JP4475803B2 - Ｅ型肝炎ウイルスを検出するための方法および組成物 - Google Patents

Description

【０００１】
発明の分野
本発明は、一般的には、Ｅ型肝炎ウイルスを検出するための方法および組成物に関する。より詳細には、本発明は、Ｅ型肝炎ウイルスのＵＳ型株およびＵＳ亜型株に感染した個体を検出または処置するための方法および組成物に関する。
【０００２】
発明の背景
肝臓の炎症（肝炎）を引き起こす肝臓親和性ウイルスには、少なくとも５種類の主要なウイルスが存在する。これらのウイルスには、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）およびＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）が含まれる。ＨＢＶ、ＨＣＶおよびＨＤＶのみが慢性肝炎を引き起こすが、５つの型はすべて、直接的に急性疾患を引き起こし、あるいは、例えば、ＨＢＶおよびＨＤＶによる重感染／共感染の結果としての急性疾患を引き起こす。ＨＥＶは、腹痛、黄疸、倦怠感、食欲不振、暗色尿、発熱、悪心および嘔吐を含む他のウイルス性病原体による肝炎症状と同様の肝炎症状を引き起こす（例えば、Ｒｅｙｅｓら、「非Ａ非Ｂ型肝炎病原体のＣ型肝炎ウイルスおよびＥ型肝炎ウイルスの分子生物学」、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１）４０：５７〜１０２；Ｂｒａｄｌｅｙ、「非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスはＣ型肝炎ウイルスおよびＥ型肝炎ウイルスと同定される」、Ｐｒｏｇｒ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９０）３７：１０１〜１３５；Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ、「非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス」、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２版（１９９０）、第２版、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２２３９頁〜２２７１頁；Ｇｕｓｔら、「ワークショップ報告書：水系感染性の非Ａ非Ｂ型肝炎」Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．（１９８７）１５６：６３０〜６３５；およびＫｒａｗｃｙｚｎｓｋｉ、「Ｅ型肝炎」、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（１９９３）１７：９３２〜９４１を参照のこと）。しかし、他のヘパトウイルスとは異なり、ＨＥＶは、合衆国における肝炎の主原因であるとは一般に認められていない。
【０００３】
ＨＥＶが風土病である地理学的地域には、東アフリカおよび北アフリカ、インド、パキスタン、ビルマならびに中国が含まれる（Ｒｅｙｅｓら（１９９１）前出）。ＨＥＶ感染の致死率は、ＨＥＶが風土病である地域では一般の人々において約０．１％〜約１．０％の間であり、発展途上国の妊婦では約２０％ほどの高さであると推定されている。大部分の死者の原因は劇症肝炎である（Ｒｅｙｅｓら（１９９１）前出）。合衆国、西ヨーロッパおよび日本におけるＨＥＶ感染に関する時折の報告は、通常、ＨＥＶが風土病である地域への旅行から戻った旅行者において認められる。しかし、ＨＥＶ感染は中央官庁には報告されていないため、合衆国におけるＨＥＶ感染による罹病率および／または死亡率に関する情報はほとんどない。合衆国におけるＨＥＶの重要性を明らかにするための詳細で組織的な研究は行われていない。さらに、そのような研究が行われたとしても、そのような研究を行うための適切な試薬が開発されない限り、合衆国（ならびにおそらくは日本および西ヨーロッパ）におけるＨＥＶの相対的な重要性は過小評価され続けるかもしれない。
【０００４】
ＨＥＶの基本的な特徴は、ＨＥＶがエンベロープを持たず、約２７ｎｍ〜３０ｎｍの直径を有し、そしてプラス鎖のセンス一本鎖ＲＮＡゲノムを有するウイルスであることである。このＲＮＡゲノムは、この分野ではオープンリーディングフレーム１（ＯＲＦ１）、オープンリーディングフレーム２（ＯＲＦ２）、およびオープンリーディングフレーム３（ＯＲＦ３）と呼ばれる３つの不連続なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。ウイルスの全体的な形態ならびにゲノムのサイズおよび構成に基づいて、このウイルスは暫定的にカリシウイルス科のメンバーとして分類されている。同定および配列決定が行われたＨＥＶの最初の２つの単離物が、ビルマおよびメキシコから得られた。両方の単離物のゲノム全体にわたる全体的な核酸同一性は７６％である（Ｒｅｙｅｓら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７：１３３５〜１３３９；Ｔａｍら（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１８５：１２０〜１３１；Ｈｕａｎｇら（１９９２）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９１：５５０〜５５８）。ヌクレオチドの相違の多くはコドンの３番目の位置に認められたので、ＨＥＶのビルマ株とメキシコ株との間のアミノ酸配列の推定される類似性は、ＯＲＦ１、ＯＲＦ２およびＯＲＦ３の各オープンリーディングフレームに関して、それぞれ、８３％、９３％および８７％であった。
【０００５】
ビルマ株には、メキシコ株では同定されなかった約２７ヌクレオチドの短い非翻訳領域がゲノムの５’末端に存在する。ＯＲＦ１は約５，１００ヌクレオチドを含み、これには推定的なメチルトランスフェラーゼドメイン、ＲＮＡヘリカーゼドメイン、推定的なＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＤＲＰ）ドメイン、および推定的なパパイン様プロテアーゼを含む数個の保存されたモチーフがコードされている。プラス鎖をセンス鎖とするＲＮＡの植物ウイルスおよび動物ウイルスのすべてで見出されているＧｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｐ（ＧＤＤ）のトリペプチド配列がＯＲＦ１の内部に見出され、これは通常ＲＤＲＰとして機能する。通常、細胞性ヘリカーゼおよびウイルス性ヘリカーゼと関連するプリンＮＴＰアーゼ活性が示唆される保存されたモチーフもまた、ＯＲＦ１の配列内に存在する。ＯＲＦ１にコードされる遺伝子産物に対する免疫応答は一貫していない。
【０００６】
２番目のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ２）は、ウイルスゲノムのカルボキシル側の１／３を占める。ＯＲＦ２は約２，０００ヌクレオチドを含み、コンセンサスシグナルペプチド配列がＯＲＦ２のアミノ末端にコードされており、そしてＯＲＦ１に関して１＋のリーディングフレームで翻訳される推定的なキャプシドタンパク質がコードされている。多くの場合、ＨＥＶ感染者は、ＯＲＦ２に由来するペプチドまたは組換えタンパク質と反応する抗体を産生している。
【０００７】
３番目のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ３）は、ＯＲＦ１とＯＲＦ２の両方に部分的に重複し、そしてＯＲＦ１に関して＋２のリーディングフレームで翻訳される３６９ヌクレオチドを含む。ＯＲＦ３によりコードされるタンパク質の機能は不明であるが、このタンパク質は抗原性であり、ＨＥＶ感染者のほとんどがこのタンパク質に対する抗体を産生している。従って、ＯＲＦ２およびＯＲＦ３に由来するペプチドまたは組換えタンパク質は、ＨＥＶへの曝露を診断するときに有用な血清学的マーカーとして利用することができる。
【０００８】
最近、さらなるＨＥＶ単離物がいくつか同定され、ＨＥＶのビルマ株およびメキシコ株と比較された。新しい単離物のほとんどは、ＨＥＶのメキシコ株よりもビルマ株に密接に関連している。１９８６年〜１９８７年における短期間の出現を除いて、ＨＥＶのさらなるメキシコ株は単離されていない（Ｖｅｌａｓｑｕｅｚら（１９９２）ＪＡＭＡ、２６３：３２８１〜３２８６）。
【０００９】
最近、ＳＡＲ−５５と呼ばれる１つの単離物が、パキスタン出身のＨＥＶ感染者から単離された。ＳＡＲ−５５単離物はビルマ株と非常に関連しており、ゲノム全体にわたるヌクレオチドおよびアミノ酸の同一性は、それぞれ、９４％および９９％である。最近、いくつかの他の単離物が、パキスタンに接する中国の新彊ウイグル自治区（Ｘｕａｒ）地方から得られた。これらの中国の単離物は、ビルマ株（約９３％のヌクレオチド同一性）よりもパキスタン株（約９８％のヌクレオチド同一性）に密接に関連していた。
【００１０】
ウイルスゲノムの配列決定ならびにウイルスによりコードされる組換えタンパク質および合成ペプチドの入手に先立って、ＨＥＶ感染を電子顕微鏡および免疫蛍光法によって観察した。ＨＥＶゲノムが同定されるとすぐに、ＨＥＶ感染を検出するために、（ｉ）特異的な免疫アッセイ（例えば、組換えタンパク質および／または合成ペプチドに基づくウエスタンブロット法およびＥＬＩＳＡ）、および（ｉｉ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ））を含む特異的な実験室技術が利用可能となった。ＲＴ−ＰＣＲは、急性肝炎に感染した場合およびＥＴ−ＮＡＮＢＨの流行時に、便サンプルまたは血清サンプルにおけるＨＥＶのＲＮＡを検出するために問題なく使用されている。さらに、ＨＥＶのメキシコ株およびビルマ株に由来する組換え抗原を使用することにより、ＨＥＶに特異的なＩｇＧ抗体、ＩｇＭ抗体、および一部の場合にはＩｇＡ抗体が、ソマリア、ビルマ、ボルネオ、タシュケント、ケニア、パキスタンおよびメキシコにおけるＥＴ−ＮＡＮＢＨの大発生から得られた検体において検出された。ＨＥＶに特異的なＩｇＧ抗体、および時にはＩｇＭ抗体が、エジプト、インド、タジキスタンおよびウズベキスタンなどの地理学的地域における急性散発性肝炎の場合、ならびにＨＥＶが風土病である地域に旅行した工業化国（例えば、合衆国、英国、オランダおよび日本）の患者での急性肝炎の場合に検出された。
【００１１】
現在までのところ、ＨＥＶのビルマ単離物およびメキシコ単離物に基づくＰＣＲおよび免疫アッセイに基づく試験により、「水系感染性肝炎」の種々の症例がＨＥＶによって引き起こされたことが立証された。抗体試験もまた、ＨＥＶが、発展途上国における急性散発性肝炎の原因であり、そしてＨＥＶが風土病である地域への旅行者の間での急性散発性肝炎の原因であることを立証するときに重要であった。しかし、現行の試薬はすべて、ＨＥＶ株への曝露が検出できないために、現在、どれほどの数が急性ＨＥＶと診断されていないことに関しては不明である。従って、新しいＨＥＶ単離物が同定された場合、現在入手可能な試験キットによって今まで検出することができなかったそのような新しいＨＥＶ株により引き起こされる肝炎の検出および／または処置を行うための新しい組成物および方法を開発することが望まれる。
【００１２】
発明の要旨
本発明は、部分的にはヒトＥ型肝炎ウイルスの新規ファミリーの発見に基づいている。Ｅ型肝炎ウイルスの新しく発見されたファミリーは、ＵＳ型Ｅ型肝炎ウイルスとしてこれ以降示されるクラスに属する。さらに、このファミリーの２つのメンバーが、合衆国に住んでいる人々で発見された。これらは、ヌクレオチドおよびアミノ酸のレベルで比較した場合、かなりの類似性を示している。この２つのメンバーはともに、これ以降ＵＳ亜型Ｅ型肝炎ウイルスとして示されるＵＳ型Ｅ型肝炎ウイルスのサブクラスに属する。
【００１３】
従って、１つの態様において、本発明は、目的とする試験サンプルにおけるＵＳ型Ｅ型肝炎ウイルスまたはＵＳ亜型Ｅ型肝炎ウイルスの存在を検出するための方法を提供する。この方法は下記の工程を含む：（ａ）試験サンプルを、ウイルスのマーカー（または標的）に特異的に結合する結合パートナーと接触させる工程であって、このマーカーがサンプル中に存在する場合、マーカーは結合パートナーに結合して、マーカー−結合パートナーの複合体を形成する工程、および（ｂ）複合体の存在の有無を検出する工程。複合体の存在は、試験サンプルにおけるウイルスの存在を示す。
【００１４】
１つの実施形態において、マーカーは、目的とするサンプル中に存在する抗ＵＳ型抗体または抗ＵＳ亜型抗体（例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子または免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）分子）であり、結合パートナーは、マーカーに特異的に結合するエピトープを規定する単離されたポリペプチド鎖である。このような場合、試験サンプルは調査中の個体から採取された体液サンプル（例えば、血液、血清または血漿）であると考えられる。好ましい実施形態において、ＵＳ型特異的エピトープまたはＵＳ亜型特異的エピトープを規定するポリペプチド鎖が固体支持体に固定化する。その後、固定化したポリペプチド鎖を、サンプル中に存在するマーカー抗体（例えば、抗ＵＳ型または抗ＵＳ亜型のＥ型肝炎ウイルスに特異的な抗体）が固定化ポリペプチドに結合することを可能にする条件のもとで試験サンプルと一緒にする。その後、結合した抗体の存在の有無を、例えば、検出可能な部分で標識された第２の抗体またはその抗原結合性フラグメント（例えば、抗ヒト抗体またはその抗原結合性フラグメント）を使用して検出することができる。
【００１５】
多数の異なるＵＳ型特異的ポリペプチドおよびＵＳ亜型特異的ポリペプチドが本発明のこの実施形態の実施における結合パートナーとして有用であり得ると考えられる。例えば、本発明の１つの好ましい実施形態において、結合パートナーは、配列番号９１、配列番号９２および配列番号９３ならびにその天然に存在する変異型からなる群より選択され、そしてビルマ株ファミリーおよびメキシコ株ファミリーのメンバーの対応するアミノ酸配列と比較した場合に特徴的なアミノ酸配列を示すポリペプチド鎖の少なくとも一部、例えば、そのようなポリヌクレオチド鎖の少なくとも５個のアミノ酸残基、好ましくは少なくとも８個のアミノ酸残基、より好ましくは少なくとも１５個のアミノ酸残基、そしてさらにより好ましくは少なくとも約２５個のアミノ酸残基であり得ると考えられる。同様に、結合パートナーは、配列番号１７３、配列番号１７４または配列番号１７５に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖であり得ると考えられる。本発明の別の好ましい実施形態において、結合パートナーは、配列番号１６６、配列番号１６７および配列番号１６８ならびに天然に存在するそれらの変異型からなる群より選択され、そしてビルマ株ファミリーおよびメキシコ株ファミリーのメンバーの対応するアミノ酸配列と比較した場合に特徴的なアミノ酸配列を示すポリペプチド鎖の少なくとも一部、例えば、そのようなポリヌクレオチド鎖の少なくとも５個のアミノ酸残基、好ましくは少なくとも８個のアミノ酸残基、より好ましくは少なくとも１５個のアミノ酸残基、そしてさらにより好ましくは少なくとも約２５個のアミノ酸残基であり得ると考えられる。同様に、結合パートナーは、配列番号１７６、配列番号２２３または配列番号２２４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖であり得ると考えられる。
【００１６】
本発明の別の実施形態において、マーカーは、ＨＥＶのＵＳ型ファミリーまたはＵＳ亜型ファミリーのメンバーに特徴的なポリペプチド鎖であり、結合パートナーは、好ましくは、マーカーポリペプチド鎖上のエピトープに結合する単離された抗体（例えば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体）である。結合パートナーは、検出可能な部分で標識することができ、あるいは固体支持体に固定化することができる。例えば、本発明のこの実施形態の実施は、目的とするマーカーポリペプチド上の第１のエピトープに結合する第１の抗体を固体支持体に固定化することによって容易に行うことができると考えられる。次いで、分析すべき試験サンプルは、固定化された抗体がマーカーポリペプチドに結合することを可能にする条件のもとで固体支持体と一緒にされる。その後、結合したマーカーポリペプチド鎖の存在の有無を、例えば、マーカーポリペプチド鎖上の第２の異なるエピトープに結合する検出可能な部分と結合した第２の抗体を使用することによって決定することができる。
【００１７】
本発明のこの実施形態の実施において有用な抗体は、好ましくは、配列番号９１、配列番号９２、配列番号および配列番号９３ならびにその天然に存在する変異型からなる群より選択されるポリペプチド鎖に特異的に結合することができ、そしてビルマ株ファミリーおよびメキシコ株ファミリーのメンバーの対応する配列に比べて、そのようなポリペプチド鎖に対して大きな結合親和性を有する。本発明の実施において有用な抗体は、好ましくは、配列番号１７３または配列番号１７５に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖に特異的に結合することができると考えられる。この抗体はさらに、同様の条件のもとで、配列番号１６９または配列番号１７１に示されるアミノ酸配列に関して、あるいは配列番号１７５に対応するビルマ株およびメキシコ株中の領域に対して、好ましくは親和性がより低いこと、そして最も好ましくはそのようなポリヌクレオチド鎖と、あるいはそのような領域に結合しないことを特徴とする。同様に、本発明の実施に有用な抗体は、好ましくは、配列番号１７４または配列番号１７６に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖に特異的に結合することができると考えられる。この抗体はさらに、同様の条件のもとで、配列番号１７０または配列番号１７２に示されるアミノ酸配列に関して、あるいは配列番号１７６に対応するビルマ株およびメキシコ株中の領域に対して、好ましくは親和性がより低いこと、そして最も好ましくはそのようなポリヌクレオチド鎖と、あるいはそのような領域に結合しないことを特徴とする。
【００１８】
同様に、本発明のこの実施形態の実施において有用な抗体は、好ましくは、配列番号１６６、配列番号１６７および配列番号１６８ならびにその天然に存在する変異型からなる群より選択されるポリペプチド鎖に特異的に結合することができ、そしてビルマ株ファミリーおよびメキシコ株ファミリーのメンバーの対応する配列に比べて、このようなポリペプチド鎖に対して大きな結合親和性を有すると考えられる。本発明の実施において有用な抗体は、好ましくは、配列番号２２３に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖に特異的に結合することができると考えられる。この抗体はさらに、同様の条件のもとで、配列番号１７０または配列番号１７２に示されるアミノ酸配列に比べて、好ましくは親和性がより低いこと、そして最も好ましくはそのようなポリペプチド鎖と結合しないことを特徴とする。同様に、本発明の実施に有用な抗体は、好ましくは、配列番号２２４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖に特異的に結合することができると考えられる。この抗体はさらに、同様の条件のもとで、配列番号１６９または配列番号１７１に示されるアミノ酸配列に比べて、好ましくは親和性がより低いこと、そして最も好ましくはそのようなポリペプチド鎖と結合しないことを特徴とする。
【００１９】
本発明の別の実施形態において、マーカーは、ＵＳ型Ｅ型ウイルスゲノムまたはＵＳ亜型Ｅ型ウイルスゲノムの少なくとも一部を規定する核酸配列またはその相補配列である。同様に、結合パートナーは、好ましくは８ヌクレオチド〜１００ヌクレオチドを含み、より好ましくは１０ヌクレオチド〜７５ヌクレオチドを含み、そして最も好ましくは１５ヌクレオチド〜５０ヌクレオチドを含む単離された核酸配列（例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列、リボ核酸（ＲＮＡ）配列またはペプチジル核酸（ＰＮＡ）配列）であって、配列番号８９または配列番号１６４に示されるヌクレオチド配列と特異的に（例えば、特異的なハイブリダイゼーション条件または特異的なＰＣＲアニーリング条件のもとで）ハイブリダイゼーションすることができる核酸配列であると考えられる。
【００２０】
本発明のこの実施形態の実施は、例えば、目的とするサンプルから核酸を単離することによって容易にすることができる。その後、得られた核酸を、例えば、ゲル電気泳動によって分画し、そして固体支持体（例えば、ニトロセルロースメンブレンまたはナイロンメンブレン）に転写して固定化することができる。あるいは、従来のドットブロット法またはスロットブロット法によって固体支持体に直接固定化することができる。次いで、固定化された核酸を、マーカー配列と特異的にハイブリダイゼーションする検出可能な部分で標識された所定の核酸配列を用いて調べることができる。あるいは、サンプル中のマーカー核酸の存在は、増幅に基づく標準的な方法論（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））によって決定することができる。この場合、特異的な増幅産物の産生により、サンプル中にマーカー核酸が存在することが示される。
【００２１】
別の態様において、本発明は、単離されたＵＳ型特異的ポリペプチド配列およびＵＳ亜型特異的ポリペプチド配列を提供する。これらのポリペプチドには、結合パートナーとして有用なＵＳ型Ｅ型肝炎およびＵＳ亜型Ｅ型肝炎の特異的ポリペプチド鎖に関する本明細書中上記の節に記載されているポリペプチドが含まれる。好ましい実施形態において、単離されたポリペプチド鎖は、配列番号９３、配列番号１６８、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号２２３または配列番号２２４に示されるアミノ酸配列を含む。これらのポリペプチド鎖ならびに他のＵＳ型特異的ポリペプチド鎖およびＵＳ亜型特異的ポリペプチド鎖は、サンプル中におけるＵＳ亜型Ｅ型肝炎特異的抗体の抗ＵＳ型の存在を検出するための測定様式において用いることができると考えられる。さらに、これらのポリペプチドは、単独で使用することができ、または実験室動物における抗体産生用のアジュバントと組み合わせて使用することができ、あるいは同様に、薬学的に許容可能な担体と組み合わせて、哺乳動物を予防的または治療的に免疫するためのワクチンとして使用することができると考えられる。
【００２２】
別の態様において、本発明は、単離された抗ＵＳ型Ｅ型肝炎特異的抗体または抗ＵＳ亜型Ｅ型肝炎特異的抗体を提供する。これらの抗体には、結合パートナーとして有用な抗体に関する本明細書上記の節に論じられている抗体が含まれる。好ましい実施形態において、単離された抗体は、ＵＳ型Ｅ型肝炎ウイルスまたはＵＳ亜型Ｅ型肝炎ウイルスのＯＲＦ１配列によりコードされるポリペプチド、ＵＳ型Ｅ型肝炎ウイルスまたはＵＳ亜型Ｅ型肝炎ウイルスのＯＲＦ２配列によりコードされるポリペプチド、あるいは、ＵＳ型Ｅ型肝炎ウイルスまたはＵＳ亜型Ｅ型肝炎ウイルスのＯＲＦ３配列によりコードされるポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチド鎖に特異的に結合することができる。詳細には、有用な抗体は、配列番号９３、配列番号１６８、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号２２３または配列番号２２４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖に特異的に結合することができる点を特徴とすると考えられる。これらの抗体および他の抗体を使用して、サンプル中におけるＵＳ型Ｅ型肝炎ファミリーまたはＵＳ亜型Ｅ型肝炎ファミリーのメンバーの存在を検出するための免疫アッセイを有利にすることができると考えられる。抗体を、直接的な免疫アッセイ（この場合、抗体自身が好ましくは検出可能な部分で標識される）または間接的な免疫アッセイ（この場合、抗体自身が第２の結合パートナー（例えば、検出可能な部分で標識された第２の抗体）に対する標的を提供する）のいずれかで使用することができる。さらに、これらの抗体は、例えば、哺乳動物の治療的または予防的な受動的免疫化において使用するために、薬学的に許容可能な担体と組み合わせて使用することができると考えられる。
【００２３】
別の態様において、本発明は、サンプル中におけるＵＳ型Ｅ型肝炎ウイルスまたはＵＳ亜型Ｅ型肝炎ウイルスの存在を検出するためのマーカーまたは結合パートナーとしての核酸の使用に関する先の節において論じられた核酸配列などの単離された核酸配列を提供する。好ましい実施形態において、本発明は、ＵＳ型Ｅ型肝炎ウイルスまたはＵＳ亜型Ｅ型肝炎ウイルスのＯＲＦ１、ＯＲＦ２またはＯＲＦ３配列あるいはその相補配列の少なくとも一部を規定する単離された核酸配列を提供する。これら核酸配列および他の核酸配列は、例えば、目的とするサンプルにおけるＵＳ型Ｅ型肝炎ウイルスまたはＵＳ亜型Ｅ型肝炎ウイルスの存在を検出するためのヌクレオチドプローブおよび／または増幅プライマーとして使用することができると考えられる。さらに、これらの核酸配列またはこれらに相補的な配列は、アンチセンス療法において使用するために、薬学的に許容可能な担体と組み合わせることができると考えられる。さらに、これらの核酸配列はベクターに組込むことができ、次いで、このベクターは目的とする宿主細胞中に形質転換またはトランスフェクションすることができると考えられる。次いで、宿主細胞は、薬学的に許容可能な担体と組み合わされ、そして所定のＵＳ型Ｅ型肝炎ウイルスまたはＵＳ亜型Ｅ型肝炎ウイルスに対して、予防的または治療的のいずれかで哺乳動物を免疫化するためのワクチン（例えば、組換えワクチン）として用いることができる。
【００２４】
本発明の前述および他の目的、特徴および利点は、発明の好ましい実施形態の以下の詳細な説明から、より明らかになる。
【００２５】
本発明の目的および特徴は、後記の図面を参照することによって一層理解される。
【００２６】
発明の詳細な説明
上記のように、本発明は、部分的にはヒトのＥ型肝炎ウイルスの新しいファミリーの発見に基づいている。Ｅ型肝炎ウイルスのこの新しく発見されたファミリーは、ＵＳ型Ｅ型肝炎ウイルスとしてこれ以降示されるクラスに含まれる。さらに、上記のように、ＵＳ型ファミリーの２つのメンバーが、アメリカ合衆国に住む２人の感染者から得られた血清において同定された。この２つのメンバーはともに、ＵＳ亜型Ｅ型肝炎ウイルスとして下記に示されるＵＳ型Ｅ型肝炎ウイルスのサブクラスに属する。ＵＳ型Ｅ型肝炎ウイルスおよびＵＳ亜型Ｅ型肝炎ウイルスの発見により、市販の肝炎検出キットに基づいて肝炎に罹患しているとこれまで診断されなかった感染者におけるＵＳ型Ｅ型肝炎ウイルスまたはＵＳ亜型Ｅ型肝炎ウイルスの存在を検出するための方法および組成物、ならびにそのようなウイルスに対して個体を免疫するための方法および組成物の開発が可能になる。
【００２７】
