JP2003525428A - Ｅ型肝炎ウイルスを検出するための方法及び組成物 - Google Patents

Ｅ型肝炎ウイルスを検出するための方法及び組成物

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Abstract

(57)【要約】 サンプル中のＵＳタイプもしくはＵＳサブタイプＥ型肝炎ウイルス（その天然変異体をも含む）の存在を検出するための方法及び組成物を開示する。特に、本発明はＵＳタイプもしくはＵＳサブタイプＥ型肝炎ウイルスのゲノムに相当する核酸配列、前記ウイルスのゲノムによりコードされるアミノ酸配列（エピトープ配列も含む）、及び前記アミノ酸配列に特異的に結合する抗体を提供する。本発明は更に、前記ウイルスによる感染に対して患者を免疫化するためまたは前記ウイルスに既に感染した患者を治療するための方法及び組成物を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、包括的にはＥ型肝炎ウイルスを検出するための方法及び組成物に関
し、より具体的にはＥ型肝炎ウイルスのＵＳタイプ及びＵＳサブタイプ株に感染
している患者を検出または治療するための方法及び組成物に関する。
【０００２】 （発明の背景） 肝臓の炎症（肝炎）の原因である肝親和性ウイルスには少なくも５つの主要ク
ラスがある。これらのウイルスにはＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイ
ルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）及
びＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）が含まれる。ＨＢＶ、ＨＣＶ及びＨＤＶのみが慢
性肝炎を引き起こすが、５タイプすべてのウイルスが直接にまたは例えばＨＢＶ
やＨＤＶの重感染／共感染の結果として急性疾患を引き起こす。ＨＥＶは他のウ
イルスと同様の肝炎の症状、例えば腹痛、黄疸、倦怠感、食欲不振、濃尿、発熱
、悪心及び嘔吐を発現する（例えば、Ｒｅｙｅｓら，「非Ａ非Ｂ肝炎剤の分子生
物学：Ｃ型及びＥ型肝炎ウイルス(Molecular biology of non-A, non-B hepatit
is agents: hepatitis C and hepatitis E viruses)」，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉ
ｎ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４０：５７−１０２（１９９１）、Ｂｒａ
ｄｌｅｙ，「非Ａ非Ｂ肝炎ウイルスはＣ型及びＥ型ウイルスとして同定されるよ
うになる(Hepatitis non-A, non-B viruses become identified as hepatitis C
and E viruses)」，Ｐｒｏｇｒ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ，３７：１０１−１３５
（１９９０）、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ，「非Ａ非Ｂ肝炎ウイルス(Non-A, non-B he
patitis viruses)」，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第２版，ニューヨーク州に所在のＲａ
ｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ（１９９０年）発行，ｐ．２２３９−２２７１、Ｇｕｓｔら
，「研究会報告：水伝播性非Ａ非Ｂ肝炎ウイルス(Report of a workshop: water
borne non-A, non-B hepatitis)」，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１５６：６
３０−６３５（１９８７）及びＫｒａｗｃｙｚｎｓｋｉ，「Ｅ型肝炎(Hepatitis
E)」，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１７：９３２−９４１（１９９３）参照）。し
かしながら、他の肝炎ウイルスとは異なり、ＨＥＶは通常米国では肝炎の重大な
原因であると考えられていない。
【０００３】 ＨＥＶが流行している地域は東アフリカ、北アフリカ、インド、パキスタン、
ビルマ及び中国である（上掲のＲｅｙｓ（１９９１））。ＨＥＶ感染の死亡率は
ＨＥＶが流行している地域の全人口の約０．１〜約１．０％であると推定され、
発展途上国の妊娠女性では約２０％くらい高いと推定されている。多くは劇症肝
炎のために死亡している（上掲のＲｅｙｓ（１９９１））。米国、西ヨーロッパ
及び日本では、ＨＥＶが流行している地域を訪問してから自宅に戻った旅行者の
ＨＥＶ感染例が時々報告されている。しかしながら、ＨＥＶ感染が中央官庁に報
告されていないので、米国ではＨＥＶ感染の罹患率及び／または死亡率に関する
情報は殆どない。米国では、ＨＥＶの重大さを調べる系統的研究は今まで実施さ
れていない。更に、前記研究が実施されていたとしても、前記研究を実施するた
めの適切な試薬が開発されない限り米国（及び多分日本及び西ヨーロッパ）での
ＨＥＶの相対的重大さは過小評価され続ける恐れがある。
【０００４】 ＨＥＶの基本的特徴は、ＨＥＶが当業界においてオープンリーディングフレー
ム１（ＯＲＦ１）、オープンリーディングフレーム２（ＯＲＦ２）及びオープン
リーディングフレーム３（ＯＲＦ３）と称される３つの非連続オープンリーディ
ングフレーム（ＯＲＦ）を含むポジティブセンスな一本鎖ＲＮＡゲノムを有する
直径約２７〜３０ｎｍのエンベロープを持たないウイルスであることである。ウ
イルスの全体形態並びにゲノムの大きさ及び構成に基づいて、ウイルスは暫定的
にカリシウイルス科の１つとして分類されている。最初に同定され、配列決定さ
れたＨＥＶの２つの単離物はビルマ及びメキシコから入手した。両単離物のゲノ
ムの範囲の全核酸同一性は７６％である（Ｒｅｙｅｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４
７：１３３５−１３３９（１９９０）、Ｔａｍら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１８５：
１２０−１３１（１９９１）、Ｈｕａｎｇら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９１：５５
０−５５８（１９９２））。ヌクレオチドの違いの多くは第３コドン位置で見ら
れ、ＨＥＶのビルマ株とメキシコ株間のアミノ酸配列の推定類似性はオープンリ
ーディングフレームＯＲＦ１、ＯＲＦ２及びＯＲＦ３のそれぞれに対して８３％
、９３％及び８７％であった。
【０００５】 ビルマ株ではゲノムの５’末端に約２７ヌクレオチドの短い非翻訳領域がある
が、これは、メキシコ株では同定されていなかった。ＯＲＦ１は、推定メチルト
ランスフェラーゼドメイン、ＲＮＡヘリカーゼドメイン、推定ＲＮＡ依存性ＲＮ
Ａポリメラーゼ（ＲＤＲＰ）ドメイン及び推定パパイン様プロテアーゼを含めた
幾つかの保存モチーフをコードする約５，１００ヌクレオチドを含む。すべての
ポジティブセンスなＲＮＡ植物及び動物ウイルスに見られるＧｌｙ−Ａｓｐ−Ａ
ｓｐ（ＧＤＤ）のトリペプチド配列はＯＲＦ１内にあり、通常ＲＤＲＰ機能を示
す。通常細胞ヘリカーゼ及びウイルスヘリカーゼに関連するプリンＮＴＰａｓｅ
活性を暗示する保存モチーフもＯＲＦ１配列中に存在する。ＯＲＦ１においてコ
ードされる遺伝子産物に対する不変の免疫応答はない。
【０００６】 第２のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ２）はウイルスゲノムの１／３
のカルボキシルを占めている。ＯＲＦ２は、ＯＲＦ２のアミノ末端のコンセンサ
ス信号ペプチド配列及び推定カプシドタンパク質をコードする約２，０００ヌク
レオチドを含み、該ヌクレオチドはＯＲＦ１に関連して１＋リーディングフレー
ムに翻訳される。ＨＥＶ感染患者はＯＲＦ２から誘導されるペプチドまたは組み
換えタンパク質と反応する抗体を産生していることが多い。
【０００７】 第３のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ３）は、ＯＲＦ１及びＯＲＦ２
と部分的に重複しており、ＯＲＦ１に関連して＋２リーディングフレームに翻訳
される３６９ヌクレオチドを含む。ＯＲＦ３によりコードされるタンパク質の機
能は未知であるが、タンパク質は抗原性であり、多くのＨＥＶ感染患者がこのタ
ンパク質に対する抗体を産生している。従って、ＯＲＦ２及びＯＲＦ３から誘導
されるペプチドまたは組み換えタンパク質はＨＥＶへの接触を診断するのに有用
な血清学的マーカーとして使用し得る。
【０００８】 最近、幾つかの別のＨＥＶ単離物が同定され、ＨＥＶのビルマ株及びメキシコ
株と比較された。最近の単離物の多くはＨＥＶのメキシコ株よりもビルマ株によ
り密接に関連している。１９８６〜１９８７年に短期間出現したものを除いて、
ＨＥＶのメキシコ株の単離物は更に存在しない（Ｖｅｌａｓｑｕｅｚら，ＪＡＭ
Ａ，２６３：３２８１−３２８６（１９９２））。
【０００９】 ＳＡＲ−５５と称する１つの単離物が最近パキスタンのＨＥＶ感染患者から単
離された。ＳＡＲ−５５単離物はビルマ株と非常に関連しており、全ゲノムの範
囲でのヌクレオチド及びアミノ酸同一性はそれぞれ９４％及び９９％である。他
に幾つかの最近の単離物はパキスタンとの国境の中国のＸｕａｒ省から単離され
た。これらの中国単離物は、ビルマ株（ヌクレオチド同一性約９３％）よりもパ
キスタン株（ヌクレオチド同一性約９８％）により密接に関連していた。
【００１０】 ウイルスゲノムを配列決定したり、ウイルスコードされる組み換えタンパク質
及び合成タンパク質を入手する前に、ＨＥＶ感染を電子顕微鏡検査及び免疫蛍光
法によりモニターした。ＨＥＶゲノムが同定されたらすぐに、（ｉ）特定のイム
ノアッセイ、例えば組み換えタンパク質及び／または合成ペプチドをベースとす
るウェスタンブロットアッセイ及びＥＬＩＳＡ、及び（ｉｉ）ポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）、例えば逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を含めたＨＥＶ感染
を検出するための特定の検査方法が利用できるようになった。ＲＴ−ＰＣＲを使
用すると、急性肝炎感染の症例及びＥＴ−ＮＡＮＢＨが流行しているときに便ま
たは血清サンプル中のＨＥＶ ＲＮＡがうまく検出された。更に、ＨＥＶのメキ
シコ株及びビルマ株から誘導した組み換え抗原を使用することにより、ソマリア
、ビルマ、ボルネオ、タシケント、ケニア、パキスタン及びメキシコのＥＴ−Ｎ
ＡＮＢＨ大発生から入手した試料においてＨＥＶに対する特異的ＩｇＧ、ＩｇＭ
及び場合によりＩｇＡ抗体が検出された。エジプト、インド、タジキスタン及び
ウズベキスタンのような地域での急性散発性肝炎の症例及びＨＥＶが流行してい
る地域に旅行した工業国（例えば、米国、英国、オランダ及び日本）の患者の中
の急性肝炎の症例においてＨＥＶに対する特異的ＩｇＧ及び場合によりＩｇＭ抗
体が検出された。
【００１１】 今まで、ＨＥＶのビルマ株及びメキシコ株単離物に対するＰＣＲ及びイムノア
ッセイに基づく試験で、“水伝播性肝炎”の各種症例がＨＥＶにより引き起こさ
れることが確認された。抗体試験も発展途上国及びＨＥＶが流行している地域へ
の旅行者の中での急性散発性肝炎の原因としてＨＥＶを確認するために重要であ
った。しかしながら、現在の試薬がＨＥＶのすべての株への接触を検出できない
ためにどれだけ多くの急性ＨＥＶの症例が現在診断未確定になっているかは分か
らない。従って、ＨＥＶの新しい単離物が同定されているので、現在市販されて
いる試験キットでは今まで検出できなかった新しいＨＥＶ株により生ずる肝炎を
検出及び／または治療するための新規な組成物及び方法の開発が望まれている。
【００１２】 （発明の要旨） 本発明は、一部はヒトＥ型肝炎ウイルスの新規ファミリーの発見に基づく。新
しく知見されたヒトＥ型肝炎ウイルスのファミリーは、以後ＵＳタイプＥ型肝炎
ウイルスと称するクラスに属する。更に、このファミリーの２つのメンバーが米
国に居住している患者で発見され、ヌクレオチドレベル及びアミノ酸レベルで比
較してかなりの類似性を示す。後者の２つのメンバーは共に、以後ＵＳサブタイ
プＥ型肝炎ウイルスと称するＵＳタイプＥ型肝炎ウイルスのサブクラスに属する
。
【００１３】 従って、１つの態様で、本発明は当該試験サンプル中のＵＳタイプもしくはＵ
ＳサブタイプＥ型肝炎ウイルスの存在を検出する方法を提供する。前記方法は、
（ａ）前記サンプル中に存在すると結合パートナーに結合してマーカー−結合パ
ートナー複合体を生成する前記ウイルスに対するマーカー（または、標的）に特
異的に結合する結合パートナーと前記サンプルを接触させるステップ、及び （ｂ）前記複合体の存在または不在を検出するステップ を含む。前記複合体の存在が試験サンプル中のウイルスの存在の指標である。
【００１４】 １つの態様で、前記マーカーは当該サンプル中に存在するＵＳタイプもしくは
ＵＳサブタイプ抗体、例えば免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）または免疫グロブリン
Ｍ（ＩｇＭ）であり、前記結合パートナーはマーカーに特異的に結合するエピト
ープを規定する単離ポリペプチド鎖である。この場合、試験サンプルは検査する
患者から集めた体液サンプル、例えば血液、血清または血漿であると考えられる
。好ましい実施態様では、ＵＳタイプもしくはＵＳサブタイプ特定エピトープを
規定するポリペプチド鎖は固体支持体上に固定化されている。その後、固定化し
たポリペプチド鎖を、サンプル中に存在するマーカー抗体（例えば、抗−ＵＳタ
イプもしくは抗−ＵＳサブタイプＥ型肝炎ウイルス特異的抗体）が固定化ポリペ
プチドに結合し得る条件下でサンプルと混合する。その後、結合した抗体の存在
または不在を、例えば検出可能部分で標識した第２抗体またはその抗原結合断片
（例えば、抗−ヒト抗体またはその抗原結合断片）を用いて検出し得る。
【００１５】 多種多様なＵＳタイプもしくはＵＳサブタイプ特異的ポリペプチドが本発明の
上記実施態様を実施する際に結合パートナーとして有用であり得ると考えられる
。例えば、本発明の１つの好ましい実施態様では、結合パートナーは天然変異体
を含めた配列番号９１、９２及び９３からなる群から選択され、ビルマファミリ
ー及びメキシコファミリーのメンバーの対応アミノ酸配列と比較してユニークな
アミノ酸配列を表すポリペプチド鎖の少なくとも一部、例えば少なくとも５個、
好ましくは少なくとも８個、より好ましくは少なくとも１５個、更に好ましくは
少なくとも約２５個のアミノ酸残基であり得ると考えられる。また、結合パート
ナーは配列番号１７３、１７４または１７５に示すアミノ酸配列を含むポリペプ
チド鎖であり得ると考えられる。本発明の別の好ましい実施態様では、結合パー
トナーは天然変異体を含めた配列番号１６６、１６７及び１６８からなる群から
選択され、ビルマファミリー及びメキシコファミリーのメンバーの対応アミノ酸
配列と比較してユニークなアミノ酸配列を表すポリペプチド鎖の少なくとも一部
、例えば少なくとも５個、好ましくは少なくとも８個、より好ましくは少なくと
も１５個、更に好ましくは少なくとも約２５個のアミノ酸残基であり得ると考え
られる。また、結合パートナーは配列番号１７６、２２３または２２４に示すア
ミノ酸配列を含むポリペプチド鎖であり得ると考えられる。
【００１６】 本発明の別の実施態様では、マーカーはＨＥＶのＵＳタイプもしくはＵＳサブ
タイプファミリーのメンバーにとってユニークなポリペプチド鎖であり、結合パ
ートナーはマーカーポリペプチド鎖上のエピトープに結合する単離抗体（例えば
、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体）であることが好ましい。結合パー
トナーは検出可能部分で標識されていても固体支持体上に固定化されていてもよ
い。例えば、固体支持体上に当該マーカーポリペプチド上の第１エピトープに結
合する第１抗体を固定化することにより上記した本発明の実施態様は容易に実施
され得ると考えられる。次いで、固定化抗体をマーカーポリペプチドに結合させ
得る条件下で分析すべき試験サンプルを固体支持体と混合する。その後、結合し
たマーカーポリペプチド鎖の存在または不在を、例えばマーカーポリペプチド鎖
上の第２の別のエピトープに結合する検出可能部分をコンジュゲートした第２抗
体を用いて測定し得る。
【００１７】 上記した本発明の実施態様を実施する際に有用な抗体は、好ましくは天然変異
体を含めた配列番号９１、９２及び９３からなる群から選択されるポリペプチド
鎖に特異的に結合し得、ビルマファミリー及びメキシコファミリーのメンバーの
対応配列と比較して前記ポリペプチド鎖に対してより高い結合アフィニティーを
有することが好ましい。本発明を実施する際に有用な抗体は配列番号１７３また
は１７５に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖に特異的に結合し得ることが
好ましいと考えられる。この抗体は更に、同様の条件下で、配列番号１６９また
は１７１に示すアミノ酸配列または配列番号１７５に相当するビルマ株及びメキ
シコ株中の領域に対して好ましくは低いアフィニテイーを有するもの、最も好ま
しくは結合しないものとして特徴づけられる。また、本発明の実施の際に有用な
抗体は好ましくは配列番号１７４または配列番号１７６に示すアミノ酸配列を含
むポリペプチド鎖に特異的に結合し得ると考えられる。前記抗体は更に、同様の
条件下で、配列番号１７０または１７２に示すアミノ酸配列または配列番号１７
６に相当するビルマ株及びメキシコ株中の領域に対して好ましくは低いアフィニ
テイーを有するもの、最も好ましくは結合しないものとして特徴づけられる。
【００１８】 また、上記した本発明の実施態様を実施する際に有用な抗体は天然変異体を含
めた配列番号１６６、配列番号１６７及び配列番号１６８からなる群から選択さ
れるポリペプチド鎖に特異的に結合し得、ビルマファミリー及びメキシコファミ
リーのメンバーの対応配列に比して前記ポリペプチド鎖に対して高い結合アフィ
ニティーを有することが好ましいと考えられる。本発明の実施態様を実施する際
に有用な抗体は配列番号２２３に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖に特異
的に結合し得ることが好ましいと考えられる。この抗体は更に、同様の条件下で
、配列番号１７０または１７２に示すアミノ酸配列に対して好ましくは低いアフ
ィニテイーを有するもの、最も好ましくは結合しないものとして特徴づけられる
。また、本発明の実施態様を実施する際に有用な抗体は好ましくは配列番号２２
４に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖に特異的に結合し得ると考えられる
。この抗体は更に、同様の条件下で、配列番号１６９または１７１に示すアミノ
酸配列に対して好ましくは低いアフィニテイーを有するもの、最も好ましくは結
合しないものとして特徴づけられる。
【００１９】 本発明の別の実施態様では、マーカーはＵＳタイプもしくはＵＳサブタイプＥ
型肝炎ウイルスのゲノムの少なくとも一部を規定する核酸配列またはその相補配
列である。また、結合パートナーは例えば特定のハイブリダイゼーション条件ま
たは特定のＰＣＲアニーリング条件下で配列番号８９または１６４に示すヌクレ
オチド配列に特異的にハイブリダイズし得る、好ましくは８〜１００ヌクレオチ
ド、より好ましくは１０〜７５ヌクレオチド、最も好ましくは１５〜５０ヌクレ
オチドを含む単離核酸配列（例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（
ＲＮＡ）またはペプチジル核酸（ＰＮＡ）配列）であると考えられる。
【００２０】 上記した本発明の実施態様は、例えば当該サンプルから核酸を単離することに
より容易に実施され得る。その後、得られた核酸を例えばゲル電気泳動にかけ、
固体支持体（例えば、ニトロセルロースまたはナイロン膜）に移し、固定化する
ことにより分画化しても、または慣用されているドットブロットまたはスロット
ブロット方法により固体支持体上に直接固定化してもよい。次いで、固定化した
核酸を、マーカー配列に対して特異的にハイブリダイズし得る検出可能部分で標
識した所定核酸配列を用いてプローブし得る。或いは、サンプル中のマーカー核
酸の存在はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような一般的な増幅方法により調
べられ得、ここで特定の増幅産物の存在がサンプル中のマーカー核酸の存在の指
標である。
【００２１】 別の態様で、本発明は単離したＵＳタイプもしくはＵＳサブタイプ特異的ポリ
ペプチド配列を提供する。これらのポリペプチドには、結合パートナーとして有
用なＵＳタイプもしくはＵＳサブタイプＥ型肝炎特異的ポリペプチド鎖に関する
欄で上記したものが含まれる。好ましい実施態様において、単離ポリペプチド鎖
は配列番号９３、配列番号１６８、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号
１７５、配列番号１７６、配列番号２２３または配列番号２２４に示すアミノ酸
配列を含む。上記した及び他のＵＳタイプもしくはＵＳサブタイプ特異的ポリペ
プチド鎖がサンプル中の抗−ＵＳタイプもしくは抗−ＵＳサブタイプＥ型肝炎特
異的抗体の存在を検出するためのアッセイフォーマットにおいて使用され得ると
考えられる。更に、前記ポリペプチドは実験動物において抗体を産生するために
単独でまたはアジュバントと組合せて使用され得、または哺乳動物を予防または
治療目的で免疫感作するためのワクチンとして医薬的に許容され得る担体と組合
せて使用され得る。
【００２２】 別の態様で、本発明は単離した抗−ＵＳタイプもしくは抗−ＵＳサブタイプＥ
型肝炎特異的抗体を提供し、この中には結合パートナーとして有用な抗体に関す
る欄で上記したものが含まれる。好ましい実施態様において、単離抗体は、ＵＳ
タイプもしくはＵＳサブタイプＥ型肝炎ウイルスのＯＲＦ１配列によりコードさ
れるポリペプチド、ＵＳタイプもしくはＵＳサブタイプＥ型肝炎ウイルスのＯＲ
Ｆ２配列によりコードされるポリペプチド、またはＵＳタイプもしくはＵＳサブ
タイプＥ型肝炎ウイルスのＯＲＦ３配列によりコードされるポリペプチドからな
る群から選択されるポリペプチド鎖に特異的に結合し得る。特に、有用な抗体は
配列番号９３、配列番号１６８、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１
７５、配列番号１７６、配列番号２２３または配列番号２２４に示すアミノ酸配
列を含むポリペプチド鎖に特異的に結合し得るという特徴を有すると考えられる
。上記抗体及び他の抗体はサンプル中のＵＳタイプもしくはＵＳサブタイプＥ型
肝炎ファミリーのメンバーの存在を検出するためのイムノアッセイにおいて有利
に使用され得ると考えられる。抗体は、抗体自体が好ましくは検出可能部分で標
識されてなる直接イムノアッセイにおいても、抗体自体が第２結合パートナーの
標的、例えば検出可能部分で標識した第２抗体となる間接イムノアッセイにおい
ても使用され得る。更に、前記抗体は例えば哺乳動物を治療または予防目的で受
動免疫するのに使用するために医薬的に許容され得る担体と組合せて使用され得
ると考えられる。
【００２３】 別の態様で、本発明は単離核酸配列、例えばサンプル中のＵＳタイプもしくは
ＵＳサブタイプＥ型肝炎ウイルスの存在を検出するためのマーカーまたは結合パ
ートナーとしての核酸の使用に関する欄に記載したものを提供する。好ましい実
施態様において、本発明はＵＳタイプもしくはＵＳサブタイプＥ型肝炎ウイルス
のＯＲＦ１、ＯＲＦ２またはＯＲＦ３配列の少なくとも一部を規定する単離核酸
配列またはその相補配列を提供する。上記した及び他の核酸配列は、例えば当該
サンプル中のＵＳタイプもしくはＵＳサブタイプＥ型肝炎ウイルスの存在を検出
するためのヌクレオチドプローブ及び／または増幅プライマーとして使用され得
ると考えられる。更に、核酸配列またはその相補配列はアンチセンス治療に使用
するための医薬的に許容され得る担体と組合せられ得ると考えられる。更に、核
酸配列はその後当該宿主細胞に形質転換またはトランスフェクトされるベクター
に統合され得ると考えられる。その後、宿主細胞は医薬的に許容され得る担体と
組合せて、哺乳動物を所定のＵＳタイプもしくはＵＳサブタイプＥ型肝炎に対し
て予防または治療目的で免疫化するためのワクチン（例えば、組み換えワクチン
）として使用され得る。
【００２４】 本発明の上記した及び他の目的、特徴及び作用効果は本発明の好ましい実施態
様に関する以下の詳細説明から明らかとなるであろう。
【００２５】 （図面の簡単な説明） 本発明の目的及び特徴は添付図面を参照することによりより深く理解され得る
。
【００２６】 図１は、ＯＲＦ１、ＯＲＦ２及びＯＲＦ３領域の相対位置を示すＨＥＶゲノム
の概略図である。
【００２７】 図２は、入院１日目から３７日目までの患者ＵＳＰ−１中の血清アスパルテー
トアミノトランスフェラーゼ（四角）及び血清総ビリルビン（菱形）のレベルを
示すグラフである。
【００２８】 図３は、本研究中に単離したクローンの相対位置を示すＨＥＶ ＵＳ−１ゲノ
ムの概略図である。
【００２９】 図４は、本研究中に単離したクローンの相対位置を示すＨＥＶ ＵＳ−２ゲノ
ムの概略図である。
【００３０】 図５は、完全長ＨＥＶ ＵＳ−１、ＨＥＶ ＵＳ−２及び１０個の他のＨＥＶ
単離物由来のヌクレオチド配列の関係を示す根なし系統樹を示す。枝の長さは配
列間の進化距離に比例する。位置あたりのヌクレオチド置換を示すスケールを示
す。節間数(internal node numbers)は１００反復から得た（すべての樹の％と
して表す）ブーツストラップ値を示す。示した単離物はビルマＢ１、Ｂ２；中国
のＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４；パキスタンＰ１；インドＩ１、Ｉ２；メキシコＭ１
；及び米国ＵＳ−１、ＵＳ−２である。
【００３１】 図６は、ＯＲＦ２／３領域由来のヌクレオチド配列（すなわち、配列番号８９
のヌクレオチド残基５０９４〜７１１４に相当する配列）の関係を示す根なし系
統樹を示す。枝の長さは配列間の進化距離に比例する。位置あたりのヌクレオチ
ド置換を示すスケールを示す。節間数は１００反復から得た（すべての樹の％と
して表す）ブーツストラップ値を示す。示した単離物はビルマＢ１、Ｂ２；中国
Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４；パキスタンＰ１；インドＩ１、Ｉ２；メキシコＭ１；
ブタＳ１；及び米国ＵＳ−１、ＵＳ−２である。
【００３２】 図７は、患者ＵＳＰ−２から採取した血清を接種する前またはその後のマカク
中のアラニンアミノトランスフェラーゼ（四角）、血清アスパルテートトランス
フェラーゼ（丸）及びγ−グルタミルトランスフェラーゼ（三角）のレベルを示
すグラフである。ＨＥＶ ＵＳ−２ ＲＮＡが血清または糞サンプル中に存在す
るときの時間及び抗−ＨＥＶ ＵＳ−２ ＩｇＭ及びＩｇＧが検出可能な時間を
も示す。
【００３３】 図８は、本研究中に単離したクローンの相対位置を示すＩｔ１ゲノム概略図で
ある。
【００３４】 図９は、ＯＲＦ１、ＯＲＦ２−３及びＯＲＦ２に対するＨＥＶコンセンサスプ
ライマーの設計を示すビルマ（Ｂ１）、メキシコ（Ｍ１）、中国（Ｃ１）、パキ
スタン（Ｐ１）及びＵＳ−１のアラインメントを示す。好ましいコンセンサスプ
ライマーを強調して示す。
【００３５】 図１０は、３７１ヌクレオチド長で配列番号８９の残基２６〜３９６に相当す
るＯＲＦ１ヌクレオチド配列の関係を示す根なし系統樹を示す。位置あたりのヌ
クレオチド置換を示すスケールを示す。節間数は１０００反復から得た（すべて
の樹の％として表す）ブーツストラップ値を示す。示した単離物はビルマＢ１、
Ｂ２；中国Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４；パキスタンＰ１；インドＩ１、Ｉ２；メキ
シコＭ１；イタリアＩｔ１；ギリシャＧ１、Ｇ２；及び米国ＵＳ−１、ＵＳ−２
である。
【００３６】 図１１は、１４８ヌクレオチド長で配列番号８９の残基６３０７〜６４５４に
相当するＯＲＦ２ヌクレオチド配列の関係を示す根なし系統樹を示す。位置あた
りのヌクレオチド置換を示すスケールを示す。節間数は１０００反復から得た（
すべての樹の％として表す）ブーツストラップ値を示す。示した単離物はビルマ
Ｂ１、Ｂ２；中国Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４；パキスタンＰ１；インドＩ１、Ｉ２
；メキシコＭ１；イタリアＩｔ１；ギリシャＧ１、Ｇ２；ブタＳ１；及び米国Ｕ
Ｓ−１、ＵＳ−２である。
【００３７】 図１２は、好ましいＨＥＶ−ＵＳ組み換えタンパク質構築物の概略図である。
図１２Ａには、ＨＥＶのＯＲＦ２及びＯＲＦ３構造タンパク質を最初及び最後の
アミノ酸位置と共に示す。免疫優性エピトープの存在をＯＲＦの範囲内のライン
で示す。図１２Ｂには、発現ベクターにクローン化したＯＲＦ３領域を最初及び
最後のアミノ酸位置と共に示す（配列番号２０３または２０４）。図１２Ｃには
、発現ベクターにクローン化したＯＲＦ２領域を最初及び最後のアミノ酸位置と
共に示す（配列番号１９９または２００）。図１２Ｄには、発現ベクターにクロ
ーン化したＯＲＦ３／２キメラ構築物を該キメラ構築物の各成分の最初及び最後
のアミノ酸位置と共に示す（配列番号２０６または２０７）。ＯＲＦ３／２構築
物から除去した配列を破線で示す。図１２Ｂ〜１２Ｄでは、各構築物のカルボキ
シル末端のＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドの存在を黒四角で示す。
【００３８】 図１３は、患者ＵＳＰ−２から採取した血清を接種する前及びその後のマカク
中のアラニンアミノトセンスフェラーゼ（四角）、ＩｇＧ（円）及びＩｇＭ（星
）のレベルを示すグラフである。
【００３９】 図１４は、３７１ヌクレオチド長で配列番号８９の残基２６〜３９６に相当す
るＯＲＦ１ヌクレオチド配列の関係を示す根なし系統樹を示す。位置あたりのヌ
クレオチド置換を示すスケールを示す。節間数は１０００反復から得た（すべて
の樹の％として表す）ブーツストラップ値を示す。示した単離物はビルマＢ１、
Ｂ２；中国Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４；パキスタンＰ１；インドＩ１、Ｉ２；メキ
