 돼지에서 급성장염을 유발하며, 특히 신생자돈에서는 폐사율이 높아 경제적손실이 크다. 이 병의 발생은 유럽과 아시아에서 주로 보고되어 왔으며 최근 국내에서 PEDV는 돼지 전염성위장염바이러스(transmissible gastroerteritis virus : TGEV)와 같이 야외농장에 널리 상재하여 그 피해가 더욱 심각한 것으로 알려져 있다.

PEDV의 다른 코로나바이러스(coronavirus)들과의 항원적인 관련성은 중화시험, 형광항체법과 면역전자현미경법으로 조사되었는데, 뉴클레오캡시드(nucleocapsid)와 멤브레인(membrane)을 포함해 약간의 교차 반응성이 다른 코로나바이러스와 웨스턴블랏팅(Western blotting)에 의해 보고 된 바 잇으나 스파이크에 관한 교차반응성은 알려져 있지 않다. 스파이크는 숙주세포의 수용체 당단백과 결합, 세포융합, 세포매개면역반응 및 중화항체를 유발하는 것으로 알려져 있다. PEDV는 TGEV가 배양되는 돼지 유래 세포에서 배양하기가 곤란하나 특이하게도 원숭이 신장(Vero) 세포에서 자랄 수 있음이 알려져 왔다. 또한 PEDV의 분자생물학적인 특징은 잘 알려져 있지 않으나, 최근 스파이크 및 뉴쿨레오캡시드, 멤브레인, 스몰멤브레인(small membrane) 그리고 ORF3의 염기서열이 분석되었다.

국내에서도 돼지 설사분변에서 바이러스를 분리하여 혈청학적인 조사, 감염상황 및 백신 개발 등을 실시한 바 있으나, 진단기술인 정립된 바 없고, 현재 효과적인 방역실시를 위해 백신접종 후 면역수준의 검사 및 감염실태 파악에 유용하게 사용될 수 있도록 항체진단법이 절실히 필요한 실정이다.

본 발명은 돼지 유행성설사병 바이러스의 스파이크 단백질이 중화항체를 유발하는 것이 알려져 있으므로 유전자재조합 방법으로 대량생산된 스파이크 단백질(KFCC-11014)을 이용하여 신속하고 정확하게 돼지 유행성설사병 바이러스 중화항체를 검사함으로써 돼지 설사증을 예방하고 조기에 근절하는데 이용할 수 있는 항체검사법으로 사용할 수 있도록 본 발명을 완성하였다.

즉 본 발명은 유전자재조합으로 생산된 돼지 유행성설사병 바이러스 스파이크 단백질을 이용하여 간접결합효소면역항체법(indirect sandwitch enzyme linked immuno sorbent assay : IS-ELISA)으로 돼지 유행성설사병 바이러스 중화항체를 검출하는 방법을 제공한다.

도 1은 중합효소연쇄반응법에 의해 증폭된 돼지 유행성설사병바이러스 스파이크(spike) 유전자를 전기영동한 사진이다.

도 2는 국내 설사분변에서의 추출한 돼지 유행성설사병 바이러스 스파이크 유전자의 염기서열도이다.

도 3은 돼지 유행성설사병 바이러스 스파이크 유전자가 클로닝된 베큘로바이러스 발현벡터 작성 모식도이다.

도 4는 유전자재조합 베큘로바이러스에 의하여 발현된 돼지 유행성설사증바이러스 스파이크 단백질을 항스파이크(anti-spike) 단클론항체를 이용하여 면역점적법으로 검출한 사진다.

도 5는 유전자재조합 베큘로바이러스에 의하여 발현된 돼지 유행성설사증바이러스 스파이크 단백질을 항스파이크 단클론항체를 이용하여 형광항체법으로 검출한 사진이다.

도 6은 유전자재조합 베큘로바이러스에 의하여 발현된 돼지 유행성설사증 바이러스 스파이크 단백질을 항스파이크 단클론항체를 이용하여 세포면역화학염색법으로 검출한 사진이다.

도 7은 웨스턴블랏팅(Western blotting)을 이용하여 재조합 스파이크 단백질의 발현을 확인한 사진이다.