１つの態様において、本発明は、試験サンプルにおけるＵＳ型Ｅ型肝炎ウイルスおよびＵＳ亜型Ｅ型肝炎ウイルスの存在を検出する方法に関する。この方法は下記の工程を含む：（ａ）試験サンプルを、そのようなウイルスのマーカーに特異的に結合する結合パートナーと接触させる工程であって、前記マーカーがサンプル中に存在する場合にこのマーカーは結合パートナーに結合して、マーカー−結合タンパク質の複合体を形成する工程；および（ｂ）そのような複合体の存在の有無を検出する工程。このような複合体の存在により、サンプル中におけるウイルスの存在が示される。本明細書に開示されるＵＳ型Ｅ型肝炎ウイルスおよびＵＳ亜型Ｅ型肝炎ウイルスの発見に基づいて、様々なアッセイ（例えば、タンパク質または核酸に基づくアッセイ）を、サンプル中におけるウイルスの存在を検出するために組み立てることができることは明らかである。タンパク質に基づくアッセイとしては、例えば、従来の免疫アッセイを挙げることができる。核酸に基づくアッセイとしては、例えば、従来のプローブハイブリダイゼーションアッセイまたは核酸配列増幅アッセイを挙げることができる。これらはすべて、この分野では十分に知られており、そして広く議論されている。
【００２８】
別の態様において、本発明は、予防または治療のいずれかで、ＵＳ型Ｅ型肝炎ウイルスまたはＵＳ亜型Ｅ型肝炎ウイルスに対して個体を免疫化するためのワクチンを開発するために使用することができる試薬類、例えば、抗体、エピトープ含有ポリペプチド鎖およびヌクレオチド配列を提供する。
【００２９】
Ｉ．定義
本発明をより容易に理解することができるように、本明細書中において使用されているいくつかの用語を下記に定義する。
【００３０】
本明細書中において使用されている用語「ＵＳ型」Ｅ型肝炎ウイルスは、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）およびＧ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）と血清学的に異なる任意のヒトウイルス（すなわち、ヒトに感染し得るウイルス）であって、少なくとも１つのオープンリーディングフレームを規定する一本鎖ＲＮＡゲノムを含み、そして配列番号８９の６３０７〜６４５４の残基によって規定されるヌクレオチド配列に対する同一性が７９．７％を超えるヌクレオチド配列を有するウイルスを意味することが理解される。しかし、Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号ＡＦ０１１９２１のもとで同定される完全なヌクレオチド配列と同一なゲノム、そのようなゲノムの一部を有するウイルスは、ＵＳ型Ｅ型肝炎ウイルスファミリーから除かれることが理解される。
【００３１】
本明細書中において使用されている用語「ＵＳ亜型」Ｅ型肝炎ウイルスは、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）およびＧ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）と血清学的に異なる任意のヒトウイルス（すなわち、ヒトに感染し得るウイルス）であって、少なくとも１つのオープンリーディングフレームを規定する一本鎖ＲＮＡゲノムを含み、そして配列番号８９の６３０７〜６４５４の残基によって規定されるヌクレオチド配列に対する同一性が９０．５％を超えるヌクレオチド配列を有するウイルスを意味することが理解される。
【００３２】
本明細書中において使用されている用語「試験サンプル」は、試験マーカー（例えば、抗体、抗原タンパク質またはペプチド、あるいはヌクレオチド配列）を含有する任意のサンプル（例えば、生物学的サンプル）を意味することが理解される。好ましい試験サンプルには、検査が行われている個体から単離することができる組織サンプルまたは体液サンプルが含まれる。好ましい体液サンプルには、例えば、血液、血清、血漿、唾液、痰、精液、尿、便、胆汁、脊髄液、乳房滲出液、腹水および腹膜液が含まれる。別の好ましい試験サンプルは、細胞株であり、より好ましくは哺乳動物の細胞株である。最も好ましい細胞株は、ヒト胎児腎臓細胞株である。
【００３３】
本明細書中において使用されている用語「オープンリーディングフレーム」または用語「ＯＲＦ」は、１つまたは複数のポリペプチド鎖をコードし得るポリヌクレオチド配列の領域を意味することが理解される。この領域は、完全なコード配列（すなわち、開始コドン（例えば、ＡＴＧ（ＡＵＧ））で始まり、終止コドン（例えば、ＴＡＡ（ＵＡＡ）、ＴＡＧ（ＵＡＧ）またはＴＧＡ（ＵＧＡ））で終わる配列）またはその一部を表し得る。
【００３４】
本明細書中において使用されている用語「ポリペプチド鎖」は、複数のアミノ酸を有する任意の分子鎖を意味することが理解され、特定の長さの産物を示していない。従って、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質は、ポリペプチド鎖の定義に含まれる。
【００３５】
本明細書中において使用されている用語「エピトープ」は、「抗原決定基」と同義的に使用されており、抗体の可変部によって特異的な結合（すなわち、約１０^５Ｍ^−１よりも大きな親和性を有する結合、より好ましくは約１０^７Ｍ^−１よりも大きな親和性を有する結合）を形成することができる抗原の少なくとも一部を意味することが理解される。考えられるところでは、エピトープは、エピトープに特徴的な空間配置をとっている３個のアミノ酸を含むことができる。一般に、エピトープは、少なくとも５個のアミノ酸を含み、そしてより通常的には、少なくとも８個〜１０個のアミノ酸を含む。空間配置を調べる方法はこの分野では知られており、例えば、Ｘ線結晶解析および二次元核磁気共鳴法が含まれる。
【００３６】
ポリペプチドは、ポリペプチド鎖によって規定される特定のエピトープが抗体により認識されることによって抗体に結合する場合、抗体との「免疫学的な反応性を有する」。免疫学的反応性は、抗体結合によって、より詳細には、抗体結合の速度論によって、および／または競合的結合研究によって決定することができる。予め選択された抗体はある抗原との免疫学的な反応性を有するが、別の異なる抗原との免疫学的な反応性を有さず、あるいは免疫学的な反応性をほとんど有さない。この場合、この２つの抗原は血清学的に異なると見なされる。本明細書中において使用されている用語「親和性」は、２つの分子の間（例えば、抗体と抗原との間）での可逆的な相互作用の大きさを意味することが理解される。親和性が大きいほど、２つの分子の間での相互作用は強い。
【００３７】
本明細書中において使用されている用語「検出可能な部分」は、任意のシグナル生成化合物、例えば、クロモゲン、触媒（酵素など）、発光化合物（ジオキセタン、アクリジン、フェナントリジニウムおよびルミノールなど）、放射活性元素、可視的に検出可能な標識を意味することが理解される。酵素の例には、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼなどが含まれる。特定の検出可能な部分を選択することは重要ではないが、検出可能な部分は、それ自体でシグナルを生成することができ、あるいは１つまたは複数のさらなる物質との組合せでシグナルを生成することができる。
【００３８】
本明細書中において使用されている用語「固体支持体」は、任意のプラスチック、誘導体化したプラスチック、磁気金属または非磁気金属、ガラス表面またはシリコン表面を意味することが理解される。有用な表面には、例えば、試験管、マイクロタイターウエル、シート、ビーズ、マイクロパーティクル、チップ、ヤギ（または他の適切な動物）の赤血球、またはデュラサイト（ｄｕｒａｃｙｔｅ）の表面が含まれる。好適な固体支持体は、本発明の実施に重要ではなく、当業者により選択することができる。ペプチドを固相に固定化するために好適な方法には、イオン的相互作用、疎水性相互作用、共有結合的相互作用などが含まれる。固体支持体は、捕捉試薬を引きつけて固定化するその固有的な能力に関して選ぶことができる。あるいは、固体支持体は、捕捉試薬を引きつけて固定化する能力を有するさらなるレセプターを保持することができる。
【００３９】
固体支持体はまた、検出抗体による接近を可能にする十分な多孔度、および抗原との結合に適切な親和性を有する任意の適切な多孔性材料を含むことができると考えられる。マイクロ細孔構造体が一般には好ましいが、水和状態のゲル構造を有する材料も同様に使用することができる。このような材料はすべて、フィルム、シートまたはプレートなどの適切な形態で使用することができ、あるいは、適する不活性な担体（紙、ガラス、プラスチックフィルムまたは織物など）にコーティングすることができ、または結合させることができ、または積層化することができる。
【００４０】
様々な他の固体支持体が利用される他の実施形態もまた考えられ、そしてこれらもまた本発明の範囲内である。例えば、欧州特許公開第０ ３２６ １００号および同第０ ４０６ ４７３号に記載されている負荷電ポリマーとの固定化が可能な反応複合体を固定化するためのイオン捕捉手順を本発明に従って用いて、迅速な液相免疫化学的反応を行うことができる。固定化可能な免疫複合体は、負荷電ポリアニオン／免疫複合体と、前処理された正荷電の多孔性マトリックスとのイオン的相互作用によって反応混合物の残りから分離され、そして欧州特許公開第０ ２７３ １１５号に記載されているような化学発光シグナル測定に記載されているシステムを含む、前記の様々なシグナル生成システムを使用することによって検出される。
【００４１】
さらに、本発明の方法は、自動化システムおよび半自動化システムを含むマイクロパーティクル技術を利用するシステムにおける使用に適合させることができる：この場合、固相はマイクロパーティクル（磁気または非磁気）を含む。そのようなシステムには、米国特許第５，０８９，４２４号および同第５，２４４，６３０号（それぞれ、１９９２年２月１８日発行および１９９３年９月１４日発行）に記載されているシステムが含まれる。
【００４２】
走査プローブ顕微鏡（ＳＰＭ）を免疫アッセイのために使用することもまた、本発明のモノクローナル抗体を容易に適合させることができる技術である。走査プローブ顕微鏡において、特に原子間力顕微鏡において、捕捉相（例えば、少なくとも１つの本発明のモノクローナル抗体）を固相に付着させ、そして走査プローブ顕微鏡を利用して、固相の表面に存在し得る抗原／抗体の複合体が検出される。走査トンネル顕微鏡を使用することによって、抗原／抗体の複合体を検出するために多くの免疫アッセイシステムにおいて通常使用しなければならない標識に対する必要性がなくなる。ＳＰＭを使用して特定の結合反応をモニターすることは、多くの方法で行うことができる。１つの実施形態において、特異的な結合パートナー（本発明のモノクローナル抗体である分析物特異的物質）の１つが、走査するのに適切な表面に結合させられる。分析物特異的物質の結合は、当業者に知られている方法に従って、プラスチック表面または金属表面の固相を含む試験片に吸着させることによって行うことができる。あるいは、特異的な結合パートナー（分析物特異的物質）の、誘導体化したプラスチック、金属、シリコンまたはガラスの固相を含む試験片への共有結合的な結合を利用することができる。共有結合的な結合方法は当業者に知られており、これには、特異的な結合パートナーを試験片に可逆的に連結させるための様々な手段が含まれる。試験片がシリコンまたはガラスである場合、その表面は、特定の結合パートナーを結合させる前に活性化しなければならない。同様に、多価電解質の相互作用は、欧州特許公開０ ３２２ １００号および同第０ ４０６ ４７３号に記載されている技術および化学薬品を使用することによって特異的な結合パートナーを試験片の表面に固定化するために使用することができる。好ましい結合方法は、共有結合的な結合によって行われる。特異的な結合メンバーを結合させた後、その表面は、非特異的な結合を最小限にするために、血清、タンパク質または他のブロッキング剤などの物質でさらに処理することができる。表面はまた、それがアッセイ目的に適するかどうかを確認するために、製造部位または使用場所のいずれかにおいて調べることができる。そのような調査プロセスによって試験片の特異的な結合特性は変化しないことが予想される。
【００４３】
本明細書中において使用されている用語「ヌクレオチド配列」または用語「核酸配列」は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかで、任意の長さを有する任意のポリマー形態のヌクレオチドを意味することが理解される。この用語は、分子の一次構造を示す。従って、この用語には、二本鎖および一本鎖のＤＮＡならびに二本鎖および一本鎖のＲＮＡが含まれる。この用語はまた、例えば、メチル化および／またはキャッピング化による修飾体、および未修飾形態のポリヌクレオチドが含まれる。
【００４４】
本明細書中において使用されている用語「プライマー」は、標的ヌクレオチド配列に相補的な特異的オリゴヌクレオチド配列を意味することが理解される。プライマーは、標的ヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションすることができ、そしてＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素によって触媒されるヌクレオチド重合の開始点として作用することができる。
【００４５】
核酸フラグメントに言及される場合、そのようなフラグメントは、検出の直線性の範囲において、ハイブリダイゼーションにより、ＨＥＶのＵＳ型、ＵＳ亜型またはその変異型とは異なる等量のポリヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションから得られるシグナルに比べてより強いシグナルが得られる場合、ＨＥＶのＵＳ型またはＵＳ亜型のポリヌクレオチドまたはその変異型に対して「特異的にハイブリダイゼーションする」と見なされ、すなわち「特異的に結合する」と見なされる。別のシグナルよりも「強い」シグナルは、特定の検出方法によるそれ以外のシグナルを上まわる測定可能なシグナルである。
【００４６】
同様に、核酸フラグメントに言及される場合、核酸フラグメントが下記の条件のもとで特異的にハイブリダイゼーションする場合、そのようなフラグメントは特異的なハイブリダイゼーション条件のもとでハイブリダイゼーションすると見なされる：（ｉ）典型的なハイブリダイゼーション条件および洗浄条件、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ（第１版、３８７頁〜３８９頁、１９８２年）に記載されている条件など、この場合、好ましいハイブリダイゼーション条件は、ストリンジェンシーがより低い条件であり、そしてより好ましくは、より大きなストリンジェンシーの条件；あるいは（ｉｉ）標準的なＰＣＲ条件（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ら）または「タッチダウン」ＰＣＲ条件（Ｒｏｕｘ，Ｋ．Ｈ．、（１９９４）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１６：８１２〜８１４）である。
【００４７】
本明細書中において使用されている用語「プローブ」は、相補的な配列を有するサンプル中に存在する特定のＤＮＡまたはＲＮＡを同定するために使用することができる配列を含有する任意のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ（例えば、ＰＮＡ）を意味することが理解される。
【００４８】
本明細書中において使用されている用語「ＰＮＡ」は、標的の存在を決定するために本明細書中に記載されているアッセイなどの手順において利用することができるペプチド核酸アナログを意味するために使用されている。「ＭＡ」は、標的の存在を決定するために本明細書中に記載されているアッセイなどの手順において利用され得る「モルホリノアナログ」を示す。例えば、米国特許第５，３７８，８４１号を参照のこと（これは参考として本明細書中に援用される）。ＰＮＡは、典型的には、ＲＮＡ標的またはＤＮＡに指向し得る中性電荷の分子である。例えば、本発明のＤＮＡプローブの代わりにアッセイにおいて使用されるＰＮＡプローブにより、ＤＮＡプローブが使用されたときに達成することができない利点が得られる。このような利点には、製造性、大規模な標識化、再現性、安定性、イオン強度の変化に対する不感性、およびＤＮＡまたはＲＮＡが利用される方法において存在する酵素的分解に対する耐性が含まれる。このようなＰＮＡは、フルオレセイン、放射性ヌクレオチド、化学発光化合物などのようなシグナル生成化合物で標識することができる。従って、ＰＮＡまたは他の核酸アナログ（ＭＡなど）は、ＤＮＡまたはＲＮＡの代わりにアッセイ方法で使用することができる。ＤＮＡプローブを利用するアッセイが本明細書中に記載されているが、ＰＮＡまたはＭＡは、それらがアッセイ試薬において必要な場合およびアッセイ試薬において必要とされるような適切な変化とともにＲＮＡまたはＤＮＡの代わりになり得ることは通常作業の範囲である。
【００４９】
核酸フラグメントに言及する場合、検出の直線性の範囲において、ハイブリダイゼーションにより、ＨＥＶのＵＳ型、ＵＳ亜型またはその変異型以外の等量のポリヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションから得られるシグナルに比べ、より強いシグナルが得られる場合、そのようなフラグメントは、ＨＥＶのＵＳ型またはＵＳ亜型のポリヌクレオチドまたはその変異型に対して「特異的にハイブリダイゼーションする」と見なされ、すなわち「特異的に結合する」と見なされる。別のシグナルよりも「強い」シグナルは、特定の検出方法によってそれ以外のシグナルよりも大きい測定可能なシグナルである。
【００５０】
同様に、核酸フラグメントに言及する場合、核酸フラグメントが下記の条件のもとで特異的にハイブリダイゼーションする場合、そのようなフラグメントは特異的なハイブリダイゼーション条件のもとでハイブリダイゼーションすると見なされる：（ｉ）典型的なハイブリダイゼーション条件および洗浄条件、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ（第１版、３８７頁〜３８９頁、１９８２年）に記載されている条件など、この場合、好ましいハイブリダイゼーション条件は、ストリンジェンシーがより低い条件であり、そしてより好ましくは、より大きなストリンジェンシーの条件である；あるいは（ｉｉ）標準的なＰＣＲ条件（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ら）または「タッチダウン」ＰＣＲ条件（Ｒｏｕｘ，Ｋ．Ｈ．、（１９９４）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１６：８１２〜８１４）。
【００５１】
ＩＩ．検出方法および試薬
本発明の検出方法には、下記に詳述される様々なタンパク質系アッセイまたは核酸系アッセイを用いることができると考えられる。
【００５２】
ウイルスまたはそのマーカーを検出するための試薬は、抗ＵＳ型Ｅ型肝炎ウイルス抗体および／または抗ＵＳ亜型Ｅ型肝炎ウイルス抗体、ＵＳ型特異的ポリペプチドおよび／またはＵＳ亜型特異的ポリペプチド、あるいはＵＳ型Ｅ型肝炎ウイルスゲノムおよび／またはＵＳ亜型Ｅ型肝炎ウイルスゲノムの少なくとも一部を規定する核酸またはその相補核酸配列のいずれかであり得ると考えられる。
【００５３】
ＩＩ．（ｉ）タンパク質系アッセイ
Ａ．マーカー抗体：ウイルスマーカーが、目的とする個体の血流中を循環している抗ＵＳ型またはＵＳ亜型の特異的抗体（例えば、ＩｇＧまたはＩｇＭ）分子である場合、結合パートナーは、好ましくは、マーカーに特異的に結合するエピトープを規定するポリペプチドである。
【００５４】
抗ＵＳ型Ｅ型肝炎ウイルス抗体または抗ＵＳ亜型Ｅ型肝炎ウイルス抗体の試験サンプル中での存在を検出するための好ましいプロトコルにおいて、このプロトコルは、好ましくは下記の工程含む：（ａ）少なくとも５個、より好ましくは少なくとも８個、さらにより好ましくは少なくとも１５個、最も好ましくは２５個の連続したアミノ酸残基を含み、抗体により結合可能な免疫学的に反応し得るＵＳ型特異的ポリペプチド鎖またはＵＳ亜型特異的ポリペプチド鎖を含む抗原を提供する工程；（ｂ）抗原を、抗体−抗原の複合体の形成を可能にする条件のもとで試験サンプルとインキュベーションする工程；および（ｃ）複合体の存在を検出する工程。
【００５５】
多くの異なるＵＳ型特異的ポリペプチドまたはＵＳ亜型特異的ポリペプチドは、抗ＵＳ型抗体または抗ＵＳ亜型抗体を検出するための結合パートナーとして有用であり得ると考えられる。例えば、このようなポリペプチド鎖は、配列番号９１、配列番号９２または配列番号９３によって規定されるアミノ酸配列、あるいは配列番号９１、配列番号９２または配列番号９３に示されるポリペプチドの少なくとも５個、より好ましくは少なくとも８個、さらにより好ましくは少なくとも１５個、最も好ましくは２５個の連続したアミノ酸残基であって、ビルマ株ファミリーおよびメキシコ株ファミリーのメンバーの対応アミノ酸配列と比較したときに特徴的なアミノ酸配列を表すアミノ酸残基を含むその免疫学的に反応し得るフラグメントであり得ると考えられる。本明細書中において使用されているビルマ株ファミリー（すなわち、「ビルマ株様」株）には、現在、Ｂ１、Ｂ２、Ｉ１、Ｉ２、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４およびＰ１として本明細書中で示される株が含まれ、メキシコ株ファミリーには、現在のところＭ１株が含まれる。
【００５６】
結合パートナーは、配列番号９１、配列番号９２および配列番号９３によって規定されるポリペプチドならびにその天然に存在する変異型からなる群から選択されるポリペプチドであり得ると考えられる。配列番号９１によって規定されるポリペプチドに関して、本明細書中において使用されている用語「その天然に存在する変異型」は、配列番号９２の残基１〜１６９８に対して少なくとも８４％の同一性、好ましくは少なくとも８６％の同一性、より好ましくは少なくとも８９％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する任意のアミノ酸配列を意味することが理解される。配列番号９２によって規定されるポリペプチドに関して、本明細書中において使用されている用語「その天然に存在する変異型」は、配列番号９１の残基１〜６６０に対して少なくとも９３％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９８％の同一性を有する任意のアミノ酸配列を意味することが理解される。配列番号９３によって規定されるポリペプチドに関して、本明細書中において使用されている用語「その天然に存在する変異型」は、配列番号９３の残基１〜１２２に対して少なくとも８５．４％の同一性、好ましくは少なくとも８７．４％の同一性、より好ましくは少なくとも９０．４％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する任意のアミノ酸配列を意味することが理解される。
【００５７】
さらに、結合パートナーは、ＯＲＦ１の配列の一部によってコードされるポリペプチドであり得ると考えられる。このＯＲＦ１の配列によってコードされるタンパク質には、例えば、メチルトランスフェラーゼタンパク質、プロテアーゼ、Ｙドメインタンパク質、Ｘドメインタンパク質、ヘリカーゼタンパク質、超可変領域タンパク質、およびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼタンパク質が含まれる。従って、有用なメチルトランスフェラーゼタンパク質は、配列番号９１の残基１〜２３１に対して、好ましくは少なくとも９２．３％の同一性、より好ましくは少なくとも９４．３％の同一性、最も好ましくは少なくとも９７．３％の同一性を有すると考えられる。同様に、有用なプロテアーゼタンパク質は、配列番号９１の残基４２４〜６９７に対して、好ましくは少なくとも７０．３％の同一性、より好ましくは少なくとも７２．３％の同一性、最も好ましくは少なくとも７５．３％の同一性を有すると考えられる。同様に、有用なＹドメインタンパク質は、配列番号９１の残基２０７〜４２４に対して、好ましくは少なくとも９４．６％の同一性、より好ましくは少なくとも９６．６％の同一性、最も好ましくは少なくとも９９．６％の同一性を有すると考えられる。同様に、有用なＸドメインタンパク質は、配列番号９１の残基７８９〜９４７に対して、好ましくは少なくとも８３．４％の同一性、より好ましくは少なくとも８５．４％の同一性、最も好ましくは少なくとも８８．４％の同一性を有すると考えられる。同様に、有用なヘリカーゼタンパク質は、配列番号９１の残基９６５〜１１９７に対して、少なくとも９２％の同一性、より好ましくは少なくとも９４％の同一性、最も好ましくは少なくとも９３％の同一性を有すると考えられる。同様に、有用な超可変領域タンパク質は、配列番号９１の残基６９８〜７８８に対して、少なくとも２８．７％の同一性、より好ましくは少なくとも３０．７％の同一性、最も好ましくは少なくとも３３．７％の同一性を有すると考えられる。同様に、有用なＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号９１の残基１２１２〜１６９８に対して、少なくとも８８．８％の同一性、より好ましくは少なくとも９０．８％の同一性、最も好ましくは少なくとも９３．８％の同一性を有すると考えられる。
【００５８】
さらに、結合パートナーは、配列番号１６６、配列番号１６７または配列番号１６８によって規定されるアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖、あるいは配列番号１６６、配列番号１６７または配列番号１６８に示されるポリペプチド鎖の５個の連続したアミノ酸残基、好ましくは少なくとも８個の連続したアミノ酸残基、より好ましくは少なくとも１５個の連続したアミノ酸残基、最も好ましくは少なくとも２５個の連続したアミノ酸残基であって、ビルマ株ファミリーおよびメキシコ株ファミリーのメンバーの対応するアミノ酸配列と比較した場合に特徴的なアミノ酸配列を示すアミノ酸残基を含有するその免疫学的に活性なフラグメントであり得ると考えられる。同様に、結合パートナーは、配列番号１６６、配列番号１６７および配列番号１６８ならびにそのその天然に存在する変異型からなる群から選択されるポリペプチドであり得ると考えられる。配列番号１６６によって規定されるポリペプチドに関して、本明細書中において使用されている用語「その天然に存在する変異型」は、配列番号１６６の残基１〜１７０８に対して少なくとも８３．９％の同一性、好ましくは少なくとも８５．９％の同一性、より好ましくは少なくとも８８．９％の同一性、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する任意のアミノ酸配列を意味することが理解される。配列番号１６７によって規定されるポリペプチドに関して、本明細書中において使用されている用語「その天然に存在する変異型」は、配列番号１６７の残基１〜６６０に対して少なくとも９３％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９８％の同一性を有する任意のアミノ酸配列を意味することが理解される。配列番号１６８によって規定されるポリペプチドに関して、本明細書中において使用されている用語「その天然に存在する変異型」は、配列番号１６８の残基１〜１２２に対して少なくとも８５．４％の同一性、好ましくは少なくとも８７．４％の同一性、より好ましくは少なくとも９０．４％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する任意のアミノ酸配列を意味することが理解される。
【００５９】