シコＭ１；イタリアＩｔ１；ギリシャＧ１、Ｇ２；オーストリアＡｕ１；アルゼ
ンチンＡｒ１、Ａｒ２；及び米国ＵＳ−１、ＵＳ−２である。
【００４０】 図１５は、１４８ヌクレオチド長で配列番号８９の残基６３０７〜６４５４に
相当するＯＲＦ２ヌクレオチド配列の関係を示す根なし系統樹を示す。位置あた
りのヌクレオチド置換を示すスケールを示す。節間数は１０００反復から得た（
すべての樹の％として表す）ブーツストラップ値を示す。示した単離物はビルマ
Ｂ１、Ｂ２；中国Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４；パキスタンＰ１；インドＩ１、Ｉ２
；メキシコＭ１；イタリアＩｔ１；ギリシャＧ１、Ｇ２；オーストリアＡｕ１；
アルゼンチンＡｒ１；ブタＳ１；及び米国ＵＳ−１、ＵＳ−２である。
【００４１】 図１６は、９８ヌクレオチド長で配列番号８９の残基６３５４〜６４５１に相
当するＯＲＦ２ヌクレオチド配列の関係を示す根なし系統樹を示す。位置あたり
のヌクレオチド置換を示すスケールを示す。節間数は１０００反復から得た（す
べての樹の％として表す）ブーツストラップ値を示す。示した単離物はビルマＢ
１、Ｂ２；中国Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４；パキスタンＰ１；インドＩ１、Ｉ２；
メキシコＭ１；イタリアＩｔ１；ギリシャＧ１、Ｇ２；オーストリアＡｕ１；ア
ルゼンチンＡｒ１、Ａｒ２；ブタＳ１；及び米国ＵＳ−１、ＵＳ−２である。
【００４２】 （発明の詳細説明） 上記したように、本発明の一部はヒトＥ型肝炎ウイルスの新しいファミリーの
発見に基づく。Ｅ型肝炎ウイルスの新しく発見されたファミリーは、以後ＵＳタ
イプＥ型肝炎ウイルスと称するクラスに属する。更に、上記したように、ＵＳタ
イプのファミリーの２つのメンバーが米国に居住する二人の患者から得た血清に
おいて同定された。これら２つのメンバーは共に、以後ＵＳサブタイプＥ型肝炎
ウイルスと称するＵＳタイプＥ型肝炎ウイルスのサブクラスに属する。ＵＳタイ
プ及びＵＳサブタイプＥ型肝炎ウイルスが発見されたことにより、従来市販され
ている肝炎検出キットを用いたときには肝炎を患っていると診断されなかった患
者においてＵＳタイプ及びＵＳサブタイプＥ型肝炎ウイルスの存在を検出するた
めの方法及び組成物並びに前記ウイルスに対して患者を免疫化するための方法及
び組成物の開発が可能となった。
【００４３】 １つの態様で、本発明は試験サンプル中のＵＳタイプもしくはＵＳサブタイプ
Ｅ型肝炎ウイルスの存在の検出方法に関する。この方法は、（ａ）前記サンプル
中に存在すると結合パートナーに結合してマーカー−結合パートナー複合体を生
成する前記ウイルスに対す目マーカーに特異的に結合する結合パートナーと前記
サンプルを接触させ、ステップ及び（ｂ）前記複合体の存在を検出するステップ
を含む。前記サンプル中の前記ウイルスの存在の指標である。本明細書に記載の
ＵＳタイプ及びＵＳサブタイプＥ型肝炎ウイルスの発見に基づいて、サンプル中
の前記ウイルスの存在を検出するために各種アッセイ、例えばタンパク質または
核酸ベースのアッセイが作成され得る。タンパク質ベースのアッセイの例には慣
用されているイムノアッセイが含まれ得、核酸ベースのアッセイの例には慣用さ
れているプローブハイブリダイゼーションまたは核酸配列増幅アッセイが含まれ
得、これらのアッセイはすべて当業界で公知であり、十分に検討されている。
【００４４】 別の態様で、本発明は試薬、例えば抗体、ポリペプチド鎖を含むエピトープ、
及び例えば予防目的または治療目的でＵＳタイプもしくはＵＳサブタイプＥ型肝
炎ウイルスに対して患者を免疫化するためのワクチンを開発するために使用され
得るヌクレオチド配列を提供する。
【００４５】 Ｉ．定義 本発明の理解を容易とするために、本明細書中で使用した用語は以下のように
定義する。
【００４６】 本明細書中、用語「ＵＳタイプ」Ｅ型肝炎ウイルスは、Ａ型肝炎ウイルス（Ｈ
ＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎
ウイルス（ＨＤＶ）及びＧ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）とは血清学的に区別され、
少なくとも１個のオープンリーディングフレームを規定し、配列番号８９の残基
６３０７〜６４５４により規定されるヌクレオチド配列と７９．７％以上同一の
ヌクレオチド配列を有する一本鎖ＲＮＡゲノムを含むヒトウイルス（すなわち、
ヒトを感染させ得る）を意味すると理解される。
【００４７】 本明細書中、用語「ＵＳサブタイプ」Ｅ型肝炎ウイルスは、Ａ型肝炎ウイルス
（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型
肝炎ウイルス（ＨＤＶ）及びＧ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）とは血清学的に区別さ
れ、少なくとも１個のオープンリーディングフレームを規定し、配列番号８９の
残基６３０７〜６４５４により規定されるヌクレオチド配列と９０．５％以上同
一のヌクレオチド配列を有する一本鎖ＲＮＡゲノムを含むヒトウイルス（すなわ
ち、ヒトを感染させ得る）を意味すると理解される。
【００４８】 本明細書中、用語「試験サンプル」は、検査すべきマーカー（例えば、抗体、
抗原タンパク質またはペプチド、ヌクレオチド配列）を含む任意のサンプル、例
えば生体サンプルを意味すると理解される。好ましい試験サンプルには、被験者
から単離され得る組織または体液サンプルが含まれる。好ましい体液サンプルの
例には、血液、血清、血漿、唾液、痰、血清、尿、便、胆汁、脊髄液、乳滲出液
、腹水及び腹膜液が含まれる。別の好ましい試験サンプルは細胞系、より好まし
くは哺乳動物細胞系である。最も好ましい細胞系はヒト胎児腎細胞系である。
【００４９】 本明細書中、「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」は、１つ以
上のポリペプチド鎖をコードし得るポリヌクレオチド配列の領域を意味すると理
解される。この領域は、開始コドン（例えば、ＡＴＧ（ＡＵＧ））で始まり、終
止コドン（例えば、ＴＡＡ（ＵＡＡ）、ＴＡＧ（ＵＡＧ）またはＴＧＡ（ＵＧＡ
））で終わる全コーディング配列またはその一部を表し得る。
【００５０】 本明細書中、用語「ポリペプチド鎖」は、アミノ酸の分子鎖を意味すると理解
され、特定長さの産物を指すのではない。よって、ポリペプチド鎖の定義にはペ
プチド、オリゴペプチド及びタンパク質が含まれる。
【００５１】 本明細書中、用語「エピトープ」は「抗原決定基」と同義的に使用され、抗体
可変領域により特異的に結合され得る（すなわち、約１０５Ｍ−１以上のアフィ
ニティー、より好ましくは約１０７Ｍ−１以上のアフィニティーで結合する）抗
原の少なくとも一部を意味すると理解される。多分、エピトープは該エピトープ
に独自の空間コンフォメーションで３個のアミノ酸を含み得る。一般的には、エ
ピトープは少なくとも５個のアミノ酸を含み、より一般的には少なくとも８〜１
０個のアミノ酸を含む。空間コンフォメーションを調べる方法は当業界で公知で
あり、その例にはＸ線結晶法及び二次元核磁気共鳴法が含まれる。
【００５２】 ポリペプチドがポリペプチド鎖により規定される特定エピトープの抗体認識の
ために抗体に結合するとき、該ポリペプチドは抗体と「免疫学的に反応性」であ
る。免疫学的反応性は、抗体結合（特に、抗体結合のカイネティック）により及
び／または競合結合研究により調べられ得る。特定の抗体が第１抗原と免疫学的
に反応性であるが第２の別の抗原とは免疫学的に反応しないか殆ど反応しない場
合、２つの抗原は血清学的に区別されると考えられる。本明細書中、用語「アフ
ィニテイー」は、２つの分子間（例えば、抗体と抗原の間）の可逆的相互作用の
尺度を意味すると理解される。アフィニテイーが高いほど、２つの分子間の相互
作用は強い。
【００５３】 本明細書中、用語「検出可能部分」は、信号発生化合物、例えば色素原、触媒
（例えば、酵素）、ルミネセンス化合物（例えば、ジオキセタン、アクリジニウ
ム、フェナントリジニウム及びルミノール）、放射性元素及び肉眼で検出可能な
標識を意味すると理解される。酵素の例には、アルカリホスファターゼ、ホース
ラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ等が含まれる。特定の検
出可能部分の選択は臨界的でないが、検出可能部分はそれ自体でまたは１つ以上
の追加物質と組合せて信号を発生し得る。
【００５４】 本明細書中、用語「固体支持体」は、プラスチック、誘導化プラスチック，磁
性または非磁性金属、ガラスまたはシリコーン表面を意味すると理解される。有
用な表面の例には、試験管、微量滴定ウェル、シート、ビーズ、微粒子、チップ
、ヒツジ（または他の適当な動物）赤血球または硬膜細胞(duracyte)が含まれる
。適当な固体支持体は本発明の実施にとって臨界的でなく、当業者は選択可能で
ある。固相上にペプチドを固定化するための好適な方法には、イオン相互作用、
疎水性相互作用、共有相互作用等が含まれる。固体支持体は、捕捉試薬を引きつ
け、固定化する固有の能力に関して選択され得る。或いは、固体支持体は捕捉試
薬を引きつけ、固定化する能力を有する追加の受容体を有していてもよい。
【００５５】 固体支持体は、検出抗体が接近し得るように十分な多孔度及び抗原を結合する
ために適当な表面アフィニテイーを有する適当な多孔質材料からなり得ると考え
られる。通常微孔性構造物が好ましいが、水和状態でゲル構造を有する材料も使
用し得る。材料はすべてフィルム、シートまたはプラスチックのような適当な形
態で使用され得、または紙、ガラス、プラスチックフィルムまたはファイバのよ
うな適当な不活性担体上にコートされたり、適当な不活性担体に結合またはラミ
ネートされていてもよい。
【００５６】 各種の他の固体支持体を用いる他の実施態様も本発明で考えられ、本発明の範
囲に含まれる。例えば、高速液相免疫化学反応を実施するために、欧州特許出願
公開第０ ３２６ １００号明細書及び同第０ ４０６ ４７３号明細書に記載
されている負電荷を有するポリマーを用いて固定化可能な反応複合体を固定化す
るためのイオン捕捉方法を本発明では使用され得る。固定化可能な免疫複合体は
、負電荷を有するポリアニオン／免疫複合体と予め処理した正電荷を有する多孔
質マトリックスの間のイオン相互反応により反応混合物の残りから分離され、欧
州特許出願公開第０ ２７３ １１５号明細書に記載されている化学ルミネセン
ト信号測定法に記載されているようなものを含めた公知の各種信号発生システム
を用いて検出される。
【００５７】 また、本発明の方法は、固相が磁性または非磁性微粒子からなる自動及び半自
動システムを含めた微粒子方法を用いるシステムに使用するために改変され得る
。前記システムには、１９９２年２月１８日に付与された米国特許第５，０８９
，４２４号明細書及び１９９３年９月１４日に付与された米国特許第５，２４４
，６３０号明細書に記載されているものが含まれる。
【００５８】 イムノアッセイのための走査プローブ顕微鏡検査法の使用も本発明のモノクロ
ーナル抗体が容易に適用され得る技術である。走査プローブ顕微鏡検査法、特に
原子力顕微鏡検査法では、捕捉相（例えば、本発明のモノクローナル抗体の少な
くとも１つ）を固相に結合させ、走査プローブ顕微鏡を用いて固相表面上に存在
するかもしれない抗原／抗体複合体を検出する。走査トンネル顕微鏡検査法を使
用すると、多くのイムノアッセイシステムでは抗原／抗体複合体を検出するため
に通常使用しなければならない標識を使用しなくてすむ。特異的結合反応をモニ
ターするためにＳＰＭは多くの方法で使用され得る。１つの実施態様では、特異
的結合パートナー（本発明のモノクローナル抗体であるアナライト特異的物質）
の１つのメンバーを走査に適した表面に結合させる。アナライト特異的物質は、
当業者に公知の方法に従ってプラスチックまたは金属表面の固相からなる試験片
へ吸着させることにより結合され得る。或いは、特異的結合パートナー（アラナ
イト特異的物質）を誘導化プラスチック、金属、シリコーンまたはガラスの固相
からなる試験片に共有結合させてもよい。共有結合方法は当業者に公知であり、
その中には特異的結合パートナーを試験片に非可逆的にリンクさせるための各種
手段が含まれる。試験片がシリコーンまたはガラスのときには、特異的結合パー
トナーを結合させる前に表面を活性化させなければならない。また、欧州特許出
願公開第０ ３２２ １００号明細書及び同第０ ４０６ ４７３号明細書に記
載されている技術及び化学を用いて特異的結合パートナーを試験片の表面上に固
定化するためにポリ電解質相互作用を使用してもよい。共有結合による結合方法
が好ましい。特異的結合メンバーを結合させた後、非特異的結合を最小限とする
ために表面を血清、タンパク質または他のブロッキング剤のような物質を用いて
更に処理してもよい。表面をアッセイ目的の適合性を証明するために製造場所ま
たは使用時点で走査してもよい。走査方法は試験片の特異的結合特性を変更しな
いと予想される。
【００５９】 本明細書中、用語「ヌクレオチド配列」または「核酸配列」は、任意の長さを
有するヌクレオチドのポリマー形態を意味すると理解され、リボヌクレオチドで
もデオキシヌクレオチドでもよい。この用語は分子の主構造を指す。よって、こ
の用語には、二本鎖及び一本鎖ＤＮＡ並びに二本鎖及び一本鎖ＲＮＡが含まれる
。また、例えばメチル化及び／またはキャッピングによる修飾及びポリペプチド
の未修飾形態も含まれる。
【００６０】 本明細書中、用語「プライマー」は、標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズ
し、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素により触媒され
るヌクレオチド重合の開始点として機能し得る標的ヌクレオチド配列に相補性で
ある特定のオリゴヌクレオチド配列を意味すると理解される。
【００６１】 核酸断片を指すとき、前記核酸断片は検出の直線範囲内でＨＥＶ ＵＳタイプ
もしくはＵＳサブタイプのポリヌクレオチドまたはその変異体に特異的にハイダ
リダイズまたは特異的に結合すると見做され、このハイブリダイゼーションによ
り、同等量のＨＥＶ ＵＳタイプ、ＵＳサブタイプまたはその変異体以外に由来
するポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションにより生ずるであろう信号に
比してより強い信号が発生する。他に比してより強い信号は特定の検出方法によ
り他の場合よりも測定可能である信号である。
【００６２】 また、核酸断片を指すとき、前記核酸断片が（ｉ）好ましいハイブリダイゼー
ション条件がより低い緊縮度を有するもの、より好ましくはより高い緊縮度を有
するものであるＭａｎｉａｔｉｓ，第１版，ｐ．３８７−３８９（１９８２）に
記載されているような典型的なハイブリダイゼーション及び洗浄条件下、または
（ｉｉ）標準のＰＣＲ条件（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ら）または“タッチダウン”
ＰＣＲ条件（Ｒｏｕｘ，Ｋ．Ｈ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｉｑｕｅｓ，１６：８１２−
８１４（１９９４））下で特異的にハイダリダイズするならば、核酸断片は特定
ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすると見做される。
【００６３】 本明細書中、用語「プローブ」は、相補配列を有するサンプル中に存在する特
定ＤＮＡまたはＲＮＡを同定するために使用され得る配列を含有するヌクレオチ
ドまたはヌクレオチドアナログ（例えば、ＰＮＡ）を意味すると理解される。
【００６４】 本明細書中、用語「ＰＮＡ」は、標的の存在を調べるために本明細書に記載さ
れているアッセイのような方法において使用され得るペプチド核酸アナログを意
味すると使用されている。「ＭＡ」は、標的の存在を調べるために本明細書に記
載されているアッセイのような方法において使用され得る「モルホリノアナログ
」を指す。例えば、援用により本明細書に含まれるとする米国特許第５，３７８
，８４１号明細書を参照されたい。ＰＮＡは通常ＲＮＡ標的またはＤＮＡに指向
し得る中性に帯電した部分である。アッセイにおいて例えば本発明のＤＮＡプロ
ーブの代わりにＰＮＡプローブを使用しても、該ＤＮＡプローブを使用したとき
に得られる効果が達成され得ない。これらの効果には、製造性、大規模ラベリン
グ、再現性、安定性、イオン強度の変化に対する非感受性、及びＤＮＡまたはＲ
ＮＡを用いる方法で見られる酵素分解に対する耐性が含まれる。前記ＰＮＡをフ
ルオレセイン、リボヌクレオチド、化学ルミセネント化合物等のような信号発生
化合物で標識してもよい。従って、ＰＮＡまたは他の核酸アナログ（例えば、Ｍ
Ａ）はＤＮＡまたはＲＮＡの代わりにアッセイ方法で使用してもよい。本明細書
ではＤＮＡを用いるアッセイを説明しているが、アッセイ試薬において可能であ
ったり所要により適切に変化させてＲＮＡまたはＤＮＡをＰＮＡまたはＭＡで置
換し得ることも日常的に行われていることである。
【００６５】 核酸断片を指すとき、前記核酸断片は検出の直線範囲内でＨＥＶ ＵＳタイプ
もしくはＵＳサブタイプのポリヌクレオチドまたはその変異体に特異的にハイダ
リダイズまたは特異的に結合すると見做され、このハイブリダイゼーションによ
り、同等量のＨＥＶ ＵＳタイプ、ＵＳサブタイプまたはその変異体以外に由来
するポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションにより生ずるであろう信号に
比してより強い信号が発生する。他に比してより強い信号は、特定の検出方法に
より他の場合よりも測定可能である信号である。
【００６６】 また、核酸断片を指すとき、前記核酸断片が（ｉ）好ましいハイブリダイゼー
ション条件がより低い緊縮度を有するもの、より好ましくはより高い緊縮度を有
するものであるＭａｎｉａｔｉｓ，第１版，ｐ．３８７−３８９（１９８２）に
記載されているような典型的なハイブリダイゼーション及び洗浄条件下、または
（ｉｉ）標準のＰＣＲ条件（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ら）または“タッチダウン”
ＰＣＲ条件（Ｒｏｕｘ，Ｋ．Ｈ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｉｑｕｅｓ，１６：８１２−
８１４（１９９４））下で特異的にハイダリダイズするならば、核酸断片は特定
ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすると見做される。
【００６７】 ＩＩ．検出方法及び試薬 本発明の方法は以下に詳記する各種のタンパク質ベースまたは核酸ベースのア
ッセイを使用し得ると考えられる。
【００６８】 ウイルスまたはそのマーカーを検出するための試薬はＵＳタイプ及び／または
ＵＳサブタイプＥ型肝炎ウイルス抗体、ＵＳタイプ及び／またはＵＳサブタイプ
特異的ポリペプチド、またはＵＳタイプ及び／またはＵＳサブタイプＥ型肝炎ウ
イルスのゲノムの少なくとも一部を規定する核酸またはその相補的な核酸配列で
あり得ると考えられる。
【００６９】 ＩＩ−（ｉ） タンパク質ベースのアッセイ （ａ）マーカー抗体 ウイルスマーカーが当該患者の血流中を循環している抗−ＵＳタイプもしくは
抗−ＵＳサブタイプ特異的抗体（例えば、ＩｇＧまたはＩｇＭ）であるならば、
結合パートナーは前記マーカーに特異的に結合するエピトープを規定するポリペ
プチドであることが好ましいと考えられる。
【００７０】 試験サンプル中の抗−ＵＳタイプもしくは抗−ＵＳサブタイプＥ型肝炎ウイル
ス抗体の存在を検出するための好ましいプロトコルでは、前記プロトコルは、好
ましくは（ａ）少なくとも５個、より好ましくは少なくとも８個、更に好ましく
は少なくとも１５個、最も好ましくは少なくとも２５個の隣接アミノ酸残基を含
む免疫学的反応性のＵＳタイプもしくはＵＳサブタイプ特異的ポリペプチド鎖を
含み、抗体に結合し得る抗原を用意するステップ、（ｂ）抗体−抗原複合体を形
成し得る条件で前記抗原を試験サンプルとインキュベートするステップ、及び（
ｃ）前記複合体の存在を検出するステップを含む。
【００７１】 多くの各種ＵＳタイプもしくはＵＳサブタイプ特異的ポリペプチドが抗−ＵＳ
タイプもしくは抗−ＵＳサブタイプ抗体を検出するための結合パートナーとして
有用であり得ると考えられる。例えば、前記ポリペプチド鎖は、配列番号９１、
９２または９３により規定されるアミノ酸配列、或いは配列番号９１、９２また
は９３に示すポリペプチド鎖の好ましくは少なくとも５個、より好ましくは少な
くとも８個、更に好ましくは少なくとも１５個、最も好ましくは少なくとも２５
個の隣接アミノ酸残基を含み、ビルマ及びメキシコファミリーのメンバーの対応
アミノ酸配列と比較してユニークなアミノ酸配列を表すその免疫学的に反応性の
断片であり得ると考えられる。ビルマファミリー、すなわちビルマ様株は現在本
明細書中でＢ１、Ｂ２、Ｉ１、Ｉ２、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４及びＰ１と称する
株を含み、メキシコファミリーは現在株Ｍ１を含む。
【００７２】 結合パートナーは天然変異体を含めた配列番号９１、９２及び９３により規定
されるポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドであり得ると考えら
れる。本明細書中、配列番号９１により規定されるポリペプチドに関して用語「
天然変異体」は配列番号９１の残基１〜１６９８と少なくとも８４％、好ましく
は少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８９％、更に好ましくは少なく
とも９５％同一であるアミノ酸配列を意味すると解される。本明細書中、配列番
号９２により規定されるポリペプチドに関して用語「天然変異体」は配列番号９
２の残基１〜６６０と少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９５％、より好
ましくは少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を意味すると解される。本明
細書中、配列番号９３により規定されるポリペプチドに関して用語「天然変異体
」は配列番号９３の残基１〜１２２と少なくとも８５．４％、好ましくは少なく
とも８７．４％、より好ましくは少なくとも９０．４％、更に好ましくは少なく
とも９５％同一であるアミノ酸配列を意味すると解される。
【００７３】 更に、結合パートナーはＯＲＦ１配列の一部によりコードされるポリペプチド
であり得ると考えられる。ＯＲＦ１配列によりコードされるタンパク質の例には
、メチルトランスフェラーゼタンパク質、プロテアーゼタンパク質、Ｙドメイン
タンパク質、Ｘドメインタンパク質、ヘリカーゼタンパク質、超可変領域タンパ
ク質及びＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼタンパク質が含まれる。従って、有用
なメチルトランスフェラーゼタンパク質は配列番号９１の残基１〜２３１に対し
て好ましくは少なくとも９２．３％、より好ましくは少なくとも９４．３％、最
も好ましくは少なくとも９７．３％の同一性を有すると考えられる。また、有用
なプロテアーゼタンパク質は配列番号９１の残基４２６〜６９７に対して好まし
くは少なくとも７０．３％、より好ましくは少なくとも７２．３％、最も好まし
くは少なくとも７５．３％の同一性を有すると考えられる。また、有用なＹドメ
インタンパク質は配列番号９１の残基２０７〜４２４に対して好ましくは少なく
とも９４．６％、より好ましくは少なくとも９６．６％、最も好ましくは少なく
とも９９．６％の同一性を有すると考えられる。また、有用なＸドメインタンパ
ク質は配列番号９１の残基７８９〜９４７に対して好ましくは少なくとも８３．
４％、より好ましくは少なくとも８５．４％、最も好ましくは少なくとも８８．
４％の同一性を有すると考えられる。また、有用なヘリカーゼタンパク質は配列
番号９１の残基９６５〜１１９７に対して好ましくは少なくとも９２％、より好
ましくは少なくとも９４％、最も好ましくは少なくとも９３％の同一性を有する
と考えられる。また、有用な超可変領域タンパク質は配列番号９１の残基６９８
〜７８８に対して好ましくは少なくとも２８．７％、より好ましくは少なくとも
３０．７％、最も好ましくは少なくとも３３．７％の同一性を有すると考えられ
る。また、有用なＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼタンパク質は配列番号９１の
残基１２１２〜１６９８に対して好ましくは少なくとも８８．８％、より好まし
くは少なくとも９０．８％、最も好ましくは少なくとも９３．８％の同一性を有
すると考えられる。
【００７４】 更に、結合パートナーは配列番号１６６、１６７または１６８により規定され
るアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖、或いは配列番号１６６、１６７または
１６８に示すポリペプチド鎖の５個、好ましくは少なくとも８個、より好ましく
は少なくとも１５個、最も好ましくは少なくとも２５個の隣接アミノ酸残基を含
み、ビルマ及びメキシコファミリーのメンバーの対応アミノ酸配列と比較してユ
ニークなアミノ酸配列を表すその免疫学的に反応性の断片であり得ると考えられ
る。同様に、結合パートナーは天然変異体を含めた配列番号１６６、１６７及び
１６８からなる群から選択されるポリペプチドであり得ると考えられる。本明細
書中、配列番号１６６により規定されるポリペプチドに関して用語「天然変異体
」は配列番号１６６の残基１〜１７０８と少なくとも８３．９％、好ましくは少
なくとも８５．９％、より好ましくは少なくとも８８．９％、最も好ましくは少
なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を意味すると解される。本明細書中、配
列番号１６７により規定されるポリペプチドに関して用語「天然変異体」は配列
番号１６７の残基１〜６６０と少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９５％
、最も好ましくは少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を意味すると解され
る。本明細書中、配列番号１６８により規定されるポリペプチドに関して用語「
天然変異体」は配列番号１６８の残基１〜１２２と少なくとも８５．４％、好ま
しくは少なくとも８７．４％、より好ましくは少なくとも９０．４％、更に好ま
しくは少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を意味すると解される。
【００７５】 更に、結合パートナーは、例えばメチルトランスフェラーゼタンパク質、プロ
テアーゼタンパク質、Ｙドメインタンパク質、Ｘドメインタンパク質、ヘリカー
ゼタンパク質、超可変領域タンパク質及びＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼタン
パク質を含めたＨＥＶ ＵＳ−２ ＯＲＦ１の一部によりコードされるポリペプ
チドまたはその変異体であり得ると考えられる。従って、有用なメチルトランス
フェラーゼタンパク質は配列番号１６６の残基１〜２４０に対して好ましくは少
なくとも９２．７％、より好ましくは少なくとも９４．７％、最も好ましくは少
なくとも９７．７％の同一性を有すると考えられる。また、有用なプロテアーゼ
タンパク質は配列番号１６６の残基４３３〜７０６に対して好ましくは少なくと
も６９．６％、より好ましくは少なくとも７１．６％、最も好ましくは少なくと
も７４．６％の同一性を有すると考えられる。また、有用なＹドメインタンパク
質は配列番号１６６の残基２１６〜４３３に対して好ましくは少なくとも９４．
６％、より好ましくは少なくとも９６．６％、最も好ましくは少なくとも９９．
６％の同一性を有すると考えられる。また、有用なＸドメインタンパク質は配列
番号１６６の残基７９９〜９５７に対して好ましくは少なくとも８２．８％、よ
り好ましくは少なくとも８４．８％、最も好ましくは少なくとも８７．８％の同
一性を有すると考えられる。また、有用なヘリカーゼタンパク質は配列番号１６
６の残基９７５〜１２０７に対して好ましくは少なくとも９２．８％、より好ま
しくは少なくとも９４．８％、最も好ましくは少なくとも９７．８％の同一性を
有すると考えられる。また、有用な超可変領域タンパク質は配列番号１６６の残
基７０７〜７９８に対して好ましくは少なくとも２７％、より好ましくは少なく
とも２９％、最も好ましくは少なくとも３１％の同一性を有すると考えられる。
また、有用なＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼタンパク質は配列番号１６６の残
基１２２２〜１７０８に対して好ましくは少なくとも８８．７％、より好ましく
は少なくとも９０．７％、最も好ましくは少なくとも９３．７％の同一性を有す
ると考えられる。
【００７６】 ＵＳタイプまたはＵＳサブタイプ特異的エピトープの同定に関し、ＵＳタイプ
もしくはＵＳサブタイプＥ型肝炎ウイルスのゲノムの少なくとも一部を規定する
核酸配列及び／または該ゲノムの少なくとも一部によりコードされるアミノ酸配
列を求めている当業者は当業界で公知であり、十分に検討されている慣用方法を
用いて潜在的なエピトープをマップすることができると考えられる。所与の配列
中の潜在的なエピトープを同定する市販のソフトウェアパッケージを用いる以外
に、前記ゲノムによりコードされるアミノ酸配列を抗原サイトが既に解明されて
いるＨＥＶの他の株のゲノムによりコードされる配列と比較することにより潜在
的なエピトープを同定することが可能である。例えば、米国特許第５，６８６，
２３９号明細書、同第５，７４１，４９０号明細書及び同第５，７７０，６８９
号明細書を参照されたい。現在同定されているエピトープを図１に示し、ここに
は当業界で８−５（配列番号９３及び１６８）、４−２（配列番号９３及び１６
８の位置９０〜１２２）、ＳＧ３（配列番号１７５及び１７６）、３−２（配列
番号９２及び１６７の位置６１３〜６５４）及び３−２ｅ（配列番号９２及び１
６７の位置６１３〜６６０）と称するエピトープが含まれている。抗原指数の計
算方法はＪａｍｅｓｏｎ及びＷｏｌｆ（ＣＡＢＩＯＳ，４（１），１８１−１８
６（１９８８））に記載されている。
【００７７】 例えば、それぞれＥ型肝炎ゲノムのＯＲＦ２及びＯＲＦ３の一部によりコード