도 8은 배양일수 별 재조합단백질의 발현량을 조사한 그림이다.

도 9는 간접결합효소면역항체법(indirect sandwitch enzyme linked immunosorbent assay : IS-ELISA)를 이용한 돼지 유행성설사병의 중화항체검출법 모식도이다.

도 10은 중화항체검출을 위한 단크론항체의 농도를 결정한 그림이다.

도 11은 중화항체검출을 위한 최적 항원농도를 결정한 그림이다.

도 12는 항체검출을 위한 최적 혈청희석농도를 결정한 그림이다.

도 13은 간접결합효소면역항체법(indirect sandwitch enzyme linked immunosorbent assay : IS-ELISA)법을 이용한 돼지 유행성설사병 바이러스에 대한 항체검출법과 기존 조직배양을 이용한 바이러스중화시험법(virus neutralization test)과의 일치율을 조사한 표이다.

본 발명은 돼지 유행성설사병 바이러스 및 세포의 분리, 바이러스 FNA추출 및 cDNA작성

중합효소연쇄반응에 의한 스파이크유전자의 증폭, PEDV 스파이크유전자 클로닝 및 염기서열 분석, PEDV 스파이크 유전자 발현백터 및 재조합 베큘로 바이러스 제조, 면역점적법에 의한 재조합단백질 확인, 간접형광항체 검사, 세포면역염색법에 의한 재조합단백질의 발현확인, 웨스턴블랏분석, 발현단백질의 생산조건 조사, 재조합단백질을 이용한 효소면역 측정, 최적항스파이크 단클론항체 흡착농도 결정, 재조합스파이크 단백질에 대한 항체검출을 위한 최적항원농도 결정의 단계로 구성되어 있다. 다음의 실시예에서 구체적으로 설명하고자 하며, 본 실시예가 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

[실시예 1]

(바이러스 및 세포의 분리)

돼지 유행성설사바이러스에 감염된 돼지의 설사분변 1g에 최소배지(alpha-minimal essential medium : α-MEM, Gibco) 10ml로 분변을 부유시킨 다음 3,000rpm에서 20분간 원심분리 후 상층액을 RNA 추출재료로서 사용하였다. 야생형베큘로바이러스(Wild type baculovirus)인 오토그라파캘리포니카 뉴클리아 폴리해드로시스 바이러스(Autographa calfornica nuclear polyhedrosis virus(AcNPV : Pharmigen) 및 재조합 바이러스는 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda (Sf9 : Invitrogen)) 세포주에서 증식, 배양하였으며, Sf9 세포주는 그레이스배지(Grace's media)에 10% 새끼송아지혈청(fetal calf serum)과 항생제안티마이크틴용액(antibiotic-antimycotic solution (Gibco, 100×))을 첨가한 배지로 28℃ 저온 항온기에서 배양하였다.

[실시예 2]

(바이러스 RNA추출 및 cDNA 작성)

RNA추출은 울트라스펙투 알렌에이분리기(Ultraspec^TMII RNA isolation system (BIOTECX Laboratories, Inc, USA))를 이용하였다. 멸균된 RNAse free-eppendorf tube에서 분변상층액 0.5ml을 넣고, Ultraspec^TMRNA reagent 1.0ml을 혼합하여 2분간 진탕하였다. 클로로포름(Chloroform) 200㎕를 첨가하고 4℃, 12,000rpm에서 원심분리하였다. 상층액 1.0ml을 수거하여 새 튜브로 옮겨, 이소프로판올(isopropanol) 500㎕와 RNA Tack^TMresin을 40㎕를 넣고 혼합한 후, 5분간 실온에서 정치하였다. 4℃, 12,000rpm에서 2분간 원심 분리한 후 70% 에틸알콜 1ml을 첨가하고 30초 동안 10,000rpm에서 원심분리로 2회 세척하였다. 침전된 RNA-Resin을 5분간 진공건조기에서 진공건조 한 후 멸균증류수 50㎕를 넣었다. 5분간 실온에서 반응한 후 2분간 원심분리하였으며 그 상층액을 수확하여 RNA를 추출하였다. cDNA작성은 Gibco/BRL사의 reverse transcriptase(Superscrip II)를 사용하여 90분간 42℃에서 반응하여 cDNA를 작성하였다.