さらに、結合パートナーは、ＨＥＶ ＵＳ−２のＯＲＦ１の一部によってコードされるポリペプチドであり得ると考えられる。これには、例えば、メチルトランスフェラーゼタンパク質、プロテアーゼ、Ｙドメインタンパク質、Ｘドメインタンパク質、ヘリカーゼタンパク質、超可変領域タンパク質、およびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼタンパク質、またはその変異型が含まれる。従って、有用なメチルトランスフェラーゼタンパク質は、配列番号１６６の残基１〜２４０に対して、好ましくは少なくとも９２．７％の同一性、より好ましくは少なくとも９４．７％の同一性、最も好ましくは少なくとも９７．７％の同一性を有すると考えられる。同様に、有用なプロテアーゼタンパク質は、配列番号１６６の残基４３３〜７０６に対して、好ましくは少なくとも６９．６％の同一性、より好ましくは少なくとも７１．６％の同一性、最も好ましくは少なくとも７４．６％の同一性を有すると考えられる。同様に、有用なＹドメインタンパク質は、配列番号１６６の残基２１６〜４３３に対して、好ましくは少なくとも９４．６％の同一性、より好ましくは少なくとも９６．６％の同一性、最も好ましくは少なくとも９９．６％の同一性を有すると考えられる。同様に、有用なＸドメインタンパク質は、配列番号１６６の残基７９９〜９５７に対して、好ましくは少なくとも８２．８％の同一性、より好ましくは少なくとも８４．８％の同一性、最も好ましくは少なくとも８７．８％の同一性を有すると考えられる。同様に、有用なヘリカーゼタンパク質は、配列番号１６６の残基９７５〜１２０７に対して、好ましくは少なくとも９２．８％の同一性、より好ましくは少なくとも９４．８％の同一性、最も好ましくは少なくとも９７．８％の同一性を有すると考えられる。同様に、有用な超可変領域タンパク質は、配列番号１６６の残基７０７〜７９８に対して、少なくとも２７％の同一性、より好ましくは少なくとも２９％の同一性、最も好ましくは少なくとも３１％の同一性を有すると考えられる。同様に、有用なＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号１６６の残基１２２２〜１７０８に対して、少なくとも８８．７％の同一性、より好ましくは少なくとも９０．７％の同一性、最も好ましくは少なくとも９３．７％の同一性を有すると考えられる。
【００６０】
ＵＳ型特異的エピトープまたはＵＳ亜型特異的エピトープの同定に関して、ＵＳ型Ｅ型肝炎ウイルスゲノムまたはＵＳ亜型Ｅ型肝炎ウイルスゲノムの少なくとも一部を規定する核酸配列および／またはそのようなゲノムの一部によってコードされるアミノ酸配列を所有している当業者は、この分野でよく知られ、そして十分に議論されている従来の技術を使用してエピトートと考えられる部位の位置を決めることができると考えられる。ある配列においてエピトープと考えられる部位を同定する市販のソフトウエアを使用することに加えて、そのようなゲノムによってコードされるアミノ酸配列を、抗原性部位が既に明らかにされている他のＨＥＶ株のゲノムによってコードされる配列と比較することによって潜在的なエピトープを同定することができる。例えば、米国特許第５，６８６，２３９号、同第５，７４１，４９０号および同第５，７７０，６９６号を参照のこと。現在同定されているエピトープを図１に示す。これには、この分野で、８−５（配列番号９３および配列番号１６８）、４−２（配列番号９３および配列番号１６８の９０位〜１２２位）、ＳＧ３（配列番号１７５および配列番号１７６）、３−２（配列番号９２および配列番号１６７の６１３位〜６５４位）、および３−２ｅ（配列番号９２および配列番号１６７の６１３位〜６６０位）として示されるエピトープが含まれる。抗原性指数を計算するための方法は、ＪａｍｅｓｏｎおよびＷｏｌｆによって記載されている（ＣＡＢＩＯＳ、４（１）、１８１〜１８６［１９８８］）。
【００６１】
例えば、目的とする２つのエピトープが下記に詳しく記載されているが、これらは３−２ｅおよび４−２として示される：３−２ｅおよび４−２は、それぞれ、Ｅ型肝炎ゲノムのＯＲＦ２およびＯＲＦ３の一部によってコードされる。これらのエピトープは、ＨＥＶのビルマ株において同定され（Ｂ３−２ｅ（配列番号１７２）およびＢ４−２（配列番号１７１）として下記では示され）、そしてＨＥＶのメキシコ株において同定された（Ｍ３−２ｅ（配列番号１７０）およびＭ４−２（配列番号１６９）として下記では示される）。類似するエピトープが、ＨＥＶ ＵＳ−１において、アミノ酸配列の比較に基づいて同定され、これらはＵ３−２ｅ（配列番号１７４）およびＵ４−２（配列番号１７３）として示される。類似するエピトープが、ＨＥＶ ＵＳ−２において、同様にアミノ酸配列の比較に基づいて同定され、これらはＵＳ−２ ３−２ｅ（配列番号２２３）およびＵＳ−２ ４−２（配列番号２２４）として示される。
【００６２】
さらに、潜在的なエピトープは、この分野でよく知られ、そして十分に記載されているスクリーニング手順を使用して同定することができる。例えば、ＨＥＶ ＵＳ−１ゲノムまたはＨＥＶ ＵＳ−２ゲノムの全体または一部のいずれかを規定する核酸配列に基づいて、発現させた後にスクリーニングしてエピトープを同定することができる発現ライブラリーを作製することができる。例えば、ＨＥＶ ＵＳ−１ゲノムまたはＨＥＶ ＵＳ−２ゲノムを表す核酸フラグメントをλｇｔ１１発現ベクターにクローニングして、λｇｔ１１ライブラリー（例えば、ｃＤＮＡライブラリー）を作製することができる。次いで、このライブラリーは、ＨＥＶ ＵＳ−１またはＨＥＶ ＵＳ−２に感染していると同定された感染者から得られた血清と特異的に結合することができるコードされたエピトープについてスクリーニングされる。例えば、Ｇｌｏｖｅｒ（１９８５）の「ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、４９頁〜７８頁）を参照のこと。典型的には、約１０^６個〜１０^７個のファージがスクリーニングされる。この中から陽性ファージの同定および精製を行い、次いで、ＨＥＶ ＵＳ−１またはＨＥＶ ＵＳ−２に以前に感染した異なる個体から得られた血清に対する結合特異性について試験される。そのような個体から得られた血清または血漿に存在する抗体に選択的に結合するファージを選択して、さらなる特徴づけが行われる。一旦同定されると、目的とするアミノ酸配列は、この分野でよく知られ、そして十分に記載されている従来の組換えＤＮＡ方法論を使用することによって、あるいは従来のペプチド合成方法論によって大規模に得ることができる。
【００６３】
ｂ．マーカーポリペプチド：マーカーがＵＳ型ウイルスまたはＵＳ亜型ウイルスあるいはその特異的ポリペプチドである場合、本発明の実施において有用な結合パートナーは、好ましくは、ウイルスまたはマーカーポリペプチドの表面にあるエピトープに結合する抗体（例えば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体）であることが考えられる。結合パートナーは、検出可能な部分で標識することができ、あるいは固体支持体に固定化することができる。特に、この実施形態の実施において有用な抗体は、好ましくは、長さが好ましくは５個の連続したアミノ酸残基、より好ましくは少なくとも８個の連続したアミノ酸残基、さらにより好ましくは少なくとも１５個のアミノ酸残基、最も好ましくは少なくとも２５個の連続したアミノ酸残基であり、そしてビルマ株ファミリーおよびメキシコ株ファミリーのメンバーにおいて見出される対応するアミノ酸配列に関して特徴的であるＵＳ型特異的ポリペプチド鎖またはＵＳ亜型特異的ポリペプチド鎖に特異的に結合することができる。
【００６４】
本発明のこの実施形態の実施において有用な抗体は、好ましくは、配列番号９１、配列番号９２および配列番号９３ならびにその天然に存在する変異型からなる群から選択されるポリペプチド鎖に特異的に結合することができ、そしてビルマ株ファミリーおよびメキシコ株ファミリーのメンバーの対応する配列に比べて、そのようなポリペプチド鎖のより大きな結合親和性を有する。本発明の実施において有用な抗体は、好ましくは、配列番号１７３または配列番号１７５に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖に特異的に結合することができると考えられる。この抗体はさらに、同様な条件のもとで、配列番号１６９または配列番号１７１に示されるアミノ酸配列あるいは配列番号１７５に対応するビルマ株およびメキシコ株の領域に対して、好ましくはより小さい親和性を有し、そして最も好ましくはそれらに結合しないことを特徴とすると考えられる。同様に、本発明の実施において有用な抗体は、好ましくは、配列番号１７４または配列番号１７６に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖に特異的に結合することができると考えられる。この抗体はさらに、同様な条件のもとで、配列番号１７０または配列番号１７２に示されるアミノ酸配列あるいは配列番号１７６に対応するビルマ株およびメキシコ株の領域に対して、好ましくはより小さい親和性を有し、そして最も好ましくはそれらに結合しないことを特徴とすると考えられる。
【００６５】
同様に、本発明のこの実施形態の実施において有用な抗体は、好ましくは、配列番号１６６、配列番号１７７および配列番号１６８ならびにその天然に存在する変異型からなる群から選択されるポリペプチド鎖に特異的に結合することができ、そしてビルマ株ファミリーおよびメキシコ株ファミリーのメンバーの対応する配列に比べて、そのようなポリペプチド鎖のより大きな結合親和性を有すると考えられる。本発明の実施において有用な抗体は、好ましくは、配列番号２２３に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖に特異的に結合することができると考えられる。この抗体はさらに、同様な条件のもとで、配列番号１７０または配列番号１７２に示されるアミノ酸配列に対して、好ましくはより小さい親和性を有し、そして最も好ましくはそれらに結合しないことを特徴とすると考えられる。同様に、本発明の実施において有用な抗体は、好ましくは、配列番号２２４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖に特異的に結合することができると考えられる。この抗体はさらに、同様な条件のもとで、配列番号１６９または配列番号１７１に示されるアミノ酸配列に対して、好ましくはより小さい親和性を有し、そして最も好ましくはそれらに結合しないことを特徴とすると考えられる。
【００６６】
本明細書中に記載されている抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＵＳ型特異的抗原またはＵＳ亜型特異的抗原を検出するために個々に提供され得る。本明細書中において提供される抗体（およびその抗原結合性フラグメント）の組合せもまた、ＵＳ型特異的抗原またはＵＳ亜型特異的抗原に対して異なる結合親和性をともに有する少なくとも２つの抗体の混合物または「カクテル」における成分として一緒に使用することができる。
【００６７】
ｃ．抗体の産生：ＵＳ型Ｅ型肝炎ウイルスまたはＵＳ亜型Ｅ型肝炎ウイルスのＯＲＦ１配列、ＯＲＦ２配列および／またはＯＲＦ３配列の少なくとも一部を規定する核酸配列あるいはそれによってコードされるアミノ酸配列を所有する当業者は、この分野でよく知られ、そして十分に記載されている技術を使用して特異的な抗体を作製することができると考えられる。例えば、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｂｕｔｔ，Ｎ．Ｒ．編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、ＮＹ、１９８４）を参照のこと。簡単に記載すると、単離された標的タンパク質は、異種の宿主（マウス、ブタ、ヤギその他の適切な動物）で抗体を惹起させるために使用される。好ましい抗体は、標的タンパク質上のエピトープに特異的に結合する抗体であって、そのようなエピトープに関して、好ましくは１０^５Ｍ^−１よりも大きな結合親和性を有し、最も好ましくは１０^７Ｍ^−１よりも大きな結合親和性を有する抗体である。典型的には、標的タンパク質は、宿主での抗体産生を高めることができる適切なアジュバントと一緒にされ、そして、例えば、腹腔内投与によって宿主に注射される。宿主の免疫応答を刺激するのに適切な任意のアジュバントを都合よく使用することができる。一般に使用されているアジュバントは、フロインド完全アジュバントである（例えば、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｏｒｐ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）またはＧｉｂｃｏ（Ｇｒａｎｄ ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）から得られる殺傷して乾燥した微生物細胞を含むエマルション）。多数回の抗原注射が所望される場合、その後の注射には、不完全アジュバント（例えば、無細胞エマルション）と組み合わせた抗原が含まれる。
【００６８】
ポリクローナル抗体は、目的とするタンパク質に対する抗体を含む血清を分離することによって、抗体を産生する宿主から単離することができる。モノクローナル抗体は、所望する抗体を産生する宿主細胞を単離し、免疫学の分野で知られている標準的な技術（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５を参照のこと）を使用してこれらの細胞をミエローマ細胞と融合し、そして標的タンパク質と特異的に反応し、かつ所望する結合親和性を有するハイブリッド細胞（ハイブリドーマ）についてスクリーニングすることによって得ることができる。
【００６９】
さらに、小さなペプチドが使用される場合、その免疫原性は、固体支持体に結合することによって高めることができると考えられる。例えば、ポリペプチドのエピトープまたは抗原性領域または抗原性フラグメントは、一般に比較的小さく、長さが約８個〜１０個以下のアミノ酸を含む程度である。３個程度の少数のアミノ酸のフラグメントによって、抗原性領域が特徴付けされることがある。このようなポリペプチドは、提供された目的のポリペプチドが、正しいエピトープが得られるようにフォールディングされるが、非常に小さいために抗原性でない場合には、適切な担体分子に連結させることができる。
【００７０】
その使用に関して好ましい連結試薬および方法は、この分野ではよく知られている。このような試薬には、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピルジルチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）およびスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＳＭＣＣ）が含まれるが、これらに限定されない。さらに、スルフヒドリル基を有さないポリペプチドは、システイン残基を付加することによって修飾することができる。これらの試薬により、自分自身とタンパク質上のペプチドのシステイン残基との間のジスルフィド結合、およびリシンのε−アミノ基またはそれ以外の他の遊離アミノ基によるアミド結合が得られる。様々なそのようなジスルフィド／アミド形成試薬が知られている。他の二官能基性カップリング剤は、ジスルフィド結合よりもむしろ、チオエステルを形成する。このようなチオエーテル形成剤の多くは市販されており、当業者に知られている。カルボキシル基は、スクシンイミドまたは１−ヒドロキシ−２−ニトロ−４−スルホン酸のナトリウム塩と一緒にすることによって活性化することができる。宿主にとって有害な抗体の産生を自身では誘導しない任意の担体を使用することができる。好適な担体には、特に、タンパク質、多糖類（例えば、ラテックスで官能基化したセファロース、アガロース、セルロースなど）、セルロースビーズ、ポリマー状アミノ酸（例えば、ポリグルタミン酸、ポリリシンなど）、および非酸コポリマー、および不活性なウイルス粒子が含まれる。タンパク質基体の例には、血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、チログロブリン、オボアルブミン、破傷風トキソイド、および当業者に知られているさらに他のタンパク質が含まれる。
【００７１】
さらに、生合成された抗体結合ドメイン（この場合、結合ドメインのアミノ酸配列は、好ましいエピトープに対する結合親和性を高めるために操作されている）もまた、本発明の実施において有用であり得ると考えられる。その調製の詳細な説明は、例えば、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ＢｕｔｔＷ．Ｒ．編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８４）に見出すことができる。任意に、ＦａｂフラグメントまたはＦａｂ’フラグメントなどの一価の抗体フラグメントを利用することができる。さらに、遺伝子工学的に生合成された抗体結合部位を利用することができる。これには、例えば、米国特許第５，０９１，５１３号および同第５，１３２，４０５号に開示されているように、１）非共有結合的会合またはジスルフィド結合の合成されたＶ_ＨダイマーおよびＶ_Ｌダイマー、２）共有結合的に連結されたＶ_Ｈ−Ｖ_Ｌの単鎖結合部位、３）個々のＶ_ＨダイマーまたはＶ_Ｌダイマー、あるいは４）単鎖抗体の結合部位のいずれかが含まれる。
【００７２】
ＵＳ型Ｅ型肝炎ウイルス特異的エピトープまたはＵＳ亜型Ｅ型肝炎ウイルス特異的エピトープと結合する無傷な抗体（例えば、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体）、抗体フラグメントまたは生合成された抗体結合部位は、診断および予後の適用において有用であり、そして受動的な免疫療法においても有用であると考えられる。
【００７３】
ｄ．アッセイ様式：抗ＵＳ型Ｅ型肝炎ウイルス特異的抗体または抗ＵＳ亜型Ｅ型肝炎ウイルス特異的抗体、あるいはＵＳ型Ｅ型肝炎ウイルス特異的エピトープまたはＵＳ亜型Ｅ型肝炎ウイルス特異的エピトープに対して惹起された抗体を含有する血清と免疫学的に反応する２つのポリペプチドは、目的とする試験サンプルにおけるそのようなウイルスの存在を検出するための免疫アッセイにおいて有用であると考えられる。さらに、試験サンプルにおけるＵＳ型Ｅ型肝炎ウイルスまたはＵＳ亜型Ｅ型肝炎ウイルスの存在は、この分野で現在知られており、そして十分に記載されている広範囲の免疫アッセイ技術（例えば、直接的なアッセイ、サンドイッチアッセイおよび／または競合アッセイ）のいずれかを使用して検出することができると考えられる。様々な好ましいアッセイ様式を下記に詳しく説明する。
【００７４】
１つの好ましい様式において、サンドイッチ様式がアッセイで用いられる。サンドイッチ免疫アッセイは、典型的には、良好な検出限界を有する標識が使用される場合、特異性が高く、非常に高感度である。免疫学的アッセイの設計、理論およびプロトコルの詳細な総説は、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｂｕｔｔ，Ｗ．Ｒ．編、Ｍａｒｃｅｌｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８４）を含むこの分野での数多くの書籍に見出すことができる。
【００７５】
サンドイッチ様式の１つのタイプにおいては、固体支持体に固定化され、そして抗ＵＳ型または抗ＵＳ亜型のＥ型肝炎ウイルス抗体（マーカー）と免疫学的に反応し得るポリペプチド（結合パートナー）を、ＵＳ型Ｅ型肝炎ウイルスまたはＵＳ亜型Ｅ型肝炎ウイルスに感染していることが疑われる個体から得られた試験サンプルと接触させて混合物にする。次いで、この混合物を、ポリペプチド／抗体の複合体が形成されるのに十分な時間および条件のもとでインキュベーションする。次いで、試験サンプルの抗体に特異的に結合するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体またはそのフラグメントを含み、そして検出可能な部分で標識された指示試薬を、抗原／抗体の複合体と接触させて第２の混合物にする。次いで、この第２の混合物を、抗原／抗体／抗体の複合体が形成されるのに十分な時間および条件のもとでインキュベーションする。試験サンプルにおける抗ＵＳ型Ｅ型肝炎抗体または抗ＵＳ亜型Ｅ型肝炎抗体の存在は、そのような抗体が存在する場合には固体支持体に固定化された検出可能な部分の存在によって決定される。試験サンプルに存在する抗体の量は、生成したシグナルに比例する。ビオチンおよび抗ビオチン、ビオチンおよびアビジン、ビオチンおよびストレプトアビジンなどを使用することによって、本明細書中に記載されているアッセイシステムにおける生成シグナルを高めることができる。
【００７６】
上記アッセイの代替的な様式において、免疫学的に反応し得るポリペプチドは、固体支持体に、「間接的に」、すなわち、そのようなポリペプチドと特異的に結合するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体またはそのフラグメントによって固定化することができる。あるいは、別の様式において、アッセイ成分は、試験サンプルの抗体と特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント、すなわち、マーカー抗体（例えば、ＩｇＧまたはＩｇＭ）が固体支持体に固定化され、そして抗体／抗体の複合体の形成を可能にするのに十分な時間および条件のもとで試験サンプルと接触させられるように逆の形態で使用することができる。次いで、指示試薬（例えば、捕捉された試験サンプルの抗体と免疫学的に反応することができ、そして検出可能な部分で標識されたＵＳ型Ｅ型肝炎ポリペプチドまたはＵＳ亜型Ｅ型肝炎ポリペプチド）を、抗体／抗体／抗原の複合体の形成を可能にするのに十分な時間および条件のもとで抗体／抗体の複合体とインキュベーションして、第２の混合物にする。上記のように、固体支持体に固定化された捕捉抗体またはその抗原結合フラグメントによって捕捉された試験サンプル中の抗体の存在は、それが存在する場合には検出可能な部分により生成した測定可能なシグナルを検出することによって決定することができる。
【００７７】
上記のサンドイッチアッセイはまた、上記のアッセイ形態の日常的な改変によって、試験サンプル中におけるＵＳ型Ｅ型肝炎ウイルスまたはＵＳ亜型Ｅ型肝炎ウイルスあるいはその免疫学的に反応し得るポリペプチドの存在について試験するために使用できると考えられる。そのような改変は当業者には十分に知られていると考えられる。
【００７８】
上記のサンドイッチアッセイに加えて、競合的アッセイもまた本発明の実施において用いることができると考えられる。この様式においては、ＵＳ型Ｅ型肝炎特異的ポリペプチド鎖またはＵＳ亜型Ｅ型肝炎特異的ポリペプチド鎖に特異的に結合する抗体（好ましくは、モノクローナル抗体）の１つまたは少なくとも２つの抗体の組合せを、ＵＳ型特異的タンパク質またはＵＳ亜型特異的タンパク質に対する抗体を検出するための競合プローブとして用いることができる。例えば、マーカーの結合パートナーとして作用する第１のＨＥＶ ＵＳ−１に特異的なポリペプチド鎖（本明細書中に開示されているポリペプチドの１つなど）は固体支持体に固定化される。次いで、ＨＥＶ ＵＳ−１抗原に対する抗体を含有することが疑われる試験サンプルは、例えば、固定化されたＨＥＶ ＵＳ−１特異的ポリペプチド鎖と結合し、そして検出可能な部分で標識されている単離された抗ＵＳ型抗体または抗ＵＳ亜型抗体を含む指示試薬と一緒に、固体支持体に固定化された抗原／抗体の複合体が得られるのに十分な時間および条件のもとで、固体支持体とインキュベーションされる。マーカー抗体が試験サンプルに存在する場合、マーカー抗体は、固定化されたポリペプチドと結合することに関して、標識された指示試薬と競合する。試験サンプル中に存在するマーカー抗体の量が大きくなると、固定化されたポリペプチドと結合する標識された指示試薬の量は減少する。固相に結合した指示試薬の量の減少を定量することができる。非Ａ非Ｂ非Ｃ非Ｄ非Ｅ型肝炎に関して陰性であることが確認された試験サンプルから生成するシグナルと比較して、シグナルの測定可能な減少はまた、試験サンプル中に抗ＨＥＶ ＵＳ−１抗体が存在していることを示している。同様なプロトコルを使用して、ＵＳ型またはＵＳ亜型のクラスに含まれる他のＥ型肝炎ウイルスの試験サンプル中での存在を同定することができると考えられる。
【００７９】
さらに別の検出方法においては、本発明の抗体を用いて、固定された組織切片ならびに固定された細胞におけるＵＳ型Ｅ型肝炎特異的抗原またはＵＳ亜型Ｅ型肝炎特異的抗原の存在を免疫組織化学的分析によって検出することができる。このような抗体が検出可能な部分（例えば、フルオレセイン、コロイド状金、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）で直接的に標識され、あるいは、例えば、検出可能な部分で標識された二次抗体によって間接的に標識された細胞化学的分析もまた、本発明の実施において使用することができる。
【００８０】
別のアッセイ様式において、抗体および／または抗原の存在は、例えば、欧州特許公開第０ ４７３ ０６５号に記載されているような同時アッセイによって検出することができる。例えば、試験サンプルを、（ｉ）第１の分析物に対する捕捉試薬（この場合、捕捉試薬は、固体支持体に固定化された第１の分析物に特異的な第１の結合メンバーを含む）、および（ｉｉ）第２の分析物に対する捕捉試薬（この場合、捕捉試薬は、第２の異なる固体支持体に固定化された第２の分析物に対する第１の結合メンバーを含む）と同時に接触させて、混合物を得る。次いで、この混合物は、捕捉試薬／第１の分析物の複合体および捕捉試薬／第２の分析物の複合体が形成されるのに十分な時間および／または条件のもとでインキュベーションされる。次いで、そのように形成された複合体を、検出可能な部分で標識された第１の分析物に特異的な結合対のメンバーを含む第１の指示試薬、および検出可能な部分で標識された第２の分析物に特異的な結合対のメンバーを含む第２の指示試薬と接触させて、第２の混合物を得る。次いで、第２の混合物は、捕捉試薬／第１の分析物／第１の指示試薬の複合体と、捕捉試薬／第２の分析物／第２の指示試薬の複合体との両方が得られるのに十分な時間および条件のもとでインキュベーションされる。１つまたは複数の分析物の存在は、試験サンプル中における１つまたは複数の分析物の存在を示すものとして一方または両方の固相に形成された複合体によって生じるシグナルを検出することにより決定される。
【００８１】
別のアッセイシステムは、特異的な抗体およびウイルスタンパク質（ペプチドなど）との接触によって、ウイルスゲノム（またはそのフラグメント）を包み込むＵＳ型またはＵＳ亜型のＥ型肝炎ウイルス粒子またはウイルスの部分構造粒子と特異的に結合する抗体を用いることができる。次いで、捕捉された粒子は、ウイルスゲノムが試験サンプル中に存在するかどうかを決定するために、ＬＣＲまたはＰＣＲなどの方法によって分析することができる。そのような抗原捕捉増幅方法を利用することの利点は、ウイルスゲノムが、特異的な抗体を使用することによって試験検体中の他の分子から分離できることである。そのような方法は、欧州特許公開第０ ６７２ １７６号（１９９５年９月２０日公開）に記載されている。
【００８２】
一般に、免疫アッセイを設計するときの検討事項には、非特異的な相互作用の生成物から確実に区別することができる複合体が得られるように、標的タンパク質に対する十分に大きな結合特異性を有する抗体（例えば、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント）の調製が含まれる。典型的には、抗体の結合特異性が大きいほど、より低い濃度の標的を検出することができる。