される興味深い２つのエピトープを以下に詳記し、３−２ｅ及び４−２と称する
。これらのエピトープは、ＨＥＶのビルマ株（以下、Ｂ３−２ｅ（配列番号１７
２）及びＢ４−２（配列番号１７１）と称する）及びＨＥＶのメキシコ株（以下
、Ｍ３−２ｅ（配列番号１７０）及びＭ４−２（配列番号１６９）と称する）で
同定された。アミノ酸配列比較に基づいて類似のエピトープがＨＥＶ ＵＳ−１
で同定され、これらを以下Ｕ３−２ｅ（配列番号１７４）及びＵ４−２（配列番
号１７３）と称する。同様にアミノ酸配列比較に基づいて類似のエピトープがＨ
ＥＶ ＵＳ−２で同定され、これらを以下ＵＳ−２ ３−３ｅ（配列番号２２３
）及びＵＳ−２ ４−２（配列番号２２４）と呼ぶ。
【００７８】 加えて、潜在的なエピトープは当業界で公知であり、文献に詳しく記載されて
いるスクリーニング方法を用いて同定され得る。例えば、ＨＥＶ ＵＳ−１また
はＨＥＶ ＵＳ−２ゲノムの全部または一部を規定する核酸配列に基づいて、発
現後エピトープを同定すべくスクリーニングにかけられ得る発現ライブラリーを
作成することが可能である。例えば、ＨＥＶ ＵＳ−１またはＨＥＶ ＵＳ−２
ゲノムの代表的な核酸断片をラムダ−ｇｔ１１発現ベクターにクローニングして
、ラムダ−ｇｔ１１ライブラリー（例えば、ｃＤＮＡライブラリー）を作成し得
る。次いで、このライブラリーを、ＨＥＶ ＵＳ−１またはＨＥＶ ＵＳ−２に
感染していると同定された患者から得た血清に特異的に結合し得るコード化エピ
トープについてスクリーニングする。例えば、Ｇｌｏｖｅｒ，「ＤＮＡクローニ
ング方法 実際的アプローチ(DNA Cloning Techniques, A Practical Approach)
」，ｐ．４９−７８，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９５年）発行を参照されたい。
通常、約１０６〜１０７ファージをスクリーニングし、これから陽性ファージを
同定し、精製し、次いでＨＥＶ ＵＳ−１またはＨＥＶ ＵＳ−２に感染してい
ると既に同定された患者から得た血清への結合の特異性について試験する。患者
からの血清または血漿中に存在する抗体に選択的に結合するファージを別の特性
評価のために選択する。一旦同定されたら、当該アミノ酸配列を当業界で公知で
あり、文献に詳しく記載されている一般的な組み換えＤＮＡ方法または一般的な
ペプチド合成方法を用いて大規模に産生させることができる。
【００７９】 （ｂ）マーカーポリペプチド マーカーがＵＳタイプもしくはＵＳサブタイプウイルスまたはその特異的ポリ
ペプチドであるならば、本発明を実施するのに有用な結合パートナーは前記ウイ
ルスまたはマーカーポリペプチド上のエピトープに結合する抗体（例えば、ポリ
クローナルまたはモノクローナル抗体）であることが好ましいと考えられる。前
記結合パートナーを検出可能部分で標識しても固体支持体上に固定化してもよい
。特に、この実施態様を実施する際に有用な抗体は、ビルマ及びメキシコファミ
リーのメンバー中に存在する対応アミノ酸配列に比してユニークなＵＳタイプも
しくはＵＳサブタイプ特異的ポリペプチド鎖に特異的に結合し得、前記ポリペプ
チド鎖は好ましくは少なくとも５個、より好ましくは８個、更に好ましくは少な
くとも１５個、最も好ましくは少なくとも２５個の隣接アミノ酸残基の長さを有
する。
【００８０】 本発明の上記実施態様を実施する際に有用な抗体は天然変異体を含めた配列番
号９１、９２及び９３からなる群から選択されるポリペプチド鎖に特異的に結合
し得、ビルマ及びメキシコファミリーのメンバーの対応配列に比して前記ポリペ
プチド鎖に対してより高い結合アフィニティーを有することが好ましい。本発明
を実施する際に有用な抗体は好ましくは配列番号１７３または１７５に示すアミ
ノ酸配列を含むポリペプチド鎖に特異的に結合し得ると考えられる。前記抗体は
更に、同一条件下で配列番号１６９または１７１に示すアミノ酸配列または配列
番号１７５に対応するビルマ及びメキシコ株中の領域に対して低いアフィニティ
ーを有し、最も好ましく結合しないとして特徴づけられる。また、本発明を実施
する際に有用な抗体は好ましくは配列番号１７４または１７６に示すアミノ酸配
列を含むポリペプチド鎖に特異的に結合し得ると考えられる。前記抗体は更に、
同一条件下で配列番号１７０または１７２に示すアミノ酸配列または配列番号１
７６に対応するビルマ及びメキシコ株中の領域に対して低いアフィニティーを有
し、最も好ましく結合しないとして特徴づけられる。
【００８１】 また、上記実施態様を実施する際に有用な抗体は天然変異体を含めた配列番号
１６６、１７７及び１６８からなる群から選択されるポリペプチド鎖に特異的に
結合し得、ビルマ及びメキシコファミリーのメンバーの対応配列に比して前記ポ
リペプチド鎖に対してより高い結合アフィニティーを有することが好ましいと考
えられる。本発明を実施する際に有用な抗体は好ましくは配列番号２２３に示す
アミノ酸配列を含むポリペプチド鎖に特異的に結合し得ると考えられる。前記抗
体は更に、同一条件下で配列番号１７０または１７２に示すアミノ酸配列に対し
て低いアフィニティーを有し、最も好ましく結合しないとして特徴づけられる。
また、本発明を実施する際に有用な抗体は好ましくは配列番号２２４に示すアミ
ノ酸配列を含むポリペプチド鎖に特異的に結合し得ると考えられる。前記抗体は
更に、同一条件下で配列番号１６９または１７１に示すアミノ酸配列に対して低
いアフィニティーを有し、最も好ましく結合しないとして特徴づけられる。
【００８２】 本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は個別にＵＳタイプもしくはＵ
Ｓサブタイプ特異的抗原を検出するために提供され得る。本発明で提供される抗
体（及びその抗原結合断片）の組合せも、ＵＳタイプもしくはＵＳサブタイプ特
異的抗原を分離するために異なる結合特異性を有する少なくとも２つの抗体を含
む混合物、すなわちカクテル中の成分として一緒に使用してもよい。
【００８３】 （ｃ）抗体作成 ＵＳタイプもしくはＵＳサブタイプＥ型肝炎ウイルスのＯＲＦ１、ＯＲＦ２及
び／またはＯＲＦ３の少なくとも一部を規定するヌクレオチド配列または該ＯＲ
Ｆ１、ＯＲＦ２及び／またはＯＲＦ３の少なくとも一部によりコードされるアミ
ノ酸配列を求めている当業者は、当業界で公知であり、文献に詳しく記載されて
いる方法を用いて特異的抗体を作成することができると考えられる。例えば、Ｐ
ｒａｃｔｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｂｕｔｔ，Ｎ．Ｒ．編，ニューヨー
クに所在のＭａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ（１９８４年）発行を参照されたい。簡
単に説明すると、単離した標的タンパク質を使用して異種宿主（例えば、マウス
、ブタ、ヤギまたは他の好適な哺乳動物）において抗体を産生する。好ましい抗
体は、標的タンパク質上のエピトープに対して特異的に結合し、好ましくは該エ
ピトープに対して１０５Ｍ−１以上、最も好ましくは１０７Ｍ−１以上の結合ア
フィニティーを有する抗体である。典型的には、標的タンパク質を、宿主中での
抗体産生を強化し得る適当なアジュバントと組合わせ、宿主に対して例えば腹腔
内投与により注射する。宿主免疫応答を刺激するのに適したアジュバントを使用
するのが有利であり得る。通常使用されるアジュバントはフロイント完全アジュ
バント（例えば、カリフォルニア州サンジェゴに所在のＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ
Ｃｏｒｐ．またはニューヨーク州グランドアイランドに所在のＧｉｂｃｏから市
販されている死滅乾燥させた微生物細胞を含むエマルション）である。複数回抗
原注射が望ましいときには、その後の注射に抗原と不完全アジュバント（例えば
、無細胞エマルション）の組合せを用いる。
【００８４】 ポリクローナル抗体は、当該タンパク質に対する抗体を含む血清を抽出するこ
とにより抗体産生宿主から単離され得る。モノクローナル抗体は、所望抗体を産
生する宿主細胞を単離し、前記細胞をミエローマ細胞と免疫分野で公知の一般的
な方法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：
４９５（１９７５）参照）を用いて融合し、標的タンパク質と特異的に反応し、
所望結合アフィニティーを有するハイブリッド細胞（ハイブリドーマ）について
スクリーニングすることにより作成され得る。
【００８５】 加えて、小ペプチドを使用するとき、その免疫原性は固体支持体にカップリン
グさせることにより強化され得ると考えられる。例えば、ポリペプチドのエピト
ープもしくは抗原領域または断片は比較的小さく、約８〜１０アミノ酸以下の長
さを有し得る。３アミノ酸ほどの小さい断片が抗原領域を特徴づけ得る。前記ポ
リペプチドは、当該ポリペプチドが折り畳まれると適正なエピトープを与えるが
抗原であるには非常に小さいときにはポリペプチドは好適な担体分子に結合され
得る。
【００８６】 前記使用のための好ましい結合試薬及び方法は当業者で公知であり、それには
Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）
及びスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シロヘキサン−１−カルボ
キシレート（ＳＭＣＣ）が含まれるが、これらに限定されない。更に、スルフヒ
ドリル基を結合するポリペプチドはシステイン残基を添加することにより修飾さ
れ得る。前記試薬により、試薬と１つのタンパク質上のペプチドシステイン残基
の間にジスルフィド結合及びリシン上のイプシロンアミノを介してアミド結合が
形成され、または他の遊離アミノ基が形成される。いろいろなジスルフィド／ア
ミド形成剤が公知である。他の二官能性カップリング剤はジスルフィド結合より
もむしろチオエステルを形成する。多くのチオエーテル形成剤が市販されており
、当業者に公知である。カルボキシル基は、スクシンイミドまたは１−ヒドロキ
シ−２−ニトロ−４−スルホン酸ナトリウムと混合することにより活性化され得
る。それ自体宿主にとって有害な抗体を産生しない担体も使用可能である。好適
な担体には、タンパク質、ポリサッカライド（例えば、ラテックス官能化セファ
ロース）、アガロース、セルロース、セルロースビーズ、高分子アミノ酸（例え
ば、ポリグルタミン酸）、ポリリシン及び非酸コポリマー及び不活性ウイルス粒
子が含まれる。タンパク質基質の例には、血清アルブミン、キーホールリンペッ
トヘモシアニン、免疫グロブリン分子、チログロブリン、オボアルブミン、破傷
風トキソイド及び当業者に公知の別のタンパク質が含まれる。
【００８７】 加えて、好ましいエピトープに対する結合アフィニティーを高めるために結合
ドメインのアミノ酸配列が操作されている生合成した抗体結合ドメインも本発明
を実施するのに有用であり得ると考えられる。この製造の詳細説明は、例えばＰ
ｒａｃｔｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｂｕｔｔ，Ｗ．Ｒ．編，ニューヨー
クに所在のＭａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ（１９８４年）発行に見つけられ得る。
場合により、一価抗体断片（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ’断片）が利用され得
る。更に、例えば米国特許第５，０９１，５１３号明細書及び同第５，１３２，
４０５号明細書に記載されているように、１）非共役結合またはジスルフィド結
合した合成ＶＨ及びＶＬダイマー、２）共役結合したＶＨ−ＶＬ一本鎖抗体結合
サイト、３）個別のＶＨまたはＶＬドメイン、または４）一本鎖結合サイトを含
む遺伝子工学処理した生合成抗体結合サイトも利用され得る。
【００８８】 ＵＳタイプもしくはＵＳサブタイプＥ型肝炎ウイルスエピトープに結合する無
傷の抗体（例えば、モノクローナルまたはポリクローナル抗体）、抗体断片また
は生合成抗体結合サイトは診断及び予防分野で有用であり、受動免疫治療におい
ても有用である。
【００８９】 （ｄ）アッセイフォーマット 抗−ＵＳタイプもしくは抗−ＵＳサブタイプＥ型肝炎ウイルス特異的抗体また
はＵＳタイプもしくはＵＳサブタイプＥ型肝炎特異的エピトープに対する抗体を
含む血清と免疫学的に反応するポリペプチドが当該試験サンプル中の前記ウイル
スの存在を検出するためのイムノアッセイにおいて有用であると考えられる。更
に、サンプル中のＵＳタイプもしくはＵＳサブタイプＥ型肝炎ウイルスの存在は
当業界で公知であり、文献に詳しく記載されている広範囲のイムノアッセイ方法
、例えば直接アッセイ、サンドイッチアッセイ及び／または競合アッセイを用い
て検出され得ると考えられる。各種の好ましいアッセイフォーマットを以下に詳
記する。
【００９０】 １つの好ましいフォーマットでは、アッセイはサンドイッチフォーマットを使
用する。サンドイッチイムノアッセイは、良好な検出限界を有する標識が使用さ
れるならば通常高特異性且つ非常に感受性である。免疫学的アッセイ設計、理論
及びプロトコルの詳しい説明は、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，
Ｂｕｔｔ，Ｗ．Ｒ．編，ニューヨークに所在のＭａｒｃｅｌｌ Ｄｅｌｌｅｒ（
１９８４年）発行を含めた多数の文献に見つけることができる。
【００９１】 １つのタイプのサンドイッチフォーマットでは、固体支持体上に固定化されて
おり、抗−ＵＳタイプもしくは抗−ＵＳサブタイプＥ型肝炎ウイルス抗体（マー
カー）と免疫学的に反応するポリペプチド（結合パートナー）をＵＳタイプもし
くはＵＳサブタイプＥ型肝炎ウイルスに感染していると疑われる患者からの試験
サンプルと接触させて混合物を形成する。次いで、この混合物をポリペプチド／
抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件でインキュベートする。次いで、
試験サンプル抗体に特異的に結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体
またはその断片を含み、検出可能な部分で標識したインジケータ試薬を前記の抗
原／抗体複合体と接触させて、第２混合物を形成する。次いで、この第２混合物
を抗原／抗体／抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件でインキュベート
する。試験サンプル中に存在するかもしれない抗−ＵＳタイプもしくは抗−ＵＳ
サブタイプＥ型肝炎ウイルス抗体の存在は、固体支持体に固定化した検出可能な
部分の存在を検出することにより調べられる。試験サンブル中に存在する抗体の
量は発生する信号に比例する。ビオチンとアンチビオチン、ビオチンとアビジン
、ビオチンとストレプトアビジン等を使用すると、本明細書に記載のアッセイに
おいて発生した信号が強化され得る。
【００９２】 上記アッセイの別のフォーマットでは、免疫学的に反応性のポリペプチドを固
体支持体に間接的に、すなわち該ポリペプチドに特異的に結合するモノクローナ
ルまたはポリクローナル抗体またはその断片を介して固定化し得る。或いは、別
のフォーマットでは、試験サンプル抗体、すなわちマーカー抗体（例えば、Ｉｇ
ＧまたはＩｇＭ）に特異的に結合し、固体支持体上に固定化されている抗体また
はその抗原結合断片が抗体／抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件で試
験サンプルと接触するようにアッセイ成分を逆配置で使用してもよい。次いで、
インジケーター試薬、例えば捕捉された試験サンプル抗体と免疫学的に反応し且
つ検出可能部分で標識したＵＳタイプもしくはＵＳサブタイプＥ型肝炎ポリペプ
チドを抗体／抗体／抗原複合体を形成し得るのに十分な時間及び条件で前記抗体
／抗体複合体とインキュベートして、第２混合物を形成する。上記したように、
固体支持体上に固定化されている捕捉抗体またはその抗原結合断片により捕捉さ
れる、試験サンプル中に存在するかもしれない抗体の存在は検出可能な部分から
発生する測定可能な信号を検出することにより調べられる。
【００９３】 上記したサンドイッチアッセイも、試験サンプル中のＵＳタイプもしくはＵＳ
サブタイプＥ型肝炎ウイルスまたはその免疫学的に反応性のポリペプチドの存在
を上記アッセイフォーマットのルーチン改変により調べるために使用され得ると
考えられる。前記改変は当業者に公知であると考えられる。
【００９４】 上記のサンドイッチアッセイに加えて、本発明の実施において競合アッセイを
も使用され得ると考えられる。このフォーマットでは、ＵＳタイプもしくはＵＳ
サブタイプＥ型肝炎特異的ポリペプチド鎖に特異的に結合する少なくとも２つの
抗体（好ましくは、モノクローナル抗体）の１つまたはその組合せをＵＳタイプ
もしくはＵＳサブタイプ特異的タンパク質に対する抗体を検出するために競合プ
ローブとして使用し得る。例えば、マーカーに対する結合パートナーとして作用
する第１のＨＥＶ ＵＳ−１特異的ポリペプチド鎖（例えば、本明細書に記載さ
れているポリペプチドの１つ）を固体支持体上に固定化する。次いで、ＨＥＶ
ＵＳ−１抗原に対する抗体を含んでいると疑われる試験サンプルを、固体支持体
上に固定化された抗原／抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件で固体支
持体及び例えば固定化されているＨＥＶ ＵＳ−１特異的ポリペプチド鎖に結合
し且つ検出可能部分で標識した単離抗−ＵＳタイプもしくは抗−ＵＳサブタイプ
抗体を含むインジケータ試薬とインキュベートする。マーカー固体が試験サンプ
ル中に存在するならば、前記マーカー抗体は固定化ポリペプチドに結合するため
に標識インジケータ試薬と競合する。試験サンプル中に存在するマーカー抗体の
量が増加すると、固定化ポリペプチドに結合する標識インジケータ試薬の量は減
少する。固相に結合するインジケータ試薬の量の減少は定量化され得る。非Ａ、
非Ｂ、非Ｃ、非Ｄ、非Ｅ肝炎が陰性であると確認された試験サンプルから発生し
た信号と比較して信号が低下していると認められたならば、試験サンプル中の抗
−ＨＥＶ ＵＳ−１抗体の存在が明らかとなる。試験サンプル中のＵＳタイプも
しくはＵＳサブタイプクラスに入る他のＥ型肝炎ウイルスの存在を同定するため
に同様のプロトコルを使用してもよいと考えられる。
【００９５】 更に別の検出方法では、本発明の抗体は固定組織切片及び固定細胞中のＵＳタ
イプもしくはＵＳサブタイプＥ型肝炎特異的抗原の存在を免疫組織化学的分析に
より検出するために使用され得る。抗体が検出可能部分（例えば、フルオレセイ
ン、金コロイド、ホースラディシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ
等）で直接標識されているかまたは例えば検出可能部分で標識した第２抗体を用
いて間接的に標識されている細胞化学分析も本発明を実施する際に使用され得る
。
【００９６】 別のアッセイフォーマットでは、抗体及び／または抗原の存在は例えば欧州特
許出願公開第０ ４７３ ０６５号明細書に記載されているような同時アッセイ
を用いて検出され得る。例えば、試験サンプルを、（ｉ）固体支持体上に固定化
した第１アナライトに対して特異的な第１結合メンバーを含む第１アナライトに
対する捕捉試薬及び（ｉｉ）第２の別の固体支持体上に固定化した第２アナライ
トに対する第１結合メンバーを含む第２アナライトに対する捕捉試薬と同時に接
触させて混合物を生成する。次いで、この混合物を捕捉試薬／第１アナライト複
合体及び捕捉試薬／第２アナライト複合体を形成するのに十分な時間及び条件で
インキュベートする。こうして形成した複合体を、検出可能部分で標識した第１
アナライトに対して特異的な結合対のメンバーを含む第１インジケータ試薬及び
検出可能部分で標識した第２アナライトに対して特異的な結合対のメンバーを含
む第２インジケータ試薬と接触させて第２混合物を生成する。次いで、この第２
混合物を捕捉試薬／第１アナライト／第１インジケータ試薬複合体及び捕捉試薬
／第２アナライト／第２インジケータ試薬複合体を形成するのに十分な時間及び
条件でインキュベートする。１つ以上のアナライトの存在を、固相の一方または
両方上に形成された複合体により発生する信号を試験サンプル中に存在する１つ
以上のアナライトの存在の指標として検出することにより調べる。
【００９７】 他のアッセイシステムでは、特定抗体とウイルスタンパク質（例えば、ペプチ
ド等）の接触によりウイルスゲノム（または、その断片）を包囲するＵＳタイプ
もしくはＵＳサブタイプＥ型肝炎ウイルス粒子またはサブウイルス粒子に特異的
に結合する抗体が使用され得る。次いで、捕捉された粒子は、ウイルスゲノムが
試験サンプル中に存在するかを調べるためにＬＣＲまたはＰＣＲのような方法に
より分析され得る。抗原捕捉増幅法を用いる利点は、ウイルスゲノムを試験サン
プル中の他の分子から特異的抗体を用いて分離し得ることである。前記方法は１
９９５年９月２０日に公開された欧州特許出願公開第０ ６７２ １７６号明細
書に記載されている。
【００９８】 一般的に、イムノアッセイ設計には、非特異的相互作用の産物とは容易に区別
され得る複合体を形成するように標的タンパク質に対して十分高い結合特異性を
有する抗体（例えば、モノクローナルまたはポリクローナル抗体、またはその抗
原結合断片）の作成が含まれる。通常、抗体結合特異性が高ければ、より低濃度
の標的が検出され得る。
【００９９】 本発明のポリペプチド及び抗体試薬は、ＵＳタイプもしくはＵＳサブタイプＥ
型肝炎ウイルスに結合する抗原形態または抗体の存在を検出するための本明細書
に記載のアッセイを実施するために使用され得る。イムノアッセイでの使用に加
えて、上記ポリペプチドは単独で、または実験動物において抗体を産生するため
に使用されるアジュバンドと組み合わせて、または患者を予防または治療目的で
免疫化するためのワクチンとして医薬的に許容され得る担体と組み合わせて使用
され得ると考えられる。また、イムノアッセイでの使用に加えて、本発明の抗体
は例えば患者を治療または予防目的で受動免疫化するために使用される医薬的に
許容され得る担体と組み合わせて使用され得ると考えられる。後者の使用は以下
のセクション（ＩＩＩ）に詳記する。本発明の抗体は、治療または他の類似の用
途で使用されるキメラ抗体の作成のためにも使用可能である。
【０１００】 適当な試薬を含有する免疫診断に好適なキットは、例えば当該特定エピトープ
を規定するポリペプチドまたは前記エピトープに結合する抗体を含めた適当な材
料を好適な容器中に包装することにより構成され得る。更に、前記キットは場合
により追加の試薬、例えば適当な検出システム及び緩衝液を含み得る。
【０１０１】 更に、前記抗体（好ましくは、モノクローナル抗体）をＣＮＢｒ活性化セファ
ロースに類似のマトリックスに結合させ、例えば組み換え及び天然のウイルス抗
原及びタンパク質を精製するために細胞培養物または生体組織（例えば、血液及
び肝臓）由来のＵＳタイプもしくはＵＳサブタイプＥ型肝炎タンパク質をアフィ
ニティー精製するために使用してもよい。
【０１０２】 ＩＩ−（ｉｉ） 核酸ベースのアッセイ マーカーがＵＳタイプもしくはＵＳサブタイプ特異的ヌクレオチド配列である
ならば、結合パートナーはマーカー配列または該配列に隣接する領域に特異的に
ハイブリダイズするヌクレオチド配列またはそのアナログであることが好ましい
と考えられる。本明細書に記載されているユニークなポリヌクレオチド配列に基
づいて、結合パートナーは、ビルマ及びメキシコファミリーの対応ヌクレオチド
配列と比較してユニークなＵＳタイプもしくはＵＳサブタイプ特異的ヌクレオチ
ド配列に相補的なヌクレオチド配列、例えばＵＳタイプもしくはＵＳサブタイプ
Ｅ型肝炎ウイルスのＯＲＦ１配列、ＯＲＦ２配列またはＯＲＦ３配列の少なくと
も一部に相補的なヌクレオチド配列またはそのアナログであり得ると考えられる
。更に、Ｅ型肝炎のビルマ及びメキシコファミリーのゲノムに比してユニークな
ＵＳタイプ及びＵＳサブタイプＥ型肝炎ウイルスのゲノムの非コーディング部分
が本発明の実施において有用なマーカーを提供すると考えられる。ヌクレオチド
配列（プライマーまたはプローブ）はハイブリダイゼーション及び／または増幅
によりＵＳタイプ及びＵＳサブタイプ特異的配列を検出できる長さを有し、当業
界で公知であり、十分検討されている自動化オリゴヌクレオチド合成法を含めた
ルーチンな標準方法を用いて製造され得る。ＨＥＶ ＵＳ−１ゲノムのユニーク
部分の補体が満足である。プローブとして使用するには完全相補性が望ましいが
、断片の長さを長くするので完全相補性が不必要な場合がある。
【０１０３】 同様に、結合パートナーは、標的配列に特異的にハイブリダイズし得、好まし
くは８〜１００ヌクレオチド、より好ましくは１０〜７５ヌクレオチド、最も好
ましくは１５〜５０ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド配列（例えば、ＤＮＡ
、ＲＮＡまたはＰＮＡ配列）であり得ると考えられる。標的配列とは、ＵＳタイ
プもしくはＵＳサブタイプＥ型肝炎ウイルスのゲノムの少なくとも一部を規定す
るヌクレオチド配列または該配列に相補的な配列であり得ると解される。ハイブ
リダイゼーション反応のために選択される特定の緊縮条件が結合パートナー核酸
配列と標的配列の相補度、結合配列の組成及び結合配列の長さに大いに依存する
ことは当業界で公知である。緊縮条件を決めるパラメーターは当業者に公知であ
るかまたは一般文献（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら，「分子クローニング：実験
室マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)」，ニューヨークに所
在のＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）発行参
照）から容易に確認されると認められる。
【０１０４】 本発明で提供される配列は、試験サンプル中の核酸を検出するためのアッセイ
において使用され得るプローブを作成するために使用され得る。前記プローブは
当該ポリヌクレオチドの保存ヌクレオチド領域から、または当該ポリヌクレオチ
ドの非保存ヌクレオチド領域から設計され得る。アッセイにおいて最適なプロー
ブの設計は日常作業者の技量の範囲内である。通常、核酸プローブは最大特異性
を所望するときには非保存またはユニーク領域から作成され、核酸プローブは例
えば多遺伝子ファミリーの各種メンバーまたはマウスやヒトのような関連種に密
接に関連するヌクレオチド領域をアッセイする場合には保存領域から作成される
。
【０１０５】 １つの好ましいプロトコルは、試験サンプル中のＵＳタイプもしくはＵＳサブ
タイプＥ型肝炎ウイルスの存在または非存在の検出方法を提供する。この方法は
、（ａ）ＵＳタイプもしくはＵＳサブタイプ単離物由来の少なくとも１５隣接ヌ
クレオチドを含み、Ｅ型肝炎ビルマ及びメキシコファミリーの他のメンバー中に
は存在しないポリヌクレオチド配列を含むプローブを用意するステップ、（ｂ）
前記プローブと試験サンプル中に存在する非ＵＳタイプ及び非ＵＳサブタイプ肝
炎ポリヌクレオチド配列との間で実質的にポリヌクレオチド二重らせんを形成せ
ずに、プローブとその補体との間でポリヌクレオチド二重らせんを形成し得る条
件下で試験サンプルをプローブと接触させるステップ、及び（ｃ）前記プローブ
を含むポリヌクレオチド二重らせんの存在を検出するステップを含む。
【０１０６】 好ましいヌクレオチド配列は、配列番号８９のヌクレオチド残基１〜５０９７
またはその天然に存在する配列変異体を含み得る。この配列に関して、用語「天
然に存在する配列変異体」には配列番号８９の残基１〜５０９７と少なくとも７
３．３％、好ましくは少なくとも７５．３％、より好ましくは少なくとも７８．
３％、最も好ましくは少なくとも９５％同一の核酸配列が含まれる。他の好まし
いマーカーまたは結合パートナー配列は、配列番号８９のヌクレオチド残基５１
３２〜７１１４またはその天然に存在する配列変異体を含み得る。この配列に関
して、用語「天然に存在する配列変異体」には配列番号８９の残基５１３２〜７
１１４と少なくとも８７．４％、好ましくは少なくとも８９．４％、より好まし
くは少なくとも９２．４％、最も好ましくは少なくとも９５％同一の核酸配列が
含まれる。他の好ましいマーカーまたは結合パートナー配列は、配列番号８９の
ヌクレオチド残基５０９４〜５４６２またはその天然に存在する配列変異体を含
み得る。この配列に関して、用語「天然に存在する配列変異体」には配列番号８
９の残基５０９４〜５４６２と少なくとも８８．３％、好ましくは少なくとも９
０．３％、より好ましくは少なくとも９３．３％、最も好ましくは少なくとも９
５％同一の核酸配列が含まれる。
【０１０７】 更に、有用なヌクレオチド配列には、例えばメチルトランスフェラーゼタンパ
ク質、プロテアーゼタンパク質、Ｙドメインタンパク質、Ｘドメインタンパク質
、ヘリカーゼタンパク質、超可変領域タンパク質及びＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメ
ラーゼタンパク質からなる群から選択されるタンパク質またはその変異体をコー
ドするＯＲＦ１配列の一部が含まれる得ると考えられる。従って、ＯＲＦ１の有
用なメチルトランスフェラーゼコーディング領域は配列番号８９の残基１〜６９
３に対して好ましくは少なくとも７８％、より好ましくは少なくとも８０％、最
も好ましくは少なくとも８３％の同一性を有すると考えられる。また、ＯＲＦ１
の有用なプロテアーゼコーディング領域は配列番号８９の残基１２７０〜２０９
１に対して好ましくは少なくとも６６．１％、より好ましくは少なくとも６８．
１％、最も好ましくは少なくとも７１．１％の同一性を有すると考えられる。ま
た、ＯＲＦ１の有用なＹドメインコーディング領域は配列番号８９の残基６１９
〜１２７２に対して好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８
２％、最も好ましくは少なくとも８５％の同一性を有すると考えられる。また、
ＯＲＦ１の有用なＸドメインコーディング領域は配列番号８９の残基２３６５〜
２８４１に対して好ましくは少なくとも７３．５％、より好ましくは少なくとも
７５．５％、最も好ましくは少なくとも７８．５％の同一性を有すると考えられ
る。また、ＯＲＦ１の有用なヘリカーゼコーディング領域は配列番号８９の残基
２８９３〜３５９１に対して好ましくは少なくとも７７．５％、より好ましくは
少なくとも７９．５％、最も好ましくは少なくとも８１．５％の同一性を有する
と考えられる。また、ＯＲＦ１の有用な超可変領域コーディング領域は配列番号