[실시예 3]

(중합효소 연쇄반응에 의한 스파이크유전자의 증폭)

돼지 유행성설사병바이러스의 구조단백질인 스파이크의 유전자 염기서열은 CV777과 Br1/87주 등 보고된 바 있다. 이 결과를 기초로 하여 스파이크 유전자를 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction : PCR)으로 중폭하기 위하여 프라이머(primer)를 합성하였다. 스파이크의 1-1977bp를 증폭하기 위한 sense primer(SF1)는 5'-GCG GGA TCC ATG AGG TCT TTA ATT TAC TTC-3' anti-sense primer(SR3)는 5'-AAT ACC CTC ACC TTT AAA GCC ATA GAT AGT-3'이고 1813-3702bp를 증폭시키기 위한 sense pimer (SF3)는 5'-CGG AAT TCG CGT TCG GTA GTG GTG TTA AGT-3', anti-sense primer(SR6)는 5'-CTG GTC GCT AGT CAG ATT GAC ATA GGT GA-3'이였고, 3233-4370 bp를 증폭시키기 위한 sense pimer (SF5)는 5'-CTC TAC GTG AGC CTG GCT TAG TCT TGT T-3', anti-sense primer(SR7)는 5'-CGC GGA TCC TGC CAA CAT AAT ATA ATT GCG CCT-3'로 합성하여 증폭에 사용하였다. 반응조건은 95℃ 5분간 먼저 처리하고, 50℃ 1분, 72℃ 2분, 92℃ 1분을 29cycle로 반응하였고, 마지막으로 50℃ 1분, 72℃ 5분간 1cycle을 실시하였다.

[실시예 4]

(PEDV spike 유전자 클로닝 및 염기서열 분석)

각각의 1977 bp, 1890 bp, 838 bp의 유전자를 증폭하였으며, 각각의 유전자를 중합효소연쇄반응으로 증폭된 유전자를 클로닝할 수 있는 클로닝 벡터인 pGEMT, 일반 클로닝 벡터인 pSL1190에 제 1도와 같이 클로닝 하였다. 유전자조작에 의하여 완전한 spike 유전자로 연결하였고, 완전한 spike 유전자가 정확하게 삽입되었는 지 확인하기 위하여 염기서열 분석을 실시하였다. 분석은 ABI사의 Taq 중합효소(polymerase)와 형광이 표식된 디데옥시뉴클레오티드(dideoxynucleotides : Applied Biosystems International Prism system)을 이용한 Dye terminater kit를 사용하였으며 Appied Biosystems 377 automated sequencer 및 DNASIS program(Hitachi, ver. 7.0)를 사용하여 염기서열을 분석하였다. 그 결과 정확하게 spike 유전자가 삽입된 것을 확인하였다(제 2도 참조).

[실시예 5]

(PEDV spike 유전자 발현벡터 및 재조합 베큘로바이러스 작성)

클로닝된 spike 유전자를 베큘로바이러스 발현벡터인 pVL1393의 BamHI부위에 삽입하여 리포펙틴(lipofectin)을 이용하여 다음과 같이 재조합바이러스를 작성할 수 있었다. 즉, Pharmingen (USA)사의 베큘로바이러스발현기(baculovirus expression system)를 이용하여, 발현벡터인 pVL1393-spike plasmid DNA 5㎍과 baculovirus linearized DNA 0.5㎍이 포함된 무혈청 Grace's배지 100㎕와 동량의 lipofectin (0.1㎎/㎖, Gibco)과 혼합하여 cotransfection mixture를 제조하고 실온에서 20분간 방치한 후 60㎜ 페트리디쉬에 미리 준비된 Sft9 세포(3x10⁶cells)에 첨가하여 28℃에서 6-12시간 배양 후 상층액을 제거하고 5% FCS가 함유된 새 Grace's 배지를 2-3ml 첨가하고 27℃에서 4-6일간 배양하여 세포변성효과 (cytopathic effect : CPE)가 관찰될 때 수확하여 도 3과 같이 재조합 베큘로바이러스를 제조하였다(도 3참조).