【００８３】
本発明のポリペプチドおよび抗体はともに、ＵＳ型Ｅ型肝炎ウイルスまたはＵＳ亜型Ｅ型肝炎ウイルスから得られる抗原の存在、あるいはそれらに結合する抗体の存在のいずれかを検出するために、本明細書中に記載されているアッセイ法を発展させるために使用することができる。免疫アッセイにおけるそれらの使用に加えて、上記のポリペプチドは、単独で、あるいはアジュバントと組み合わせて、実験室動物での抗体産生における使用のために使用することができ、あるいは同様に、薬学的に許容可能な担体と組み合わせて、個体の予防的免疫化または治療的免疫化のいずれかのためのワクチンとして使用できると考えられる。さらに、免疫アッセイにおける使用に加えて、本発明の抗体は、例えば、個体の能動的免疫化、治療的免疫化または予防的免疫化において使用される薬学的に許容可能な担体と組み合わせて使用することができると考えられる。後者のこれらの使用は、下記の第（ＩＩＩ）節に詳述される。本発明の抗体はまた、治療的使用または他の類似する適用のキメラ抗体を作製するために使用することができる。
【００８４】
適切な試薬を含有する免疫診断に好適なキットを、例えば、目的とする特異的なエピトープを規定するポリペプチドまたはそのようなエピトープと結合する抗体を含む適切な物質を適する容器に入れることにより組み立てることができる。さらに、このキットは、必要に応じて、さらなる試薬、例えば、適切な検出システムおよび緩衝液を含むことができる。
【００８５】
さらに、このような抗体（好ましくは、モノクローナル抗体）は、ＣＮＢｒ活性化セファロースに類似するマトリックスに結合させることができ、そして組換えおよび天然のウイルス抗原およびウイルスタンパク質が精製されるように、ＵＳ型Ｅ型肝炎特異的タンパク質またはＵＳ亜型Ｅ型肝炎特異的タンパク質を細胞培養物または生物学的組織（血液および肝臓など）からアフィニティー精製するために使用することができる。
【００８６】
ＩＩ．（ｉｉ）核酸系アッセイ
マーカーがＵＳ型特異的ヌクレオチド配列またはＵＳ亜型特異的ヌクレオチド配列である場合、結合パートナーはまた、好ましくは、マーカー配列またはその隣接領域に特異的にハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列またはそのアナログであると考えられる。本明細書中に開示されている特徴的なポリヌクレオチド配列に基づいて、結合パートナーは、ビルマ株ファミリーおよびメキシコ株ファミリーの対応するヌクレオチド配列と比較した場合に特徴的であるＵＳ型特異的ヌクレオチド配列またはＵＳ亜型特異的ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、例えば、ＵＳ型Ｅ型肝炎ウイルスまたはＵＳ亜型Ｅ型肝炎ウイルスのＯＲＦ１配列、ＯＲＦ２配列またはＯＲＦ３配列の少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列またはそのアナログであり得ると考えられる。さらに、Ｅ型肝炎のビルマ株ファミリーおよびメキシコ株ファミリーのゲノムに比べて特徴的であるＵＳ型Ｅ型肝炎ウイルスまたはＵＳ亜型Ｅ型肝炎ウイルスのゲノムの非コード領域はまた、本発明の実施における有用なマーカーになり得ると考えられる。そのようなヌクレオチド配列（プライマーまたはプローブのいずれか）は、ハイブリダイゼーションおよび／または増幅によるＵＳ型特異的配列またはＵＳ亜型特異的配列の検出を可能にする長さであり、そしてこの分野でよく知られ、そして十分に議論されている自動化されたオリゴヌクレオチド合成方法論を含む日常的で標準的な方法を使用して調製することができる。ＨＥＶ ＵＳ−１ゲノムの任意の特徴的な部分の相補体も十分である。完全な相補性は、プローブとして使用するためには望ましいが、フラグメントの長さが増大するに従って必要とされなくなることがある。
【００８７】
同様に、結合パートナーは、標的配列に特異的にハイブリダイゼーションすることができ、そして好ましくは８個〜１００個のヌクレオチドを含み、より好ましくは１０個〜７５個のヌクレオチドを含み、最も好ましくは１５個〜５０個のヌクレオチドを含むポリヌクレオチド配列（例えば、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列またはＰＮＡ配列）であり得ると考えられる。標的配列は、ＵＳ型Ｅ型肝炎ウイルスゲノムまたはＵＳ亜型Ｅ型肝炎ウイルスゲノムの少なくとも一部を規定するヌクレオチド配列またはその相補的な配列であり得ることが理解される。ハイブリダイゼーション反応のために選択される特定のストリンジェントな条件は、一般には、結合パートナーの核酸配列と標的配列との相補性の程度、結合配列の組成および結合配列の長さに依存することがこの分野で知られている。ストリンジェントな条件を決定するためのパラメーターは、当業者にはよく知られており、あるいは標準的な書籍（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．、１９８９））から容易に確認されると考えられる。
【００８８】
本明細書中において提供される配列を使用して、試験サンプルにおける核酸を検出するためのアッセイにおいて使用することができるプローブを作製することができる。このようなプローブは、目的とするポリヌクレオチドの保存的なヌクレオチド領域から、あるいは目的とするポリヌクレオチドの非保存的なヌクレオチド領域から設計することができる。アッセイにおいて最適なそのようなプローブの設計は当業者の技術の範囲である。一般に、核酸プローブは、最大限の特異性が所望される場合には非保存的領域または特徴的な領域から組み立てられ、そして例えば、多重遺伝子ファミリーの異なるメンバーに密接に関連し、あるいはマウスおよびヒトのような関連する種において密接に関連するヌクレオチド領域についてアッセイする場合には保存的な領域から組み立てられる。
【００８９】
１つの好ましいプロトコルにより、試験サンプル中におけるＵＳ型Ｅ型肝炎ウイルスまたはＵＳ亜型Ｅ型肝炎ウイルスの存在の有無を検出する方法が提供される。この方法は下記の工程を含む：（ａ）ＵＳ型またはＵＳ亜型の単離物に由来する少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド配列を含むプローブを提供する工程、ただし、この配列は、Ｅ型肝炎のビルマ株ファミリーおよびメキシコ株ファミリーの他のメンバーに存在していない；（ｂ）プローブとその相補体とのポリヌクレオチド二重鎖の形成を可能にする条件のもとで、プローブと、試験サンプル中に存在する非ＵＳ型肝炎ポリヌクレオチド配列および非ＵＳ亜型肝炎ポリヌクレオチド配列との実質的なポリヌクレオチド二重鎖の形成なしに、試験サンプルおよびプローブを接触させる工程；および（ｃ）プローブを含有する何らかのポリヌクレオチド二重鎖の存在を検出する工程。
【００９０】
好ましいヌクレオチド配列は、配列番号８９のヌクレオチド残基１〜５０９７またはその天然に存在する配列変異型を含むことができる。この配列に関して、用語「天然に存在する配列変異型」には、配列番号８９の１位〜５０９７位の残基に対して少なくとも７３．３％の同一性、好ましくは少なくとも７５．３％の同一性、より好ましくは少なくとも７８．３％の同一性、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する任意の核酸配列が含まれる。他の好ましいマーカーまたは結合パートナーの配列は、配列番号８９の５１３２位〜７１１４位のヌクレオチド残基またはその天然に存在する配列変異型を含むことができる。この配列に関して、用語「天然に存在する配列変異型」には、配列番号８９の５１３２位〜７１１４位の残基に対して少なくとも８７．４％の同一性、好ましくは少なくとも８９．４％の同一性、より好ましくは少なくとも９２．４％の同一性、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する任意の核酸配列が含まれる。他の好ましいマーカーまたは結合パートナーの配列は、配列番号８９の５０９４位〜５４６２位のヌクレオチド残基またはその天然に存在する配列変異型を含むことができる。この配列に関して、用語「天然に存在する配列変異型」には、配列番号８９の５０９４位〜５４６２位の残基に対して少なくとも８８．３％の同一性、好ましくは少なくとも９０．３％の同一性、より好ましくは少なくとも９３．３％の同一性、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する任意の核酸配列が含まれる。
【００９１】
さらに、有用なヌクレオチド配列には、例えば、ＯＲＦ１配列の一部であって、例えば、メチルトランスフェラーゼタンパク質、プロテアーゼタンパク質、Ｙドメインタンパク質、Ｘドメインタンパク質、ヘリカーゼタンパク質、超可変領域タンパク質およびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼタンパク質からなる群から選択されるタンパク質またはその変異型をコードするＯＲＦ１配列の一部が含まれ得ると考えられる。従って、ＯＲＦ１の有用なメチルトランスフェラーゼのコード領域は、配列番号８９の残基１〜６９３に対して、好ましくは少なくとも７８％の同一性、より好ましくは少なくとも８０％の同一性、最も好ましくは少なくとも８３％の同一性を有すると考えられる。同様に、ＯＲＦ１の有用なプロテーゼのコード領域は、配列番号８９の残基１２７０〜２０９１に対して、好ましくは少なくとも６６．１％の同一性、より好ましくは少なくとも６８．１％の同一性、最も好ましくは少なくとも７１．１％の同一性を有すると考えられる。同様に、ＯＲＦ１の有用なＹドメインのコード領域は、配列番号８９の残基６１９〜１２７２に対して、少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも８２％の同一性、最も好ましくは少なくとも８５％の同一性を有すると考えられる。同様に、ＯＲＦ１の有用なＸドメインのコード領域は、配列番号８９の残基２３６５〜２８４１に対して、少なくとも７３．５％の同一性、より好ましくは少なくとも７５．５％の同一性、最も好ましくは少なくとも７８．５％の同一性を有すると考えられる。同様に、ＯＲＦ１の有用なヘリカーゼのコード領域は、配列番号８９の残基２８９３〜３５９１に対して、少なくとも７７．５％の同一性、最も好ましくは少なくとも７９．５％の同一性、最も好ましくは少なくとも８１．５％の同一性を有すると考えられる。同様に、ＯＲＦ１の有用な超可変領域のコード領域は、配列番号８９の残基２０９２〜２３６４に対して、少なくとも５１．２％の同一性、より好ましくは少なくとも５３．２％の同一性、最も好ましくは少なくとも５６．２％の同一性を有すると考えられる。同様に、ＯＲＦ１の有用なＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのコード領域は、配列番号８９の残基３６３４〜５０９４に対して、少なくとも７６．３％の同一性、より好ましくは少なくとも７８．３％の同一性、最も好ましくは少なくとも８１．３％の同一性を有すると考えられる。
【００９２】
好ましいヌクレオチド配列は、配列番号１６４のヌクレオチド残基３６〜５１６２またはその天然に存在する配列変異型を含むことができる。この配列に関して、用語「天然に存在する配列変異型」には、配列番号１６４の３６位〜５１６２位の残基に対して少なくとも７３．６％の同一性、好ましくは少なくとも７５．６％の同一性、より好ましくは少なくとも７８．６％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する任意の核酸配列が含まれる。他の好ましいマーカーまたは結合パートナーの配列は、配列番号１６４の５１９７位〜７１７９位のヌクレオチド残基またはその天然に存在する配列変異型を含むことができる。この配列に関して、用語「天然に存在する配列変異型」には、配列番号１６４の５１９７位〜７１７９位の残基に対して少なくとも８０．７％の同一性、好ましくは少なくとも８２．７％の同一性、より好ましくは少なくとも８５．７％の同一性、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する任意の核酸配列が含まれる。他の好ましいマーカーまたは結合パートナーの配列は、配列番号１６４の５１５９位〜５５２７位のヌクレオチド残基またはその天然に存在する配列変異型を含むことができる。この配列に関して、用語「天然に存在する配列変異型」には、配列番号１６４の５１５９位〜５５２７位の残基に対して少なくとも８７．９％の同一性、好ましくは少なくとも８９．９％の同一性、より好ましくは少なくとも９２．９％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する任意の核酸配列が含まれる
さらに、有用なＨＥＶ ＵＳ−２のヌクレオチド配列には、例えば、ＯＲＦ１配列の一部であって、例えば、メチルトランスフェラーゼタンパク質、プロテアーゼタンパク質、Ｙドメインタンパク質、Ｘドメインタンパク質、ヘリカーゼタンパク質、超可変領域タンパク質およびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼタンパク質からなる群から選択されるタンパク質の少なくとも一部またはその変異型をコードするＯＲＦ１配列の一部が含まれ得ると考えられる。従って、ＯＲＦ１の有用なメチルトランスフェラーゼのコード領域は、配列番号１６４の残基３６〜７５５に対して、好ましくは少なくとも７９．５％の同一性、より好ましくは少なくとも８１．５％の同一性、最も好ましくは少なくとも８４．５％の同一性を有すると考えられる。同様に、ＯＲＦ１の有用なプロテーゼのコード領域は、配列番号１６４の残基１３３２〜２１５３に対して、好ましくは少なくとも６６．１％の同一性、より好ましくは少なくとも６８．１％の同一性、最も好ましくは少なくとも７１．１％の同一性を有すると考えられる。同様に、ＯＲＦ１の有用なＹドメインのコード領域は、配列番号１６４の残基６８０〜１３３４に対して、少なくとも８０．７％の同一性、より好ましくは少なくとも８２．７％の同一性、最も好ましくは少なくとも８５．７％の同一性を有すると考えられる。同様に、ＯＲＦ１の有用なＸドメインのコード領域は、配列番号１６４の残基２４３０〜２９０６に対して、少なくとも７３．７％の同一性、より好ましくは少なくとも７５．７％の同一性、最も好ましくは少なくとも７８．７％の同一性を有すると考えられる。同様に、ＯＲＦ１の有用なヘリカーゼのコード領域は、配列番号１６４の残基２９５８〜３６５６に対して、少なくとも７６．４％の同一性、最も好ましくは少なくとも７８．４％の同一性、最も好ましくは少なくとも８１．４％の同一性を有すると考えられる。同様に、ＯＲＦ１の有用な超可変領域のコード領域は、配列番号１６４の残基２１５４〜２４２９に対して、少なくとも５０．４％の同一性、より好ましくは少なくとも５２．８％の同一性、最も好ましくは少なくとも５５．８％の同一性を有すると考えられる。同様に、ＯＲＦ１の有用なＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのコード領域は、配列番号１６４の残基３６９９〜５１５９に対して、少なくとも７６．８％の同一性、より好ましくは少なくとも７８．８％の同一性、最も好ましくは少なくとも８１．８％の同一性を有すると考えられる。
【００９３】
他の有用なヌクレオチド配列には、配列番号９３、配列番号１６８、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号２２３および配列番号２２４からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列およびそれらの相補的なヌクレオチド配列が含まれる。
【００９４】
本明細書中に提供される核酸配列を使用して、試験サンプル中のＵＳ型Ｅ型肝炎ウイルスまたはＵＳ亜型Ｅ型肝炎ウイルスの存在を、従来の核酸系アッセイによって、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および／またはブロットハイブリダイゼーション研究（下記に詳述される）によって決定できると考えられる。核酸系アッセイにおけるその使用に加えて、上記の核酸配列はベクターに組み込むことができ、その後、このベクターは目的とする宿主細胞（例えば、ワクシニアまたはマイコバクテリア）に形質転換またはトランスフェクションすることができると考えられる。次いで、得られた宿主細胞は、薬学的に許容可能な担体と組み合わせることができ、そして例えば、所定のＵＳ型Ｅ型肝炎ウイルスまたはＵＳ亜型Ｅ型肝炎ウイルスに対して、予防的または治療的のいずれかで哺乳動物を免疫化するための組換えワクチンとして使用することができる。
【００９５】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、核酸またはその混合物に含有される所望の核酸配列（標的）を増幅するための技術である。ＰＣＲにおいて、１対のプライマーが、典型的には、標的核酸の相補的な鎖の外側端でハイブリダイゼーションするように過剰に用いられる。プライマーは、標的配列をテンプレートとして使用して、ポリメラーゼ（例えば、熱安定性ポリメラーゼ）によりそれぞれ伸長される。伸長産物は、最初の標的配列から解離した後に標的配列自体になる。次いで、新しいプライマーがハイブリダイゼーションして、ポリメラーゼにより伸長される。そのサイクルを繰り返して、標的配列分子の数を幾何級数的に増大させる。ＰＣＲは、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号に開示されている。
【００９６】
リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）は、核酸増幅の代わりの方法である。ＬＣＲにおいて、２つの一次（第１および第２）プローブおよび二次（第３および第４）プローブを含むプローブ対が使用される：これらのプローブはすべて、標的核酸配列のモル過剰量で用いられる。第１プローブは標的鎖の第１のセグメントにハイブリダイゼーションし、第２プローブは標的鎖の第２のセグメントにハイブリダイゼーションする。この第１および第２のセグメントは隣接しており、その結果、これらの一次プローブは５’リン酸−３’ヒドロキシルの関係で互いに接し、そしてリガーゼはこの２つのプローブを共有結合的に融合または連結して、融合産物にすることができる。さらに、第３の（二次）プローブは第１のプローブの一部にハイブリダイゼーションすることができ、第４の（二次）プローブは、同様に接する様式で、第２のプローブの一部にハイブリダイゼーションすることができる。一次プローブの連結された鎖が標的配列から分離されると、それは、相補的な二次連結産物が得られるように連結され得る第３および第４のプローブとハイブリダイゼーションする。この連結産物は、標的またはその相補体のいずれかに対して機能的に等価である。ハイブリダイゼーションおよび連結のサイクルを繰り返すことによって、標的配列の増幅が達成される。この技術は、欧州特許公開ＥＰ−Ａ−３２０ ３０８（Ｋ．Ｂａｃｋｍａｎ；１９８９年６月１６日公開）および同ＥＰ−Ａ−４３９ １８２（Ｋ．Ｂａｃｋｍａｎら；１９９１年７月３１日公開）に、より完全に記載されている。
【００９７】
ｍＲＮＡの増幅に関して、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、その後、ポリメラーゼ連鎖反応すること（ＲＴ−ＰＣＲ）；または米国特許第５，３２２，７７０号に記載されているように両工程に１つの酵素を使用すること；またはＲ．Ｌ．Ｍａｒｓｈａｌｌら（ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ４：８０〜８４（１９９４））により記載されているように、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、その後、非対称ギャップリガーゼ連鎖反応を行うこと（ＲＴ−ＡＧＬＣＲ）は、本発明の範囲に含まれる。
【００９８】
本明細書中において利用することができる他の知られている増幅方法には、下記の方法が含まれるが、これらに限定されない：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４〜１８７８（１９９０）に記載され、そしてＮａｔｕｒｅ ３５０（Ｎｏ．６３１３）：９１〜９２（１９９１）にも記載されているいわゆる「ＮＡＳＢＡ」または「３ＳＲ」技術；欧州特許公開ＥＰ４５４４６１０に記載されているＱ−β増幅；ストランド排除増幅（Ｇ．Ｔ．Ｗａｌｋｅｒら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４２：９〜１３［１９９６］；および欧州特許ＥＰ６８４３１５）；およびＰＣＴ国際特許公開ＷＯ９３２２４６１により記載されているような標的媒介増幅。
【００９９】
１つの実施形態において、本発明は、一般に、標的ポリヌクレオチド配列を含有することが疑われる試験サンプルを、アンプリコン配列の内部領域とハイブリダイゼーションすることができる検出プローブと、増幅プライマーとを含む増幅反応試薬と接触させる工程を含む。本明細書中の方法に従って用いられるプローブおよびプライマーは捕捉標識および検出標識で標識される：この場合、プローブは任意のタイプの標識で標識され、そしてプライマーは、それとは異なる標識で標識される。さらに、プライマーおよびプローブは、プローブ配列がプライマー配列よりも低い融解温度を有するように選択される。増幅試薬、検出試薬および試験サンプルは増幅条件のもとに置かれ、それによって、標的配列の存在下で標的配列（アンプリコン）の複数のコピーが得られる。次いで、二本鎖のアンプリコンを熱的に変性して、一本鎖のアンプリコンメンバーにする。一本鎖のアンプリコンメンバーが形成されると、混合物を冷却して、プローブと一本鎖のアンプリコンメンバーとの複合体を形成させる。
【０１００】
プローブ／一本鎖のアンプリコンメンバーのハイブリッドが形成された後にハイブリッドを検出する。標準的な不均一アッセイ様式は、プライマーおよびプローブに存在する検出標識および捕捉標識を使用してハイブリッドを検出するのに好適である。ハイブリッドは、捕捉標識によって固相試薬に結合させることができ、そして検出標識によって検出することができる。検出標識が直接的に検出できる場合、固相上のハイブリッドの存在は、必要に応じて標識により検出可能なシグナルを生成させて、そのシグナルを検出することによって検出することができる。標識が直接的に検出できない場合、捕捉されたハイブリッドを、直接的に検出することができる標識に結合させた結合メンバーを一般に含む複合体と接触させることができる。複合体は複合体に結合し、そして複合体上の複合体の存在は、直接的に検出できる標識を用いて検出することができる。このようにして、固相上のハイブリッドの存在を決定することができる。当業者は、洗浄工程を用いて、ハイブリダイゼーションしなかったアンプリコンまたはプローブならびに未結合の複合体を洗い流すことができることを認識している。
【０１０１】
標的配列を検出するための試験サンプルは、サンプルを入手し、そして必要に応じて、それに含有される何らかの細胞を破壊して標的核酸を遊離させることなどによるこの分野でよく知られている方法論を使用して調製することができる。ＰＣＲがこの方法で用いられる場合、標的配列の末端は通常知られている。ＬＣＲまたはその増幅が好ましい方法で用いられる場合、標的配列の全体は通常知られている。典型的には、標的配列は、例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡなどの核酸配列である。
【０１０２】
プライマーおよびプローブの長さは変化させることができるが、プローブ配列は、それらがプライマー配列よりも低い融解温度を有するように選択される。従って、プライマー配列は、一般に、プローブ配列よりも長い。典型的には、プライマー配列は、２０ヌクレオチド〜５０ヌクレオチドの範囲の長さであり、より典型的には２０ヌクレオチド〜３０ヌクレオチドの範囲の長さである。好ましいプライマー配列は、典型的には、２０ヌクレオチドよりも長い。代表的なプローブは、１０ヌクレオチド〜２５ヌクレオチドの範囲の長さであり、より典型的には１５ヌクレオチド〜２０ヌクレオチドの範囲の長さである。。好ましいプローブ配列は、典型的には、１５ヌクレオチドよりも長い。
【０１０３】
あるいは、プローブは、「ネストＰＣＲ（ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）」として知られているプロセスによる標的配列の増幅に含まれ得る。ネストＰＣＲにおいて、プローブは、増幅のために通常使用される第１のプライマーおよび第２のプライマーの特性と類似する特性（長さ、融解温度など）を有し、そのためプローブ自身は増幅反応におけるプライマーとして役立ち得る。一般に、ネストＰＣＲにおいて、最初のプライマー対（Ｐ_１およびＰ_２）を用いて、一次伸長生成物を形成させる。一次プライマーの一方（例えば、Ｐ_１）は、必要に応じて、捕捉プライマーであり得る（すなわち、最初の反応性ペアの一方のメンバーに連結され得る）。これに対して、もう一方のプライマー（Ｐ_２）は捕捉プライマーではない。次いで、二次伸長生成物が、その５’端での捕捉型の標識（二次の反応性ペアの一方のメンバーなど）または検出標識をも有し得るプローブ（Ｐ_１’）およびプローブ（Ｐ_２’）を使用して形成される。これらのプローブは、依然として溶液中に存在するならば、Ｐ_１およびＰ_２の３’末端がハイブリダイゼーションする部位の近くまたはそのような部位に隣接するテンプレート上の部位に相補的であり、そしてそのようなテンプレートの部位でハイブリダイゼーションする。あるいは、二次伸長生成物は、Ｐ_１プライマーをプローブ（Ｐ_２’）とともに使用し、あるいはＰ_２プライマーをプローブ（Ｐ_１’）とともに使用して形成させることができ、これは「半ネストＰＣＲ」と呼ばれることがある。従って、標識されたプライマー／プローブの組合せによって、一次伸長生成物よりも短い二次伸長生成物が得られる。さらに、二次伸長生成物は、その大きさに基づいて、あるいはその標識末端を介して（当業者によく知られている検出方法論によって）検出することができる。このプロセスにおいて、プローブおよびプライマーは、一般には等濃度で用いられる。
【０１０４】