８９の残基２０９２〜２３６４に対して好ましくは少なくとも５１．２％、より
好ましくは少なくとも５３．２％、最も好ましくは少なくとも５６．２％の同一
性を有すると考えられる。また、ＯＲＦ１の有用なＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラ
ーゼコーディング領域は配列番号８９の残基３６３４〜５０９４に対して好まし
くは少なくとも７６．３％、より好ましくは少なくとも７８．３％、最も好まし
くは少なくとも８１．３％の同一性を有すると考えられる。
【０１０８】 好ましいヌクレオチド配列は、配列番号１６４のヌクレオチド残基３６〜５１
６２またはその天然に存在する配列変異体を含み得る。この配列に関して、用語
「天然に存在する配列変異体」には配列番号１６４の残基３６〜５１６２と少な
くとも７３．６％、好ましくは少なくとも７５．６％、より好ましくは少なくと
も７８．６％、最も好ましくは少なくとも９５％同一の核酸配列が含まれる。他
の好ましいマーカーまたは結合パートナー配列は、配列番号１６４のヌクレオチ
ド残基５１９７〜７１７９またはその天然に存在する配列変異体を含み得る。こ
の配列に関して、用語「天然に存在する配列変異体」には配列番号１６４の残基
５１９７〜７１７９と少なくとも８０．７％、好ましくは少なくとも８２．７％
、より好ましくは少なくとも８５．７％、最も好ましくは少なくとも９５％同一
の核酸配列が含まれる。他の好ましいマーカーまたは結合パートナー配列は、配
列番号１６４のヌクレオチド残基５１５９〜５５２７またはその天然に存在する
配列変異体を含み得る。この配列に関して、用語「天然に存在する配列変異体」
には配列番号１６４の残基５１５９〜５５２７と少なくとも８７．９％、好まし
くは少なくとも８９．９％、より好ましくは少なくとも９２．９％、最も好まし
くは少なくとも９５％同一の核酸配列が含まれる。
【０１０９】 更に、有用なＨＥＶ ＵＳ−２ヌクレオチド配列には、例えばメチルトランス
フェラーゼタンパク質、プロテアーゼタンパク質、Ｙドメインタンパク質、Ｘド
メインタンパク質、ヘリカーゼタンパク質、超可変領域タンパク質及びＲＮＡ依
存性ＲＮＡポリメラーゼタンパク質からなる群から選択されるタンパク質または
その変異体の一部をコードするＯＲＦ１配列の一部が含まれる得ると考えられる
。従って、ＯＲＦ１の有用なメチルトランスフェラーゼコーディング領域は配列
番号１６４の残基３６〜７５５に対して好ましくは少なくとも７９．５％、より
好ましくは少なくとも８１．５％、最も好ましくは少なくとも８４．５％の同一
性を有すると考えられる。また、ＯＲＦ１の有用なプロテアーゼコーディング領
域は配列番号１６４の残基１３３２〜２１５３に対して好ましくは少なくとも６
６．１％、より好ましくは少なくとも６８．１％、最も好ましくは少なくとも７
１．１％の同一性を有すると考えられる。また、ＯＲＦ１の有用なＹドメインコ
ーディング領域は配列番号１６４の残基６８０〜１３３４に対して好ましくは少
なくとも８０．７％、より好ましくは少なくとも８２．７％、最も好ましくは少
なくとも８５．７％の同一性を有すると考えられる。また、ＯＲＦ１の有用なＸ
ドメインコーディング領域は配列番号１６４の残基２４３０〜２９０６に対して
好ましくは少なくとも７３．７％、より好ましくは少なくとも７５．７％、最も
好ましくは少なくとも７８．７％の同一性を有すると考えられる。また、ＯＲＦ
１の有用なヘリカーゼコーディング領域は配列番号１６４の残基２９５８〜３６
５６に対して好ましくは少なくとも７６．４％、より好ましくは少なくとも７８
．４％、最も好ましくは少なくとも８１．４％の同一性を有すると考えられる。
また、ＯＲＦ１の有用な超可変領域コーディング領域は配列番号１６４の残基２
１５４〜２４２９に対して好ましくは少なくとも５０．４％、より好ましくは少
なくとも５２．８％、最も好ましくは少なくとも５５．８％の同一性を有すると
考えられる。また、ＯＲＦ１の有用なＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼコーディ
ング領域は配列番号８９の残基３６９９〜５１５９に対して好ましくは少なくと
も７６．８％、より好ましくは少なくとも７８．８％、最も好ましくは少なくと
も８１．８％の同一性を有すると考えられる。
【０１１０】 他の有用なヌクレオチド配列は、配列番号９３、１６８、１７３、１７４、１
７５、１７６、２２３及び２２４からなる群から選択されるアミノ酸配列をコー
ドするヌクレオチド配列及び該配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。
【０１１１】 本発明で提供される核酸配列は、一般的な核酸ベースのアッセイ、例えば以下
に詳記するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及び／またはブロットハイブリダイ
ゼーション研究により試験サンプル中のＵＳタイプもしくはＵＳサブタイプＥ型
肝炎ウイルスの存在を調べるために使用され得ると考えられる。核酸ベースのア
ッセイでの使用に加えて、上記核酸配列はその後当該宿主細胞（例えば、天然痘
またはミコバクテリア）に形質転換またはトランスフェクトされ得るベクターに
統合され得ると考えられる。生じた宿主細胞は、その後医薬的に許容され得る担
体と組合わされ、例えば哺乳動物を特定のＵＳタイプもしくはＵＳサブタイプＥ
型肝炎ウイルスに対して予防または治療目的で免疫化するための組み換えワクチ
ンとして使用される。
【０１１２】 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は核酸またはその混合物中に含まれる所望の
核酸配列（標的）を増幅させる方法である。ＰＣＲでは、プライマー対は通常標
的核酸の相補鎖の外端でハイブリダイズするために過剰に使用される。プライマ
ーはそれぞれ、鋳型として標的核酸を用いてポリメラーゼ（例えば、熱安定性ポ
リメラーゼ）により延長される。延長産物は元の配列鎖から解離後それ自体標的
配列となる。その後、新しいプライマーをハイブリタイズし、ポリメラーゼによ
り延長するが、このサイクルは標的配列分子の数を等比的に増加させるために繰
り返される。ＰＣＲは米国特許第４，６８３，１９５号明細書及び同第４，６８
３，２０２号明細書に開示されている。
【０１１３】 リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）は核酸増幅の代替方法である。ＬＣＲでは、２つ
の一次（第１及び第２）プローブ及び２つの二次（第３及び第４）プローブを含
むプローブ対を使用し、前記プローブをすべて標的核酸配列に対してモル過剰で
使用する。第１プローブは標的鎖の第１セグメントにハイブリダイズし、第２プ
ローブは標的鎖の第２セグメントにハイブリダイズするが、前記の第１及び第２
セグメントは一次プローブが５’ホスフェート−３’−ヒドロキシ関係で相互に
隣接するように且つリガーゼが２つのプローブを共役的に融合するかまたは連結
して融合産物とし得るように隣接している。加えて、第３（二次）プローブは第
１プローブの一部にハイブリダイズし得、第４（二次）プローブは同様に隣接し
て第２プローブの一部にハイブリダイズし得る。一旦一次プローブの連結鎖が標
的鎖から分離したら、該連結鎖は第３及び第４プローブにハイブリダイズし、連
結して相補的二次連結産物を形成する。連結産物は標的またはその補体と機能的
に同等である。ハイブリダイゼーション及び連結のサイクルを繰り返すことによ
り、標的配列は増幅される。この技術は１９８９年６月１６日に公開されたＫ．
Ｂｅｃｋｍａｎの欧州特許出願公開第３２０ ３０８号明細書及び１９９１年７
月３１日に公開されたＫ．Ｂｅｃｋｍａｎの欧州特許出願公開第４３９ １８２
号明細書により詳しく記載されている。
【０１１４】 ｍＲＮＡを増幅させるために、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した後ポリメラー
ゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）すること；米国特許第５，３２２，７７０号明細書
に記載されているように両ステップに対して１つの酵素を使用すること；または
Ｒ．Ｌ．Ｍａｒｓｈａｌｌら，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃ
ａｔｉｏｎｓ，４：８０−８４（１９９４）に記載されているようにｍＲＮＡを
ｃＤＮＡに逆転写した後非対称ギャップリガーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＡＧＬＣＲ）
を行うことも本発明の範囲内である。
【０１１５】 本発明において使用可能な他の公知の増幅方法には、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：１８７４−１８７８（１９９０）及びＮａｔｕ
ｒｅ，３５０（Ｎｏ．６３１３）：９１−９２（１９９１）に記載されている所
謂“ＮＡＳＢＡ”または“３ＳＲ”；欧州特許出願公開第４５４４６４０号明細
書に記載されているＱ−ベーター増幅；Ｇ．Ｔ．Ｗａｌｋｅｒら，Ｃｌｉｎ．Ｃ
ｈｅｍ．，４２：９−１３（１９９６）及び欧州特許出願公開第６８４３１５号
明細書に記載されている鎖置換増幅；及び国際特許出願公開第９３２２４６１号
パンフレットに記載されている標的媒介増幅が含まれるが、これらに限定されな
い。
【０１１６】 １つの実施態様で、本発明は包括的に、標的ポリヌクレオチド配列を含んでい
ると疑われる試験サンプルを増幅プライマーを含む増幅反応試薬及びアンプリコ
ン配列の内部領域とハイブリダイズし得る検出プローブと接触させるステップを
含む。本発明の方法に従って使用されるプローブ及びプライマーは、前記プロー
ブが１つのタイプの標識で標識され、プライマーが他のタイプの標識で標識され
るように捕捉及び検出標識で標識される。また、プライマー及びプローブは、プ
ローブ配列がプライマー配列よりも低い融点を有するように選択される。増幅試
薬、検出試薬及び試験サンプルを増幅条件下に置き、こうすると標的配列の存在
下で標的配列（アンプリコン）のコピーが作成される。その後、二本鎖アンプリ
コンを熱変性すると、一本鎖アンプリコンメンバーが形成される。一本鎖アンプ
リコンメンバーが形成されたら、混合物を冷却して、プローブと一本鎖アンプリ
コンメンバーの間で複合体を形成する。
【０１１７】 プローブ／一本鎖アンプリコンメンバーハイブリッドを形成した後、前記ハイ
ブリッドを検出する。標準の異種アッセイフォーマットがプライマー及びプロー
ブ上に存在する検出標識及び捕捉標識を用いてハイブリッドを検出するのに適し
ている。前記ハイブリッドは捕捉標識により固相試薬に結合され得、検出標識に
より検出され得る。検出標識が直接検出可能な場合には、固相上のハイブリッド
の存在は、所要により標識により検出可能な信号を生じさせ、その信号を検出す
ることにより検出され得る。標識が直接検出可能でない場合には、捕捉されたハ
イブリッドを通常直接検出可能な標識に結合した結合メンバーを含むコンジュゲ
ートと接触させ得る。前記コンジュゲートは複合体と結合するようになり、複合
体上に存在するコンジュゲートは直接検出可能な標識で検出され得る。よって、
固相試薬上のハイブリッドの存在が調べられ得る。当業者は、ハイブリダイズさ
れていないアンプリコンまたはプローブ及び非結合コンジュゲートを除去するた
めに洗浄ステップを使用し得ることを認識している。
【０１１８】 標的配列を検出するための試験サンプルは当業者に公知の方法を用いて、例え
ばサンプルを採取し、所要により該サンプル中に含まれる細胞を破壊して標的核
酸を放出することにより調製され得る。この方法でＰＣＲを使用する場合、標的
配列の末端は通常公知である。ＬＣＲまたはその修正法が好ましい方法で使用さ
れる場合には、全標的配列は通常公知である。通常、標的配列はＲＮＡまたはＤ
ＮＡのような核酸配列である。
【０１１９】 プライマー及びプローブの長さは変更可能であるが、プローブ配列はプライマ
ー配列よりも低い融点を有するように選択される。よって、プライマー配列は通
常プローブ配列よりも長い。通常、プライマー配列は２０〜５０ヌクレオチド長
、より一般的には２０〜３０ヌクレオチド長の範囲である。好ましいプライマー
配列は、通常２０ヌクレオチド以上の長さを有する。一般的なプローブは１０〜
２５ヌクレオチド長、より一般的には１５〜２０ヌクレオチド長の範囲である。
好ましいプローブ配列は一般的には１５ヌクレオチド以上の長さを有する。
【０１２０】 或いは、プローブを“ネステッドＰＣＲ”として公知の方法を介して標的配列
を増幅する際に関与し得る。ネステッドＰＣＲでは、プローブは増幅に通常使用
される第１及び第２プライマーと同様の特性（例えば、長さ、融点等）を有し、
そのまま増幅反応においてプライマーとして作用し得る。通常、ネステッドＰＣ
Ｒでは、第１対のプライマー（Ｐ１及びＰ２）を使用して一次延長産物を形成す
る。一次プライマーの１つ（例えば、Ｐ１）は場合により（第１反応性対のメン
バーに結合した）捕捉プライマーであり得、他方の一次プライマー（Ｐ２）はそ
うではない。その後、５’末端に捕捉タイプの標識（例えば、第２反応対のメン
バー）または検出標識を有し得るプローブ（Ｐ１’）またはプローブ（Ｐ２’）
を用いて二次延長産物を形成する。前記プローブは、溶解しているならばＰ１及
びＰ２の３’末端がハイブリダイズするであろうサイトの近くまたは該サイトに
隣接する鋳型上のサイトに相補性であり、該サイトでハイブリダイズする。或い
は、Ｐ１プライマーとプローブ（Ｐ２’）またはＰ２プライマーとプローブ（Ｐ １’ ）を用いて二次延長産物を形成してもよい（“ヘミネステッドＰＣＲ”とも
称することもある）。よって、標識プライマー／プローブ組により、一次延長産
物よりも短い二次延長産物が生成する。更に、この二次産物はそのサイズに基づ
いてまたはその標識末端により（当業者に公知の検出方法により）検出され得る
。この方法では、プローブ及びプライマーは通常均等濃度で使用される。
【０１２１】 プライマー及びプローブを合成するための各種方法は当業界で公知である。ま
た、標識をプライマーまたはプローブに結合させる方法も当業界で公知である。
例えば、一般的なヌクレオチドホスホルアミダイト化学及びＡｐｐｌｉｅｄ Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州フォスターシティーに所在）
、ＤｕＰｏｎｔ（デラウェア州ウィルミントンに所在）またはＭｉｌｌｉｇｅｎ
（マサチューセッツ州ベッドフォードに所在）から入手可能な器具を用いて所望
の核酸プライマーまたはプローブを合成することは日常的に行われている実験の
範囲である。本発明のプライマーまたはプローブのようなオリゴヌクレオチドを
標識するための多くの方法が記載されている。Ｅｎｚｏ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌ（ニューヨーク州ニューヨーク）及びＣｌｏｎｔｅｃｈ（カリフォルニア州パ
ロアルト）はプローブ標識法を記載し、市販している。例えば、一級アミンは３
’−Ａｍｉｎｅ−ＯＮ ＣＰＧ（登録商標）（カリフォルニア州パロアルトに所
在のＣｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて３’オリゴ末端に結合され得る。同様に、一級
アミンはＡｍｉｎｏｍｏｄｉｆｉｅｒ ＩＩ（登録商標）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）
を用いて５’オリゴ末端に結合させ得る。前記アミンは慣用の活性化及び結合化
学を用いて各種ハプテンに反応させ得る。更に、１９９２年６月２５日に公開さ
れた国際特許出願公開第９２／１０５０６号パンフレット及び１９９４年３月１
日に米国特許第５，２９０，９２５号明細書は、それぞれ５’及び３’末端でプ
ローブを標識する方法を教示している。更に、１９９２年７月９日に公開された
国際特許出願公開第９２／１１３８８号パンフレットは、末端でプローブを標識
する方法を教示している。オリゴヌクレオチドを標識するための１つの公知の方
法では、標識−ホスホルアミダイト試薬を作成し、この試薬をその合成中にオリ
ゴヌクレオチドに標識を添加するために使用する。例えば、Ｎ．Ｔ．Ｔｈｕｏｎ
ｇら，Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，２９（４６）：５９０５−５９０８（１９８８
）またはＪ．Ｓ．Ｃｏｈｅｎらの米国特許出願第０７／２４６，６８０号明細書
（１９８９）を参照されたい。好ましくは、プローブを３’及び５’末端で標識
する。
【０１２２】 捕捉標識はプライマーまたはプローブにより実施され、固相試薬特異的結合メ
ンバーと結合対を形成する特異的結合メンバーであり得る。勿論、プライマーま
たはプローブそれ自体は捕捉標識として機能し得ると解される。例えば、固相試
薬特異的結合メンバーが核酸配列の場合には、プライマーまたはプローブの相補
的部分に結合して前記プライマーまたはプローブを固相に固定化させるように選
択される。プローブそれ自体が結合メンバーとして機能する場合には、プローブ
が一本鎖アンプリコンメンバーと相補的でない配列、すなわち“テール”を含む
と当業者は認識している。プライマーそれ自体が捕捉標識として機能する場合、
プローブがプライマー配列に対して完全に相補的でないようにプローブが選択さ
れているのでプライマーの少なくとも一部が固相上の核酸とハイブリダイズしな
い。
【０１２３】 通常、プローブ／一本鎖アプリコンメンバー複合体は、異種イムノアッセイを
実施するように通常使用される方法を用いて検出され得る。好ましくは、この実
施態様では、検出は市販されているＡｂｂｏｔｔ ＬＣｘ（登録商標）（イリノ
イ州アボットパークに所在のＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で用い
られるプロトコルに従って実施される。
【０１２４】 当業界で公知の他の有用な方法には、液中ハイブリダイゼーション並びにドッ
ト及びスロットブロットハイブリダイゼーションプロトコルが含まれる。場合に
よりサンプル中に存在する標的核酸の量は、ハイブリダイズした断片の放射能を
当業界で公知の一般的方法を用いて測定することにより定量化され得る。
【０１２５】 ＩＩＩ．ワクチン ワクチンは、ＵＳタイプ及び／またはＵＳサブタイプ特異的タンパク質配列ま
たは前記タンパク質配列に結合する抗体に基づいて１つ以上の免疫原ポリペプチ
ドから作成され得ると考えられる。更に、ワクチンは、死滅させた、生の弱毒化
したＵＳタイプもしくはＵＳサブタイプＥ型肝炎ウイルス、またはＵＳタイプも
しくはＵＳサブタイプＥ型肝炎ウイルス特異的抗原を発現する異種宿主細胞（例
えば、ワクチンウイルス）を含む生の組み換えワクチンを含み得ると考えられる
。
【０１２６】 ポリペプチドベースのワクチンの場合、ポリペプチドは少なくとも１つのエピ
トープを規定しなければならない。しかしながら、ワクチンは１つ以上のポリペ
プチド鎖により規定される複数の異なるエピトープを含み得ると考えられる。更
に、たとえ非構造タンパク質及び構造タンパク質が中和抗体を産生しなくても、
前記タンパク質はウイルス病原性に対して保護を与え得ると考えられる。以上を
考慮して、ＵＳタイプもしくはＵＳサブタイプウイルスに対する多価ワクチンは
１つ以上の構造タンパク質及び／または１つ以上の非構造タンパク質を含み得る
。前記免疫原性エピトープを組合せて、すなわち組み換えタンパク質、合成ペプ
チド及び／またはビリオンから単離されるポリペプチドの混合物として使用され
得、同時にまたは時間をずらして一緒に投与してもよい。
【０１２７】 活性成分として少なくとも１つの免疫原性ペプチドを含むタンパク質またはペ
プチドベースのワクチンの製造方法は当業界で公知である。通常、前記ワクチン
は溶液または懸濁液のような注射剤として製造される。調製物を乳化させてもよ
く、タンパク質をリポソームにカプセル化してもよい。活性な免疫原性成分を該
活性成分と相容性の医薬的に許容され得る賦形剤と混合してもよい。好適な賦形
剤には、水、食塩液、デキストロース、グリセロール、エタノールまたはその組
合せが含まれるが、これらに限定されない。ワクチンは少量の助剤（例えば、湿
潤・乳化剤、ｐＨ緩衝剤及び／またはワクチンの効果を高めるアジュバント）を
含み得る。例えば、前記アジュバントには、２％スクアレン／ツイーン８０（登
録商標）エマルション中の水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−
スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（Ｔｈｒ−ＤＭＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラ
ミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ １１６８７、ｎｏｒ−ＭＤ
Ｐとも称する）、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニ
ル−Ｌ−アラニン−２−（１’，２’−ジパルミトイル ｓｎ−グリセロ−３−
ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ １９８３５Ａ、ＭＩＴ
−ＰＥとも称する）及びＲＩＢＩ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）が含まれる。アジ
ュバントの有効性は、調査しようとする各種アジュバントをも含むワクチンの形
態でＵＳタイプもしくはＵＳサブタイプ特異的抗原配列を含む免疫原性ポリペプ
チドを投与すると生ずる前記ポリペプチドに対する抗体の量を測定することによ
り調べられ得る。
【０１２８】 前記ワクチンは通常静注または筋注により投与される。他の投与モードに適し
た別の製剤には座剤が含まれ、場合により経口製剤が含まれる。座剤の場合、慣
用されている結合剤及び担体にはポリアルキレングリコールまたはトリグリセリ
ドが含まれるが、これらに限定されない。前記座剤は、約０．５〜約１０％（ｗ
／ｗ）、好ましくは約１〜約２％（ｗ／ｗ）の活性成分を含有する混合物から形
成され得る。経口製剤は賦形剤をも含み得、その賦形剤としてはマンニトール、
ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セ
ルロース、炭酸マグネシウム等が挙げられる。前記組成物は溶液、懸濁液、錠剤
、ピル剤、カプセル剤、徐放性製剤または散剤の形態をとり得、約１０〜約９５
％（ｗ／ｗ）、好ましくは約２５〜約７０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含有する。
【０１２９】 ワクチン中に使用されるポリペプチド鎖は中性または塩の形態としてワクチン
に処方され得る。医薬的に許容され得る塩の例には、無機酸（例えば、塩酸また
はリン酸）、有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸）または他
の当業界で公知の酸を添加して形成される酸付加塩が含まれる。遊離カルボキシ
ル基で形成される塩は、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム
、水酸化アンモニウム、水酸化鉄等）、有機塩基（例えば、イソプロピルアミン
、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジンプロカイン）ま
たは他の当業界で公知の塩基から誘導され得る。
【０１３０】 ワクチンは製剤に適合し得る方法で、予防及び／または治療上有効であろう量
投与される。投与量は通常１回投与あたり約５〜約２５０μｇであるが、実際の
投与量は患者の健康及び体格、患者の免疫系の抗体合成能力及び所望する保護の
程度に依存する。ワクチンは１回または複数回投与スケジュールで投与され得る
。複数回投与とは、免疫化の初期コースでは１〜１０回別々に投与し、その後免
疫応答を維持及び／または補強するのに必要な時間間隔で（例えば、第二回投与
の間に１〜４ヶ月で）、及び患者によつては所要により数ヶ月後に１回以上投与
することである。更に、投与レジメは少なくとも部分的には患者の必要性により
決定され、担当医の判断に基づき得る。
【０１３１】 死滅させたまたは不活化させたＵＳタイプもしくはＵＳサブタイプＥ型肝炎ウ
イルスを含有するワクチンの場合、不活化は当業界で公知であり、文献に詳しく
記載されている慣用方法により実施され得る。好ましい不活化方法の例には、（
ｉ）有機溶媒、（ｉｉ）洗剤、（ｉｉｉ）ホルマリン及び（ｉｖ）イオン放射線
の１つ以上への露出が含まれる。弱毒化ワクチン中の幾つかのタンパク質は他の
公知のウイルスと交差反応し得、よってＵＳタイプもしくはＵＳサブタイプＥ型
肝炎ウイルスとＨＥＶファミリーの他のメンバー（例えば、ビルマまたはメキシ
コファミリーのメンバー）の間に共通のエピトープが存在し得、従って前記病原
菌により引き起こされる１つ以上の疾患に対する保護抗体を産生し得る。好まし
い投与製剤及び投与方法は当業界の文献に詳しく記載されており、従って本明細
書では詳細に説明しない。考慮すべき各種因子には、ペプチドベースのワクチン
に関して上で検討した１つ以上の要件が含まれる。
【０１３２】 弱毒化生ワクチンの場合、弱毒化ウイルスは当業界で公知であり、使用されて
いる弱毒化方法を用いて作成され得る。簡単に説明すると、弱毒化はウイルスを
低温で経代することにより、ウイルスゲノムにミスセンス突然変異または欠失を
導入することにより実施され得る。好ましい投与製剤及び投与方法は当業界の文
献に詳しく記載されており、従って本明細書では詳細に説明しない。考慮すべき
各種因子には、ペプチドベースのワクチンに関して上で検討した１つ以上の要件
が含まれる。
【０１３３】 弱毒化生ワクチン（ベクターワクチン）の場合、このワクチンは生きているが
有害でないウイルスまたはバクテリアに抗原決定基を規定するＵＳタイプもしく
はＵＳサブタイプＥ型肝炎特異的ポリペプチド鎖をコードする遺伝子または核酸
配列を導入することにより作成され得る。生じたベクター生物はその後意図する
宿主に投与され得る。通常、ワクチンが有効であるためには、ベクター生物は生
存可能でなければならず、本質的に非毒性であるかまたは弱毒化表現型を有して
いなければならない。好ましい宿主生物には、ワクシニアウイルス、アデノウイ
ルス、アデノ関連ウイルス、サルモネラまたはマイコバクテリアが含まれる。ワ
クチンウイルス及びマイコバクテリアの生存株はそれぞれ天然痘及び結核（ＢＣ
Ｇ）ワクチンの形態でヒトに安全に投与されてきた。また、前記ワクチンは外来
タンパク質を発現せず、有毒表現型に殆どまたは全く変換されないことが判明し
ている。ベクターワクチンは複数の外来遺伝子または核酸配列を有し得、よって
各種の所定抗原決定基に対して同時にワクチン接種することができる。好ましい
投与製剤及び投与方法は当業界の文献に詳しく記載されており、従って本明細書
では詳細に説明しない。
【０１３４】 ＩＶ．抗−ＵＳタイプもしくはＵＳサブタイプＥ型肝炎ウイルス活性を有する 分子の同定 特異的ＨＥＶ ＵＳタイプ配列の発見から、当業者はＨＥＶゲノムのＯＲＦ１
タンパク質によりコードされるＨＥＶ ＵＳタイプ特異的タンパク質（例えば、
ヘリカーゼ、メチルトランスフェラーゼまたはプロテアーゼタンパク質）の活性
を不活化または低下させる分子を同定することができる。ＨＣＶプロテアーゼを
阻害する分子を同定するためのプロトコルの例は、援用により本明細書に含まれ
るとする米国特許第５，５９７，６９１号明細書に記載されている。前記方法は
ＨＣＶプロテアーゼ阻害剤の同定に関しているが、ＨＣＶプロテアーゼ阻害剤ま
たはＨＥＶ ＵＳタイプ配列によりコードされる他のタンパク質を同定するため
に同一または類似のプロトコルを使用し得ると考えられる。
【０１３５】 簡単に説明すると、ＨＥＶプロテアーゼ阻害剤の同定方法は以下の通りである
。通常、プロテアーゼ天然基質に似ているが開裂したときに定量可能な信号を与
える基質を使用する。前記信号が比色または蛍光定量手段により検出可能である
ことが好ましい。しかしながら、ＨＰＬＣ、シリカゲルクロマトグラフィー、核
磁気共鳴法等のような他の方法も有用であり得る。最適基質及びプロテアーゼ濃
度を決定したら、候補プロテアーゼ阻害剤を各種濃度で反応混合物に一度に添加
する。好ましいアッセイ条件は、プロテアーゼがインビボで阻害される条件、す
なわち生理学的ｐＨ、温度、イオン強度等に類似している。好適な阻害剤は、患
者に有毒な副作用を与えない濃度で強いプロテアーゼ阻害を示す。プロテアーゼ
活性サイトへの結合に関して競合する阻害剤は基質濃度以上の濃度を必要とし得
、プロテアーゼ活性サイトに非可逆的に結合し得る阻害剤は酵素濃度のオーダー
の濃度で添加され得る。
【０１３６】 阻害剤は、例えばＨＥＶプロテアーゼにより認識される開裂サイトに似ている
有機化合物であり得るか、またはＨＥＶプロテアーゼに特異的に結合し且つＨＥ
Ｖプロテアーゼの活性を不活化または低下させ得る抗体または抗体断片のような
タンパク質であり得ると考えられる。一旦同定されれば、プロテアーゼ阻害剤は
各種方法、例えば静脈内、経口、筋肉内、腹腔内、気管支、鼻腔内等で投与され
得る。好ましい投与ルートは阻害剤の種類に依存する。有機化合物として製造さ
れた阻害剤は、十分に吸収されるならば経口投与される（経口投与が通常好まし
い）。多くの抗体または抗体誘導体のようなタンパク質ベースの阻害剤は通常非
経口ルートで投与される。
【０１３７】 （実施例） 本発明の実施は下記実施例から十分に理解されるであろう。これらの実施例は
本明細書に例示の目的のみで提示されており、本発明を決して限定するものと解
釈されるべきではない。上掲または下掲する特許明細書、特許出願明細書及び発
表された科学文献を含めたすべての文献が援用により本明細書に含まれるとする
。
【０１３８】 実施例１：症例研究 ＨＥＶ株ＵＳ−１は急性肝炎を患っている患者（ＵＳＰ−１）の血清中で同定
された。この患者は６２歳の白人男性であり、発熱、腹痛、黄疸及びそう痒感を
３週間訴えた後ミネソタ州ロチェスターの病院に入院した。カリフォルニア州サ
ンノゼに１０日間旅行後自宅に戻ってから２週間後に兆候及び症状が発現した。
【０１３９】 患者は過去に、中程度の腎不全を伴う常染色体優性遺伝多嚢胞性腎疾患のため
に腎摘出及び症候性胆石症のために腹腔鏡下胆嚢摘出術を受けていた。患者は変
形性関節炎を患っており、血圧が高かった。入院の３ヶ月前からリシノプリル治
療を受けていた。診察は、白人男性が圧痛性肝肥大を伴う黄疸にかかっているこ
とを示し、羽ばたき振せんはなかった。血清アスパルテートアミノトランスフェ
ゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びビリルビンレ