[실시예 6]

(연역점적법에 의한 재조합단백질 확인)

재조합단백질의 발현을 확인하기 위하여 면역점적법을 이용하였다. 감염된 Sf9 세포를 원심분리하여 수확한 다음, 배양상층액과 동량으로 saline(0.85% NaCl)을 첨가하여 sonication한 후 12,000×g에 5분 원심분리한 상층액과 접종 후 수확된 배양상층액 2계단희석하여 nitroce lulose paper에 음압을 이용하여 점적하였다. anti-spike 단클론항체를 이용하여 실온에서 1시간 반응하고 세척한 후 각각 anti-mouse IgG HRP*KPL로 40분 반응하여 세척후 diaminobenzidine(DAB, Pierce)으로 발색하여 확인하였다(도 4 참조).

[실시예 7]

(간접형광항체 검사)

재조합바이러스를 Sf9 cell에 접종후 3일에 80% 냉아세톤(cold acetone)으로 고정하여 humid chamber에서 PEDV-spike 단클론항체를 1차 항체로 사용하여 40분간 반응하고 2차 항체로는 anti-mouse-FITC를 사용하였다. 형광현미경 검경하에서 spike 단백질이 발현된 감염세포에서만 특이반응을 나타내어 spike 단백질의 발현을 확인할 수 있었다(도 5참조).

[실시예 8]

(세포면역염색법에 의한 재조합단백질의 발현확인)

감염된 Sf9 세포 및 정상 Sf9 세포를 접종 3일에 80% cold ace one으로 고정하여 실온에서 항 PEDV-spike단클론 항체로 반응하고 3회 세척한 후, anti-mouse IgG-HRP(Kpl)를 1시간 동안 반응시켰으며, PBST로 3회 세척하고 발생하였다. 발색제로는 diaminobenzidine(DAB, 0.9㎎/1.00ml) 10ml에 과산화수소(H₂O₂) 10㎕를 넣어 발색시켰다(도 6참조).

[실시예 9]

(Western blot 분석)

재조합바이러스를 접종 4일 후 채독한 후 감염된 세포를 파쇄(sonication)하고 3,000rpm에서 20분간 원심분리하여 SDS-PAGE sample buffer에서 부유시킨 후 95℃ 5분간 처리 후 SDS-PAGE하였다.

SDS-PAGE한 후 nitrocellulose paper에 전이 시켰다. 블로킹용액(blocking solution : 5% lactalbumin hydrolysate and skim milk in PBS)을 첨가하여 실온에서 1시간 동안 blocking하였다. Anti-PEDV spike 단클론항체로 반응하고 3회 PBST(PBS-0.05%Tween20)로 세척한 후, anti-mouseIgG-HRP(Kpl)를 1시간 동안 반응시켰으며, 3회 세척하고 발색제로는 diaminobenzidine(DAB, 0.9㎎/100ml에 H₂O₂10㎕를 넣어 발색시켰다. 발현된 스파이크단백질의 분자량은 약 150 kd로 확인되었다. (도 7참조)

[실시예 10]

(발현단백질의 생산조건 조사)

발현되는 양을 측정하기 위하여 간접결합효소면역항체법(indirect ELISA) 방법으로 조사하였다. 6 well TC microplate에 Sf9 세포를 단층배양한 후 선발된 재조합바이러스를 접종하고 24시간 마다 배양상층액 및 감염세포에서 발현된 재조합단백질을 96 well polysorb ELISA plate에 coating buffer(BuPH^TMCarbonate Bicarbonate buffer Packs, Pierce, USA)에 의하여 2배 계단 희석하여 100㎕를 넣고 4℃에서 18시간 coating하였다. 상층액을 버리고 PBST(PBS-0.05% Tween 20)로 4회 세척한 후 blocking solution(5% lactalbumin hydrolysate and skim milk in PBS)의 200㎕로 1시간동안 blocking 하였다. 돼지 유행성설사병 바이러스 특이 단클론성 항체를 PBST에 1,000배 희석하여 1시간 동안 37℃에서 반응하였다. PBST로 4회 세척한 후 anti-mouse-HRP(kpl)을 PBST에 1,000배 희석하여 37℃ 1시간 반응하였다. PBST로 4회 세척한 후 OPD(o-pheylenediamine dehydrochloride, 5㎎/12.5ml in citrate phosphate buffer)의 100㎕을 첨가하고 15분간 암실에서 반응후 2.5M H₂SO₄를 첨가하여 반응을 중지 시켰다. 판독은 ELISA reader에 의하여 490㎚에서 흡광도를 측정하였다. 판정은 양성혈청 흡광도/음성혈청 흡광도 비율이 2이상이면 양성반으로 판정하였다(도 8참조)