プローブおよびプライマーを合成するための様々な方法がこの分野でよく知られている。同様に、標識をプローブまたはプライマーに結合させるための方法もまたこの分野でよく知られている。例えば、所望する核酸のプライマーまたはプローブを、従来のヌクレオチドホスホラミダイト化学およびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）、Ｄｕｐｏｎｔ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）またはＭｉｌｌｉｇｅｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）から得られる装置を使用して合成することは日常的な実験の範囲である。本発明のプライマーまたはプローブなどのオリゴヌクレオチドを標識するための多くの方法が記載されている。Ｅｎｚｏ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ）およびＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）はともに、プローブ標識技術を記載し、それらを商品化している。例えば、一級アミンは、３’オリゴ末端に、３’−Ａｍｉｎｅ−ＯＮ ＣＰＧ（登録商標）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）を使用して結合させることができる。同様に、一級アミンは、５’オリゴ末端に、ＡｍｉｎｏｍｏｄｉｆｉｅｒＩＩ（登録商標）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して結合させることができる。これらのアミンは、従来の活性化試薬および連結試薬を使用して様々なハプテンに反応させることができる。さらに、国際特許公開ＷＯ９２／１０５０６（１９９２年６月２５日公開）および米国特許第５，２９０，９２５号（１９９４年３月１日発行）は、プローブをその５’末端および３’末端でそれぞれ標識するための方法を教示している。さらに、国際特許公開ＷＯ９２／１１３８８（１９９２年７月９日公開）は、プローブをその末端で標識するための方法を教示している。オリゴヌクレオチドを標識するための知られているいずれかの方法に従って、標識用のホスホラミダイト試薬を調製し、これを使用して、合成中のオリゴヌクレオチドに標識を付加する。例えば、Ｎ．Ｔ．Ｔｈｕｏｎｇら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔｅｒｓ ２９（４６）：５９０５〜５９０８（１９８８）；またはＪ．Ｓ．Ｃｏｈｅｎら、公開された米国特許出願第０７／２４６，６８８号（ＮＴＩＳ ＯＲＤＥＲ Ｎｏ．ＰＡＴ−ＡＰＰＬ−７−２４６，６８８）（１９８９）を参照のこと。好ましくは、プローブは、その３’末端および５’末端で標識される。
【０１０５】
捕捉標識はプライマーまたはプローブにより運ばれ、そして固相試薬に特異的な結合メンバーとの結合対を形成する特異的な結合メンバーであり得る。当然なことではあるが、プライマーまたはプローブ自体は、捕捉標識として役立ち得ることが理解される。例えば、固相試薬の結合メンバーが核酸配列である場合、核酸配列は、プライマーまたはプローブの相補的な部分と結合し、それによってプライマーまたはプローブが固相に固定化されるように選択することができる。プローブ自体が結合メンバーとして役立ち得る場合、当業者は、プローブには、一本鎖アンプリコンメンバーに相補的でない配列または「テイル」が含有されることを認識している。プライマー自体が捕捉標識として役立つ場合には、プローブはプライマー配列に対して十分に相補的でないように選択されるので、プライマーの少なくとも一部は、固相上の核酸とハイブリダイゼーションしない。
【０１０６】
一般に、プローブ／一本鎖状アンプリコンメンバーの複合体は、不均一な免疫アッセイを行うために一般的に用いられる技術を使用して検出することができる。好ましくは、この実施形態において、検出は、市販のＡｂｂｏｔｔのＬＣｘ（登録商標）手段（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬ）によって使用されるプロトコルに従って行われる。
【０１０７】
この分野で知られている他の有用な手順には、溶液ハイブリダイゼーション、ドットブロットハイブリダイゼーションおよびスロットブロットハイブリダイゼーションのプロトコルが含まれる。サンプル中に存在する標的核酸の量は、必要に応じて、ハイブリダイゼーションしたフラグメントの放射能を、この分野で知られている標準的なプロトコルを使用して測定することによって定量化することができる。
【０１０８】
ＩＩＩ．ワクチン
ワクチンは、ＵＳ型及び／あるいはＵＳ亜型特異的タンパク質配列あるいはそのようなタンパク質配列に結合する抗体に基づく１又はそれ以上の免疫原性ポリペプチドから調製しうると考えられる。さらに、ワクチンはまた、死滅又は生弱毒化ＵＳ型又はＵＳ亜型Ｅ型肝炎ウイルス、あるいはＵＳ型又はＵＳ亜型Ｅ型肝炎ウイルス特異的抗原を発現する異種宿主細胞、例えばワクシニアウイルスを含む組換え生ワクチンも含みうると考えられる。
【０１０９】
ポリペプチドベースのワクチンに関して、当該ポリペプチドは少なくとも１個のエピトープを含む。しかし、ワクチンは１又はそれ以上のポリペプチド鎖によって規定される複数の異なるエピトープを含みうると考えられる。さらに、非構造タンパク質ならびに構造タンパク質は、中和抗体を産生しない場合でも、ウイルスの病原性に対する防御を提供しうると考えられる。上記を考慮すると、ＵＳ型あるいはＵＳ亜型ウイルスに対する多価ワクチンは１又はそれ以上の構造タンパク質、及び／あるいは１又はそれ以上の非構造タンパク質を含みうる。これらの免疫原性エピトープは、組合わせとして、すなわち組換えタンパク質、合成ペプチド及び／あるいはビリオンから単離したポリペプチドの混合物として使用することができ、それらは同時に投与するかあるいは異なる時点で投与してもよい。
【０１１０】
少なくとも１個の免疫原性ペプチドを有効成分として含む、タンパク質あるいはペプチドベースのワクチンの製剤方法は当該技術において周知である。典型的には、そのようなワクチンは溶液又は懸濁液の形態で注射剤として製剤される。製剤を乳化するか、あるいはタンパク質をリポソーム中に被包することができる。免疫原性有効成分は、その有効成分と適合性の薬理的に許容される賦形剤と混合しうる。適当な賦形剤は、限定されないが、水、塩類溶液、デキストロース、グリセロール、エタノールあるいはそれらの組合せを含む。ワクチンはまた、ワクチンの有効性を高める湿潤化又は乳化試薬、ｐＨ緩衝剤、及び／あるいはアジュバントのような少量の補助物質も含みうる。例えば、そのようなアジュバントは、水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＤＭＰ）、Ｎ−アセチル−ノムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ １１６８７、ｎｏｒ−ＭＤＰとも称される）、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’２’−ジパルミトイル ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ １９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥとも称される）、及び２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ−８０（登録商標）乳剤中のＲＩＢＩ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を含みうる。アジュバントの有効性は、ＵＳ型あるいはＵＳ亜型特異的抗原配列を含む免疫原性ポリペプチドを、検討する種々のアジュバントも合わせて含むワクチンとして投与することから生じる、このポリペプチドに対する抗体の量を測定することによって決定できる。
【０１１１】
ワクチンは通常静脈内又は筋肉内注射によって投与する。他の投与方法に適する追加的な製剤は、坐剤、また一部の場合には、経口製剤を含む。坐剤については、慣用される結合剤及び担体はポリアルキレングリコールあるいはトリグリセリドを含むがこれらに限定されない。そのような坐剤は、約０．５％から約１０％、好ましくは約１％から約２％（重量／重量）の範囲の有効成分を含む混合物から製造される。経口製剤は、例えばマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等を含めた賦形剤を包含しうる。これらの組成物は溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル、持続放出性製剤あるいは散剤の形態をとることができ、約１０％から約９５％、好ましくは約２５％から約７０％（重量／重量）の有効成分を含む。
【０１１２】
ワクチンにおいて使用するポリペプチド鎖は、中性あるいは塩の形態でワクチンに組み込むことができる。薬学的に許容される塩は、例えば、塩酸又はリン酸のような無機酸、あるいは酢酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸又は当業者に既知の他の酸のような有機酸の付加によって形成される酸付加塩を含む。遊離カルボキシル基で形成される塩は、水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム又は第二鉄等のような無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジンプロカイン、又は当業者に既知の他の塩基のような有機塩基からも誘導されうる。
【０１１３】
ワクチンは典型的には、予防上及び／あるいは治療上有効であるような量で、投与剤型に適合する方法によって投与される。一般に投与する量は、１回投与量につき抗原約５μｇから約２５０μｇの範囲であるが、実際の用量は被験者の健康状態と体格、被験者の免疫系が抗体を合成する能力、ならびに求める防御の度合に依存する。ワクチンは単回又は多回投与スケジュールで投与しうる。多回投与は、ワクチン接種の初期段階を１回から１０回の独立した投与によって行い、その後免疫応答を維持する及び／あるいは増強するために必要な時間を置いて別途の投与を、例えば第２回目の投与を１ヶ月目から４ヶ月目に行い、そして個人ごとに必要に応じて、その後数ヵ月目にも追加投与を行う。さらに投与様式は、少なくとも一部には、個人の必要性によって決定され、また医師の判断に依存するであろう。
【０１１４】
死滅又は不活化ＵＳ型あるいはＵＳ亜型Ｅ型肝炎ウイルスを含むワクチンに関して、不活化は、当該技術において周知であり、十分に資料の裏付けがある常套的な方法を用いて容易に行うことができる。好ましい不活化法は、例えば、１又はそれ以上の（ｉ）有機溶媒、（ｉｉ）洗浄剤、（ｉｉｉ）ホルマリン、及び（ｉｖ）電離放射線への曝露を含む。弱毒化ワクチン中のタンパク質の一部は他の既知のウイルスと交差反応すると考えられ、従ってＵＳ型あるいはＵＳ亜型Ｅ型肝炎ウイルスとＨＥＶファミリーの他のメンバー（例えばビルマ族あるいはメキシコ族のメンバー）の間に共通のエピトープが存在し、これらの病原体によって引き起こされる１又はそれ以上の疾患に対して防御抗体を生じるであろうと想定される。好ましい製剤及び投与方法は当該技術において資料で十分に裏付けられており、それ故ここで詳細に論じることはしない。考慮すべき種々の因子には、ペプチドベースのワクチンに関して上記に述べた１又はそれ以上の特徴が含まれる。
【０１１５】
生であるが弱毒化されたワクチンに関しては、当該技術において使用される既知の弱毒化法のいずれかを用いて弱毒化ウイルスを産生することが可能であろう。簡単に述べると、低温でウイルスを継代させるか、あるいはウイルスゲノムにミスセンス突然変異又は欠失を導入することによって弱毒化が実施できる。好ましい製剤及び投与方法は当該技術において資料で十分に裏付けられており、それ故ここで詳細に論じることはしない。考慮すべき種々の因子には、ペプチドベースのワクチンに関して上記に述べた１又はそれ以上の特徴が含まれる。
【０１１６】
生組換えワクチン（ベクターワクチン）に関しては、生きているが無害なウイルス又は細菌のゲノムに、抗原決定基を決めるＵＳ型あるいはＵＳ亜型Ｅ型肝炎特異的ポリペプチド鎖をコードする遺伝子又は核酸配列を組み込むことによって作製される。その後、生じたベクター生物を意図する宿主に投与することができる。典型的には、そのようなワクチンが成功を収めるためには、ベクター生物が成育可能でなくてはならず、また自然のままで非感染性であるか若しくは弱毒表現型を有していなければならない。好ましい宿主生物は、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、サルモネラ及びマイコバクテリアを含む。ワクシニアウイルス及びマイコバクテリアの生株は、それぞれ痘瘡ワクチン及び結核（ＢＣＧ）ワクチンの形態でヒトに安全に投与されてきた。さらに、それらは異種タンパク質を発現し、毒性表現型への変換をほとんどあるいは全く生じないことが示されてきた。ベクターワクチンは、複数の異種遺伝子あるいは核酸配列を担うことができ、それによってあらかじめ選択された種々の抗原決定基に対する同時ワクチン接種を可能にする。好ましい製剤及び投与方法は当該技術において資料で十分に裏付けられており、それ故ここで詳細に論じることはしない。
【０１１７】
ＩＶ．抗ＵＳ型あるいは抗ＵＳ亜型Ｅ型肝炎ウイルス活性を有する分子の同定 特異的ＨＥＶ ＵＳ型配列の発見という見地から、当業者は、ＨＥＶ ＵＳ型特異的タンパク質、例えばＨＥＶゲノムのＯＲＦ１部分によってコードされるヘリカーゼ、メチルトランスフェラーゼ、あるいはプロテアーゼタンパク質を不活化する又はその活性を低下させる分子を同定しうると考えられる。ＨＣＶプロテアーゼを阻害する分子を同定するための例示プロトコールは米国特許第５，５９７，６９１号に開示されており、その開示内容は参照してここに組み込まれる。かかる方法はＨＣＶプロテアーゼ阻害因子の同定に関するものであるが、ＨＥＶプロテアーゼ阻害因子、あるいはＨＥＶ ＵＳ型配列によってコードされる他のタンパク質を同定するためにも同じあるいは類似したプロトコールが使用できるであろう。
【０１１８】
簡単に述べると、ＨＥＶプロテアーゼ阻害因子を同定する方法は次の通りである。典型的には、当該プロテアーゼの天然基質を擬態するが、開裂したとき定量可能なシグナルを提供する基質を用いる。シグナルは、好ましくは比色定量あるいは蛍光定量手段によって検出できる；しかし、ＨＰＬＣあるいはシリカゲルクロマトグラフィー、核磁気共鳴等のような他の方法も有用であろう。至適基質とプロテアーゼ濃度を決定したあと、候補プロテアーゼ阻害因子を一連の濃度範囲で反応混合物に一度に加える。アッセイの条件は、好ましくはプロテアーゼがインビボで阻害される条件、すなわち生理的ｐＨ、温度、イオン強度等の条件を模倣する。適当な阻害因子は、被験者において毒性副作用を引き起こさない濃度で強いプロテアーゼ阻害を示す。プロテアーゼ活性部位に競合的に結合する阻害因子は基質濃度に等しいか又はそれ以上の濃度を必要とするが、プロテアーゼ活性部位に不可逆的に結合しうる阻害因子はほぼ酵素濃度に近い濃度で加えればよい。
【０１１９】
阻害因子は、例えばＨＥＶプロテアーゼによって認識される開裂部位を模倣する有機化合物であるか、若しくはその代わりにタンパク質、例えばＨＥＶプロテアーゼに特異的に結合して不活化する又は活性を低下させることができる抗体あるいは抗体フラグメントであると考えられる。ひとたび同定されれば、プロテアーゼ阻害因子は静脈内、経口、筋肉内、腹腔内、経気管支、経鼻等のような様々な方法によって投与しうる。好ましい投与経路は阻害因子の性質に依存する。有機化合物として調製した阻害因子は、良好に吸収される場合には、経口投与（一般に好ましい）することができる。タンパク質ベースの阻害因子（大部分の抗体あるいは抗体誘導体のような）は一般に非経口経路で投与される。
【０１２０】
実施例
下記の実施例から本発明の実施がよりよく理解されるであろう。ここに示す実施例は例示だけを目的とするものであり、いかなる意味においても本発明を制限すると解釈するべきではない。特許、特許出願及び学術出版物を含めて、上記及び下記の引用文献はすべて、その全体が参照してここに組み込まれる。
【０１２１】
実施例１−症例検討
急性肝炎を発症した患者（ＵＳＰ−１）の血清においてＨＥＶのＵＳ−１株を同定した。患者は６２歳の白人男性で、３週間にわたる発熱、腹痛、黄疸、及びそう痒のあとミネソタ州のロチェスターにある病院に入院した。カリフォルニア州のサンホセに１０年間旅行して帰宅した後、２週間目に徴候や症状の発現が始まった。
【０１２２】
患者の過去の病歴には、軽度の腎不全を伴う常染色体性腎多嚢胞病のための腎摘出、及び症候性胆石症のための腹腔鏡下胆嚢摘出が含まれた。患者は変形性関節症があり、高血圧症であった。入院の３ヵ月前にリジノプリルによる治療が開始されていた。理学的検査は、アステリクシスはないが肝臓が肥大して脆弱な、疾病様相を呈する黄疸の白人男性を明らかにした。入院の時点で血清アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、及びビリルビンレベルが著しく高く、それぞれ入院後８日目と１６日目にピークに達した（図２）。リジノプリルは入院時に停止された。Ａ型肝炎（ＩｇＭ及びＩｇＧ抗ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎（ＨＢｓＡｇ、ＩｇＭ及びＩｇＧ抗ＨＢｃ）、Ｃ型肝炎（抗ＨＣＶ）、及びＨＣＶ ＲＮＡについての血清検査は陰性であった。セルロプラスミン、鉄、トランスフェリン、抗核及び抗平滑筋抗体、毒素、ならびに薬剤スクリーニングはすべて正常であった。患者に注意深く問診した結果、エタノール使用の経歴はないことが明らかになった。腹部の超音波及びコンピュータ連動断層撮影スキャン、ならびに内視鏡的逆行性胆道膵管造影法も正常であった。肝生検は、自己免疫性、薬剤性あるいはウイルス性肝炎に一致する、肝細胞の著しい核濃縮性の気球状変性を伴った重篤な急性小葉肝炎を示した。
【０１２３】
患者は２ヵ月以内に臨床的には完全に回復し、入院から約５ヵ月後にＡＳＴ、ＡＬＴ及びビリルビンの正常化を認めた。ＨＥＶを獲得する危険因子は同定されなかった。１０年間、米国外には旅行していなかった。疾病を発症する前の６週間に患者が摂取したと報告した、家庭で調理されたのではない食事は、１軒のメキシコ料理店と大きなファーストフードレストランチェーンだけであった。処理されていない飲料水は摂取しておらず、生の甲殻類も食べていないと報告しており、また患者の知るかぎり家畜にも接触していなかった。該当するメキシコ料理店あるいはファーストフードレストランの食品取扱い担当者で、入院前５ヵ月以内に外国を旅行した者はおらず、また肝炎の徴候及び／あるいは症状を報告した者もなかった。入院期間中、患者がカリフォルニア州で滞在した郡ならびにミネソタ州の患者が在住する郡の保健局において非ＡＢＣ型肝炎の他の症例は報告されていなかった。家族のメンバーにも、患者のカリフォルニアへの旅行中あるいはその後１０週間の間に肝炎の徴候及び／あるいは症状は認められなかった。カリフォルニア州を訪れた６名の家族、及び対象期間中ミネソタ州で患者と生活していた患者の妻から採取した血清は、ＥＩＡにより抗ＨＥＶ陰性であった。
【０１２４】
実施例２−ＨＥＶ ＵＳ−１型のユニーク単離物の同定
ＨＥＶプライマー配列を用いてＲＴ−ＰＣＲによりＨＥＶの存在を判定した。簡単に述べると、以前に記述されているように（Ｓｃｈｌａｕｄｅｒら（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ４６：８１−８９）ＵＳＰ−１患者の血清２５μｌから核酸を単離した。エタノール沈澱した核酸をジエチルピロカルボネート（ＤＥＰＣ）処理した水３μＬ中に懸濁した。
【０１２５】
Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）からのＧｅｎｅＡｍｐ ＲＮＡ ＰＣＲキットを使用し、製造者の指示に従ってｃＤＮＡ合成とＰＣＲを実施した。ＲＮＡ（１μＬ）をそれぞれ１０μＬのｃＤＮＡ反応のためのテンプレートとして用いた。特異的プライマーを最終濃度４μＭになるように加え、ｃＤＮＡ合成を開始させた。その後オリゴヌクレオチドを加えて最終濃度０．８−１．０μＭとし、ｃＤＮＡの増幅を開始させた。ＰＣＲを４０サイクル実施した（９４℃、２０秒間；５５℃、３０秒間；７２℃、３０秒間；次いで７２℃で３分間の伸長サイクル）。次にネストセット（ｎｅｓｔｅｄ ｓｅｔ）のＰＣＲプライマーを用いて、最初のＰＣＲ反応物（２μＬ）を第二段階の増幅のテンプレートとして使用した。Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒからのＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲキットを使用し、製造者の指示に従ってＰＣＲを実施した。簡単に述べると、プライマーを加えて最終濃度１μＭとした。最初のセットの実験は３組のプライマーを使用した。ビルマ及びメキシコ株からの配列に基づくＯＲＦ１の５’末端からの２組と、メキシコ株配列に基づくＯＲＦ１の３’末端からの１組であった。使用した３組のプライマーは次の通りであった：
【０１２６】
プライマーセット１
プライマー 配列 配列番号
5’-ORF1-メキシコプライマーC375M CTGAACATCCCGGCCGAC 配列番号:1
PCRプライマーA1-350M AGAAAGCAGCTATGGAGGA 配列番号:2
PCRプライマーS1-34M GCCCACCAGTTCATTAAGGCT 配列番号:3
ネストPCRプライマーA2-320M TCATTAATGGAGCGTGGGTG 配列番号:4
ネストPCRプライマーS2-55M CCTGGCATCACTACTGCTAT 配列番号:5
プライマーセット２
プライマー 配列 配列番号
5’-ORF1-ビルマcDNAプライマーC375 CTGAACATCACGCCCAAC 配列番号:6
PCRプライマーA1-350 AGGAAGCAGCGGTGGACCA 配列番号:7
PCRプライマーS1-34 GCCCATCAGTTTATTAAGGC 配列番号:8
ネストPCRプライマーA2-320 TCATTTATTGAGCGGGGATG 配列番号:9
ネストPCRプライマーS2-55 CCTGGCATCACTACTGCTAT 配列番号:10
プライマーセット３
プライマー 配列 配列番号
3’-ORF1-メキシコcDNAプライマーM1PR6 CCATGTTCCACACCGTATTCCAGAG 配列番号:11
PCRプライマーS4294M GTGTTCTACGGGGATGCTTATGACG 配列番号:12
ネストPCRプライマーM1PF6 GACTCAGTATTCTCTGCTGCCGTGG 配列番号:13
ネストPCRプライマーA4556 GGCTCACCAGAATGCTTCTTCCAGA 配列番号:14
【０１２７】
５’−ＯＲＦ１−ビルマプライマーはＳｃｈｌａｕｄｅｒら（１９９３）Ｌａｎｃｅｔ ３４１：３７８に記述されている。プライマーＭ１ＰＲ６とＭ１ＰＦ６はＭｃＣａｕｓｔｌａｎｄら（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３５：３３１−３４２に記述されている。ＰＣＲ生成物をアガロースゲル電気泳動によって分離し、臭化エチジウム染色した後ＵＶ照射によって視覚化した。生じたＰＣＲ生成物をサザンブロット法でニトロセルロースフィルターに移行させ、放射標識プローブとハイブリダイゼーションさせた。
【０１２８】
Ｑｉａｇｅｎ（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）のＱＩＡＥＸゲル抽出精製キットで精製したＰＣＲ生成物から放射標識プローブを作製した。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（登録商標）（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）のＰｒｉｍｅ−Ｉｔ ＩＩキットを使用し、製造者の指示に従って放射性同位元素標識を組み込んだ。Ａｍｅｒｓｈａｍ（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）のＲａｐｉｄ−ｈｙｂ緩衝液中でフィルターを３−５時間プレハイブリダイゼーションさせ、次いでＦａｓｔ−Ｐａｉｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ中、１００−２００ｃｐｍ／ｃｍ２、４２℃で１５−２５時間ハイブリダイゼーションさせた。次にＳｃｈｌａｕｄｅｒら（１９９２）Ｊ．Ｖｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３７：１８９−２００に述べられているようにフィルターを洗浄した。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ ４２５Ｅ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いてプローブしたフィルターの蛍光画像を得た。
【０１２９】
臭化エチジウム染色バンドをＯＲＦ１の５’末端からのプライマーで検出した。しかし、メキシコ株に基づくプライマーだけが予想された２６６塩基対の大きさのネスト生成物を生じた。ビルマ様株（同一性＞９０％）感染患者から誘導したプローブとのハイブリダイゼーションは、ビルマ陽性対照からのシグナルと比較すると、ＵＳＰ−１患者誘導産物に対して非常に弱いハイブリダイゼーションシグナルを生じた。これらの結果は、この単離物がビルマ単離物とはあまり緊密な類縁関係がないことの最初の示唆であった。メキシコ株からのプローブは入手できなかった。
【０１３０】
これらの結果を確認するため、ＵＳＰ−１患者の追加血清アリコートからＲＮＡを抽出した。５’−ＯＲＦ１メキシコプライマー、配列番号１−５を用いて上述したようにＲＴ−ＰＣＲを実施した。アガロースゲル電気泳動し、臭化エチジウム染色した後、各サンプルにおいて３４２塩基対の生成物を視覚化した。Ｑｉａｇｅｎ（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）のＱＩＡＥＸＩＩ アガロースゲル抽出キットを使用してアガロースゲルからＰＣＲ生成物を抽出し、Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によるｐＴ７ Ｂｌｕｅ Ｔ−ベクタープラスミドにクローニングした。ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ ＶＥＲＳＩＯＮ ２．０配列決定キット（ＵＳＢ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）を使用し、製造者の指示に従ってクローニング産物を配列決定した。
【０１３１】
後の２つのサンプルの生成物から得られたヌクレオチド配列は同じであり、配列番号１５に示されている。これらの結果は、ビルマとメキシコの両方の株からのｃＤＮＡプライマーとプライマーＳ１だけがＵＳＰ−１患者のサンプルから臭化エチジウム染色される生成物を生じたことを示唆している。メキシコ株に基づくネストプライマー、Ｓ２及びＡ２だけが予想された大きさの臭化エチジウム染色性産物を生じた。
【０１３２】
ＨＥＶ ＵＳ−１単離物とＨＥＶの他の既知単離物との間の類縁関係の度合を調べるため、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，５３７１１から入手可能なＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ（バージョン９）のＧＡＰプログラムを使用して、ヌクレオチド及びアミノ酸配列の整列を実施した。当該プログラムは、ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９７０）４８：４４３−４５３）のアルゴリズムを用いて類似性と同一性の度合を計算し、並んでいる２つの配列間のパーセンテージとして表す。ｇａｐの創造及びｇｙａｐ伸長のペナルティーは、核酸配列整列についてはそれぞれ５０と３．０、アミノ酸配列の比較に関してはそれぞれ１２と４であった。
【０１３３】
ビルマとメキシコの２つの「基本型」ＨＥＶ単離物の完全なヌクレオチド及びアミノ酸配列、ならびに分析に使用した他の配列はＧｅｎＢａｎｋから入手した。それぞれのアクセス番号を下記の表１に示す。これらの配列はそれぞれ参考として本明細書中に援用される。
【０１３４】
【表１】