ベルは入院時に著しく高く、それぞれ入院から８日及び１６日目にピークに達し
た（図２）。リシノプリルは入院時に中止した。Ａ型肝炎（ＩｇＭ及びＩｇＧ抗
ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎（ＨｂｓＡｇ、ＩｇＭ及びＩｇＧ抗−ＨＢｃ）、Ｃ型肝炎（
抗−ＨＣＶ）及びＨＣＶ ＲＮＡについての血清検査は陰性であった。セルロプ
ラスミン、鉄、トランスフェリン、抗−核及び抗−平滑筋抗体、毒素及び薬物ス
クリーニングはすべて正常であった。患者を注意深く問診したところ、エタノー
ルは飲用していなかった。腹部超音波、ＣＴスキャン及び内視鏡的逆行性胆管膵
臓造影像も正常であった。肝生検は、自己免疫、薬物またはウイルス肝炎と一致
した肝細胞の顕著な核濃縮及び風船状変性を伴う重篤な急性小葉肝炎を示した。
【０１４０】 患者は２ヶ月以内に臨床的に完全に回復し、入院から約５ヶ月後にＡＳＴ、Ａ
ＬＴ及びビリルビンは正常となった。ＨＥＶに感染する危険因子は同定されなか
った。患者は１０年以上米国の国外に旅行したことはなかった。発病前６週間の
間に彼が外食したのはメキシコレストランと大きなファーストフードレストラン
チェーンのみであった。彼は処理済飲料水しか飲用しておらず、生貝も食してお
らず、家畜にも接していなかった。メキシコレストランまたはファーストフード
レストランの料理人は誰も、入院日の５ヶ月以内に外国に旅行したことはなく、
肝炎の兆候及び／または症状も訴えていなかった。入院期間中カリフォルニアに
滞在していたとかミネソタに住んでいた非−ＡＢＣ肝炎患者の他の症例は地方保
険局に報告されていなかった。患者がカリフォルニアに旅行中にもその後１０週
間の間にも家族は誰も肝炎の兆候及び／または症状を呈しなかった。カリフォル
ニアの６家族及び問題の期間患者と一緒にミネソタに住んでいた彼の配偶者から
得た血清はＥＩＡにより抗−ＨＥＶ陰性であった。
【０１４１】 実施例２：ＨＥＶ ＵＳ−１のユニーク単離物の同定 ＨＥＶの存在をＨＥＶプライマー配列を用いてＲＴ−ＰＣＲにより調べた。簡
単に説明すると、核酸を患者ＵＳＰ−１の血清２５μｌから上記したように（Ｓ
ｃｈｌａｕｄｅｒ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，４６：８１
−８９（１９９５））単離した。エタノール沈降核酸を水で処理したジエチルピ
ロカーボネート（ＤＥＰＣ）３μｌに再懸濁させた。
【０１４２】 ｃＤＮＡ合成及びＰＣＲはＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ（コネチカット州ノーウ
ォークに所在）のＧｅｎｅＡｍｐＲＮＡ ＰＣＲキットを製造業者の指示に従っ
て用いて実施した。ｃＤＮＡ反応物１０μｌ毎にＲＮＡ（１μｌ）を鋳型として
使用した。ｃＤＮＡ合成は４μＭの最終濃度まで添加した特定プライマーを用い
て開始した。その後のｃＤＮＡの増幅を０．８〜１．０μＭの最終濃度まで添加
したオリゴヌクレオチドを用いて開始した。ＰＣＲを４０サイクル（９４℃×２
０秒、５５℃×３０秒、７２℃×３０秒）、その後７２℃×３分の延長サイクル
を実施した。次いで、最初のＰＣＲ反応物（２μｌ）をネステッドＰＣＲプライ
マーを用いる第２ラウンドの増幅のための鋳型として使用した。ＰＣＲはＰｅｒ
ｋｉｎ−ＥｌｍｅｒのＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲキットを製造業者の指示に従って
用いて実施した。簡単に説明すると、プライマーを１μＭの最終濃度まで添加し
た。第１組の実験では３組のプライマーを用いた。２組はビルマ株及びメキシコ
株由来の配列に基づくＯＲＦ１の５’末端からであった。１組はメキシコ株配列
に基づくＯＲＦ１の３’末端からであった。使用した３組のプライマーは以下の
通りであった。
【０１４３】
【表１】
【０１４４】 ５’−ＯＲＦ１ビルマプライマーはＳｃｈｌａｕｄｅｒら，Ｌａｎｃｅｔ，３
４１：６７８（１９９３）に記載されている。プライマーＭ１ＰＲ６及びＭ１Ｐ
Ｆ６はＭｃＣａｕｔｌａｎｄら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ
，３５：３３１−３４２（１９９１）に記載されている。ＰＣＲ産物をアガロー
スゲル電気泳動により分離し、臭化エチジウム染色後ＵＶ照射することにより可
視化した。サザンブロットをニトロセルロースフィルターに移した後生じたＰＣ
Ｒ産物を放射性同位元素標識したプローブにハイブリダイズした。
【０１４５】 放射性同位元素標識したプローブは、Ｑｉａｇｅｎ（カリフォルニア州チャッ
ツワースに所在）のＱＩＡＥＸゲル抽出精製により精製したＰＣＲ産物から作成
した。放射性同位元素標識はＳｔｒａｔｇｅｎｅ（登録商標）（カリフォルニア
州ラ・ホーヤに所在）Ｐｒｉｍｅ−Ｉｔ ＩＩキットを製造業者の指示に従って
用いて取り込んだ。フィルターをＡｍｅｒｓｈａｍ（イリノイ州アーリントンハ
イツに所在）のＲａｐｉｄ−ｈｙｂ緩衝液において３〜５時間プレハイブリダイ
ズした後、４２℃でＦａｓｔ−Ｐａｉｒハイブリダイゼーション溶液において１
０〜２００ｃｐｍ／ｃｍ２で１５〜２５時間ハイブリダイズした。次いで、フィ
ルターをＳｃｈｌａｕｄｅｒら，Ｊ．Ｖｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，３７：１８９
−２００（１９９２）に記載されているように洗浄した。プローブ化フィルター
のリンイメージをＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉ
ｍａｇｅｒ ４２５Ｅ（カリフォルニア州サニーベールに所在）を用いて得た。
【０１４６】 臭化エチジウム染色バンドをＯＲＦ１の５’末端からのプライマーを用いて検
出した。しかしながら、メキシコ株に基づくプライマーのみにより２６６塩基対
の予想サイズを有するネステッド産物が生じた。ビルマ様株（同一性＞９０％）
感染患者由来のプローブへのハイブリダイゼーションにより、ビルマポジティブ
コントロールからの信号に比して患者ＵＳＰ−１由来産物に対して非常に弱いハ
イブリダイゼーション信号が生じた。これらの結果は、この単離物がビルマ単離
物に密接に関連していなかったことを初めて示すものであった。メキシコ株から
プローブは入手できなかった。
【０１４７】 上記結果を確認するために、患者ＵＳＰ−１の別の血清アリコートからＲＮＡ
を抽出した。ＲＴ−ＰＣＲを上記したように５’−ＯＲＦ１−メキシコプライマ
ー（配列番号１〜５）を用いて実施した。アガロース電気泳動及び臭化エチジウ
ム染色後、各サンプルにおいて３４２ｂｐ産物が可視化された。ＰＣＲ産物をＱ
ｉａｇｅｎ（カリフォルニア州チャツツワースに所在）のＱＩＡＥＸＩＩアガロ
ースゲル抽出キットを用いてアガロースゲルから抽出し、Ｎｏｖａｇｅｎ（ウィ
スコンシン州マディソンに所在）のｐＴ７ Ｂｌｕｅ Ｔ−ベクタープラスミド
にクローン化した。クローン化産物をＳＥＱＵＥＮＡＳＥ ＶＥＲＳＩＯＮ ２
．０配列決定キット（オハイオ州クリーヴランドに所在のＵＳＢ）を製造業者の
指示に従って用いて配列決定した。
【０１４８】 後者の２つのサンプルの産物から得たヌクレオチド配列は同一であり、配列番
号１５に示す。これらの結果から、ビルマ株及びメキシコ株由来のｃＤＮＡプラ
イマー及びプライマーＳ１のみにより患者ＵＳＰ−１サンプルから臭化エチジウ
ムで染色可能な産物が生じたことが分かる。メキシコ株に基づくネステッドプラ
イマーＳ２及びＡ２だけが所望サイズを有する臭化エチジウムで染色可能な産物
を生成した。
【０１４９】 ＨＥＶ ＵＳ−１単離物とＨＥＶの他の公知の単離物の関連度を調べるために
、ウィスコンシン州マジソンに所在のＳｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ ５７５に所
在のＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．から入手し得
るＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ
（バージョン９）のプログラムＧＡＰを用いてヌクレオチド配列及びアミノ酸配
列のアラインメントを実施した。前記プログラムは、アラインさせた２つの配列
間の％として表す類似度及び同一度を計算するためにＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷ
ｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３−４５３（
１９７０））を使用している。ギャップ形成及びギャップ延長ペナルティーは核
酸配列アラインメントについてそれぞれ５０及び３．０であり、アミノ酸配列比
較に対してそれぞれ１２及び４であった。
【０１５０】 ビルマ株及びメキシコ株由来の２つの“原型”ＨＥＶ単離物の完全ヌクレオチ
ド配列及びアミノ酸配列、並びに分析のために使用した他の配列はＧｅｎＢａｎ
ｋから入手し、それぞれの受託番号を下表１に示す。これらの配列の各々は援用
により本明細書に含まれるとする。
【０１５１】
【表２】 （配列番号８９の残基１〜３０３に相同の）ＨＥＶ ＵＳ−１の３０３塩基対
配列をメキシコ株、ビルマ株、パキスタン株及び中国株で同定した相同領域と比
較した。同一％を下表２に要約する。
【０１５２】
【表３】
【０１５３】 表２の結果から、ＵＳＰ−１単離物由来のＯＲＦ１の５’末端からの断片がＨ
ＥＶの他の公知の単離物に対して約７４．９〜約７７．２％核酸同一であること
が分かる。これは、原型メキシコ単離物とビルマ単離物間の同一性（８３．２％
）よりも低かった。これらの結果は、産物が多分今までに同定されていなかった
ＨＥＶのユニークな単離物に由来していたことを示している。
【０１５４】 実施例３：ＨＥＶ ＵＳ−１のゲノム延長及び配列決定 上記実施例２に記載のように入手し、配列決定したクローン（配列番号１５）
はユニークなＨＥＶゲノム、ＨＥＶ ＵＳ−１由来であった。ＨＥＶ ＵＳ−１
ゲノムの別の領域から配列を得るために、幾つかの逆転写酵素−ポリメラーゼ連
鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）ウォーキング実験を実施した。
【０１５５】 全核酸を、実施例２に記載の手順（配列番号１９に対してのみ）または以下の
手順の１つにより抽出した。患者ＵＳＰ−１血清のアリコート（２５μｌ）を担
体としての酵母ｔＲＮＡ（１０ｍｇ）の存在下でＴｏｔａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ方法を製造業者（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）に従って用いて抽出した。核酸を沈降させ、ＲＮａｓ
ｅ／ＤＮａｓｅ非含有水（３．７５μｌ）中に再懸濁させた。或いは、全ＲＮＡ
を血清（１００μｌ）からＴｏＴＡＬＬＹ ＲＮＡ単離キットを製造業者（Ａｍ
ｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）が推奨するように用いて単離した。生じたＲＮＡをＤＮａ
ｓｅで処理し、Ｓ．Ｎ．Ａ．Ｐ．Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ単離キット（カリフォルニ
ア州サンジェゴに所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の試薬を用いてカラム精製した
。その後、ＲＮＡを３Ｍ 酢酸ナトリウム（０．１容量）、担体としてのペレッ
トペイント（Ｎｏｖａｇｅｎ）（２０μｌ）及びエタノール（２容量）を用いて
沈降させた。ＲＮＡペレットをＤＥＰＣ処理水（５０μｌ）に溶解させた。
【０１５６】 ＲＴ−ＰＣＲをＧｅｎｅＡｍｐ ＲＮＡ ＰＣＲキットを製造業者の指示（Ｐ
ｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）に従って用いて実施した。配列番号１９の単離物を除
いて、総容量２５μｌでｃＤＮＡ合成を開始するためにランダムヘキサマーを用
いた。配列番号１９の単離物に対しては、上記実施例２に記載したようにプライ
マーＰＡ２−５５６０（配列番号１６）を用いて特異的に開始させたｃＤＮＡを
利用した。ＵＳ１−ギャップを、１２．５μｌの血清等価物から抽出したＲＮＡ
、プライマーＵＳ１ギャップ−ａ０．５（配列番号４６）及びＳｕｐｅｒｓｃｒ
ｉｐｔ ＩＩ（３’ＲＡＣＫキット：ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ））を用いて作成した
特異的プライマーｃＤＮＡで作成した。ＰＣＲを全反応容量の１／５（１０μｌ
反応物では２μｌ、２５μｌ反応物では５μｌ等）を含むｃＤＮＡを用いて実施
した。標準ＰＣＲを２ｍＭのＭｇＣｌ２及び０．５〜１．０Ｍの各プライマーの
存在下で実施した。配列番号３３及び４１の単離のために製造業者の指示に従っ
て修飾反応物に１×ＰＣＲ緩衝液及び２０％ Ｑ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｑｉａｇ
ｅｎ）を含めた。反応には２つのＨＥＶコンセンサスプライマー（表３）；１つ
のＨＥＶコンセンサスプライマー及び１つのＨＥＶ ＵＳ−１特異的プライマー
（表４）；２つのＨＥＶ ＵＳ−１特異的プライマー（表５）；１つのＨＥＶ
ＵＳ−１特異的プライマー及び１つのＨＥＶ ＵＳ−２（実施例５参照）特異的
プライマー；または２つのＨＥＶ ＵＳ−２特異的プライマー（表７）を使用し
た。反応物を次のように熱サイクルにかけた。
【０１５７】 配列番号１９、２４、２７、３０、３３、４１、４４、６０、６４、６８、７
３、７８及び８３をタッチダウンＰＣＲにより得た。増幅には、９４℃×３０秒
、５５℃×３０秒（−０．３℃／サイクル）及び７２℃×１分間の４３サイクル
を含めた。この後に、９４℃×３０秒、４０℃×３０秒及び７２℃×１分の１０
サイクルを実施した。配列番号３８、４９、５２及び５５の場合、９４℃×３０
秒、５５℃×３０秒及び７２℃×１分間の３５サイクルを含めた。すべての増幅
の前に９４℃×１〜２分、その後に７２℃×５〜１０分間を含めた。反応物をア
ガロースゲル分析前に４℃で保持した。
【０１５８】 配列番号１９の単離には、所望産物を単離するために２ラウンドのタッチダウ
ン増幅が必要であった。ここで、第１ラウンド１μｌを第２ラウンドの２５μｌ
反応物に添加した。第２ラウンドの増幅は反応１．１．１及び１．１．２により
表３に示すヘミネステッドプライマーを使用した。配列番号２４の単離には第２
ラウンドの上記したネステッドタッチダウン増幅を必要とし、反応２．１．１及
び２．１．２として表４に示した。配列番号３８及び４９の単離には、上記した
ように第１ラウンド１μｌを用いる２５μｌ反応物に用いるネステッドＰＣＲ（
表５）の第２ラウンドを必要とした。配列番号６０、６４、６８及び７３の単離
には、第１ラウンド１μｌを第２ラウンド反応２５μｌにおいて増幅させるネス
テッドＰＣＲを必要とした（表６）。配列番号７８及び８３の産物が２ラウンド
増幅により生成した（表７）。
【０１５９】 ＰＣＲ反応物の一部または全部に対してアガロースゲル電気泳動を０．２ｍｇ
／ｍｌの臭化エチジウムの存在下０．８〜２％アガロースＴＡＥゲル中で実施し
た。産物をＵＶ照射により可視化し、所望分子量の産物を切り取り、ＧｅｎｅＣ
ｌｅａｎを製造業者の指示（ＢＩＯ １０１，Ｉｎｃ．）に従って精製し、ｐＴ
７−Ｂｌｕｅ Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ）ＩＩまたはｐＧ
ＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に製造業者の指示に従っ
てクローン化した。クローン化産物を実施例２に記載したように、またはＡＢＩ
Ｍｏｄｅｌ ３７３ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ上で製造業者が特定するよ
うにＡＢＩ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを
用いて配列決定した。上記実験の結果を下表３〜７に示す。
【０１６０】
【表４】
【０１６１】
【表５】
【０１６２】
【表６】
【０１６３】
【表７】
【０１６４】
【表８】
【０１６５】 ゲノムの３’末端で配列を得るために、増幅はＧＩＢＣＯ ＢＲＬの３’ＲＡ
ＣＥシステムを製造業者の指示に従って使用した。ＨＥＶ株のように、ＨＲＶ−
ＵＳ−１ゲノムの３’末端はメキシコ株、ビルマ株及びパキスタン株と同様にポ
リアデノシン尾を含むと想定した。血清５０μｌの等価物から上記のように抽出
したＲＮＡを製造業者から供給された配列番号８４のオリゴｄＴアダプタープラ
イマー５’−ＧＧＣＣＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＡＧＴＡＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ
ＴＴＴＴＴＴＴ−３’を用いて逆転写した。第１ラウンドのＰＣＲでは、ＡＵＡ
Ｐプライマー供給５’−ＧＧＣＣＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＡＧＴＡＣ−３’（配
列番号８５）及び０．２ｍＭ最終濃度のＨＥＶ ＵＳ特異的プライマー（表８）
を推奨される濃度のＰＣＲ緩衝液、ＭｇＣｌ２及びｃＤＮＡと共に用いた。増幅
には９４℃×３０秒、５５℃×３０秒及び７２℃×１時間の３５サイクルを含め
た。増幅の前に９４℃×１分のインキュベーション、増幅の後に７２℃×１０分
の延長を行った。増幅の第２ラウンドでは、５０μｌの反応に１μｌの第１ラウ
ンドを使用した。ＰＣＲ緩衝液は２ｍＭのＭｇＣｌ２及び０．５ｍＭの各プライ
マーで１×最終濃度であった。プライマーをＡＵＡＰプラマー及びＨＥＶ−ＵＳ
−１特異的プライマー（表８）を用いてヘミネステッドした。増幅条件は第１ラ
ウンドと同一であった。産物を上記のようにアガロースゲル電気泳動により分析
、クローン化し、配列決定した。
【０１６６】
【表９】
【０１６７】 上記産物から得た配列を上表３〜８に記載し、ゲノム（配列番号１５）の５’
末端近くの最初のＰＣＲ産物をＧＣＧパッケージ（ウィスコンシン州マジソンに
所在のＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，バージョン９）のプ
ログラムを用いてコンティグにアセンブリし、コンセンサス配列を決定した。ア
センブリしたコンティグの概略を図３に示す。ＨＥＶ ＵＳ−１ゲノムは７２０
２ｂｐ長であり、そのすべての配列が決定された（配列番号８９）。この配列を
３つのオープンリーディングフレームに翻訳した。前記オープンリーディングフ
レームの２つを配列番号９０に示す（第３のＯＲＦはヌクレオチド位置５０９４
〜５４６２にあるが、他の２つのＯＲＦと重複するので配列番号９０に示すこと
はできない）。生じた翻訳物（ＯＲＦ１、ＯＲＦ２及びＯＲＦ３）をそれぞれ配
列番号９１、配列番号９２及び配列番号９３に示す。
【０１６８】 実施例４：ＨＥＶ ＵＳ−２のユニーク単離物の同定 ＨＥＶ ＥＩＡ試験でＩＧＧクラス抗体について検査した急性肝炎を患ってい
る米国患者も、ＵＳ−１株特異的ＥＬＩＳＡを用いて陽性と判定された。急性肝
炎と診断されたこの患者（ＵＳ−２）は黄疸及び疲労を訴えて入院した６２歳男
性であった。最初の臨床検査で、ＡＬＴは１２７０Ｕ／Ｌであった（正常値０〜
４０Ｕ／Ｌ）。当地域で最近Ａ型肝炎ウイルスが大発生しているので、この患者
もＨＡＶに感染していると疑われた。しかしながら、抗−ＨＡＶ ＩｇＭ検査の
ＨＡＶＡＢ−Ｍ ＥＩＡ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｓ）は、Ｂ型肝
炎ウイルス及びＣ型肝炎ウイルスに対する血清マーカーに関する検査と同様に陰
性であった。この患者の病歴によると、発病の数週間前にメキシコのカンクンを
訪問していた。
【０１６９】 その後、患者からのサンプルをＨＥＶ ＵＳ−１特異的ＰＣＲプライマーを用
いるＰＣＲ増幅によりＨＥＶ特異的配列の存在について分析した。ＲＮＡを実施
例２に記載のＵｌｔｒａｓｐｅｃを用いて抽出した。ランダムプライマーｃＤＮ
Ａ合成を実施例３に記載のように実施し、ＰＣＲをＨＥＶ ＵＳ−１特異的プラ
イマー（配列番号９４及び配列番号９６）を用いて実施例２に記載の標準条件で
実施した。ネステッドＰＣＲはプライマー（配列番号９５及び配列番号９７）を
用いて実施した。ＰＣＲ産物は実施例３に記載のように配列決定した。生じたＰ
ＣＲ産物の配列を配列番号９８に示す。実施例２のようにＧＡＰ分析して、ヌク
レオチド配列（配列番号９８）はＨＥＶ ＵＳ−１からの対応または相同領域と
９５％同一であった。
【０１７０】 実施例５：ＨＥＶ ＵＳ−２のゲノム延長及び配列決定 実施例４で得、配列決定したクローン（配列番号９８）はＨＥＶ ＵＳ−１に
最も密接に関連しているＨＥＶ単離物から誘導した。ＨＥＶ ＵＳ−２ゲノムの
別の領域を得るために、幾つかのＲＴ−ＰＣＲウォーキング実験を実施例３に記
載のように実施した。
【０１７１】 ＲＮＡをＴｏｔａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ方法
（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を用いて抽出した。
逆転写物をＧｅｎｅＡｍｐ ＲＮＡ ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ
）を用いてランダムプライムした。標準ＰＣＲを２ｍＭのＭｇＣｌ２及び０．５
〜１．０μＭの各プライマーの存在下で実施した。配列番号１２９、１４１及び
１４６の単離のために修飾反応物には１×ＰＣＲ緩衝液及び２０％ Ｑ Ｓｏｌ
ｕｔｉｏｎ（Ｑｉａｇｅｎ）を含めた。反応には２つのＨＥＶ ＵＳ−１特異的
プライマー（表９）；１つのＨＥＶ ＵＳ−１特異的プライマー及び１つのＨＥ
Ｖコンセンサスプライマー（表１０）；１つのＨＥＶ ＵＳ−２特異的プライマ
ー及び１つのＨＥＶコンセンサスプライマー（表１１）；２つのＨＥＶ ＵＳ−
２特異的プライマー（表１２）；２つのビルマ、メキシコ及びＵＳ由来コンセン
サスプライマー（以下に記載する、表１３）を使用した。
【０１７２】 配列番号１０１、１０２、１０５、１０８、１１０、１１３、１１７、１２０
、１２４、１４９及び１５１に示す産物はタッチダウンＰＣＲにより得た。増幅
には、９４℃×３０秒、５５℃×３０秒（−０．３℃／サイクル）及び７２℃×
１分の４３サイクルを含めた。増幅の後に、９４℃×３０秒、４０℃×３０秒及
び７２℃×１分の１０サイクルを含めた。配列番号１２９、１３２、１３６、１
４１及び１４６を増幅するためには９４℃×３０秒、５５℃×３０秒及び７２℃
×１分の３５サイクルを含めた。すべての増幅において、その前に９４℃×１〜
２分、その後に７２℃×５〜１０分を含めた。この反応物を４℃で保持してから
、アガロースゲル分析にかけた。大抵の産物の単離には、表９〜１３に示すネス
テッドまたはヘミネステッドＰＣＲの第２ラウンドを必要とした。これらの反応
では、ＰＣＲ１産物１μｌをＰＣＲ２反応混合物２５〜５０μｌに添加し、生じ
た混合物をＰＣＲ１と同様のサイクルにかけた。
【０１７３】 上記実施例３に記載のように反応物を分析し、産物をクローン化し、配列決定
した。これらの実験の結果を表９〜１３に示す。
【０１７４】
【表１０】
【０１７５】
【表１１】
【０１７６】
【表１２】
【０１７７】
【表１３】
【０１７８】
【表１４】
【０１７９】 ゲノムの３’末端で配列を得るために、増幅は実施例３に記載されているよう
にＧＩＢＣＯ ＢＲＬの３’ＲＡＣＥシステムを製造業者の指示に従って用いた
。ｃＤＮＡを配列番号８４を用いて作成した。ＰＣＲ１はプライマー（配列番号
１５０及び配列番号８５）を用いた。ＰＣＲ２プライマーは配列番号１５２及び
配列番号８５であった（反応１２．１）。生じた産物は９０１ｂｐ（配列番号１
５３）であった。
【０１８０】 ＨＥＶ ＵＳ−２ウイルスゲノムの５’末端にある新規配列を逆ＰＣＲ（Ｍ，
Ｚｅｉｎｅｒ及びＵ．Ｇｅｈｒｉｎｇ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１７：１
０５１−１０５３（１９９４））により単離した。ＵＳＰ−１及びＵＳＰ−２か
らの血清は十分に入手できないので、（下記実施例に記載の）ＨＥＶ ＵＳ−２
感染マカクの糞材料をソース材料として選択した。４６２ヌクレオチドの産物を
、プライマー（配列番号１５４、１５５、１５６及び１５７）を用いて実施例３
に記載のように抽出、逆転写及びＰＣＲ増幅したＲＮＡを用いて超可変／富プロ
リンヒンジ領域内でマカク糞材料から増幅させた。この産物（配列番号１５８）
はＨＥＶ ＵＳ−２配列と１００％同一であった。従って、マカク糞からのＨＥ
Ｖゲノムの５’末端で同定された配列はＨＥＶ ＵＳ−２ゲノムの５’末端を正
確に表さなければならないと考えられる。全核酸を上記した１０％糞懸濁液２０
０μｌから抽出した。ＨＥＶ ＵＳ特異的プライマー（配列番号１５９）を用い
る逆転写反応を、（上掲のＭ．Ｚｅｉｎｅｒ及びＵ．Ｇｅｈｒｉｎｇ，Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｉｑｅｓに記載されている）ＢＭＢから入手したキットを用いて実施し
た。但し、核酸を７０℃で５分間変性し、氷上に保存した後ＲＴ反応を開始した
。二本鎖環状ｃＤＮＡの作成は上掲のＭ．Ｚｅｉｎｅｒ及びＵ．Ｇｅｈｒｉｎｇ
，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｅｓに記載されているように実施した。生じた環状ｃＤ
ＮＡ分子をその後のＰＣＲ反応の鋳型として使用した。第１のＰＣＲ反応（ＰＣ
Ｒ１）で用いたプライマーを配列番号１６０及び１６１に示す。第２ＰＣＲ反応
（ＰＣＲ２）で用いたネステッドプライマーを配列番号１６２及び１６３に示す
。
【０１８１】 ＰＣＲ２（反応１３．１）からの産物をｐＧＥＭ−ＥａｓｙＴベクター（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ）にクローン化し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７３
６自動シーケンサーを用いて配列決定した。２２１ヌクレンチドの１つの産物は
適当なプライマー及び公知のＨＥＶ ＵＳ−２配列の上流６３ヌクレオチドを同
定するＨＥＶ ＵＳ−２配列を有するものとして同定された。別のクローンを適
当なプライマー及び前記の新規配列の一部を用いて同定した。１００μｌのＵＳ
Ｐ−２血清または１００μｌの１０％糞懸濁液由来のＲＮＡに対して配列番号１
６３及び１６４に示す配列をプライマーとして用いて実施したプライマー延長実
験では、この配列の長さをうまく確認できなかった。ビルマ様単離物の５’ＮＴ
Ｒ配列に対する６３ヌクレオチドの１対比較で９４％以上の同一性を示し、これ
がＨＥＶ ＵＳ−２の真の配列であることが示唆された。
【０１８２】 本実施例に記載の産物から得た配列及び実施例４に記載の配列をＧＣＧパッケ
ージ（ウィスコンシン州マジソンに所在のＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ
Ｇｒｏｕｐ，バージョン９）のプログラムを用いてコンティグに集合し、コン
センサス配列を決定した。集合したコンティグを図４に概略的に示す。ＨＥＶ
ＵＳ−２株のゲノムは７２７７ｂｐ長であり、そのすべての配列が決定されてお
り、配列番号１６４に示す。この配列を配列番号１６５に示す３つのオープンリ
ーディングフレームに翻訳し、ＯＲＦ１及びＯＲＦ２配列の翻訳産物のみを示す
（第３のＯＲＦはヌクレオチド位置５１５９〜５５２７に存在するが、他の２つ
のＯＲＦと重複しているので配列番号１６５に示すことができない）。ＯＲＦ１
、ＯＲＦ２及びＯＲＦ３配列の生じた翻訳物をそれぞれ配列番号１６６、１６７
及び１６８に示す。
【０１８３】 実施例６：配列比較 ウイルスの関連度に関する情報は通常、ヌクレオチド及び推定アミノ産配列の
アラインメントのような比較を実施することにより得ることができる。ＨＥＶの
ＵＳ単離物（例えば、ＨＥＶ ＵＳ−１及びＨＥＶ ＵＳ−２）の配列とＨＥＶ
の他の単離物の対応配列のアラインメントにより、配列間の類似度及び同一度が
定量的に評価される。通常、２つのアミノ酸配列の類似性は、アラインメント中
のアミノ酸対の側鎖間の類似度に基づいて算出される。類似度はアミノ酸側鎖の
物理−化学的特性、すなわちサイズ、形、電荷、水素結合能及び化学反応性に基
づく。従って、類似のアミノ酸は類似の物理−化学的特性を有する側鎖を持って
いる。２つのアラインさせたアミノ酸またはヌクレオチド配列間の同一性の計算
は、通常アラインメント中のアミノ酸またはヌクレオチドの同一対の数をカウン
トし、この数をアラインメント中の配列の長さで割る算術計算である。２つのア
ラインさせたヌクレオチド配列間の類似性の計算には、時にはアラインメント中
の異なる位置の対比（マッチド）ヌクレオチド間のトランジション及びトランス
バージョンについて異なる値を使用する。しかしながら、ヌクレオチド配列の対
間の類似スコア及び同一スコアの大きさは通常非常に似通っており、すなわち１
〜２％の範囲内である。
【０１８４】 類似度及び同一度は、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓ
ｉｓ ＰａｃｋａｇｅのプログラムＧＡＰ（バージョン９）を用いて決定した。
ギャップ形成及びギャップ延長のペナルティーは核酸配列の場合それぞれ５０及
び３．０であり、アミノ酸配列比較の場合それぞれ１２及び４であった。
【０１８５】 上記したように、最初の５’末端ＯＲＦ１クローンとＨＥＶの他の単離物は部
分的に同一であり、これはＨＥＶのユニーク単離物のためにＨＥＶ感染が患者Ｕ
ＳＰ−１に関連するという説を裏付けるものである。この単離物とＨＥＶの他の
公知の単離物の関連度をより大規模に調べるために、延長したヌクレオチドと推
定アミノ酸間のアラインメントを実施した。
【０１８６】 ＵＳ単離物の相互間及びＵＳ単離物とＨＥＶの公知の変異体の間の関連性を調
べるために、ＨＥＶ ＵＳ−１、ＨＥＶ ＵＳ−２及び（公開されているデータ
ーベースから得た、表１４参照）１０個の他の完全長ＨＥＶゲノムのヌクレオチ
ド及びアミノ酸の１対比較を上記したように実施した。
【０１８７】
【表１５】 ＵＳ−１、ＵＳ−２，Ｂ１、Ｂ２、Ｉ２、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｐ１、Ｃ４及び
Ｉ１株の全ゲノムの範囲のヌクレオチド同一性を表１５に示す。ＯＲＦ１、ＯＲ
Ｆ２及びＯＲＦ３のヌクレオチド同一性をそれぞれ表１６〜１８に示す。表１７