[실시예 11]

(재조합 단백질을 이용한 효소면역 측정법 : IS-ELISA)

정제된 anti-spike 단클론항체를 흡착용 coating buffer(BuPH^TMCarbonate Bicarbonate buffer Packs, Pierce, USA)를 사용 최적농도로 희석하여 면역검사용(immunoassay)용 플레이트에 100㎕씩 분주한 후 4℃에서 12시간 흡착한다. 흡착이 끝난 항체를 플레이트에서 버리고 ELISA 1차 세척용액(Tris-base 2.42g NaCl 22.22g, Merthiolate 0.1g, Tween 20 0.5ml/liter, pH7.3)으로 1회 세척 후 blocking buffer(5% gelatin, 1% bovine serum albummain)를 100㎕씩 분주한 후 37℃에서 2시간 반응한다.

유전자재조합 spike 단백질을 PBS에 최적희석농도로 희석하여 100㎛씩 분주한 후 37℃에서 2시간 반응하고 다시 1차 세척액으로 3회 세척한다. blocking buffer(5% gelatin, 1% bovine serum albumain)를 100㎕씩 분주한 후 37℃에서 1시간 반응한다. 준비된 돼지혈청을 1차 세척용액으로 최적희석배수로 별도의 희석용 플레이트에서 희석한다. blocking 반응이 끝난 플레이트는 blocking 용액을 버리고 희석된 혈청을 100㎕씩 첨가하고 37℃에서 1시간 반응한다. 반응 후 2차 세척액(Tris-base 2.42g NaCl 29.22g, Merthiolate 0.1g, Tween 20 1.0ml/liter, pH7.7)으로 3회이상 세척한다. 이때 각세척은 5분씩 실시한다. anti-swine IgG peroxidase conjugate를 1차 세척액에 최적희석농도로 희석하여 100㎕씩 첨가한 후 37℃에서 1시간 동안 반응한다. 반응후 세척액으로 3회 이상 세척한 후 남은 용액을 전부 제거한다. 발색을 하기 위해 발색제로는 ABTS를 사용한다. 발색이 완료되면 ELISA reader를 이용하여 405㎚에서 흡광도를 측정한다. 혈청의 항체가 결정은 표준 양성 및 음성혈청 각각 5개를 선정하여 대조군으로 하고 2배 단계 희석하여 위와 같은 방법으로 ELISA를 수행한다. 양성혈청 흡광도/음성혈청 흡광도 비율이 2이하로 떨어지는 희석배수의 역수를 항체기로 결정한다. ELISA를 이용한 돼지 유행성설사중바이러스 증화항체검사법의 절차는 도 9와 같다.

[실시예 12]

(최적 항 스파이크 단크론항체 흡착농도 결정)

돼지 유행성설사병바이러스에 대한 중화항체를 검출을 위한 적정 단클론 항체 농도는 (1/1000, 10㎍/ml)에서 가장 좋은 반응성을 나타내었으며 그 결과는 도 10과 같다.

[실시예 13]

(재조합 스파이크 단백질에 대한 항체검출을 위한 최적 항원농도결정)

돼지 유행성설사증바이러스 중화항체를 검출하기 위한 적정항원 농도는 1/10, 즉 5㎍/ml에서 가장 좋은 반응성을 나타내었으며 그 결과는 도 11과 같다.

[실시예 14]

(재조합 스파이크 단백질에 대한 항체검출을 위한 최적 혈청희석 농도 결정)

항체검출을 위한 적정 혈청희석배수는 1/50이 적당하였으며 그 결과는 도 12와 같다.