【０１３５】
ＨＥＶ ＵＳ−１の３０３塩基対配列（配列番号８９の残基１−３０３に相同）をメキシコ、ビルマ、パキスタン及び中国株において同定された相同領域と比較した。得られた同一性のパーセントを下記の表２に要約する。
【０１３６】
【表２】

表２の結果は、ＵＳＰ−１単離物からのＯＲＦ１の５’末端からのフラグメントが、ＨＥＶの他の既知単離物に対して約７４．９から約７７．２％の核酸同一性を示したことを明らかにしている。これは基本型のメキシコとビルマ単離物間の同一性（８３．２％）より低かった。これらの結果は、生成物がおそらくこれまでに同定されていないＨＥＶのユニーク単離物から誘導されたのであろうことを示唆している。
【０１３７】
実施例３−ＨＥＶ ＵＳ−１ゲノム伸長と配列決定
上記の実施例２で述べたようにして入手し、配列決定したクローン（配列番号１５）は、ユニークＨＥＶゲノム、ＨＥＶ ＵＳ−１から誘導した。ＨＥＶ ＵＳ−１ゲノムのさらなる領域から配列を得るため、いくつかの逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）ウォーキング実験を実施した。
【０１３８】
実施例２で述べた方法によって（配列番号１９に関してのみ）あるいは次の方法のいずれかによって全核酸を抽出した。担体としての酵母ｔＲＮＡ １０ｍｇの存在下で、Ｔｏｔａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ法を使用し、製造者（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）の指示に従ってＵＳＰ−１患者の血清のアリコート（２５μＬ）を抽出した。核酸を沈殿させ、ＲＮアーゼ／ＤＮアーゼ不含水３．７５μＬに懸濁した。その代わりには、ＴｏＴＡＬＬＹ ＲＮＡ分離キットを製造者（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）の推奨するように使用して、血清１００μＬから全ＲＮＡを分離した。生じたＲＮＡをＤＮアーゼで処理し、Ｓ．Ｎ．Ａ．Ｐ．Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ分離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）からの試薬でカラム精製した。その後ＲＮＡを０．１容の３Ｍ酢酸ナトリウム、担体としてのペレットペイント２μＬ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、及び２容のエタノールで沈殿させた。ＲＮＡペレットをＤＥＰＣ処理水５０μＬに溶解した。
【０１３９】
ＧｅｎｅＡｍｐ ＲＮＡ ＰＣＲキットを使用し、製造者（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）の指示に従ってＲＴ−ＰＣＲを実施した。配列番号１９の単離を除いて、ランダム六量体を使用して総容量２５μＬでｃＤＮＡ合成を開始させた。配列番号１９に関しては、上記の実施例２で述べたように、プライマーＰＡ２−５５６０（配列番号１６）で特異的に始動するｃＤＮＡを使用した。１２．５μＬ血清当量から抽出したＲＮＡ、プライマーＵＳ１ ｇａｐ−ａ０．５（配列番号４６）、及びＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（３’ＲＡＣＥ Ｋｉｔ：ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）を用いて生成した特異的始動ｃＤＮＡでＵＳ１−ｇａｐを作製した。総反応容量の５分の１（１０μＬ反応について２μＬあるいは２５μＬ反応について５μＬ、等々）を含むｃＤＮＡに関してＰＣＲを実施した。ＭｇＣｌ_２ ２ｍＭと各プライマー０．５から１．０μＭの存在下で標準的なＰＣＲを実施した。配列番号３３及び４１の分離に関しては、製造者の指示に従って改変反応は１ｘＰＣＲ緩衝液と２０％Ｑ溶液（Ｑｉａｇｅｎ）を含んだ。反応は、２個のＨＥＶコンセンサスプライマー（表３）、１個のＨＥＶコンセンサスプライマーと１個のＨＥＶ−ＵＳ−１特異的プライマー（表４）、２個のＨＥＶ ＵＳ−１特異的プライマー（表５）、１個のＨＥＶ ＵＳ−１特異的プライマーと１個のＨＥＶ ＵＳ−２（実施例５参照）特異的プライマー（表６）、あるいは２個のＨＥＶ ＵＳ−２特異的プライマー（表７）を使用した。反応を次のような温度サイクルに供した：
配列番号１９、２４、２７、３０、３３、４１、４４、６０、６４、６８、７３、７８、及び８３をタッチダウンＰＣＲによって得た。増幅は、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間（−０．３℃／サイクル）、及び７２℃で１分間の４３サイクルを含んだ。このあとに９４℃で３０秒間、４０℃で３０秒間、及び７２℃で１分間の１０サイクルを実施した。配列番号３８、４９、５２、及び５５に関しては、サイクルは９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、及び７２℃で１分間の３５ラウンドを含んだ。すべての増幅の前に、９４℃で１−２分間、次いで７２℃で５−１０分間を実施した。アガロースゲル分析まで反応物を４℃に保持した。
【０１４０】
配列番号１９の単離は、所望する産物を単離するために第二ラウンドのタッチダウン増幅を必要とした。ここでは第一ラウンドの１μＬを第二ラウンドの２５μＬ反応に加えた。第二ラウンドの増幅は、反応物１．１．１及び１．１．２として表３に示すような半ネスト（ヘミネスト）プライマーを使用した。配列番号２４の単離は、反応物２．１．１及び２．１．２として表４に示す、上述したような第二ラウンドのネストタッチダウン増幅を必要とした。配列番号３８及び４９の単離は、上述したような２５μＬ反応に第一ラウンドの１μＬを使用する第二ラウンドのネストＰＣＲを必要とした（表５）。配列番号６０、６４、６８、及び７３の単離は、第一ラウンドの１μＬを２５μＬの第二ラウンド反応で増幅するネストＰＣＲを必要とした（表６）。２ラウンドの増幅から、配列番号７８及び８３の生成物を得た（表７）。
【０１４１】
０．２ｍｇ／ｍＬの臭化エチジウムの存在下に０．８％から２％のアガロースＴＡＥゲル中でＰＣＲ反応物の分画あるいは反応物全部に関してアガロースゲル電気泳動を行った。生成物をＵＶ照射によって視覚化し、所望する分子量の生成物を切り出して、ＧｅｎｅＣｌｅａｎを用いて製造者（ＢＩＯ １０１，Ｉｎｃ．）の指示に従って精製し、ｐＴ７−Ｂｌｕｅ Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ）ＩＩあるいはｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に、製造者の指示に従ってクローニングした。実施例２で述べたように、あるいはＡＢＩ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いてＡＢＩ Ｍｏｄｅｌ ３７３ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒで製造者が指定するように、クローニング産物を配列決定した。これらの実験の結果を下記の表３、４、５、６、及び７に示す。
【０１４２】
【表３】