及び１８には、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０１１９２１として入手可能な最近
単離されたブタ（Ｓ１）配列との比較も示す。
【０１８８】
【表１６】
【０１８９】
【表１７】
【０１９０】
【表１８】
【０１９１】
【表１９】
【０１９２】 更に、メチルトランスフェラーゼタンパク質をコードするＯＲＦ１ヌクレオチ
ド配列をＵＳ−１、ＵＳ−２、Ｍ１及びＰ１単離物の各々の間で比較した。ＨＥ
Ｖ ＵＳ−１ゲノムのメチルトランスフェラーゼコーディング領域は配列番号８
９の残基１〜６９３で示されるのに対して、ＨＥＶ ＵＳ−２ゲノムのメチルト
ランスフェラーゼコーディング領域は配列番号１６４の残基３６〜７５５で示さ
れる。比較結果を表１９に示す。
【０１９３】
【表２０】
【０１９４】 Ｙドメインタンパク質をコードするＯＲＦ１ヌクレオチド配列をＵＳ−１、Ｕ
Ｓ−２、Ｍ１及びＰ１単離物の各々の間で比較した。ＨＥＶ ＵＳ−１ゲノムの
Ｙドメインタンパク質コーディング領域は配列番号８９の残基６１９〜１２７２
で示されるのに対して、ＨＥＶ ＵＳ−２ゲノムのＹドメインタンパク質コーデ
ィング領域は配列番号１６４の残基６８０〜１３３４で示される。比較結果を表
２０に示す。
【０１９５】
【表２１】
【０１９６】 プロテアーゼタンパク質をコードするＯＲＦ１ヌクレオチド配列をＵＳ−１、
ＵＳ−２、Ｍ１及びＰ１単離物の各々の間で比較した。ＨＥＶ ＵＳ−１ゲノム
のプロテアーゼタンパク質コーディング領域は配列番号８９の残基１２７０〜２
０９１で示されるのに対して、ＨＥＶ ＵＳ−２ゲノムのプロテアーゼタンパク
質コーディング領域は配列番号１６４の残基１３３２〜２１５３で示される。比
較結果を表２１に示す。
【０１９７】
【表２２】
【０１９８】 超可変領域をコードするＯＲＦ１ヌクレオチド配列をＵＳ−１、ＵＳ−２、Ｍ
１及びＰ１単離物の各々の間で比較した。ＨＥＶ ＵＳ−１ゲノムの超可変領域
コーディング領域は配列番号８９の残基２０９２〜２３６４で示されるのに対し
て、ＨＥＶ ＵＳ−２ゲノムの超可変領域コーディング領域は配列番号１６４の
残基２１９４〜２４２９で示される。比較結果を表２２に示す。
【０１９９】
【表２３】
【０２００】 Ｘドメインタンパク質をコードするＯＲＦ１ヌクレオチド配列をＵＳ−１、Ｕ
Ｓ−２、Ｍ１及びＰ１単離物の各々の間で比較した。ＨＥＶ ＵＳ−１ゲノムの
Ｘドメインタンパク質コーディング領域は配列番号８９の残基２３６５〜２８４
１で示されるのに対して、ＨＥＶ ＵＳ−２ゲノムのＸドメインタンパク質コー
ディング領域は配列番号１６４の残基２４３０〜２９０６で示される。比較結果
を表２３に示す。
【０２０１】
【表２４】
【０２０２】 ヘリカーゼタンパク質をコードするＯＲＦ１ヌクレオチド配列をＵＳ−１、Ｕ
Ｓ−２、Ｍ１及びＰ１単離物の各々の間で比較した。ＨＥＶ ＵＳ−１ゲノムの
ヘリカーゼタンパク質コーディング領域は配列番号８９の残基２８９３〜３５９
１で示されるのに対して、ＨＥＶ ＵＳ−２ゲノムのヘリカーゼタンパク質コー
ディング領域は配列番号１６４の残基２９５８〜３６５６で示される。比較結果
を表２４に示す。
【０２０３】
【表２５】
【０２０４】 ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードするＯＲＦ１ヌクレオチド配列をＵ
Ｓ−１、ＵＳ−２、Ｍ１及びＰ１単離物の各々の間で比較した。ＨＥＶ ＵＳ−
１ゲノムのポリメラーゼコーディング領域は配列番号８９の残基３６３４〜５０
９４で示されるのに対して、ＨＥＶ ＵＳ−２ゲノムのポリメラーゼコーディン
グ領域は配列番号１６４の残基３６９９〜５１５９で示される。比較結果を表２
５に示す。
【０２０５】
【表２６】
【０２０６】 更に、ＵＳ−１、ＵＳ−２、Ｂ１、Ｂ２、Ｉ２、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｐ１、Ｃ
４及びＩ１株のＯＲＦ１、ＯＲＦ２及びＯＲＦ３配列によりコードされるタンパ
ク質のアミノ酸同一性／類似性をそれぞれ表２６〜２８に示す。加えて、表２７
及び２８には、ブタ配列（Ｓ１）に対する比較も示す。表２６〜２８において、
類似性は表の右上半分に示し、同一性は表の左下半分に示した。
【０２０７】
【表２７】
【０２０８】
【表２８】
【０２０９】
【表２９】
【０２１０】 加えて、メチルトランスフェラーゼタンパク質を規定するＯＲＦ１アミノ酸配
列をＵＳ−１、ＵＳ−２、Ｍ１及びＰ１単離物の各々の間で比較した。ＨＥＶ
ＵＳ−１ゲノムによりコードされるメチルトランスフェラーゼタンパク質は配列
番号９１の残基１〜２３１で示されるのに対して、ＨＥＶ ＵＳ−２ゲノムによ
りコードされるメチルトランスフェラーゼタンパク質は配列番号１６６の残基１
〜２４０で示される。比較結果を表２９に示す。
【０２１１】
【表３０】
【０２１２】 プロテアーゼタンパク質を規定するＯＲＦ１アミノ酸配列をＵＳ−１、ＵＳ−
２、Ｍ１及びＰ１単離物の各々の間で比較した。ＨＥＶ ＵＳ−１ゲノムにより
コードされるプロテアーゼタンパク質は配列番号９１の残基４２４〜６９７で示
されるのに対して、ＨＥＶ ＵＳ−２ゲノムによりコードされるプロテアーゼタ
ンパク質は配列番号１６６の残基４３３〜７０６で示される。比較結果を表３０
に示す。
【０２１３】
【表３１】
【０２１４】 Ｙドメインタンパク質を規定するＯＲＦ１アミノ酸配列をＵＳ−１、ＵＳ−２
、Ｍ１及びＰ１単離物の各々の間で比較した。ＨＥＶ ＵＳ−１ゲノムによりコ
ードされるＹドメインタンパク質は配列番号９１の残基２０７〜４２４で示され
るのに対して、ＨＥＶ ＵＳ−２ゲノムによりコードされるＹドメインタンパク
質は配列番号１６６の残基２１６〜４３３で示される。比較結果を表３１に示す
。
【０２１５】
【表３２】
【０２１６】 Ｘドメインタンパク質を規定するＯＲＦ１アミノ酸配列をＵＳ−１、ＵＳ−２
、Ｍ１及びＰ１単離物の各々の間で比較した。ＨＥＶ ＵＳ−１ゲノムによりコ
ードされるＸドメインタンパク質は配列番号９１の残基７８９〜９４７で示され
るのに対して、ＨＥＶ ＵＳ−２ゲノムによりコードされるＸドメインタンパク
質は配列番号１６６の残基７９９〜９５７で示される。比較結果を表３２に示す
。
【０２１７】
【表３３】
【０２１８】 ヘリカーゼタンパク質を規定するＯＲＦ１アミノ酸配列をＵＳ−１、ＵＳ−２
、Ｍ１及びＰ１単離物の各々の間で比較した。ＨＥＶ ＵＳ−１ゲノムによりコ
ードされるヘリカーゼタンパク質は配列番号９１の残基９６５〜１１９７で示さ
れるのに対して、ＨＥＶ ＵＳ−２ゲノムによりコードされるヘリカーゼタンパ
ク質は配列番号１６６の残基９７５〜１２０７で示される。比較結果を表３３に
示す。
【０２１９】
【表３４】
【０２２０】 超可変領域を規定するＯＲＦ１アミノ酸配列をＵＳ−１、ＵＳ−２、Ｍ１及び
Ｐ１単離物の各々の間で比較した。ＨＥＶ ＵＳ−１ゲノムによりコードされる
超可変領域は配列番号９１の残基６９８〜７８８で示されるのに対して、ＨＥＶ
ＵＳ−２ゲノムによりコードされる超可変領域は配列番号１６６の残基７０７
〜７９８で示される。比較結果を表３４に示す。
【０２２１】
【表３５】
【０２２２】 ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを規定するＯＲＦ１アミノ酸配列をＵＳ−１
、ＵＳ−２、Ｍ１及びＰ１単離物の各々の間で比較した。ＨＥＶ ＵＳ−１ゲノ
ムによりコードされるポリメラーゼは配列番号９１の残基１２１２〜１６９８で
示されるのに対して、ＨＥＶ ＵＳ−２ゲノムによりコードされるポリメラーゼ
は配列番号１６６の残基１２２２〜１７０８で示される。比較結果を表３５に示
す。
【０２２３】
【表３６】
【０２２４】 更に、本研究中ＨＥＶ ＵＳタイプファミリーに属する幾つかの別のＨＥＶ単
離物を同定した（以下の実施例１３参照）。別の単離物をＩｔ１（イタリア株）
、Ｇ１（第１ギリシャ株）及びＧ２（第２ギリシャ株）と称する。追加の配列比
較を実施し、その中にＩｔ１、Ｇ１及びＧ２配列を含め、その結果を下表３６及
び３７に示す。表３６は３７１塩基（１２３アミノ酸）ＯＲＦ１断片の範囲のＨ
ＥＶ単離物間のヌクレオチド及び推定アミノ酸同一性を示す。ＯＲＦ１断片は配
列番号８９の残基２６〜３９６に対応する。表３７は１４８塩基（４９アミノ酸
）ＯＲＦ２断片の範囲のＨＥＶ単離物間のヌクレオチド及び推定アミノ酸同一性
を示す。ＯＲＦ２断片は配列番号８９の残基３６０７〜６４５４に対応する。表
３６及び３７において示した単離物はビルマ（Ｂ１，Ｂ２）、中国（Ｃ１，Ｃ２
，Ｃ３，Ｃ４）、インド（Ｉ１，Ｉ２）、パキスタン（Ｐ１）、メキシコ（Ｍ１
）、ブタ（Ｓ１）、米国（ＵＳ−１，ＵＳ−２）、ギリシャ（Ｇ１，Ｇ２）及び
イタリア（Ｉｔ１）である。
【０２２５】 ＨＥＶ ＵＳ−１及びＨＥＶ ＵＳ−２のそれぞれのゲノムのヌクレオチド配
列を表１４で同定した他のＨＥＶ単離物の他のゲノムと一緒に用いた完全長ヌク
レオチド配列の１対比較が好ましかった。比較の結果を表１５に示す。ヌクレオ
チドレベルで、ＨＥＶ ＵＳ−１及びＨＥＶ ＵＳ−２は相互に最も密接に関連
しており、全ゲノムの範囲で９２．０％の同一性であった。完全長ビルマ様単離
物も９２．０〜９８．８％の同一性を示した。ＵＳ単離物はビルマ様単離物及び
メキシコ単離物に対して７３．５〜７４．５％同一であった。これは、７５．０
〜７６．１％というビルマ様単離物及びメキシコ単離物間のヌクレオチド同一性
と似ている。これらのデータは、ＵＳ単離物はビルマ株及びメキシコ株とは区別
されるＨＥＶの新規株変異体のメンバーであることを示す。
【０２２６】 各ゲノムの小部分、例えば個々のＯＲＦを分析するときに同様の同一性が見ら
れる。これらの値をＯＲＦ１、ＯＲＦ２及びＯＲＦ３のそれぞれについて表１６
〜１８に示す。各領域の範囲で、ビルマ単離物及びパキスタン単離物は９３．１
〜９８．９％の最高同一度を示す。メキシコ単離物はビルマ様単離物に対して７
３．６〜９０．１％の同一性であり、区別される。ＨＥＶ ＵＳ−１ヌクレオチ
ド配列分析は、ビルマ様単離物及びメキシコ単離物に対する同一性が７２％未満
であり、ＯＲＦ１配列に対する相違が有意であることを示す。同様に、ＯＲＦ２
及びＯＲＦ３配列の同一性はビルマ様単離物及びメキシコ単離物に対してそれぞ
れ７９．１％及び８６．９％未満であった。
【０２２７】 ヌクレオチドレベルで見られる変動は翻訳されたオープンリーディングフレー
ムのアミノ酸の類似性及び同一性において反映される。ＯＲＦ１は多分超可変領
域が存在するために最も逸脱している産物である。ＵＳ単離物はこの領域の範囲
で９７．５％のアミノ酸同一性を有する（表２６）。これは、ビルマ様ＯＲＦ１
タンパク質間で見られる９４．４〜９９．６％同一性に類似している。ＵＳ Ｏ
ＲＦ１産物はビルマ様タンパク質及びメキシコタンパク質に対して８０．７〜８
３．０％同一である（表２６）。これらの値は、ビルマ様単離物とメキシコ単離
物間で見られる８１．８〜８４．２％同一性に類似している。アミノ酸類似性の
値は通常同一性の値よりも最高３．５％高く、これは保守的アミノ酸置換が多数
あることを反映している。ＯＲＦ２産物は、多分ウイルスキャプシドタンパク質
としての役割のために最も保存される。ＵＳ ＯＲＦ２産物は相互に９８．０％
同一であり、ビルマ及びメキシコＯＲＦ２タンパク質と９０．１〜９２％同一で
あった（表２７）。また、これらの領域はビルマ単離物間で見られる同一性（９
７．７〜９９．７％）を反映している。ビルマ単離物とメキシコ単離物間の同一
性は、ＵＳ変異体と他の変異体間（９２．４〜９３．３％）よりもわずかに高い
。ＯＲＦ２の範囲のアミノ酸類似性は同一性の値より約１．５％高い。ＨＥＶ
ＵＳ−１及びＨＥＶ ＵＳ−２のＯＲＦ３産物は９６．７％のアミノ酸同一性を
有していた。ビルマ単離物は９６．７〜１００％のアミノ酸同一性を示した。Ｕ
Ｓ単離物のビルマ単離物及びメキシコ単離物に対するＯＲＦ３アミノ酸同一性は
、ビルマ単離物とメキシコ単離物間で見られる同一性（８５．４〜８８．６％）
よりも僅かに低く、７８．７〜８４．４％であった（表２８）。ＯＲＦ３の範囲
のアミノ酸類似性は通常同一性の値と同じであるが、幾つかの比較では類似性の
値は同一性の値よりも１．０％未満しか高くないことが示された。これらのアミ
ノ酸類似性及び同一性の値は、短アミノ酸配列の分析は完全長及び部分ヌクレオ
チド分析に対して同様の結果を与えることを示し、ＵＳ単離物がＨＥＶの既に特
性付けられている単離物と密接に関連しており、遺伝的に区別されることを示唆
している。
【０２２８】 表２７及び２８には、ブタで最近同定されたＨＥＶ様単離物（Ｍｅｎｇら，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：９８６０−９８６５（１
９９７））との１対アミノ酸配列比較が含まれている。ＯＲＦ２／３領域の範囲
の２０２１ｂｐのみが特性付けられた（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０１１９２
１）。ＵＳブタ配列はヌクレオチドレベルでＨＥＶ ＵＳ−１の対応領域と９２
％同一である。ＨＥＶ ＵＳ−１はアミノ酸レベルで最近同定されたブタウイル
スに非常に類似していることに注目されたい。例えば、ＨＥＶ ＵＳ−１及びブ
タ株はそれぞれＯＲＦ２及びＯＲＦ３配列の範囲で９７．１％及び９３．５％の
同一性を示す（表２７及び２８）。
【０２２９】 Ｇ９及びＧ２０（それぞれＧｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ８７３０６及びＸ８７３
０７）と呼ぶ中国からの２つのＨＥＶ単離物由来の２１０ヌクレオチドの部分配
列が最近文献（Ｈｕａｎｇら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，４７：３０３−
３０８（１９９５））に記載された。これらの断片は配列番号８９の残基４５３
３〜４７４２に相同のヌクレオチド配列を表す。このコード化アミノ酸配列（６
９アミノ酸残基の長さ）は配列番号９１の残基１５１２〜１５８０と相同である
。ヌクレオチド配列及び前記配列の推定されるアミノ酸配列の１対比較の結果を
表３８及び３９に示す。結果は、Ｇ９及びＧ２０単離物はこの領域の範囲のヌク
レオチドレベルで相互に８９％同一であることを示す。密接に関連しているビル
マ単離物及びパキスタン単離物はこの領域の範囲で９２．９％同一である。ＵＳ
−１単離物はこの領域の範囲で７７．１及び８１．０％を示し、ＵＳ−１単離物
がこれらの単離物とはユニークであることが示唆される。Ｇ９及びＧ２０配列は
ヌクレオチドレベルで最も密接に関連しているが、Ｇ２０の推定アミノ酸翻訳は
ＵＳ−１単離物からのＵＳ配列と最も類似／同一である（表３８）。これは、多
分分析に使用したアミノ酸の長さが短いためである可能性が高い。
【０２３０】
【表３７】
【０２３１】
【表３８】
【０２３２】 実施例７：系統発生的分析 ＨＥＶの新規なＵＳタイプ単離物及び他の単離物間の系統発生的関係を調べる
ためにヌクレオチド及びアミノ酸配列のアラインメントを実施した。前記アライ
ンメントは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａ
ｃｋａｇｅ（ウィスコンシン州マジソンに所在のＧｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔ
ｅｒ Ｇｒｏｕｐｓ）バージョン９のプログラムＰＩＬＥＵＰを用いて作成した
。配列間の進化距離を、ＤＮＡＤＩＳＴプログラム（Ｋｉｍｕｒａ ２−パラメ
ーター法）を利用し、２．０のトランジション−トランスバージョン比及びＰＨ
ＹＬＩＰパッケージ（Ｆｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎ １９９３，シアトルに所在のワ
シントン大学の遺伝学部門）バージョン３．５ｃのＰＲＯＴＤＩＳＴ（Ｄａｙｈ
ｏｆｆ ＰＡＭマトリックス）プログラムを用いて調べた。プログラムＦＩＴＣ
Ｈ（Ｆｉｔｃｈ−Ｍａｒｇｏｌｉａｓｈ法）を用いて系統樹を構築するためにコ
ンピュータ化した距離を使用した。樹のロバストを、マルチプル配列アラインメ
ント（１００組または１０００組）をプログラムＳＥＱＢＯＯＴ、ＤＮＡＤＩＳ
Ｔ、プログラムＮＥＩＧＨＢＯＲの隣接結合方法及びＣＯＮＳＥＮＳＥ（ＰＨＹ
ＬＩＰパッケージ）を用いてブーツストラップリサンプリングすることにより調
べた。７０％未満のブーツストラップ値は、系統発生的グループ化のための証拠
を与えないと見做される（Ｍｕｅｒｈｏｆｆら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ，７１：６５０１−６５０８（１９９７））。最終樹をＲＥＴＲＥＥ
（ＰＨＹＬＩＰ）を利用して中点ルーティングオプションで作成し、グラフ出力
をＴＲＥＥＶＩＥＷ（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃ
ｅｓ，１２：３５７−３５８（１９９６））を用いて作成し、その結果を図５、
６、１０及び１２に示す。
【０２３３】 完全ゲノムを用いる系統発生的分析 ＨＥＶ ＵＳ−１、ＨＥＶ ＵＳ−２及びＨＥＶの他の公知の単離物間の関連
度を広範囲に調べるために、ヌクレオチドアラインメントを実施した。完全長Ｈ
ＥＶ ＵＳ−１及びＨＥＶ ＵＳ−２ゲノムを、完全ゲノムが入手可能な１０個
のＨＥＶの他の単離物とアラインした（表１４）。
【０２３４】 ＤＮＡＤＩＳＴプログラム（Ｋｉｍｕｒａ ２−パラメーター法）を利用して
２．０のトランジション−トランシバージョン比で測定したＨＥＶ ＵＳ単離物
及びＨＥＶの他の単離物のアラインメントに基づく系統発生的距離の調査から、
ＵＳ由来の単離物と他の地域由来の単離物の間にかなりの進化距離があることが
分かる（表４０）。計算した距離はアジアに由来する単離物間の密接した関係を
も示す。ビルマ様グループ内では、完全長アラインメントから計算した最長距離
は塩基あたり０．０８５０ヌクレオチド置換である。このグループのメンバーと
ＵＳ単離物間の最短距離は０．３３２２置換である。メキシコ株は、ビルマ様グ
ループに対して０．３０５５〜０．３１３２置換、ＵＳ単離物に対して０．３３
２２〜０．３４６２置換という類似の距離を示す。ＨＥＶ ＵＳ−１とＨＥＶ
ＵＳ−２間の遺伝的距離は０．０８１２置換であり、これはビルマ様単離物間で
見られる距離に類似している。分析したウイルス配列間の相対的進化距離は、図
５に示す根無し系統樹を精査することにより明らかである。ここで、枝の長さは
進化距離に比例する。系統樹において、ビルマ様単離物、メキシコ単離物及び米
国単離物はそれぞれ主要枝を表す。更に、原型ウイルスの枝は、ブーツストラッ
プ値が１００％であることから裏付けられる。ゲノムの小セグメント（例えば、
ＯＲＦ１、ＯＲＦ２またはＯＲＦ３）を個別に分析すると、完全長配列で得た樹
に似た樹が生じ、図５に示す。これらの分析から、ＨＥＶ ＵＳ単離物がＨＥＶ
の異なる株または変異体を表し、最も異なるビルマ様単離物のようにＨＥＶ Ｕ
Ｓ−１及びＨＥＶ ＵＳ−２は相互に類似していることが分かる。
【０２３５】
【表３９】
【０２３６】 ブタＨＥＶ由来のＯＲＦ２／ＯＲＦ３に対する比較 最近発表されたブタＨＥＶ及びヒトＨＥＶ ＵＳ−１及びＨＥＶ ＵＳ−２単
離物間の関連を調べるために、完全ＯＲＦ２及びＯＲＦ３の範囲のヌクレオチド
配列を上で使用した１０個の完全長配列からの類似領域を用いて比較した（表１
４）。系統発生的分析により、ＵＳ及びブタＨＥＶ単離物間で１位置あたり０．
０７９９〜０．０８１０ヌクレオチド置換の遺伝的距離が生ずる（表４１）。こ
の値は、最も遠いビルマ様単離物間で見られた値と似ている。ＯＲＦ ２／３ヌ
クレオチド配列を分析したときに根無し系統樹でＵＳ及びブタ単離物グループは
近い（図６参照）。これらの単離物は、メキシコ単離物及びビルマ様単離物から
離れた系統発生的グループを形成する。これらのグループ分けは、ブーツストラ
ップ値が１００％であることから裏付けられる。
【０２３７】
【表４０】
【０２３８】 実施例８：ＨＥＶ血清学的研究 （Ａ）背景 早期研究で、ＨＥＶ感染の診断に有用なエピトープがＨＥＶのビルマ株及びメ
キシコ株の両方のＯＲＦ２及びＯＲＦ３のカルボキシル末端近くにあることが分
かっている。以後Ｍ３−２及びＭ４−２と称するメキシコ株由来の２つの抗原は
それぞれＯＲＦ２及びＯＲＦ３のカルボキシル末端近くに４２及び３２アミノ酸
を含む（Ｙａｒｂｏｕｇｈら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６５
：５７９０−５８７９（１９９１））。以後Ｂ３−２及びＢ４−２タンパク質と
称するＨＥＶのビルマ株由来の２つの抗原はそれぞれＯＲＦ２及びＯＲＦ３のカ
ルボキシル末端近くに４２及び３２アミノ酸を含む（上掲したＹａｒｂｏｕｇｈ
ら（１９９１））。ＨＥＶに対するＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＭクラス抗体を検出
するように設計された診断テストが上記抗原領域に基づいて開発された。ＨＥＶ
に対する抗体の検出を潜在的に高めるために、完全長ＯＲＦ３を含む別のＨＥＶ
組み換えタンパク質（Ｄａｗｓｏｎら，Ｊｏｕｒａｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏ
ｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，３８：１７５−１８６（１９９２））またはＯＲＦ２タ
ンパク質由来の別のアミノ酸配列（上掲したＤａｗｓｏｎら（１９９３））を作
成した。比較研究で、元の組み換えタンパク質及び合成ペプチド（Ｂ４−２、Ｂ
３−２、Ｍ３−２、Ｍ４−２）が公知の急性ＨＥＶ感染症例においてＨＥＶに対
する抗体を検出する際により大きな組み換えタンパク質と同程度に有効であった
ことが分かっている。ＨＥＶに対する抗体を検出するための認可テストがＡｂｂ
ｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓで製造されており、完全長のビルマ株ＯＲＦ
３タンパク質及びビルマ株ＯＲＦ２タンパク質のカルボキシル３２７アミノ酸か
ら構成されている。
【０２３９】 初期の血清学的研究でＢ３−２、Ｂ４−２、Ｍ３−２及びＭ４−２の有用性を
立証した後、Ｍ３−２及びＢ３−２抗原ペプチドの一部を形成しないＨＥＶのビ
ルマ及びメキシコ株の両方のＯＲＦ２のカルボキシ末端に更に６個のアミノ酸残
基があることが確認された。ＯＲＦ２及びＯＲＦ３のカルボキシ末端はＨＥＶの
ビルマ株及びメキシコ株にとって重要であることが判明したので、ゲノムの前記
領域に対応する合成ペプチドをＨＥＶのＵＳ−１株に対して作成した。ＯＲＦ２
のカルボキシ末端の４８アミノ酸に対応する合成ペプチドをＨＥＶのビルマ株及
びメキシコ株（それぞれ、配列番号１７２及び１７０）に対して作成し、Ｂ３−
２ｅ及びＭ３−２ｅ（ここで、“ｅ”は延長アミノ酸配列を指す）と称する。更
に、ＨＥＶ ＵＳ−１ ＯＲＦ３のカルボキシル末端の３３アミノ酸を表す合成
ペプチドをＨＥＶのビルマ株及びメキシコ株（それぞれ、配列番号１７１及び１
６９）に対して作成し、Ｂ４−２及びＭ４−２と称する。ＨＥＶ ＵＳ−１株の
ＯＲＦ２（配列番号１７４）内のエピトープに基づく合成ペプチドをＵＳ３−２
ｅと称する。ＨＥＶ ＵＳ−１ ＯＲＦ３（配列番号１７３）のカルボキシ末端
のエピトープに基づく合成ペプチドをＵＳ４−２ｅと称する。ＨＥＶのメキシコ
株及びビルマ株から誘導される前記ペプチドの各々を合成し、固相上にコートし
、合成ペプチドの相対的有用性を調べるためにＥＬＩＳＡ試験で用いた。
【０２４０】 表４２に示すように、ＨＥＶ ＵＳ−１とＨＥＶのビルマ株、メキシコ株及び
パキスタン株間のアミノ酸同一性は、ＯＲＦ２内の３−２ｅエピトープを含むア
ミノ酸に対して約８７．５〜約９１．７％、ＯＲＦ３内の４−２エピトープを含
むアミノ酸に対して約６３．６〜約７２．７％である。理論に束縛されるつもの
はないが、エピトープをコードする領域が変化するならば前記ウイルスに対する
株特異性抗体応答がありそうである。
【０２４１】
【表４１】
【０２４２】 （Ｂ）急性ＨＥＶ感染の診断におけるＥＬＩＳＡの使用 ヒトにおける急性ＨＥＶ感染の多くの症例は１つ以上のＨＥＶ組み換えタンパ
ク質または合成ペプチドに結合するＩｇＭクラス抗体を有していることが報告さ
れている。ヒトがＨＥＶに対するＩｇＭクラス抗体を有していない場合には、急
性ＨＥＶ感染の診断の基準は血清学に基づいて行うことができず、ＲＴ−ＰＣＲ
及び／または病因物質としてのＨＥＶを証明するための他の検査が必要となるこ
とがある。
【０２４３】 （Ｃ）合成ペプチドの作成 ペプチドを、Ｒａｉｎｉｎ Ｓｙｍｐｈｏｎｙ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｐｅｐｔ
ｉｄｅ ＳｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒにおいてＮ−メチルモルホリンにより与えられ
るｉｎ ｓｉｔｕ活性化による（ＨＢＴＵ）カップリング化学を用い、各残基で
４５分のカップリング時間及び所定の残基で２倍カップリングとして、０．０２
５マイクロモルスケールで標準ＦＭＯＣ固相ペプチド合成により製造した。樹脂
を通常通り開裂すると非保護ペプチドが得られ、その後にエーテル沈降及び洗浄
を行った。合成したペプチドを表４３に示す。
【０２４４】
【表４２】
【０２４５】 （Ｄ）合成ペプチドの分析 合成したペプチドを、そのアミノ酸組成について分析した。小規模合成（０．
０２５マイクロモル）で製造した粗なペプチドの品質を各溶媒に０．１％（ｖ／
ｖ）２−トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を添加したアセトニトリル／水勾配を用い
てＣ１８逆相高速液体クロマトグラフィーにより分析した。分析クロマトグラム
から、各合成からの主要ピークを集め、溶離液を質量分析法（エレクトロスプレ
ー及び／またはレーザー脱着質量分析法）により分析した。ペフチド（小規模及
び／または大規模）は、各溶媒に０．１％ ＴＦＡを添加したアセトニトリル／
水勾配を用いてＣ１８逆相ＨＰＬＣを用いて精製した。主要ピークを集め、使用
するまで凍結乾燥した。
【０２４６】 （Ｅ）ＥＬＩＳＡ試験 ＨＥＶ ＵＳ−１エピトープの有用性を、１／４インチのポリスチレンビーズ
を各ペプチドでコートすることにより調べた。具体的には、ペプチドを水または
水＋氷酢酸において可溶化し、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中に１０μｇ／ｍｌ
を含むように希釈した。全部で６０個のポリスチレンビーズを１０μｇ／ｍｌの
ペプチド溶液（１４ｍｌ）と一緒にシンチレーション管に添加し、リン酸緩衝食
塩液（ＰＢＳ）において５６℃で２時間インキュベートした。インキュベート後
、液体を吸引し、０．１％ トリトンＸ−１００（登録商標）を含有する緩衝液
と交換した。ビーズをこの溶液に６０分間さらし、流体を吸引し、ビーズをＰＢ
Ｓ緩衝液で２回洗浄した。次いで、ビーズを５％ ウシ血清アルブミン溶液と４
０℃で６０分間インキュベートした。インキュベート後、流体を吸引し、ビーズ
をＰＢＳで濯いだ。生じたビーズを５％ スクロース含有ＰＢＳ中に３０分間浸
した。次いで、流体を吸引し、ビーズを風乾した。
【０２４７】 １つの研究で、１／４インチのポリスチレンビーズを各種濃度の合成ペプチド
（１ロットあたり約５０個のビーズ）でコートし、ネガティブコントロールとし
て抗−ＨＥＶセロネガティブヒトからの血清、ポジティブコントロールとしてＨ
ＥＶ患者からの回復期の血清を用いて（以下に記載する）ＥＬＩＳＡ試験で評価
した。最高のポジティブコントロール信号／ネガティブコントロール信号比を与
えるビーズコーティング条件をビーズコーティング方法を大規模とするために選
択した。ＨＥＶ ＵＳ−１ ＯＲＦ２及びＯＲＦ３に対して２つの１，０００ビ
ーズロットを作成した後、以下のように使用した。
【０２４８】 血清または血漿サンプルをサンプル希釈剤で希釈し、サンプル中の抗体が固定
化抗原に結合し得る条件で抗原をコートした固相と混合した。洗浄後、生じたビ
ーズを固相に結合させたタマリンまたはヒト抗体に結合するホースラディッシュ
ペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）標識した抗−ヒト抗体と混合した。カットオフ値
以上の信号を発生するサンプルを反応性と見做した。
【０２４９】 より具体的には、好ましいＥＬＩＳＡフォーマットでは、抗原コートした固相
を予めサンプル希釈剤（動物血清及びノニオン性洗剤を含有する緩衝溶液）で希
釈した血清と接触させなければならない。具体的には、血清（１０μｌ）をサン
プル希釈剤（１５０μｌ）で希釈し、撹拌した。次いで、予備希釈したサンプル
（１０μｌ）をＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに添加した後、サンプル希釈剤（
２００μｌ）及び抗原コートしたポリスチレンビーズを添加した。次いで、ＥＬ
ＩＳＡプレートをＤｙｎａｍｉｃ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｓ）で常に撹拌しながら室温で１時間インキュベートした。イン
キュベート後、流体を吸引し、ウェルを蒸留水（１洗浄あたり５ｍｌ）で３回洗
浄した。次いで、上記したようにコンジュゲート希釈剤（動物血清及びノニオン
性洗剤を含有する緩衝溶液）中で希釈したＨＲＰＯ標識ヤギ抗−ヒト免疫グロブ
リン（２００μｌ）を各ウェルに添加し、ＥＬＩＳＡプレートを１時間インキュ
ベートした。次いで、ウェルを蒸留水で３回洗浄して抗原及び結合免疫グロブリ
ンを含有するビーズを各ウェルから除去した後、０．１Ｍ クエン酸塩緩衝液（
ｐＨ５．５）、０．３％ ｏ−フェニレンジアミン−２ＨＣｌ及び０．０２％
過酸化水素を含む溶液（３００μｌ）と共に試験管に入れた。室温で３０分後、
１Ｎ 硫酸を添加して反応を停止した。４９２ｎｍでの吸光度を記録した。生じ
た色の濃度は試験サンプル中に存在する抗体の量に直接比例した。各群のサンプ
ルに関して、多分ＨＥＶエピトープに対する抗体を含んでいるサンプルを該抗体
を含んでいないサンプルから分離するように予備カットオフ値を設定した。
【０２５０】 パネル１：プレスクリーニングしたパネルの検査 ＨＥＶ ＵＳ−１株由来のエピトープの有用性を立証するために、試料パネル
をＨＥＶ ＵＳ−１アミノ酸配列に基づくＥＬＩＳＡにより検査した（表４４）
。これらのサンプルについては、上記し、公表文献（上掲したＤａｗｓｏｎら（
１９９３），上掲したＰａｕｌ（１９９３））に記載されているように既存のペ
プチド及び認可されている抗−ＨＥＶ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ）の組合せを用いてＨＥＶに対する抗体についてプレスクリーニングした。