[시험예]

(IS-ELISA와 바이러스 중화시험과의 항체검출 일치율의 조사)

이상에서 결정된 단크론항체, 항원 및 혈청 사용 조건에서 기존 돼지 유행성설사병 바이러스 중화시험과 본 발명 방법은 IS-ELISA법 간에 항체 검출 상관관계를 조사한 바 0.706 정도의 상관성을 보이며 특이성은 33.3%, 민감성은 83.3%로 이는 ELISA법으로 돼지 유행성설사병 바이러스 중화항체를 검출할 수 있음을 입증할 수 있는 데 결과는 도 13과 같다. 이상의 결과로 보아 본 발명의 IS-ELISA 법은 돼지 유행성설사병 바이러스 중항항체를 신속하고 정확하게 검사할 수 있는 방법으로 평가된다.

돼지 유행성설사병은 돼지의 일령에 상관없이 구토와 수양성 설사 증상을 내며 그 원인체는 돼지유행성설사 바이러스로서 구조단백질인 스파이크는 중화항체를 유발하므로 이 스파이크 유전자를 곤충 바이러스인 베큘로바이러스에 삽입하여 발현된 스파이크 단백질을 이용하여 돼지 유행성설사병 바이러스의 특이 중화항체검출방법을 개발하였다.

이 방법에 의해 4시간이내에 돼지 유행성 설사병에 대한 중화항체검출이 가능하게 되었고, 돼지 설사병의 효과적인 방역실시를 위해 백신접종후 면역수준의 검사 및 감염실태 파악에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

돼지 유행성설사병에 감염된 설사분변에서 분리된 스파이크 유전자의 염기서열이 다음과 같은 구조인 것을 특징으로 하는 유전자.

스파이크 유전자의 5'지역 염기서열

스파이크 유전자의 3' 지역 염기서열
돼지 유행성 설사병 바이러스의 스파이크유전자를 중합효소연쇄반응에 의하여 증폭시켜 유전자를 클로닝하고, 이 유전자를 베큘로바이러스 발현벡터에 삽입하여 스파이크를 발현하는 유전자재조합 베큘로바이러스(한국종균협회 균주기탁번호 KFCC-11014).
제 1항 및 제 2항에 있어서,

돼지 유행성설사병 바이러스(PEDV)에서 RNA를 추출하여 상보디엔에이(cDNA) 제조한 후, 프라이머를 이용하여 스파이크유전자를 중합효소연쇄반응에 의하여 증폭시켜 라이게이션하여 pGEM-T와 pSL1190벡터에서 클로닝하여 베큘로바이러스 발현백터 pVL1393에 삽입하고 리포펙틴을 이용하여 바이러스를 제조하는 것을 특징으로 하는 유전자재조합 베큘로바이러스의 제조방법.
제 3항에 있어서,

특이 중화항체 검출방법에 사용되는 검출항원이 유전자재조합 베큘로바이러스에서 생산된 항원인 것을 특징으로 하는 유전자재조합 베큘로바이러스의 제조방법.
돼지 유행성설사병 바이러스의 스파이크유전자가 삽입된 유전자재조합 베큘로바이러스에서 발현된 항원을 이용하여 돼지 유행성설사병 바이러스의 특이 중화항체 검출방법.
제 5항에 있어서,

항스파이크 단클론항체를 플레이트에 코팅하여 세척하고, 블록킹완충액으로 반응시켜 세척한 후, 가검 돼지혈청을 플레이트에 반응시켜 세척한 세척액과 항돼지콘쥬게이트를 반응시켜 세척하고 발색제로 발색시켜 효소결합면역항체측정기(ELISA)를 이용하여 흡광도를 측정하는 것을 특징으로 하는 돼지 유행성설사병 바이러스의 특이 중화항체 검출방법.
제 6항에 있어서,

특이 중화항체 검출시 항원을 플레이트에 고정하는 방법으로 돼지 유행성 설사바이러스에 특이적인 항스파이크 단클론 항체를 이용하는 것을 특징으로 하는 돼지 유행성설사병 바이러스의 특이 중화항체 검출방법.