【０１４３】
【表４】

【０１４４】
【表５】

【０１４５】
【表６】

【０１４６】
【表７】

【０１４７】
ゲノムの３’末端の配列を得るため、増幅はＧＩＢＣＯ ＢＲＬの３’ＲＡＣＥ Ｓｙｓｔｅｍを製造者の指示に従って使用した。ＨＥＶ株として、ＨＥＶ−ＵＳ−１ゲノムの３’末端はメキシコ、ビルマ及びパキスタン株と同様にポリアデノシンテールを含むであろうと推測された。血清５０μＬ当量から上述したように抽出したＲＮＡを、製造者から提供されたオリゴｄＴアダプタープライマー、５’−ＧＧＣＣＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＡＧＴＡＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号８４）を用いて逆転写した。第一ラウンドのＰＣＲは、５’−ＧＧＣＣＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＡＧＴＡＣ−３’（配列番号８５）を提供するＡＵＡＰプライマー及びＨＥＶ ＵＳ特異的プライマー（表８）を、ＰＣＲ緩衝剤、ＭｇＣｌ_２と共に０．２ｍＭの最終濃度で、また推奨されているｃＤＮＡ濃度で使用した。増幅は、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、及び７２℃で１分間の３５サイクルを含んだ。増幅の前に９４℃で１分間インキュベーションし、次いで７２℃で１０分間の伸長を行った。第二ラウンドの増幅は、５０μＬ反応において第一ラウンドの１μＬを使用した。ＰＣＲ緩衝液は、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２に関して１Ｘ最終濃度及び各プライマー０．５ｍＭであった。プライマーはＡＵＡＰプライマーとＨＥＶ−ＵＳ−１特異的プライマーによるヘミネストであった（表８）。増幅条件は第一ラウンドと同じであった。生成物をアガロースゲル電気泳動で分析し、クローニングして、上記のように配列決定した。
【０１４８】
【表８】

【０１４９】
上記の表３、４、５、６、７、及び８に示した生成物から得られた配列、及びゲノムの５’末端近くの初期ＰＣＲ生成物、配列番号１５を、ＧＣＧパッケージ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，バージョン９）のプログラムと決定されたコンセンサス配列を用いてコンティーグ（ｃｏｎｔｉｇ）に組み立てた。組み立てたコンティーグの概要を図３に示す。ＨＥＶ ＵＳ−１ゲノムは７２０２ｂｐの長さであり、その全部が配列決定されている（配列番号８９）。この配列を３つのオープンリーディングフレームに翻訳した。そのうちの２つが配列番号９０に示されている（３番目のＯＲＦはヌクレオチド５０９４−５４６２に位置するが、他の２つのＯＲＦとの重複のため配列番号９０には示すことができない）。生じた翻訳産物（ＯＲＦ１、ＯＲＦ２、及びＯＲＦ３）をそれぞれ配列番号９１、配列番号９２、及び配列番号９３に示す。
【０１５０】
実施例４−ＨＥＶ ＵＳ−２のユニーク単離物の同定
急性肝炎を発症した米国の患者をＨＥＶ ＥＩＡ検定でＩｇＧクラス抗体に関して検査し、またＵＳ−１株特異的ＥＬＩＳＡによって陽性と判定した。急性肝炎と診断されたこの患者（ＵＳＰ−２）は６２歳の男性で、黄疸と疲労のために入院した。初期検体検査は１２７０Ｕ／Ｌ（正常値は０−４０Ｕ／Ｌ）のＡＬＴを示した。その地域で最近Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）が集団発生していたため、この患者もＨＡＶに感染したことが疑われた。しかし、抗ＨＡＶ ＩｇＭ検査、ＨＡＶＡＢ−Ｍ ＥＩＡ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は陰性であり、Ｂ型肝炎ウイルス及びＣ型肝炎ウイルスの血清マーカーに関する検査も同様であった。この患者の経歴で、疾病発症の数週間前にメキシコのカンクンを訪れていたことがわかった。
【０１５１】
次に患者からのサンプルを、ＨＥＶ ＵＳ−１特異的ＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲ増幅を通してＨＥＶ特異的配列の存在に関して分析した。実施例２で述べたようにＵｌｔｒａｓｐｅｃを使用してＲＮＡを抽出した。実施例３で述べたようにランダム始動（ｐｒｉｍｅｄ）ｃＤＮＡ合成を実施し、ＨＥＶ ＵＳ−１特異的プライマー、配列番号９４及び配列番号９６により、実施例２で述べたような標準条件を用いてＰＣＲを行った。配列番号９５と配列番号９７のプライマーによりネストＰＣＲを実施した。実施例３で述べたようにＰＣＲ生成物の配列決定を行った。生じたＰＣＲ生成物の配列を配列番号９８に示す。実施例２で述べたようなＧＡＰ分析は、ヌクレオチド配列、配列番号９８がＨＥＶ ＵＳ−１からの対応領域あるいは相同領域と９５％同一であることを示した。
【０１５２】
実施例５−ＨＥＶ ＵＳ−２のゲノム伸長と配列決定
実施例４で生成し、配列決定したクローン（配列番号９８）を、ＨＥＶ ＵＳ−１と最も緊密な類縁関係にあるＨＥＶ単離物から誘導した。ＨＥＶ ＵＳ−２ゲノムの追加領域を得るため、いくつかのＲＴ−ＰＣＲウォーキング実験を実施例３で述べたように実施した。
【０１５３】
Ｔｏｔａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ手法（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を用いてＲＮＡを抽出した。ＧｅｎｅＡｍｐ ＲＮＡ ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を使用して逆転写をランダム始動させた。２ｍＭ ＭｇＣｌ_２と各プライマー０．５−１．０μＭの存在下で標準ＰＣＲを実施した。配列番号１２９、１４１及び１４６の単離に関して、改変反応は１ｘＰＣＲ緩衝液と２０％Ｑ溶液（Ｑｉａｇｅｎ）を含んだ。反応は、２個のＨＥＶ ＵＳ−１特異的プライマー（表９）、１個のＨＥＶ ＵＳ−１特異的プライマーと１個のＨＥＶコンセンサスプライマー（表１０）、１個のＨＥＶ ＵＳ−２特異的プライマーと１個のＨＥＶコンセンサスプライマー（表１１）、２個のＨＥＶ ＵＳ−２特異的プライマー（表１２）、あるいは２個のビルマ、メキシコ、及び米国誘導コンセンサスプライマー（下記に述べる、表１３）を使用した。
【０１５４】
配列番号１０１、１０２、１０５、１０８、１１０、１１３、１１７、１２０、１２４、１４９、及び１５１に示す生成物をタッチダウンＰＣＲによって得た。増幅は、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間（−０．３℃／サイクル）、及び７２℃で１分間の４３サイクルを含んだ。このあとに９４℃で３０秒間、４０℃で３０秒間、及び７２℃で１分間の１０サイクルを実施した。配列番号１２９、１３２、１３６、１４１及び１４６の増幅には、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、及び７２℃で１分間の３５サイクルを含む工程を使用した。すべての増幅の前に、９４℃で１−２分間、次いで７２℃で５−１０分間を実施した。アガロースゲル分析まで反応物を４℃に保持した。多くの生成物の単離には、表９−１３に示すように第二ラウンドのネストあるいはヘミネストＰＣＲを必要とした。これらの反応では、ＰＣＲ１の生成物１μＬをＰＣＲ２反応混合物２５−５０μＬに加えて、生じた混合物をＰＣＲ１におけるようにサイクルさせた。
【０１５５】
上記の実施例３で述べたように反応物を分析し、生成物をクローニングして配列決定した。これらの実験の結果を下記の表９−１３に示す。
【０１５６】
【表９】

【０１５７】
【表１０】

【０１５８】
【表１１】

【０１５９】
【表１２】

【０１６０】
【表１３】

【０１６１】
ゲノムの３’末端の配列を得るため、増幅は、実施例３で述べたようにＧＩＢＣＯ ＢＲＬの３’ＲＡＣＥ Ｓｙｓｔｅｍを製造者の指示に従って使用した。ＰＣＲ１は、配列番号１５０と配列番号８５のプライマーを使用した。ＰＣＲ２のプライマーは配列番号１５２と配列番号８５であった（反応物１２．１）。生じた生成物は９０１ｂｐであった（配列番号１５３）。
【０１６２】
ＨＥＶ ＵＳ−２ウイルスゲノムの５’末端に位置する新しい配列の単離は、逆ＰＣＲ（Ｍ．ＺｅｉｎｅｒとＵ．Ｇｅｈｒｉｎｇ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７：１０５１−１０５３，１９９４）によって実施した。ＵＳＰ−１及びＵＳＰ−２からの血清の入手には限りがあるため、ＨＥＶ ＵＳ−２感染したサルからの糞便物質を原材料として選択した。超可変／プロリンに富むちょうつがい領域内からのサル糞便物質から、抽出したＲＮＡを用いて４６２ヌクレオチドの生成物を増幅し、逆転写して、配列番号１５４、１５５、１５６及び１５７のプライマーを使用して実施例３で述べたようにＰＣＲ増幅した。この生成物（配列番号１５８）はＨＥＶ ＵＳ−２配列と１００％同一であった。それ故、さサルの糞便からのＨＥＶゲノムの５’末端で同定される配列は、ＨＥＶ ＵＳ−２ゲノムの５’末端を正確に表すはずであると考えられる。１０％糞便懸濁液２００μＬから上述したように全核酸を抽出した。ＲＴ反応を開始する前に核酸を７０℃で５分間変性させ、次いで氷上に置いたことを除き、ＢＭＢから入手したキットを使用して、ＨＥＶ ＵＳ特異的プライマー（配列番号１５９）を用いた逆転写反応を実施した（Ｍ．ＺｅｉｎｅｒとＵ．Ｇｅｈｒｉｎｇ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、前出に述べられているように）。Ｍ．ＺｅｉｎｅｒとＵ．Ｇｅｈｒｉｎｇ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、前出に述べられているようにして、二本鎖環状ｃＤＮＡの作製を実施した。生じた環状ｃＤＮＡ分子をその後のＰＣＲ反応のテンプレートとして用いた。最初のＰＣＲ反応（ＰＣＲ１）で使用したプライマーを配列番号１６０及び１６１に示す。第二のＰＣＲ反応（ＰＣＲ２）で使用したネストプライマーは配列番号１６２及び１６３に示す通りであった。
【０１６３】
ＰＣＲ２からの生成物（反応物１３．１）をｐＧＥＭ−Ｅａｓｙ Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングし、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７３自動シーケンサーを用いて配列決定した。２２１ヌクレオチドの１個の生成物を適切なプライマーとＨＥＶ ＵＳ−２配列を持つものとして同定し、既知のＨＥＶ ＵＳ−２配列の上流の６３ヌクレオチドを同定した。適切なプライマーとこの新しい配列の一部で追加クローンを同定した。配列番号１６３及び１６１に示す配列をプライマーとして使用し、ＵＳＰ−２血清１００μＬあるいは１０％糞便懸濁液１００μＬからのＲＮＡに関してプライマー伸長実験を実施したが、この配列の長さを確認することはできなかった。ビルマ様単離物の５’ＮＴＲ配列と６３ヌクレオチドの対合比較は９４％以上の同一性を示し、これが本当のＨＥＶ ＵＳ−２配列であることを示唆した。
【０１６４】
この実施例で述べた生成物と実施例４で述べた生成物から得られた配列を、ＧＣＧパッケージ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，バージョン９）のプログラムと決定されたコンセンサス配列を用いてコンティーグに組み立てた。組み立てたコンティーグの概要を図４に示す。ＨＥＶ ＵＳ−２株のゲノムは７２７７ｂｐの長さで、その全部が配列決定されており、配列番号１６４に示されている。この配列を配列番号１６５に示す３つのオープンリーディングフレームに翻訳したが、ＯＲＦ１とＯＲＦ２配列の翻訳産物だけを示している（３番目のＯＲＦはヌクレオチド５１５９−５５２７に位置するが、他の２つのＯＲＦとの重複のため配列番号１６５には示すことができない）。生じたＯＲＦ１、ＯＲＦ２、及びＯＲＦ３配列の翻訳産物をそれぞれ配列番号１６６、１６７、及び１６８に示す。
【０１６５】
実施例６−配列の比較
ウイルスの類縁性の度合についての情報は、典型的にはヌクレオチドと推定アミノ酸配列の整列のような比較を行うことによって得られる。ＨＥＶのＵＳ単離物（例えばＨＥＶ ＵＳ−１やＨＥＶ ＵＳ−２）の配列と他のＨＥＶ単離物の対応する配列の整列は、配列間の類似性と同一性の度合の定量的評価を提供する。一般に、２個のアミノ酸配列間の類似性の算定は、整列中のアミノ酸対の側鎖間で示される類似の度合に基づく。類似の度合はアミノ酸側鎖の物理化学特性、すなわち大きさ、形、電荷、水素結合能、及び化学反応性に基づく。従って、類似アミノ酸は類似した物理化学特性を持つ側鎖を有している。並んだ２個のアミノ酸あるいはヌクレオチド配列間の同一性の算定は、一般に、整列中の同じアミノ酸対あるいはヌクレオチド対の数を計数し、この数を整列中の配列の長さで割るという算術計算である。並んだ２個のヌクレオチド配列間の類似性の算定は、時として整列中の種々の位置の対応する（すなわちマッチする）ヌクレオチド間の遷移やトランスバージョンについて異なる数値を使用する。しかし、ヌクレオチド配列対間の類似性及び同一性スコアの等級は通常非常に近い、すなわち１から２パーセントの範囲内である。
【０１６６】
類似性と同一性の度合をＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ（バージョン９）のＧＡＰプログラムを用いて決定した。ｇａｐの創造及びｇａｐ伸長のペナルティーは、核酸配列整列についてはそれぞれ５０と３．０、アミノ酸配列の比較に関してはそれぞれ１２と４であった。
【０１６７】
先に示したように、初期５’末端ＯＲＦ１クローンと他のＨＥＶ単離物間には部分的な同一性が存在し、ＵＳＰ−１患者に関連するＨＥＶ感染はＨＥＶのユニーク単離物によるものであるという主張を裏付ける。この単離物とＨＥＶの他の既知単離物との間の類縁性の度合をより広汎に調べるため、伸長したヌクレオチドと推定アミノ酸配列の整列を実施した。
【０１６８】
ＨＥＶ ＵＳ−１、ＨＥＶ ＵＳ−２、及び他の１０個の完全な長さのＨＥＶゲノム（公知の入手可能なデータベースから入手、表１４参照）についてのヌクレオチド及びアミノ酸の対合比較を上述したように実施し、ＵＳ単離物相互の関係及びＵＳ単離物と既知のＨＥＶ変異株との関係を調べた。
【０１６９】
【表１４】

【０１７０】
ＵＳ−１、ＵＳ−２、Ｂ１、Ｂ２、Ｉ２、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｐ１、Ｃ４及びＩ１株のゲノム全体にわたるヌクレオチド同一性を表１５に示す。ＯＲＦ１、ＯＲＦ２及びＯＲＦ３のヌクレオチド同一性をそれぞれ表１６、１７及び１８に示す。表１７と１８はまた、ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＡＦ０１１９２１として入手可能な、最近単離されたブタ（Ｓ１）単離物に対する比較も含む。
【０１７１】
【表１５】

【０１７２】
【表１６】

【０１７３】
【表１７】

【０１７４】
【表１８】

【０１７５】
さらに、メチルトランスフェラーゼタンパク質をコードするＯＲＦ１ヌクレオチド配列をＵＳ−１、ＵＳ−２、Ｍ１及びＰ１単離物のそれぞれの間で比較した。ＨＥＶ ＵＳ−１ゲノムのメチルトランスフェラーゼコード領域は配列番号８９の残基１−６９３で表され、一方ＨＥＶ ＵＳ−２ゲノムのメチルトランスフェラーゼコード領域は配列番号１６４の残基３６−７５５で表される。比較の結果を表１９に示す。
【０１７６】
【表１９】

【０１７７】
Ｙドメインタンパク質をコードするＯＲＦ１ヌクレオチド配列を、ＵＳ−１、ＵＳ−２、Ｍ１及びＰ１単離物のそれぞれの間で比較した。ＨＥＶ ＵＳ−１ゲノムのＹドメインタンパク質コード領域は配列番号８９の残基６１９−１２７２で表され、一方ＨＥＶ ＵＳ−２ゲノムのＹドメインタンパク質コード領域は配列番号１６４の残基６８０−１３３４で表される。比較の結果を表２０に示す。
【０１７８】
【表２０】

【０１７９】
プロテアーゼタンパク質をコードするＯＲＦ１ヌクレオチド配列を、ＵＳ−１、ＵＳ−２、Ｍ１及びＰ１単離物のそれぞれの間で比較した。ＨＥＶ ＵＳ−１ゲノムのプロテアーゼタンパク質コード領域は配列番号８９の残基１２７０−２０９１で表され、一方ＨＥＶ ＵＳ−２ゲノムのプロテアーゼタンパク質コード領域は配列番号１６４の残基１３３２−２１５３で表される。比較の結果を表２１に示す。
【０１８０】
【表２１】

【０１８１】
超可変領域をコードするＯＲＦ１ヌクレオチド配列をＵＳ−１、ＵＳ−２、Ｍ１及びＰ１単離物のそれぞれの間で比較した。ＨＥＶ ＵＳ−１ゲノムの超可変領域をコードする領域は配列番号８９の残基２０９２−２３６４で表され、一方ＨＥＶ ＵＳ−２ゲノムの超可変領域をコードする領域は配列番号１６４の残基２１９４−２４２９で表される。比較の結果を表２２に示す。
【０１８２】
【表２２】

【０１８３】
Ｘドメインタンパク質をコードするＯＲＦ１ヌクレオチド配列を、ＵＳ−１、ＵＳ−２、Ｍ１及びＰ１単離物のそれぞれの間で比較した。ＨＥＶ ＵＳ−１ゲノムのＸドメインタンパク質コード領域は配列番号８９の残基２３６５−２８４１で表され、一方ＨＥＶ ＵＳ−２ゲノムのＸドメインタンパク質コード領域は配列番号１６４の残基２４３０−２９０６で表される。比較の結果を表２３に示す。
【０１８４】
【表２３】

【０１８５】
ヘリカーゼタンパク質をコードするＯＲＦ１ヌクレオチド配列を、ＵＳ−１、ＵＳ−２、Ｍ１及びＰ１単離物のそれぞれの間で比較した。ＨＥＶ ＵＳ−１ゲノムのヘリカーゼコード領域は配列番号８９の残基２８９３−３５９１で表され、一方ＨＥＶ ＵＳ−２ゲノムのヘリカーゼコード領域は配列番号１６４の残基２９５８−３６５６で表される。比較の結果を表２４に示す。
【０１８６】
【表２４】