【０２５１】 前記パネルの最初の１０個は、ＨＥＶのビルマ株及びメキシコ株由来の組み換
えタンパク質及びペプチドの組合せを用いる分析により血清がＨＥＶに対する抗
体に関して陰性であった米国の志願血液ドナーから採取した試料であった。すべ
ての試料がＨＥＶ ＵＳ−１由来のＥＬＩＳＡで非反応性であった。５個の別の
試料を、急性肝炎を患っており、血清がＨＥＶ組み換え抗原及びＨＥＶのビルマ
株及びメキシコ株に基づく合成ペプチドに対するＩｇＧ及びＩｇＭクラス抗体に
対して反応性であったので急性ＨＥＶ感染と診断された患者から得た。５個の試
料のうち３個はエジプトから入手し、１個はインド、１個はノルウェー（旅行者
）から入手した。ＨＥＶ ＲＮＡは上記患者のうち５人すべてでＲＴ−ＰＣＲに
より検出された。５個の試料をＨＥＶ ＵＳ−１単離物に対する抗体について検
査し、ＩｇＧ及びＩｇＭの両クラスの抗体を各症例で検出した（表４４）。よっ
て、前記データから、ＨＥＶのＵＳ−１株由来の合成ペプチドがＨＥＶへの接触
を診断し、急性ＨＥＶ感染を診断するのに有用であることが裏付けられる。
【０２５２】
【表４３】
【０２５３】 パネル２：ＨＥＶ ＵＳ−１単離物の生物学的ソース中のＨＥＶに対する抗体 の検出 一連の血液を実施例１に記載の患者から入手し、その血清をＨＥＶ ＵＳ−１
株に対する生物学的ソースとして使用した。ＨＥＶのビルマ株及びメキシコ株で
得た血清学的データに基づいて、前記患者はＨＥＶに対する検出可能なＩｇＭク
ラス抗体がなかったのでＨＥＶ陰性と誤診されたであろう。しかしながら、ＨＥ
Ｖ ＵＳ−１株に対するＩｇＭクラス（表４５）及びＩｇＧクラス（表４６）抗
体が４個すべての採血日で検出された（表４５及び４６）。この患者の血清をＨ
ＥＶ ＵＳ ３−２ｅ及びＵＳ ４−２ペプチドに対するＩｇＭ及びＩｇＧクラ
ス抗体の存在について分析したならば、急性ＨＥＶ感染陽性と診断されたであろ
う。この診断は、患者が急性肝炎を患っており、最も重要なことは血清サンプル
中にＨＥＶ ＵＳ−１株ＲＮＡが検出され得たという所見から裏付けられる。こ
れらのデータは、ＨＥＶ ＵＳ−１株由来の合成ペプチドがＨＥＶのために急性
肝炎とより正確に診断するのに有用であり得ることを示している。
【０２５４】
【表４４】
【０２５５】
【表４５】
【０２５６】 パネル３：潜在的な急性ＨＥＶ感染の他の症例 ビルマ株及びメキシコ株に対するＩｇＭクラス抗体が陰性であった急性肝炎と
診断された５０人の患者から得た血清を集めた。５０個の血清サンプル中１０個
はＨＥＶのＵＳ株に対する抗体について陽性であった（表４７及び４８）。上記
サンプルに対してＲＴ−ＰＣＲを実施したが、１０個のサンプルはいずれもＨＥ
Ｖ ＲＮＡ陽性ではなかった。よって、本実施例で立証されているように、患者
の血清をＨＥＶ ＵＳ−１に対する抗体の存在について分析したとき不顕性ウイ
ルス肝炎は急性ＨＥＶ感染と診断され得る。
【０２５７】
【表４６】
【０２５８】
【表４７】
【０２５９】 実施例９：動物伝染研究 マカクザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）はテキサス州サンア
ントニオに所在のＳｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｂｉｏ
ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｕ（ＳＦＢＲ）から入手した。動物は、ヒトに
対するケア及び霊長類の倫理的使用を保証すべくＳＦＢＲが確立したガイドライ
ンに従って維持し、モニターした。血清ＡＬＴのベースラインレベルを得るため
に接種前少なくとも４週間の間週２回血清を採取した。ベースラインの平均＋標
準偏差の３．５倍に基づいてカットオフ（ＣＯ）値を得た。２匹のマカクにＨＥ
Ｖ陽性ＵＳＰ−１血清（０．４〜０．６２５ｍｌ）、１匹のマカクにはＨＥＶ陽
性ＵＳＰ−２血清（２．０ｍｌ）を静注により接種した。血清及び糞サンプルを
接種後（ＰＩ）最長６週間まで週２回集めた。血清をＡＬＴの変化について検査
し、ＣＯ以上の値は陽性と見做し、肝障害が示唆された。血清試料を実施例８に
上記されているようにＨＥＶに対する抗体について検査した（表４９、図７）。
血清及び糞試料をＲＴ−ＰＣＲによりＨＥＶ ＲＮＡについて検査した。マカク
血清（２５〜１００μｌ）をＱＩＡａｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡキット（Ｑｉａ
ｇｅｎ）を用いて抽出した。１０％糞懸濁液を実施例１に記載されているように
抽出した。ＲＴ ＰＣＲを実施例１２に下記するように実施した（図７）。
【０２６０】 ＵＳＰ−１血清（０．４〜０．６２５ｍｌ）を２匹のマカクザルに静脈内接種
しても感染は生じなかったが（データ示さず）、患者ＵＳ−２の血清（２．０ｍ
ｌ）を接種するとウイルス血症が生じ、血清中の肝酵素レベルが上昇した（図７
）。ＨＥＶ ＲＮＡはＰＩ１５日目に糞試料中でまず検出され、ＰＩ６４日目ま
で陽性のままであった。ＰＩ２８〜５６日の間に集めた血清試料はＨＥＶ ＲＮ
Ａ陽性であった。ＡＬＴ値の上昇がＰＩ１５日目、４４〜５８日目、７２日目及
び９３日目に記録され、ＰＩ５１日目がピーク値（１１６ＩＵ／Ｌ）であった。
【０２６１】 抗体応答を評価するために４−２及び３−２ｅペプチドに対してビルマ、メキ
シコ及び米国配列に基づく６つのＥＬＩＳＡを利用した。ＵＳ３−２ｅペプチド
アッセイのみで測定可能な応答が認められ（表４９）、ビルマまたはメキシコペ
プチドに対する交差反応性は見られなかった。ＨＥＶに対するＩｇＭクラス抗体
はＰＩ２８〜５８日目に検出された。この後に、ＰＩ４４日目に強い抗−ＨＥＶ
−ＩｇＧ応答が見られた。
【０２６２】
【表４８】
【０２６３】 実施例１０：組み換えタンパク質ＥＬＩＳＡ （Ａ）組み換え構築物 ＨＥＶ ＵＳゲノムのＯＲＦ２及びＯＲＦ３由来のＨＥＶ ＵＳ配列によりコ
ードされる大腸菌由来組み換えタンパク質を、ｐＪＯｏｒｆ３−２９（配列番号
）、ｃｋｓｏｒｆ２ｍ−２（配列番号１９２）及びＣＫＳＯＲＦ３２Ｍ−３（配
列番号１９３）と称されるＣＭＳ−ＫＤＯシンターゼ（ＣＫＳ）との融合タンパ
ク質として、或いはｐｌｏｒｆ３−１２（配列番号１９４）、ｐｌｏｒｆ２−２
．６（配列番号１９５）及びＰＬＯＲＦ−３２Ｍ−１４−５（配列番号１９６）
と称される非融合タンパク質として発現させた。組み換え融合タンパク質の構築
には、米国特許５，１２４，２５５号明細書に記載されているクローニングベク
ターｐＪＯ２０１を用いた。このベクターを制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ
及びＢａｍＨＩで消化して、ＣＫＳとのインフレームでＨＥＶ ＵＳ配列をクロ
ーニングさせた。組み換え非融合タンパク質の構築には、ラムダｐＬ発現ベクタ
ーｐＫＲＲ８２６を用いた。このベクターを制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ
及びＢａｍＨＩで消化して、ＨＥＶ ＵＳ配列をリボソーム結合サイトの直ぐ下
流でクローニングさせた。ベクター系が強力なラムダプロモーターを含んでいる
ので、温度を３０℃から温度感受性リプレッサータンパク質を不活化する４２℃
にシフトすることにより異種タンパク質合成を誘導する。構築物をクローン化し
、前記ＨＥＶタンパク質を発現させるために大腸菌Ｋ１２株ＨＳ３６細胞に形質
転換させた。
【０２６４】 ＨＥＶ ＵＳ配列をＨＥＶ ＵＳ−２ヒト血清またはマカク１３９０６糞試料
から抽出した核酸から増幅し、実施例５に上記したように逆転写した。ＯＲＦ２
のカルボキシル半分を含む（すなわち、配列番号１６７のアミノ酸残基番号３３
４〜６６０をコードする）ＯＲＦ２配列を、ＥｃｏＲＩ制限サイト及びＡＴＧ開
始コドンを含むセンスプライマー（配列番号２０８）とＦＬＡＧ（Ｅａｓｔｍａ
ｎ Ｋｏａｄｋ）と称されるユニークなペプチド配列、２つの逐次ＴＡＡ終止コ
ドン及びＢａｍＨＩ制限サイトを含むアンチセンスプライマー（配列番号１９８
）を用いて作成した。ＰＣＲ反応（５０μｌ）を製造業者が推奨するようにＬＡ
ＴＡＱ（Ｔａｋａｒａ）試薬を用いて始めた。サイクリング条件には、９４℃
×２０秒、５５℃×３０秒、７２℃×２分の４０サイクルを含めた。増幅の前に
９４℃×１分、その後に７２℃×１０分を含めた。産物をＥｃｏＲＩ及びＢａｍ
ＨＩで消化し、所望のベクターに連結させた。制限サイト間のＣＫＳ融合クロー
ンのヌクレオチド配列を配列番号１９２に示し、その翻訳物を配列番号１９９に
示す。制限サイト間の非融合クローンのヌクレオチド配列を配列番号１９５に示
し、その翻訳物を配列番号２００に示す。全ＯＲＦ３（アミノ酸１〜１２２）を
包含するＯＲＦ３配列を、ＥｃｏＲＩ制限サイト及びＡＴＧ開始コドンを含むセ
ンスプライマー（配列番号２０１）とＦＬＡＧと称されるユニークなペプチド配
列、２つの逐次ＴＡＡ終止コドン及びＢａｍＨＩ制限サイトを含むアンチセンス
プライマー（配列番号２０２）を用いて作成した。ＰＣＲ反応（５０μｌ）を実
施例５に記載のようにＱｉａｇｅｎ試薬を用いて開始した。サイクリング条件に
は、９４℃×２０秒、５５℃×３０秒、７２℃×１分の３５サイクルを含めた。
増幅の前に９４℃×１分のインキュベーション、その後に７２℃×１０分延長し
た。生じた産物をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化し、所望のベクターに連結さ
せた。制限サイト間のＣＫＳ融合クローンのヌクレオチド配列を配列番号１９１
に示し、その翻訳物を配列番号２０３に示す。制限サイト間の非融合構築物であ
るクローンを表すヌクレオチド配列を配列番号１９５に示し、その翻訳物を配列
番号２０４に示す。
【０２６５】 更に、完全長ＯＲＦ３（アミノ酸１〜１２３）及びＯＲＦ２（アミノ酸３３４
〜６６０）のカルボキシル半分を包含するキメラ構築物を作成した。ＰＣＲ反応
物（１００μｌ）中の鋳型として、配列番号１９１及び配列番号１９２を含むプ
ラスミド（約１００ｍｇ）を用いた。ＰＣＲ緩衝液及び酵素はＬＡ ＴＡＱキッ
トＴａｋａｒａ）のものであり、製造業者の指示に従って用いた。ＯＲＦ３を配
列番号２０１及び２０５に示すプライマーを用いて増幅させた。配列番号２０５
のアンチセンスプライマーは配列番号１９１のカルボキシル末端からＦＬＡＧ配
列及び停止コドンを排除し、ＡＴＧ開始コドンを含まない配列番号１９２と同一
の配列を含む。ＯＲＦ２を配列番号２０８及び１９８に示すプライマーを用いて
増幅させた。サイクリング条件はＬＡ ＴＡＱを用いて上記した通りであった。
生じた産物を１．２％アガロースゲルで分画し、切除した。ＤＮＡを製造業者（
Ｂｉｏ １０１）が記述しているようにＧｅｎｅＣｌｅａｎ ＩＩを用いてゲル
スライスから単離した。産物をガラスビーズからＨ２Ｏ（１５μｌ）に溶出させ
た。ほぼ等モル比の各産物（ＯＲＦ３産物１０μｌ及びＯＲＦ２産物１μｌ）を
、１×ＰＣＲ緩衝液、ｄＮＴＰｓ（０．５μｌ）及びＬＡ ＴＡＱ（Ｔａｋａｒ
ａ）（０．２５μｌ）を用いて末端充填反応物（２５μｌ）で混合した。この反
応を以下のサイクルにかけた。９４℃×１分；９４℃×２０秒、５５℃×３０秒
及び７２℃×１０分の１０サイクル；７２℃×１０分。この反応物（５μｌ）を
、ＬＡ ＴＡＱキット（Ｔａｋａｒａ）及び配列番号２０１及び１９８のプライ
マーを用いる増幅反応物（１００μｌ）に入れた。サイクリング条件は、９４℃
×１分、その後９０℃×２０秒、５５℃×３０秒及び７２℃×１．５分の３５サ
イクルであった。この後に、７２℃×１０分及び４℃浸漬を設けた。適当なサイ
ズの産物を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化した。この産物をｐＪＯ２
０１に連結し、同定されている適当な配列（配列番号１９３、その翻訳物を配列
番号２０６に示す）を用いてクローン化した。生じた産物をｐＫＲＲ８２６に連
結し、同定されている適当な配列（配列番号１９６、その翻訳物を配列番号２０
７に示す）を用いてクローン化した。
【０２６６】 （Ｂ）タンパク質発現及び精製 ＣＫＳ構築物を２つの培養物（５００ｍｌ）（４時間誘導）において米国特許
第５，３１２，７３７号明細書に記載されているように発現させた。ＰＬ構築物
は上記のように発現させた。誘導大腸菌培養物の凍結細胞ペレットをタンパク質
精製のための出発物質として使用した。細胞をリゾチーム、ＤＮａｓｅ及びプロ
テイナーゼ阻害剤を含む緩衝液において溶解させた。可溶性タンパク質を１１，
００００×ｇで遠心して不溶性（封入体）タンパク質から分離した。組み換えタ
ンパク質の溶解度をドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（ＰＡＧＥ）及びＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ２を用いる抗体ウェスタンブ
ロットから推定した。
【０２６７】 可溶性組み換えタンパク質を、適当な緩衝液に交換後ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ
２抗体アフィニティーゲルを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精
製した（Ｓｕｒｏｗｙら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ，７８：１８５１−１８５９（１９９７））。所要により、サンプル及び
クロマトグラフィー緩衝液に１０ｍＭ β−メルカプトエタノールを含有させた
Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（登録商標）Ｓ−２００ゲル濾過クロマトグラフィーにかけ
て更に精製した。精製タンパク質を、２８０ｎｍでの吸光度を測定することによ
り定量化した。吸光度をタンパク質１ｍｇに換算するために推定吸光係数１を用
いた。タンパク質純度を、ＳＤＳ ＰＡＧＥにより分画化したタンパク質を予め
純度を測定した標準物質を用いて走査デンシトメトリー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｄｅｎａｍｉｃｓ）にかけて測定した。
【０２６８】 （Ｃ）ＥＬＩＳＡ 組み換えＨＥＶ ＵＳ構築物の潜在的有用性を調べるために、固相ＥＬＩＳＡ
を実施し、評価した。すべての組み換えＨＥＶ ＵＳタンパク質を下記するよう
に固相上にコートした。簡単に説明すると、１００ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐ
Ｈ７．６）中に希釈した０．５〜１０μｇ／ｍｌの濃度の量のＰＪＯＯＲＦ３−
２９を用いて１／４”ポリスチレンビーズをコートした。１つの濃度条件あたり
６０個のビーズを緩衝液（約１４ｍｌ）においてコートし、４０℃で２時間ひっ
くり返して回転させた。コーティング溶液を吸引し、コーティングの残りの手順
は実施例８のセクションＥ、第１段落に記載されているように実施した。
【０２６９】 ＥＬＩＳＡをｐＪＯｒｆ３−２９コートビーズを用いて実施した。簡単に説明
すると、血清または血漿を上記したＳｐｅｃｉｍｅｎ Ｄｉｌｕｅｎｔ（ＳｐＤ
）で１：１６に希釈した。次いで、この調製物の１０μｌアリコートを反応トレ
ーのウェルに添加した後、ＳｐＤ（２００μｌ）を添加した。１ウェルあたり１
個のコートビードを添加し、Ｄｙｎａｍｉｃ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ（Ａｂｂｏｔ
ｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｓ）を用いて動的モードにおいて３７℃で１時間イン
キュベートした。インキュベート後、流体を吸引し、各ビードを脱イオン水で３
回洗浄した（洗浄１回あたり５ｍｌ）。次いで、ビーズをＨＰＲＯ標識したヤギ
抗−ヒトＩｇＧまたはＩｇＭコンジュゲート（２００μｌ）とインキュベートし
、上記したコンジュゲート希釈剤で希釈し、３７℃で３０分間インキュベートし
た。次いで、上記のようにコンジュゲートを吸引し、ビーズを洗浄した。発色及
び吸光度を実施例８のセクションＥに記載されているように測定した。
【０２７０】 前記構築物の免疫反応性を確認するために、実施例９に記載のＨＥＶ ＵＳ−
２を実験的に感染させたマカク＃１３９０３からの一連の血液サンプルをｐＪＯ
ｏｒｆ３−２９に対するＩｇＭ及びＩｇＧ抗体について検査した。図１に示すよ
うに、ＩｇＭ抗体は感染後（ＰＩ）５１日目に検出され、ＡＬＴ値がピークに達
する７２日目まで評価し続けた。ｐＪＯｏｒｆ３−２９に対するＩｇＧ抗体は最
初ＰＩ５６日目に検出され、１０７日目まで陽性のままであった（表５０）。
【０２７１】 ＨＥＶ ＵＳ ＯＲＦ３を表すがＣＫＳ融合パートナーを欠く第２構築物ｐｌ
ｏｒｆ３−１２も上記と同一のＥＬＩＳＡフォーマットで評価した。ｐｌｏｒｆ
３−１２に対するＩｇＧ抗体を同様に実験的に感染させたマカクからの一連の血
液で評価した。ｐｌｏｒｆ３−１２に対するＩｇＧ抗体がＰＩ５８日目に検出さ
れ、１０７日目まで陽性のままであった（表５０）。
【０２７２】
【表４９】
【０２７３】 ブタＨＥＶ及びＵＳ−２単離物間の相同％が高いために、ｐＪＯｏｒｆ３−２
９ ＥＬＩＳＡも米国のブタから単離した血清中の免疫反応性ＩｇＧ及びＩｇＭ
の両方の罹患率を調べるために使用した（表５１）。このアッセイは上記したよ
うに実施したが、ただし抗−ヒトコンジュゲートの代わりにＨＰＲＯ−コンジュ
ゲートした標識抗−ブタ免疫グロブリン（ＩｇＧまたはＩｇＭ）を使用した。
【０２７４】
【表５０】
【０２７５】 反応性試料を確認するために、ブロッキングアッセイを実施した。簡単に説明
すると、予備希釈した１：１６試料の１０μｌアリコートを反応トレーの２つの
ウェルに添加した。１つのウェルは標準アッセイのために使用し、もう１つのウ
ェルはブロッキングアッセイのために使用した。標準アッセイのためのＥＬＩＳ
Ａは、ｐＪＯｏｒｆ３−２９抗原コートしたビーズを添加する前に室温で３０分
間プレインキュベートするステップを含めた以外は上記のように実施した。ブロ
ッキングアッセイのために、ｐＪＯｏｒｆ３−２９をＳｐＤ（ブロッキング試薬
）に対して固相上よりも１０倍モル過剰添加した。１反応あたり２００μｌのブ
ロッキング試薬を添加し、ｐＪＯｏｒｆ３−２９抗原コートしたビーズを添加す
る前に室温で３０分間プレインキュベートした。アッセイの残りは、抗−ヒトコ
ンジュゲートの代わりにＨＰＲＯ−コンジュゲートした抗−ブタコンジュゲート
（ＩｇＧ）を使用した以外はブタアッセイに関して上記したように実施した。
【０２７６】 ブロッキング率（％）は、式： ［（Ａ４９２ｎｍ標準アッセイ−Ａ４９２ｎｍブロッキングアッセイ）／Ａ４９ ２ｎｍ 標準アッセイ］×１００ を用いて求めた。５０％以上のブロッキング率を示した試料がＨＥＶ ｐＪＯｏ
ｒｆ３−２９に対するＩｇＧ抗体に対して反応性であると見做された。代表的な
ＩｇＧ陽性及びＩｇＧ陰性ブタサンプル及びブロッキング結果を表５２に示す。
【０２７７】
【表５１】
【０２７８】 ブロッキングアッセイに加えて、別の組のブタ試料に対してウェスタンブロッ
トを実施した。簡単に説明すると、ＨＥＶ ｐＪＯｏｒｆ３−２９（５０μｇ）
及び“ＣＫＳのみ”タンパク質（５０μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画化し、分
画化したタンパク質をニトロセルロースに移した。ニトロセルロースの３ｍｍス
トリップを切断し、環状ローターにおいて室温で１０％大腸菌ライゼートを含有
するタンパク質ベース緩衝液において１：１００希釈で一次抗体と一晩インキュ
ベートした。翌日、ストリップを０．３％ ツイーン／ＴＢＳ（ＴＢＳＴ）で３
回洗浄後ＴＢＳＴで０．５μｇ／ｍｌに希釈したＨＰＲＯ−コンジュゲートした
抗−ブタ免疫ＩｇＧコンジュゲートを添加した。ストリップを室温で回転させな
がら４時間インキュベートした。次いで、ブロットをＴＢＳＴで３回洗浄した後
ＴＢＳで２回洗浄した。ブロットを基質として４−クロロ−１−ナフトールを用
いて展開させた。水を添加して反応を停止し、バンド強度を記録した。試料がｐ
ＪＯｏｒｆ３−２９（約４０ｋＤ）に関して正確な分子量のバンドを示し、“Ｃ
ＫＳのみ”バンド（約２９ｋＤ）を含む領域では反応性がない場合にはＨＥＶに
対して特異的反応性を有すると判定された。ｐＪＯｏｒｆ３−２９ウェスタンブ
ロットに対して実施した２０個のブタ血清の結果を表５３に示す。ブタ血清は、
“ＣＫＳのみ”バンドと非特異的反応性を示さなかった。
【０２７９】
【表５２】
【０２８０】 これらのデータから、ＨＥＶ ＵＳ組み換えタンパク質がＨＥＮ接触を診断す
る際に有用であることが示唆される。
【０２８１】 実施例１１：コンセンサスプライマー ＨＥＶ ＯＲＦ１、ＯＲＦ２及びＯＲＦ３に対するコンセンサスオリゴヌクレ
オチドプライマーをアジア、メキシコ及び米国由来の単離物の完全長配列間の保
存領域に基づいて設計した（図９）。ＯＲＦ１プライマーはビルマ単離物（Ｇｅ
ｎＢａｎｋ受託番号Ｍ７３２１８）のヌクレオチド５６〜７９及び４７３〜４５
１のメチルトランスフェラーゼ領域内に位置しており、４１８ヌクレオチド長の
産物を増幅させる。ＯＲＦ１プライマーには、 ＨＥＶＣｏｎｓＯＲＦ１−ｓｌ；ＣＴＧＧＣＡＴＹＡＣＴＡＣＴＧＣＹＡＴＴＧ
ＡＧＣ（配列番号１４７）及び ＨＥＶＣｏｎｓＯＲＦ１−ａｌ；ＣＣＡＴＣＲＡＲＲＣＡＧＴＡＡＧＴＧＣＧＧ
ＴＣ（配列番号１４８） が含まれる。
【０２８２】 ビルマ単離物の６２９８〜６３２１及び６４９４〜６４７０位置のＯＲＦプラ
イマーは１９７ヌクレオチド長の産物を生ずる。ＯＲＦ２プライマーには、 ＨＥＶＣｏｎｓＯＲＦ２−ｓｌ；ＧＡＣＡＧＡＡＴＴＲＡＴＴＴＣＧＴＣＧＧＣ
ＴＧＧ（配列番号１５０）及び ＨＥＶＣｏｎｓＯＲＦ２−ａｌ；ＣＴＴＧＴＴＣＲＴＧＹＴＧＧＴＴＲＴＣＡＴ
ＡＡＴＣ（配列番号１２６） が含まれる。
【０２８３】 第２ラウンドの増幅の場合、ＯＲＦ１及びＯＲＦ２に対してそれぞれ２８７及
び１４５ヌクレオチド長の産物を生じさせるために内部プライマーを使用した。
ＯＲＦ１プライマーには、 ＨＥＶＣｏｎｓＯＲＦ１−ｓ２；ＣＴＧＣＣＹＴＫＧＣＧＡＡＴＧＣＴＧＴＧＧ
（配列番号１７７）及び ＨＥＶＣｏｎｓＯＲＦ１−ａ２；ＧＧＣＡＧＷＲＴＡＣＣＡＲＣＧＣＴＧＡＡＣ
ＡＴＣ（配列番号１７８） が含まれる。
【０２８４】 ＯＲＦ２プライマーには、 ＨＥＶＣｏｎｓＯＲＦ２−ｓ２；ＧＴＹＧＴＣＴＣＲＧＣＣＡＡＴＧＧＣＧＡＧ
Ｃ（配列番号１５２）及び ＨＥＶＣｏｎｓＯＲＦ２−ｓ２；ＧＴＴＣＲＴＧＹＴＧＧＴＴＲＴＣＡＴＡＡＴ
ＣＣＴＧ（配列番号１２８） が含まれる。
【０２８５】 ＰＣＲ反応物は製造業者（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）の指示に従って２ｍＭ
のＭｇＣｌ２及び０．５μＭの各オリゴヌクレオチドプライマーを含め、実施例
５に記載のタッチダウンＰＣＲを用いて増幅した。増幅した産物を１．５％アガ
ロースゲルを用いて分離し、適当なサイズを有するＰＣＲ産物の存在について分
析した。このプライマーを、ＨＥＶ ＵＳ−２を含む血清及び糞中のウイルスの
存在を実施例８及び図７に記載されているように検出するために用いた。更に、
前記プライマーはビルマ様株６Ａ、７Ａ、９Ａ及び１２Ａを含めたＨＥＶの多種
多様変異体、ギリシャ由来の２つの異なる単離物（以下の実施例１３参照）、イ
タリア由来のユニークな単離物及び米国由来の２つの単離物（以下の実施例１３
参照）と反応することが判明した。更に、前記プライマーを使用して、中国の遼
寧省の急性散在性肝炎と臨床診断された患者（Ｓ１５）からの単離物を同定した
。結果を下表５４に示す。
【０２８６】
【表５３】
【０２８７】 実施例１２：一次ヒト胎児腎細胞におけるＨＥＶ ＲＮＡの検出 １０×１０６細胞を含む凍結細胞ペレットを融解し、ダルベッコリン酸塩緩衝
食塩液（１．０ｍｌ）に再懸濁した。ＲＮＡを細胞ペレット（２０μｌ；２×１
０５細胞）から実施例１に記載のＵｌｔｒａｓｐｅｃ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓ
ｙｓｔｅｍを用いて抽出した。ｃＤＮＡ合成を上記のように抽出した核酸（ＲＮ
Ａ）に対して実施、ランダムヘキサマーを用いてプライムした。次いで、上記ｃ
ＤＮＡに対して、実施例１１に記載のように０．５μＭの最終濃度でウイルスゲ
ノムのＯＲＦ−１及びＯＲＦ−２領域由来の縮重プライマーを用いてＰＣＲを実
施した。
【０２８８】 上記アッセイの性能をモニターするために、一次ヒト腎細胞及びＨＥＶ ＵＳ
−２陽性血清を用いるポジティブコントロールを実験計画に含めた。２つのポジ
ティブコントロールを、２×１０５個のＨＥＶ陰性一次ヒト腎細胞を公知のＨＥ
Ｖ ＵＳ−２陽性血清標本（２．５μｌ及び２５μｌ）でスパイクすることによ
り調製した。ポジティブコントロール血清もヒト腎細胞を添加せずに試験した。
【０２８９】 一次ヒト腎細胞ペレットの１９個のロットをＯＲＦ１及びＯＲＦ２由来の２つ
の縮合プライマー組を用いて上記アッセイで試験した。結果を下表５５に要約す
る。試験した細胞ペレットのいずれのロットもポジティブコントロールでみられ
るような陽性結果を示さなかった。
【０２９０】
【表５４】
【０２９１】 実施例１３：別のＵＳタイプ単離物の同定及び延長 （Ａ）イタリア単離物（Ｉｔ１と称する）の同定 ＲＮＡを血清（２５〜５０μｌ）からＱＡＩＡａｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡキ
ット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者が記述しているように用いて抽出した。ただし
、血清（２５〜５０μｌ）をＰＢＳ（１００μｌ）で希釈し、最終溶離をＲＮａ
ｓｅ非含有水（１００μｌ）で実施した。ＲＴ反応はランダムプライムした。Ｐ
ＣＲは実施例５に上記したＨＥＶ ＵＳ−１プライマーを用いた。プライマー（
配列番号９４及び配列番号９６）を用いて増幅後２９４ｂｐ産物が生じた。この
産物を実施例３に記載のようにクローン化し、配列決定し、配列番号１７９に示
す。
【０２９２】 Ｉｔ１単離物を以下のように延長させた。ＲＮＡを実施例５に上記されている
ように血清（２５〜５０μｌ）から抽出した。ＲＴ反応はランダムプライムした
。ＰＣＲは実施例１１に上記したＨＥＶ ＣＯＮＳＥＮＳＵＳプライマーを実施
例３に上記したようにタッチダウンＰＣＲにおいて用いた。配列番号１４７及び
１４８に示すプライマーを用いて、配列番号１８０に示す配列を有する産物を生
成した（反応ｚ２，４１８ｂｐ）。配列番号１５０及び１２６に示すプライマー
を用いて、配列番号１８１に示す配列を有する産物を生成した（反応ｚ３，１９
７ｂｐ）。１×ＰＣＲ緩衝液及び２０％ Ｑ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｑｉａｇｅｎ
）の存在下で、配列番号１８２及び１８３に示すプライマーを用いて配列番号１
８４に示す配列を有する産物を生成した（反応ｚ４，２３４ｂｐ）。ゲノムの３
’末端をＰＣＲ１では配列番号１５０及び８５に示すプライマー、ＰＣＲ２では
配列番号１５２及び８５に示すプライマーを用いて実施例３に上記した３’ＲＡ
ＣＥにより単離して、配列番号１８５に示す配列を有する産物を生成した（反応
ｚ５，８９０ｂｐ）。産物を実施例３に記載のようにクローン化し、配列決定し
、コンセンサス配列を作成した。これらの領域を図８に示し、配列番号１８０、
１８４及び１８６に示す、前記領域のアミノ酸翻訳を配列番号１８７、１８８、
１８９、１９０及び１９７に示すアミノ酸配列で表す。
【０２９３】 （Ｂ）２つのギリシャ単離物（Ｇ１及びＧ２と呼ぶ）の同定 病気が流行している地域へ旅行したことがない２人の急性肝炎患者をビルマ単
離物（Ｐｓｉｃｈｏｇｉｏｕ Ｍ．Ａ．ら，「急性非Ａ非Ｂ型肝炎患者のコホー
トにおけるＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）感染(Hepatitis E virus (HEV) infecti
on in a cohort of patients with acute non-A, non-B hepatitis)」，Ｊｏｕ
ｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２３：６６８−６７３（１９９５））
に基づくプライマーを用いて分析した。患者Ｇ２のみがＰＣＲ陽性であると判明
した。ＲＮＡを実施例１２に上記したように単離し、ＰＣＲを実施例１１に上記
のコンセンサスプライマーを用いて実施した。ＯＲＦ１及びＯＲＦ２プライマー
組により、両方の患者から予想されるサイズを有する産物が生成した。この産物
を実施例３に上記したようにクローン化し、配列決定した。患者Ｇ１からＯＲＦ
１及びＯＲＦ２コンセンサスプライマーを用いて生成した産物をそれぞれ配列番
号２０９及び２１１に示す。患者Ｇ２からＯＲＦ１及びＯＲＦ２コンセンサスプ
ライマーを用いて生成した産物をそれぞれ配列番号２１３及び２１５に示す。Ｇ
１がＰＣＲ陽性であると同定されたことから、コンセンサスプライマーがビルマ
株特異的プライマーよりも有用であることが立証される。
【０２９４】 Ｇ１及びＧ２由来の追加配列も、実施例３に上記した配列番号１９の作成の場
合のようにプライマー（配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８）を用い
て得た。ただし、ＰＣＲのためにランダムプライマーｃＤＮＡを用い、増幅には
９４℃×２０秒、６０℃×３０秒及び７２℃×１分の１０サイクル、その後に９
４℃×２０秒、５５℃×３０秒及び７２℃×１分の１０サイクル及びその後に９
４℃×２０秒、５０℃×３０秒（−０．３℃／サイクル）及び７２℃×１分の３
０サイクルを含めた。この後に、７２℃×７分の延長サイクルを続けた。患者Ｇ
１から生成した産物を配列番号２１７に示す。患者Ｇ２から生成した産物を配列
番号２２０に示す。
【０２９５】 米国、中国、ギリシャ、イタリア、メキシコ及びビルマ様単離物のヌクレオチ
ド配列のアラインメイトを前記単離物の相互の関係を調べるために実施した。イ
タリア単離株の相違は、ゲノムのＯＲＦ１領域由来の産物をビルマ（Ｂ１）、メ
キシコ（Ｍ１）及び米国（ＵＳ−１）由来の原型単離物と比較したときの核酸同
一性がそれぞれ７７．６％、７８．４％及び８４．６％であることにより裏付け
られる（表３６）。イタリア単離株の相違は、ゲノムのＯＲＦ２領域由来の産物
をビルマ、メキシコ及び米国由来の原型単離物と比較したときの核酸同一性がそ
れぞれ８３．３％、７９．７％及び８７．８％であることによっても裏付けられ
る（表３７）。ビルマ、メキシコ及び米国由来の原型単離物間のヌクレオチド同
一性は両領域の範囲で７５．５〜８２．４％である。これらの同一領域の範囲で
、ビルマ様グループを含む単離物は９１．２％以上の非常に高い同一性を有する
。
【０２９６】 ＯＲＦ１及びＯＲＦ２増幅配列の比較から、２人のギリシャ人患者からの単離
物は相互に全く異なっており、ＯＲＦ１及びＯＲＦ２領域の範囲でそれぞれ８４
．４％及び８７．２％のヌクレオチド配列同一性を示すことが分かる。ヌクレオ
チドレベルで、ギリシャ、イタリア及び米国単離物間の同一％はＯＲＦ１産物に
対して８１．９〜８６．８％（表３６）、ＯＲＦ２産物に対して８２．４〜８７
．８％（表３７）である。これらの値は、ＯＲＦ１及びＯＲＦ２の両方に対する
ビルマ様単離物間のヌクレオチド同一性の最低％が９１．２％以上であるのに比
べて低い。米国、イタリアまたはギリシャ単離物とビルマまたはメキシコ単離物
間のＯＲＦ１断片由来のアミノ酸同一性を比較すると、８７．８〜９３．５％で
ある（表３６）。これらの値は、ビルマ単離物とメキシコ単離物間の相違（９３
．５〜９５．１％）（表３６）と同等またはそれ以下であり、非流行地域由来の
単離物は流行地域を起源とする単離物とは区別されることが分かる。
【０２９７】 分析したウイルス配列間の相対的進化距離は、１対距離から作成した根無し系
統樹の精査から明白である。ここでは、枝の長さが単離物間の相対的遺伝的関係
に比例している。ＯＲＦ１（図１０）またはＯＲＦ２（図１１）配列のアライン
メントに基づく系統樹は全トポロジーにおいて全く同一である。ビルマ様単離物
及びメキシコ単離物は樹の１端の主要枝を表す。米国人単離物はメキシコ単離物
及びビルマ単離物から離れた別のグループを形成する。ＯＲＦ２由来のブタＨＥ
Ｖ様配列は米国人単離物と密接に関連している。３つのヨーロッパ単離物は３つ
の別の異なる枝を形成し、イタリア単離物が米国単離物に最も密接に関連してい
る。
【０２９８】 実施例１４：オーストリア及びアルゼンチン由来の別のＵＳタイプ単離物の同 定 ＨＥＶが流行していると見られる地域に旅行したことがない３人の急性肝炎患
者の血清からＲＮＡを実施例１２に上記したように単離し、ＰＣＲを実施例１１
に上記したコンセンサスプライマーを用いて実施した。１人はオーストリア患者
Ａｕ１（Ｗｏｒｍら，「オーストリアにおける散発性Ｅ型肝炎(Sporadic hepati
tis E in Austria)」，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒａｎａｌ ｏｆ Ｍ
ｅｄｉｃｉｎｅ，３３９：１５５４−１５５５（１９９８））であり、他の２人
はアルゼンチン患者であった。ＯＲＦ１及びＯＲＦ２プライマー組を用いて、す
べての患者から予想されるサイズの産物が生成された。この産物を実施例３に上
記したようにクローン化し、配列決定した。患者Ａｕ１からＯＲＦ１及びＯＲＦ
２コンセンサスプライマーを用いて生成した産物をそれぞれ配列番号２４３及び
２４５に示す。患者Ａｒ１からＯＲＦ１及びＯＲＦ２コンセンサスプライマーを
用いて生成した産物をそれぞれ配列番号２４７及び２４９に示す。患者Ａｒ２か
らＯＲＦ１及びＯＲＦ２コンセンサスプライマーを用いて生成した産物をそれぞ
れ配列番号２５１及び２５３に示す。Ａｕ１、Ａｒ１及びＡｒ２に対してａ１及
びｓ１プライマーを用いるＯＲＦ１ ＰＣＲの第１ラウンド及びａ２及びｓ２プ
ライマーを用いるネステッドＯＲＦ１ ＰＣＲの第２ラウンド後ＰＣＲ産物が得
られた。Ａｕ１及びＡｒ２に対してａ１及びｓ１プライマーを用いるＯＲＦ２
ＰＣＲの第１ラウンド及びａ２及びｓ２プライマーを用いるネステッドＯＲＦ２
ＰＣＲの第２ラウンド後ＰＣＲ産物が得られた。Ａｒ１からの産物は、ａ２及
びｓ２プライマーを用いるネステッドＯＲＦ２ ＰＣＲの第２ラウンド後にのみ
検出された。
【０２９９】 米国、中国、ギリシャ、イタリア、オーストリア、アルゼンチン、メキシコ及
びビルマ様単離物のヌクレオチド配列のアラインメントを実施例６に記載されて
いるように実施して、前記単離物の相互の関係を調べた。オーストリア単離物Ａ
ｕ１の相違は、ゲノムのＯＲＦ１領域由来の産物をビルマ（Ｂ１）、メキシコ（
Ｍ１）及び米国（ＵＳ−１）由来の原型単離物と比較したときの核酸同一性がそ
れぞれ７７．１％、７８．２％及び８７．９％であることにより裏付けられる（
表５６）。オーストリア単離物の相違は、ゲノムのＯＲＦ２領域由来の産物をビ
ルマ（Ｂ１）、メキシコ（Ｍ１）及び米国（ＵＳ−１）由来の原型単離物と比較
したときの核酸同一性がそれぞれ８５．１％、７９．１％及び８３．１％である
ことによっても裏付けられる（表５７）。アルゼンチン単離物Ａｒ２の相違は、
ゲノムのＯＲＦ１領域由来の産物をビルマ（Ｂ１）、メキシコ（Ｍ１）及び米国
（ＵＳ−１）由来の原型単離物と比較したときの核酸同一性がそれぞれ７６．０
％、７６．０％及び８４．９％であることにより裏付けられる（表５６）。Ａｒ
２単離物の相違は、ゲノムのＯＲＦ２領域由来の産物をビルマ（Ｂ１）、メキシ
コ（Ｍ１）及び米国（ＵＳ−１）由来の原型単離物と比較したときの核酸同一性
がそれぞれ８５．８％、８２．４％及び８５．８％であることにより裏付けられ
る（表５７）。アルゼンチン単離物Ａｒ１の相違は、ゲノムのＯＲＦ１領域由来
の産物をビルマ（Ｂ１）、メキシコ（Ｍ１）及び米国（ＵＳ−１）由来の原型単
離物と比較したときの核酸同一性がそれぞれ７６．６％、７７．６％及び８５．
７％であることにより裏付けられる（表５６）。ビルマ（Ｂ１）、メキシコ（Ｍ
１）及び米国（ＵＳ−１）由来の原型単離物間のヌクレオチド同一性は２つの領
域の範囲で７５．５〜８２．４％である。同一領域の範囲で、ビルマ様グループ
を含む単離物は９１．２％以上という非常に高い同一性を有する。ネステッドＯ
ＲＦ２ ＰＣＲ産物のみがアルゼンチン単離物Ａｒ１から得られたが、Ａｒ２単
離物の相違はゲノムのＯＲＦ２領域由来の小産物をビルマ（Ｂ１）、メキシコ（
Ｍ１）及び米国（ＵＳ−１）由来の原型単離物と比較したときの核酸同一性が８
０．６％であることにより裏付けられる（表５７）。
【０３００】 ヌクレオチドレベルで、（ＵＳ−１及びＵＳ−２間の同一性を除き）オースト
リア、アルゼンチン、ギリシャ、イタリア及び米国単離物間の同一％はＯＲＦ１
産物に対して８０．６〜８９．８％である（表５６）。ヌクレオチドレベルで、
（ＵＳ−１、ＵＳ−２、Ａｒ−１及びＡｒ−２間の同一性を除き）オーストリア
、アルゼンチン、ギリシャ、イタリア及び米国単離物間の同一％はＯＲＦ２産物
に対して８０．６〜８９．２％である（表５７）。これらの値は、ＯＲＦ１及び
ＯＲＦ２に対するビルマ様単離物間のヌクレオチド同一性の最低％が９１．２％
あるのに比べて低い。
【０３０１】
【表５５】
【０３０２】
【表５６】
【０３０３】 ＯＲＦ１及びＯＲＦ２増幅配列の比較から、２人のアルゼンチン患者からの単
離物は相互に全く異なり、ＯＲＦ１及びＯＲＦ２領域の範囲でそれぞれ８８．４
％及び９１．４％のヌクレオチド配列同一性を示すことが分かる。ＯＲＦ１に対
する値は、ＯＲＦ１に対してビルマ様単離物間のヌクレオチド同一性の最低％が
９１．４％であるのに比べて低い。しかしながら、ＯＲＦ２の場合、９１．８％
というアルゼンチン由来の２つの単離物間のヌクレオチド同一性は多分断片の長
さがより短いためにビルマ様単離物とＯＲＦ２間の同一性で見られる範囲内であ
る。
【０３０４】 系統発生的分析を実施例７に記載されているように実施した。分析したウイル
ス配列間の相対的進化距離は１対距離から作成した根無し系統樹を精査すること
により明白である。ここで、枝の長さは単離物間の相対的遺伝的関係に比例する
。ＯＲＦ１由来の３７１ヌクレオチド（図１４）、Ａｒ１を除くＯＲＦ２由来の
１４８ヌクレオチド（図１５）またはＡｒ１を含めたＯＲＦ２由来の９８ヌクレ
オチド（図１６）のアラインメントに基づく系統樹は全トポロジーにおいて非常
に類似している。ビルマ様単離物及びメキシコ単離物は樹の１端で主要枝を表す
。米国人単離物はメキシコ及びビルマ単離物から離れた別のグループを形成する
。ブタＨＥＶ様配列は米国人単離物と密接に関連している。４つのヨーロッパ単
離物及び２つのアルゼンチン単離物もメキシコ単離物及びビルマ単離物から離れ
た枝を形成する。米国、ギリシャ、イタリア、オーストリア及びアルゼンチン単
離物で表される米国タイプの単離物とビルマ様及びメキシコ単離物間の主要枝は
、すべての樹において７５．７％以上のブーツストラップ値により裏付けられる
。
【０３０５】 実施例１５：新規な縮合プライマー ＨＥＶ ＯＲＦ１及びＯＲＦ２に対するコンセンサスオリゴヌクレオチドプラ
イマーから誘導した縮合プライマーを、実施例１１に記載のアジア、メキシコ及
び米国由来の単離物とギリシャ及びイタリア由来の単離物の完全長配列間の保存
領域に基づいて設計した。ＯＲＦ１プライマーはビルマ単離物（ＧｅｎＢａｎｌ
受託番号Ｍ７３２１８）のヌクレオチド４７３〜４５１のメチルトランスフェラ
ーゼ領域内に位置し、実施例１１に記載のＨＥＶＣｏｎｓＯＲＦ１−ｓ１（配列
番号１４７）と組合せて使用したときに４１７ヌクレオチド長の産物を増幅する
。新規なＯＲＦ１プライマーの組合せには、 ＨＥＶＣｏｎｓＯＲＦ１−ｓ１；ＣＴＧＧＣＡＴＹＡＣＴＡＣＴＧＣＹＡＴＴＧ
ＡＧＣ（配列番号１４７）及び ＨＥＶＣｏｎｓＯＲＦ１Ｎ−ａ１；ＣＣＲＴＣＲＡＲＲＣＡＲＴＡＧＧＴＧＣＧ
ＧＴＣ（配列番号２５５） が含まれる。
【０３０６】 ビルマ単離株の６４９４〜６４７０の位置の新規なＯＲＦ２プライマーは実施
例１１に記載のＨＥＶＣｏｎｓＯＲＦ２−ｓ１（配列番号１５０）と組合せて使
用したときに１９７ヌクレオチド長の産物を生成する。新規なＯＲＦ２プライマ
ーには、 ＨＥＶＣｏｎｓＯＲＦ２−ｓ１；ＧＡＣＡＧＡＡＴＴＲＡＴＴＴＣＧＴＣＧＧＣ
ＴＧＧ（配列番号１５０）及び ＨＥＶＣｏｎｓＯＲＦ２Ｎ−ａ１；ＣＹＴＧＹＴＣＲＴＧＹＴＧＧＴＴＲＴＣＡ
ＴＡＡＴＣ（配列番号２５６） が含まれる。
【０３０７】 第２ラウンドの増幅の場合には、実施例１１に記載のようにＯＲＦ１及びＯＲ
Ｆ２に対してそれぞれ２８７及び１４５ヌクレオチド長の産物を生成するために
内部プライマーを使用することができる。ＯＲＦ１プライマーの新規な組合せに
は、 ＨＥＶＣｏｎｓＯＲＦ１Ｎ−ｓ２；ＣＹＧＣＣＹＴＫＧＣＧＡＡＴＧＣＴＧＴＧ
Ｇ（配列番号２５７）及び ＨＥＶＣｏｎｓＯＲＦ１−ａ２；ＧＧＣＡＧＷＲＴＡＣＣＡＲＣＧＣＴＧＡＡＣ
ＡＴＣ（配列番号１７８） が含まれる。
【０３０８】 ＯＲＦ２プライマーには、 ＨＥＶＣｏｎｓＯＲＦ２−ｓ２；ＧＴＹＧＴＣＴＣＲＧＣＣＡＡＴＧＧＣＧＡＧ
Ｃ（配列番号１５２）及び ＨＥＶＣｏｎｓＯＲＦ２Ｎ−ａ２；ＧＹＴＣＲＴＧＹＴＧＲＴＴＲＴＣＡＴＡＡ
ＴＣＣＴＧ（配列番号２５８） が含まれる。
【０３０９】 ＰＣＲ反応物は、製造業者（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）の指示に従って２ｍ
ＭのＭｇＣｌ２及び０．５μＭの各プライマーを含み、実施例５に記載のタッチ
ダウンＰＣＲを用いて増幅させた。増幅産物を１．５％アガロースゲル上で分離
し、臭化エチジウムで染色し、適当なサイズのＰＣＲ産物について分析した。上
記したようにＨＥＶを含有する血清中のウイルスの存在を検出するためにプライ
マーを使用し、実施例１１で使用した従来のプライマー組に比して感度の著しい
上昇を示した。これらの新規なプライマーの組合せは、２つのアルゼンチン由来
の新規単離物Ａｒ１及びＡｒ２、オーストリア由来の新規単離物Ａｕ１（上記実
施例１４参照）、ギリシャ由来の単離物Ｇ１及びエジプト由来の単離物Ｅｇ４６
を含めた多種多様のＨＥＶ変異体に対してより感受性であることが判明した。結
果を下表５８に示すが、表中、ＮＴは試験しなかったサンプルを指し、“−”は
臭化エチジウム染色により検出可能な産物バンドがないことを指し、“±”は臭
化エチジウム染色により検出可能な弱い産物バンドを指し、“２＋”、“３＋”
及び“４＋”は臭化エチジウム染色により検出された産物の増加量を指す。
【０３１０】
【表５７】
【０３１１】 均等 本発明は、趣旨またはその必須要件を逸脱しない限り他の特定形態も包含し得
る。よって、上記した実施態様は、本明細書に記載の本発明を限定するよりはむ
しろすべての点で例示と見做される。従って、本発明の範囲は以上の記載ではな
く請求の範囲により規定されており、請求の範囲の均等の意味及び範囲に入るす
べての変更が本発明に包まれると意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＯＲＦ１、ＯＲＦ２及びＯＲＦ３領域の相対位置を示すＨＥＶゲノムの概略図
である。
【図２】 入院１日目から３７日目までの患者ＵＳＰ−１中の血清アスパルテートアミノ
トランスフェラーゼ及び血清総ビリルビンのレベルを示すグラフである。
【図３】 本研究中に単離したクローンの相対位置を示すＨＥＶ ＵＳ−１ゲノムの概略
図である。
【図４】 本研究中に単離したクローンの相対位置を示すＨＥＶ ＵＳ−２ゲノムの概略
図である。
【図５】 完全長ＨＥＶ ＵＳ−１、ＨＥＶ ＵＳ−２及び１０個の他のＨＥＶ単離物由
来のヌクレオチド配列の関係を示す根なし系統樹を示す。
【図６】 ＯＲＦ２／３領域由来のヌクレオチド配列（すなわち、配列番号８９のヌクレ
オチド残基５０９４〜７１１４に相当する配列）の関係を示す根なし系統樹を示
す。
【図７】 患者ＵＳＰ−２から採取した血清を接種する前またはその後のマカク中のアラ
ニンアミノトランスフェラーゼ、血清アスパルテートトランスフェラーゼ及びγ
−グルタミルトランスフェラーゼのレベルを示すグラフである。
【図８】 本研究中に単離したクローンの相対位置を示すＩｔ１ゲノム概略図である。
【図９Ａ】 ＯＲＦ１、ＯＲＦ２−３及びＯＲＦ２に対するＨＥＶコンセンサスプライマー
の設計を示すビルマ（Ｂ１）、メキシコ（Ｍ１）、中国（Ｃ１）、パキスタン（
Ｐ１）及びＵＳ−１のアラインメントを示す。
【図９Ｂ】 ＯＲＦ１、ＯＲＦ２−３及びＯＲＦ２に対するＨＥＶコンセンサスプライマー
の設計を示すビルマ（Ｂ１）、メキシコ（Ｍ１）、中国（Ｃ１）、パキスタン（
Ｐ１）及びＵＳ−１のアラインメントを示す。
【図９Ｃ】 ＯＲＦ１、ＯＲＦ２−３及びＯＲＦ２に対するＨＥＶコンセンサスプライマー
の設計を示すビルマ（Ｂ１）、メキシコ（Ｍ１）、中国（Ｃ１）、パキスタン（
Ｐ１）及びＵＳ−１のアラインメントを示す。
【図９Ｄ】 ＯＲＦ１、ＯＲＦ２−３及びＯＲＦ２に対するＨＥＶコンセンサスプライマー
の設計を示すビルマ（Ｂ１）、メキシコ（Ｍ１）、中国（Ｃ１）、パキスタン（
Ｐ１）及びＵＳ−１のアラインメントを示す。
【図９Ｅ】 ＯＲＦ１、ＯＲＦ２−３及びＯＲＦ２に対するＨＥＶコンセンサスプライマー
の設計を示すビルマ（Ｂ１）、メキシコ（Ｍ１）、中国（Ｃ１）、パキスタン（
Ｐ１）及びＵＳ−１のアラインメントを示す。
【図９Ｆ】 ＯＲＦ１、ＯＲＦ２−３及びＯＲＦ２に対するＨＥＶコンセンサスプライマー
の設計を示すビルマ（Ｂ１）、メキシコ（Ｍ１）、中国（Ｃ１）、パキスタン（
Ｐ１）及びＵＳ−１のアラインメントを示す。
【図９Ｇ】 ＯＲＦ１、ＯＲＦ２−３及びＯＲＦ２に対するＨＥＶコンセンサスプライマー
の設計を示すビルマ（Ｂ１）、メキシコ（Ｍ１）、中国（Ｃ１）、パキスタン（
Ｐ１）及びＵＳ−１のアラインメントを示す。
【図１０】 ３７１ヌクレオチド長で配列番号８９の残基２６〜３９６に相当するＯＲＦ１
ヌクレオチド配列の関係を示す根なし系統樹を示す。
【図１１】 １４８ヌクレオチド長で配列番号８９の残基６３０７〜６４５４に相当するＯ
ＲＦ２ヌクレオチド配列の関係を示す根なし系統樹を示す。
【図１２】 好ましいＨＥＶ−ＵＳ組み換えタンパク質構築物の概略図である。
【図１３】 患者ＵＳＰ−２から採取した血清を接種する前及びその後のマカク中のアラニ
ンアミノトセンスフェラーゼ、ＩｇＧ及びＩｇＭのレベルを示すグラフである。
【図１４】 ３７１ヌクレオチド長で配列番号８９の残基２６〜３９６に相当するＯＲＦ１
ヌクレオチド配列の関係を示す根なし系統樹を示す。
【図１５】 １４８ヌクレオチド長で配列番号８９の残基６３０７〜６４５４に相当するＯ
ＲＦ２ヌクレオチド配列の関係を示す根なし系統樹を示す。
【図１６】 ９８ヌクレオチド長で配列番号８９の残基６３５４〜６４５１に相当するＯＲ
Ｆ２ヌクレオチド配列の関係を示す根なし系統樹を示す。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 31/12 Ａ６１Ｐ 31/12 ４Ｈ０４５ Ｃ０７Ｋ 14/08 Ｃ０７Ｋ 14/08 16/10 16/10 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 15/09 ＺＮＡ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/576 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/576 5/00 Ａ (72)発明者 アーカー，ジエイムズ・シー アメリカ合衆国、イリノイ・60030、グレ イズレイク、ノース・ホワイト・テイル・ ドライブ・359 (72)発明者 デサイ，スレツシユ・エム アメリカ合衆国、イリノイ・60048、リバ テイビル、アミー・レイン・1408 (72)発明者 ドーソン，ジヨージ・ジエイ アメリカ合衆国、イリノイ・60048、リバ テイビル、サウス・ダイマンド・ロード・ 914 (72)発明者 マツシヤワー，アイサ・ケイ アメリカ合衆国、イリノイ・60030、グレ イズレイク、アーバー・ブールバード・ 18790 Ｆターム(参考） 4B024 AA14 BA32 DA03 EA02 GA11 HA14 4B063 QA01 QQ10 QR32 QR55 QS34 4B065 AA93X AA96X AA96Y AA99Y BA02 CA45 4C085 AA03 AA13 BA87 BB31 CC22 CC23 DD33 EE06 FF03 4C087 BB63 DA15 NA14 ZA75 ZB33 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA02 DA75 DA86 EA22 EA28 FA74

Claims (43)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 試験サンプル中のＵＳタイプもしくはＵＳサブタイプＥ型肝
    炎ウイルス（ＨＥＶ）またはその天然変異体の存在を検出する方法であって、 （ａ）前記サンプル中に存在すると結合パートナーに結合してマーカー−結合パ
    ートナー複合体を生成する前記ウイルスに対するマーカーに特異的に結合する結
    合パートナーと前記サンプルを接触させるステップ、及び （ｂ）前記サンプル中の前記ウイルスの存在の指標である前記複合体の存在を検
    出するステップ を含むことを特徴とする前記方法。
  2. 【請求項２】 マーカーがウイルスに結合し得る抗体であることを特徴とす
    る請求の範囲第１項に記載の方法。
  3. 【請求項３】 抗体が、免疫グロブリンＧまたは免疫グロブリンＭであるこ
    とを特徴とする、請求の範囲第２項に記載の方法。
  4. 【請求項４】 結合パートナーが単離ポリペプチド鎖であることを特徴とす
    る、請求の範囲第２項に記載の方法。
  5. 【請求項５】 ポリペプチド鎖が固体支持体上に固定化されていることを特
    徴とする、請求の範囲第４項に記載の方法。
  6. 【請求項６】 結合パートナーが、天然変異体を含めた配列番号９１、配列
    番号９２及び配列番号９３からなる群から選択されるポリペプチド鎖であること
    を特徴とする、請求の範囲第４項に記載の方法。
  7. 【請求項７】 結合パートナーが、配列番号１７３または配列番号１７５に
    示すアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖であることを特徴とする、請求の範囲第
    ４項に記載の方法。
  8. 【請求項８】 結合パートナーが、配列番号１７４または配列番号１７６に
    示すアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖であることを特徴とする、請求の範囲第
    ４項に記載の方法。
  9. 【請求項９】 結合パートナーが、それらの天然変異体を含めた配列番号１
    ６６、配列番号１６７及び配列番号１６８からなる群から選択されるポリペプチ
    ド鎖であることを特徴とする、請求の範囲第４項に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 結合パートナーが、配列番号２２３に示すアミノ酸配列を
    含むポリペプチド鎖であることを特徴とする、請求の範囲第４項に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 結合パートナーが、配列番号２２４に示すアミノ酸配列を
    含むポリペプチド鎖であることを特徴とする、請求の範囲第４項に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 結合パートナーが、天然変異体を含めた配列番号９１、配
    列番号９２、配列番号９３、配列番号１６６、配列番号１６７及び配列番号１６
    ８からなる群から選択されるポリペプチド鎖に特異的に結合し得る単離抗体であ
    ることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする、請求
    の範囲第１２項に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 マーカーがポリペプチド鎖であることを特徴とする、請求
    の範囲第１項に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 ポリペプチド鎖が、天然変異体を含めた配列番号９１、配
    列番号９２及び配列番号９３からなる群から選択されることを特徴とする、請求
    の範囲第１４項に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 ポリペプチド鎖が、配列番号１７３または配列番号１７５
    に示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求の範囲第１４項に記載の方法
    。
  17. 【請求項１７】 ポリペプチド鎖が、配列番号１７４または配列番号１７６
    に示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求の範囲第１４項に記載の方法
    。
  18. 【請求項１８】 ポリペプチド鎖が、天然変異体を含めた配列番号１６６、
    配列番号１６７及び配列番号１６８からなる群から選択されることを特徴とする
    、請求の範囲第１４項に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 ポリペプチド鎖が配列番号２２３に示すアミノ酸配列を含
    むことを特徴とする、請求の範囲第１４項に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 ポリペプチド鎖が配列番号２２４に示すアミノ酸配列を含
    むことを特徴とする、請求の範囲第１４項に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 マーカーが、ウイルスのゲノムの少なくとも一部を規定す
    る核酸配列またはその相補鎖であることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載
    の方法。
  22. 【請求項２２】 結合パートナーが、特定のハイブリダイゼーション条件下
    で、配列番号８９及び１６４に示す核酸配列にハイブリダイズし得る単離核酸配
    列であることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 結合パートナーが、配列番号１２６、配列番号１２８、配
    列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１
    ７７、配列番号１７８、配列番号２５５、配列番号２５６、配列番号２５７及び
    配列番号２５８からなる群から選択されることを特徴とする、請求の範囲第１項
    に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 結合パートナーが単離ポリペプチド鎖であることを特徴と
    する、請求の範囲第１項に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 試験サンプルが、哺乳動物細胞系であることを特徴とする
    、請求の範囲第１項に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 哺乳動物細胞系が、ヒト胎児腎細胞系であることを特徴と
    する、請求の範囲第４１項に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 試験サンプル中のＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）の存在の検
    出方法であって、 （ａ）サンプル中に存在すると結合パートナーに結合してマーカー−結合パート
    ナー複合体を生成する前記ウイルスに対するマーカーに特異的に結合する配列番
    号１２６、配列番号１２８、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１５０
    、配列番号１５２、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号２５５、配列番
    号２５６、配列番号２５７及び配列番号２５８からなる群から選択される結合パ
    ートナーと前記サンプルを接触させるステップ、及び （ｂ）前記サンプル中の前記ウイルスの存在の指標である前記複合体の存在を検
    出するステップ を含むことを特徴とする前記方法。
  28. 【請求項２８】 配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列
    番号１７６、配列番号２２３及び配列番号２２４に示すアミノ酸配列を含むこと
    を特徴とする単離ポリペプチド鎖。
  29. 【請求項２９】 ＵＳタイプもしくはＵＳサブタイプＨＥＶのＯＲＦ１配列
    によりコードされるポリペプチド、ＵＳタイプもしくはＵＳサブタイプＨＥＶの
    ＯＲＦ２配列によりコードされるポリペプチド、及びＵＳタイプもしくはＵＳサ
    ブタイプＨＥＶのＯＲＦ３配列によりコードされるポリペプチドからなる群から
    選択されるポリペプチド鎖に特異的に結合し得ることを特徴とする単離抗体。
  30. 【請求項３０】 配列番号１７３、配列番号１７５または配列番号２２４に
    示すアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖に特異的に結合し得ることを特徴とする
    単離抗体。
  31. 【請求項３１】 配列番号１７４、配列番号１７６または配列番号２２３に
    示すアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖に特異的に結合し得ることを特徴とする
    単離抗体。
  32. 【請求項３２】 同様の条件下で、配列番号１６９または配列番号１７１に
    示すアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖に対して低アフィニティーを有すること
    を特徴とする、請求の範囲第３０項に記載の単離抗体。
  33. 【請求項３３】 同様の条件下で、配列番号１７０または配列番号１７２に
    示すアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖に対して低アフィニティーを有すること
    を特徴とする、請求の範囲第３１項に記載の単離抗体。
  34. 【請求項３４】 更に、検出可能部分を含むことを特徴とする、請求の範囲
    第２９項に記載の単離抗体。
  35. 【請求項３５】 ＵＳタイプもしくはＵＳサブタイプＥ型肝炎ウイルスのＯ
    ＲＦ１、ＯＲＦ２またはＯＲＦ３配列の少なくとも一部を規定することを特徴と
    する単離核酸配列またはその相補配列。
  36. 【請求項３６】 特定ハイブリダイゼーション条件下で配列番号８９及び配
    列番号１６４に示すヌクレオチド配列にハイブリダイズし得ることを特徴とする
    単離核酸配列。
  37. 【請求項３７】 請求の範囲第３５項に記載の単離核酸配列を含むことを特
    徴とするベクター。
  38. 【請求項３８】 請求の範囲第３７項に記載のベクターを含むことを特徴と
    する宿主細胞。
  39. 【請求項３９】 ＵＳタイプもしくはＵＳサブタイプＨＥＶに対して哺乳動
    物を免疫化する方法であって、前記哺乳動物に対して請求の範囲第２８項に記載
    のポリペプチドを前記ＵＳタイプもしくはＵＳサブタイプＥ型肝炎ウイルスに特
    異的に結合し得る抗体の産生を刺激するのに十分な量投与することを特徴とする
    前記方法。
  40. 【請求項４０】 ＵＳタイプもしくはＵＳサブタイプＨＥＶ １に対して哺
    乳動物を免疫化する方法であって、前記哺乳動物に対して請求の範囲第２９項に
    記載の抗体を前記ＵＳタイプもしくはＵＳサブタイプＥ型肝炎ウイルスに対して
    該哺乳動物を免疫化するのに十分な量投与することを特徴とする前記方法。
  41. 【請求項４１】 ＵＳタイプもしくはＵＳサブタイプＨＥＶ １に対して哺
    乳動物を免疫化する方法であって、前記哺乳動物に対して請求の範囲第３０項に
    記載の抗体を前記ＵＳタイプもしくはＵＳサブタイプＥ型肝炎ウイルスに対して
    該哺乳動物を免疫化するのに十分な量投与することを特徴とする前記方法。
  42. 【請求項４２】 ＵＳタイプもしくはＵＳサブタイプＨＥＶ １に対して哺
    乳動物を免疫化する方法であって、前記哺乳動物に対して請求の範囲第３１項に
    記載の抗体を前記ＵＳタイプもしくはＵＳサブタイプＥ型肝炎ウイルスに対して
    該哺乳動物を免疫化するのに十分な量投与することを特徴とする前記方法。
  43. 【請求項４３】 ＵＳタイプもしくはＵＳサブタイプＨＥＶに対して哺乳動
    物を免疫化する方法であって、前記哺乳動物に対して請求の範囲第３８項に記載
    の宿主細胞を前記ＵＳタイプもしくはＵＳサブタイプＥ型肝炎ウイルスに対して
    該哺乳動物を免疫化するのに十分な量投与することを特徴とする前記方法。
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