【０１８７】
ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードするＯＲＦ１ヌクレオチド配列を、ＵＳ−１、ＵＳ−２、Ｍ１及びＰ１単離物のそれぞれの間で比較した。ＨＥＶ ＵＳ−１ゲノムの当該ポリメラーゼコード領域は配列番号８９の残基３６３４−５０９４で表され、一方ＨＥＶ ＵＳ−２ゲノムの当該ポリメラーゼコード領域は配列番号１６４の残基３６９９−５１５９で表される。比較の結果を表２５に示す。
【０１８８】
【表２５】

【０１８９】
さらに、ＵＳ−１、ＵＳ−２、Ｂ１、Ｂ２、Ｉ２、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｐ１、Ｃ４及びＩ１株のＯＲＦ１、ＯＲＦ２及びＯＲＦ３配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸同一性／類似性をそれぞれ表２６、２７及び２８に示す。さらに、表２７と２８はブタ配列（Ｓ１）に対する比較も含む。表２６、２７及び２８では、類似性を表の右上半分に示し、同一性を表の左下半分に示している。
【０１９０】
【表２６】

【０１９１】
【表２７】

【０１９２】
【表２８】

【０１９３】
さらに、メチルトランスフェラーゼタンパク質を規定するＯＲＦ１アミノ酸配列をＵＳ−１、ＵＳ−２、Ｍ１及びＰ１単離物のそれぞれの間で比較した。ＨＥＶ ＵＳ−１ゲノムによってコードされるメチルトランスフェラーゼタンパク質は、配列番号９１の残基１−２３１によって表され、ＨＥＶ ＵＳ−２ゲノムによってコードされるメチルトランスフェラーゼタンパク質は、配列番号１６６の残基１−２４０によって表される。比較の結果を表２９に示す。
【０１９４】
【表２９】

【０１９５】
プロテアーゼタンパク質を規定するＯＲＦ１アミノ酸配列をＵＳ−１、ＵＳ−２、Ｍ１及びＰ１単離物のそれぞれの間で比較した。ＨＥＶ ＵＳ−１ゲノムによってコードされるプロテアーゼタンパク質は、配列番号９１の残基４２４−６９７によって表され、ＨＥＶ ＵＳ−２ゲノムによってコードされるプロテアーゼタンパク質は、配列番号１６６の残基４３３−７０６によって表される。比較の結果を表３０に示す。
【０１９６】
【表３０】

【０１９７】
Ｙドメインタンパク質を規定するＯＲＦ１アミノ酸配列をＵＳ−１、ＵＳ−２、Ｍ１及びＰ１単離物のそれぞれの間で比較した。ＨＥＶ ＵＳ−１ゲノムによってコードされるＹドメインタンパク質は、配列番号９１の残基２０７−４２４によって表され、ＨＥＶ ＵＳ−２ゲノムによってコードされるＹドメインタンパク質は、配列番号１６６の残基２１６−４３３によって表される。比較の結果を表３１に示す。
【０１９８】
【表３１】

【０１９９】
Ｘドメインタンパク質を規定するＯＲＦ１アミノ酸配列をＵＳ−１、ＵＳ−２、Ｍ１及びＰ１単離物のそれぞれの間で比較した。ＨＥＶ ＵＳ−１ゲノムによってコードされるＸドメインタンパク質は、配列番号９１の残基７８９−９４７によって表され、ＨＥＶ ＵＳ−２ゲノムによってコードされるＸドメインタンパク質は、配列番号１６６の残基７９９−９５７によって表される。比較の結果を表３２に示す。
【０２００】
【表３２】

【０２０１】
ヘリカーゼタンパク質を規定するＯＲＦ１アミノ酸配列をＵＳ−１、ＵＳ−２、Ｍ１及びＰ１単離物のそれぞれの間で比較した。ＨＥＶ ＵＳ−１ゲノムによってコードされるヘリカーゼタンパク質は、配列番号９１の残基９６５−１１９７によって表され、ＨＥＶ ＵＳ−２ゲノムによってコードされるヘリカーゼタンパク質は、配列番号１６６の残基９７５−１２０７によって表される。比較の結果を表３３に示す。
【０２０２】
【表３３】

【０２０３】
超可変領域を規定するＯＲＦ１アミノ酸配列をＵＳ−１、ＵＳ−２、Ｍ１及びＰ１単離物のそれぞれの間で比較した。ＨＥＶ ＵＳ−１ゲノムによってコードされる超可変領域は、配列番号９１の残基６９８−７８８によって表され、ＨＥＶ ＵＳ−２ゲノムによってコードされる超可変領域は、配列番号１６６の残基７０７−７９８によって表される。比較の結果を表３４に示す。
【０２０４】
【表３４】

【０２０５】
ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼタンパク質を規定するＯＲＦ１アミノ酸配列をＵＳ−１、ＵＳ−２、Ｍ１及びＰ１単離物のそれぞれの間で比較した。ＨＥＶ ＵＳ−１ゲノムによってコードされるポリメラーゼは、配列番号９１の残基１２１２−１６９８によって表され、ＨＥＶ ＵＳ−２ゲノムによってコードされるポリメラーゼは、配列番号１６６の残基１２２２−１７０８によって表される。比較の結果を表３５に示す。
【０２０６】
【表３５】

【０２０７】
上記に加えて、ＨＥＶ ＵＳ型ファミリーに属するいくつかの付加的なＨＥＶ単離物がこの作業の間に同定された（下記の実施例１３参照）。付加的な単離物をＩｔ１（イタリア株）、Ｇ１（最初のギリシャ株）及びＧ２（２番目のギリシャ株）と称した。Ｉｔ１、Ｇ１及びＧ２配列を含む付加的な配列の比較を行った。その結果を下記の表３６と３７に示す。表３６は、３７１塩基（１２３アミノ酸）のＯＲＦ１フラグメント上のＨＥＶ単離物間のヌクレオチドと推定アミノ酸の同一性を示している。ＯＲＦ１フラグメントは配列番号８９の残基２６−３９６に対応する。表３７は、１４８塩基（４９アミノ酸）のＯＲＦ２フラグメント上のＨＥＶ単離物間のヌクレオチドと推定アミノ酸の同一性を示している。ＯＲＦ２フラグメントは配列番号８９の残基６３０７−６４５４に対応する。表３６と３７の両方において、提示されている単離物はビルマ（Ｂ１、Ｂ２）、中国（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４）、インド（Ｉ１、Ｉ２）、パキスタン（Ｐ１）、メキシコ（Ｍ１）、ブタ（Ｓ１）、米国（ＵＳ−１、ＵＳ−２）、ギリシャ（Ｇ１、Ｇ２）及びイタリア（Ｉｔ１）株である。
【０２０８】
【表３６】

【０２０９】
【表３７】

【０２１０】
ＨＥＶ ＵＳ−１とＨＥＶ ＵＳ−２のそれぞれのゲノム及び表１４で同定した他のＨＥＶ単離物の他のゲノムのヌクレオチド配列を用いて、完全な長さのヌクレオチド配列の対合比較を行った。比較の結果を表１５に示す。ヌクレオチドレベルでは、ＨＥＶ ＵＳ−１とＨＥＶ ＵＳ−２は互いに極めて緊密に関連しあっており、ゲノム全体で９２．０％の同一性であった。完全な長さのビルマ様単離物は、９２．０から９８．８％の範囲の同じような同一性を示した。ＵＳ単離物は、ビルマ様単離物及びメキシコ単離物と７３．５から７４．５％同一であった。これはビルマ様単離物のいずれかひとつとメキシコ単離物間で認められた同一性と同様であり、７５．０から７６．１％のヌクレオチド同一性であった。これらのデータは、ＵＳ単離物がビルマ及びメキシコ株とは異なるＨＥＶの新しい系統の変異株のメンバーであることを示唆している。
【０２１１】
個々のＯＲＦのような、各々のゲノムのより小さな部分を分析すると、同様の度合の同一性が認められる。これらの数値をＯＲＦ１、ＯＲＦ２及びＯＲＦ３についてそれぞれ表１６、１７及び１８に示す。各々の領域にわたって、ビルマとパキスタン単離物は９３．１から９８．９％という最も高い度合の同一性を示す。メキシコ単離物は異なっており、ビルマ様単離物と７３．６から９０．１％の同一性である。ＨＥＶ ＵＳ−１のヌクレオチド配列を分析すると、ＯＲＦ１配列と有意の度合の相違が明らかになり、ビルマ様及びメキシコ単離物とは７２％未満の同一性であった。同様に、ＯＲＦ２とＯＲＦ３配列は、ビルマ様及びメキシコ単離物とそれぞれ７９．１％と８６．９％同一であった。
【０２１２】
ヌクレオチドレベルで見られる変異性は、アミノ酸の類似性及び翻訳したオープンリーディングフレームの同一性に反映されている。ＯＲＦ１は、おそらく超可変領域の存在のために、最も相違する生成物である。ＵＳ単離物はこの領域で９７．５％のアミノ酸同一性を有している（表２６）。これは、ビルマ様ＯＲＦ１タンパク質間で見られた９４．４から９９．６％の同一性と同等である。ＵＳ ＯＲＦ１生成物は、ビルマ様及びメキシコタンパク質と８０．７から８３．０％同一である（表２６）。これらの数値は、ビルマ様分離株のいずれかとメキシコ単離物間で認められた８１．８から８４．２％の同一性に近い。アミノ酸類似性の数値は概して同一性の数値を３．５％上回っており、多数の保存的アミノ酸置換を反映している。ＯＲＦ２生成物は、おそらくウイルスのカプシドタンパク質としての役割ゆえに、最も保存されている。ＵＳ ＯＲＦ２生成物は互いに９８．０％同一であったが、ビルマ及びメキシコのＯＲＦ２タンパク質とは９０．１から９２％の同一性である（表２７）。やはり、これらの範囲はビルマ単離物間で認められたもの（９７．７から９９．７％の同一性）を反映している。ビルマとメキシコ分離株間の同一性は、ＵＳ変異株と他の変異株間の同一性よりわずかに大きく、９２．４から９３．３％であった。ＯＲＦ２上のアミノ酸類似性は同一性の数値よりも約１．５％高い。ＨＥＶ ＵＳ−１とＨＥＶ ＵＳ−２のＯＲＦ３生成物は９６．７％のアミノ酸同一性を有する。ビルマ単離物は９６．７から１００％のアミノ酸同一性を示した。ビルマ及びメキシコ単離物に対するＵＳ単離物のＯＲＦ３のアミノ酸同一性は７８．７から８４．４％であり、ビルマとメキシコ単離物間で認められた８５．４から８８．６％の同一性をわずかに下回った（表２８）。ＯＲＦ３上のアミノ酸類似性は概して同一性の数値と同じであったが、一部の比較は、同一性の数値を１．０％未満上回る類似性値を明らかにした。これらのアミノ酸類似性および同一性値は、短いアミノ酸配列の分析が完全な長さ及び部分的なヌクレオチド分析と同様の結果を生じることを示しており、ＵＳ単離物が緊密な類縁関係にあること、そしてこれまでに特性付けられたＨＥＶの単離物とは遺伝的に異なることを示唆している。
【０２１３】
表２７及び２８は、最近ブタにおいて同定された（Ｍｅｎｇら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：９８６０−９８６５）ＨＥＶ様単離物との対合アミノ酸配列比較も含んでいる。ＯＲＦ２／３領域の２０２１ｂｐだけが特性付けられている（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号：ＡＦ０１１９２１）。ＵＳブタ配列は、ヌクレオチドレベルでＨＥＶ ＵＳ−１の対応する領域と９２％同一である。ＨＥＶ ＵＳ−１は、最近同定されたブタウイルスとアミノ酸レベルで非常に類似していることが認められる。例えば、ＨＥＶ ＵＳ−１とブタ株はそれぞれのＯＲＦ２及びＯＲＦ３配列上で９７．１％と９３．５％の同一性を示す（それぞれ表２７及び２８）。
【０２１４】
Ｇ９及びＧ２０と称される、中国からの２つのＨＥＶ単離物由来２１０ヌクレオチドの部分配列（それぞれＧｅｎＢａｎｋアクセス番号：Ｘ８７３０６とＸ８７３０７）が、最近文献においてＨｕａｎｇら（１９９５）Ｊ．Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４７：３０３−３０８によって報告された。これらのフラグメントは、配列番号８９の残基番号４５３３−４７４２と相同なヌクレオチド配列を示す。それらがコードするアミノ酸配列（６９アミノ酸残基の長さ）は、配列番号９１の残基番号１５１２−１５８０と相同である。ヌクレオチド配列及びこれらの配列の推定アミノ酸配列の対合比較からの結果を表３８と３９に示す。結果は、Ｇ９及びＧ２０単離物がこの領域にわたってヌクレオチドレベルで互いに８９％同一であることを示している。緊密に関連するビルマとパキスタン単離物は、この範囲で９２．９％同一である。ＵＳ−１単離物はこの領域で７７．１と８１．０％の同一性を示し、ＵＳ−１単離物はこれらの単離物からも独自であることを示唆している。Ｇ９とＧ２０配列はヌクレオチドレベルで最も緊密に関連しているが、Ｇ２０の推定アミノ酸翻訳産物は、ＵＳ−１単離物からのＵＳ配列と最も類似／同一である（表３８）。これはおそらく分析に使用したアミノ酸の長さが短いことによると考えられる。
【０２１５】
【表３８】

【０２１６】
【表３９】

【０２１７】
実施例７−系統発生的分析
新規ＵＳ型単離物とＨＥＶの他の単離物間の系統発生的関係を調べるため、ヌクレオチドとアミノ酸配列の整列を実施した。Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，バージョン９（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＰＩＬＥＵＰプログラムを使用して整列を行った。ＰＨＹＬＩＰパッケージ、バージョン３．５ｃ（Ｆｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎ １９９３，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ）の遷移−転換率２．０のＤＮＡＤＩＳＴプログラム（Ｋｉｍｕｒａ ２パラメータ法）とＰＲＯＴＤＩＳＴ（Ｄａｙｈｏｆｆ ＰＡＭマトリックス）プログラムを使用して、配列間の進化学的距離を決定した。算定した距離を用いて、ＦＩＴＣＨプログラム（Ｆｉｔｃｈ−Ｍａｒｇｏｉａｓｈ法）によって進化系統樹を構築した。系統樹の強さ（ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ）を、ＳＥＱＢＯＯＴプログラム、ＤＮＡＤＳＩＴプログラム、ＮＥＩＧＨＢＯＲプログラムの隣接ジョイニング法（ｎｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）、及びＣＯＮＳＥＮＳＥ（ＰＨＹＬＩＰパッケージ）により、多配列整列（１００セットあるいは１，０００セット）のブーツストラップリサンプリングによって決定した。７０％未満のブーツストラップ値は系統発生的分類の根拠を提供しないとみなす（Ｍｕｅｒｈｏｆｆら（１９９７）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７１：６５０１−６５０８）。ＲＥＴＲＥＥ（ＰＨＹＬＩＰ）を用いてミッドポイントルーティングオプションにより最終的な系統樹を作製し、ＴＲＥＥＶＩＥＷ（Ｐａｇｅ（１９９６）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ １２：３５７−３５８）でグラフィック画像を創造した。その結果を図５、６、１０及び１１に示す。
【０２１８】
完全なゲノムに関する系統発生的分析。ＨＥＶ ＵＳ−１、ＨＥＶ ＵＳ−２及びＨＥＶの他の既知の単離物間の類縁性の度合をより広汎に調べるため、ヌクレオチド整列を行った。完全な長さのＨＥＶ ＵＳ−１とＨＥＶ ＵＳ−２ゲノムを、完全なゲノムが入手できる他の１０個のＨＥＶ単離物とともに配列した（表１４）。
【０２１９】
ＨＥＶ−ＵＳ単離物と他のＨＥＶ単離物の整列に基づいて系統発生的距離を検討すると、遷移−変換率２．０でＮＡＤＩＳＴプログラム（Ｋｉｍｕｒａ２パラメータ法）を用いて測定したとき、ＵＳからの単離物と他の地域からのものとの間にはかなりの進化学的距離があることが明らかになった（表４０）。算定した距離は同時に、アジア由来の単離物間に緊密な類縁関係があることを示している。ビルマ様群の中では、完全な長さの整列から算定された最大距離は１塩基当り０．０８５０ヌクレオチド置換である。この群のメンバーとＵＳ単離物間での最小距離は０．３３２２置換である。メキシコ株は、ビルマ様群とは０．３０５５から０．３１３２置換、ＵＳ単離物とは０．３３２２から０．３４６２置換という同様の距離を示す。ＨＥＶ ＵＳ−１とＨＥＶ ＵＳ−２間の０．０８１２置換という遺伝的距離は、ビルマ様単離物間で見られたものと同様である。分析したウイルス配列間の相対的な進化学的距離は、図５に示す根なし（ｕｎｒｏｏｔｅｄ）進化系統樹を調べればただちに明白である。この図では枝の長さが進化学的距離に比例する。進化系統樹において、ビルマ様単離物、メキシコ単離物及びＵＳ単離物がそれぞれ主要な枝である。さらに、基本型ウイルスの分枝は１００％のブーツストラップ（ｂｏｏｔｓｔｒａｐ）値で裏付けられている。ゲノムのより小さなセグメント（例えばＯＲＦ１、ＯＲＦ２あるいはＯＲＦ３）を個々に分析して、完全な長さの配列に関して得たものと同様の系統樹を作製し、図５に示している。これらの分析は、ＨＥＶ ＵＳ単離物が異なる系統であるか又はＨＥＶの変異株であること、そしてＨＥＶ ＵＳ−１とＨＥＶ ＵＳ−２が互いに、最も相違の大きいビルマ様単離物と同じ程度に類似することを明らかにしている。
【０２２０】
【表４０】

【０２２１】
ブタＨＥＶからのＯＲＦ２／ＯＲＦ３との比較。最近報告されたブタＨＥＶとヒトＨＥＶ ＵＳ−１及びＨＥＶ ＵＳ−２単離物間の類縁関係を調べるため、上記で使用した１０個の完全な長さの配列からの類似領域を用いて、完全なＯＲＦ２とＯＲＦ３上のヌクレオチド配列の比較を行った（表１４）。系統発生的分析により、ＵＳとブタＨＥＶ単離物間でポジション当り０．０７９９から０．０８１０ヌクレオチド置換の遺伝的距離を得た（表４１）。これらの数値は最も離れたビルマ様単離物間で認められたものと同様である。ＯＲＦ２／３ヌクレオチド配列を分析すると、ＵＳとブタ単離物は根なし進化系統樹上で近接して分類される（図６参照）。これらの単離物は、メキシコ単離物及びビルマ様単離物とは異なる系統発生群を形成する。これらの分類は１００％のブーツストラップ値で裏付けられる。
【０２２２】
【表４１】

【０２２３】
実施例８−ＨＥＶの血清学的試験
Ａ．背景
ＨＥＶ感染の診断に有用なエピトープは、ビルマ及びメキシコの両株のＨＥＶのＯＲＦ２とＯＲＦ３のカルボキシル末端近くに位置することが初期試験で示されている。以下Ｍ ３−２及びＭ ４−２と称するメキシコ株からの２つの抗原は、それぞれＯＲＦ２とＯＲＦ３のカルボキシル末端近くに４２個と３２個のアミノ酸を含む（Ｙａｒｂｏｕｇｈら（１９９１）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６５：５７９０−５７９７）。以下Ｂ ３−２及びＢ ４−２タンパク質と称するＨＥＶのビルマ株からの２つの抗原は、それぞれＯＲＦ２とＯＲＦ３のカルボキシル末端近くに４２個と３３個のアミノ酸を含む（Ｙａｒｂｏｕｇｈら（１９９１）前出）。ＨＥＶに対するＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＭクラス抗体を検出するためにデザインされた診断試験は、これらの抗原領域に基づいて開発された。潜在的にＨＥＶに対する抗体の検出力を高めるために、完全な長さのＯＲＦ３（Ｄａｗｓｏｎら（１９９２）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，３８：１７５−１８６）あるいはＯＲＦ２タンパク質からの追加アミノ酸配列（Ｄａｗｓｏｎら（１９９３）前出）を含む追加的なＨＥＶ組換えタンパク質を生成した。比較試験は、最初の組換えタンパク質と合成ペプチド（Ｂ ４−２、Ｂ ３−２、Ｍ ３−２、Ｍ ４−２）が、急性ＨＥＶ感染の既知症例においてＨＥＶに対する抗体を検出する上で、より大きな組換えタンパク質と同程度に有効であったことを示している。ＨＥＶに対する抗体を検出するための認可された試験がＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓによって製造されており、これは完全な長さのビルマ株ＯＲＦ３タンパク質とビルマ株ＯＲＦ２タンパク質のカルボキシル末端の３２７アミノ酸を含む。
【０２２４】
初期血清学的試験でＢ ３−２、Ｂ ４−２、Ｍ ３−２及びＭ ４−２の有用性が明らかにされたあと、ビルマ及びメキシコ両株のＨＥＶのＯＲＦ２のカルボキシル末端に６個の付加アミノ酸が存在し、それらはＭ ３−２及びＢ ３−２抗原タンパク質の一部を形成しないことが確認された。ＯＲＦ２とＯＲＦ３のカルボキシル末端はＨＥＶのビルマ及びメキシコ株にとって重要であることが示されているので、ゲノムのこれらの領域に対応する合成ペプチドをＨＥＶのＵＳ−１株に関して生成した。ＯＲＦ２のカルボキシル末端の４８アミノ酸に対応する合成ペプチドをＨＥＶのビルマ及びメキシコ株に関して生成し（それぞれ配列番号１７２と１７０）、Ｂ ３−２ｅ及びＭ ３−２ｅ（「ｅ」は伸長したアミノ酸配列を示す）と称した。さらに、ＨＥＶ ＵＳ−１ ＯＲＦ３のカルボキシル末端の３３アミノ酸を表す合成ペプチドをＨＥＶのビルマ及びメキシコ株に関して生成し（それぞれ配列番号１７１と１６９）、Ｂ ４−２及びＭ ４−２と称した。ＨＥＶ ＵＳ−１株に関するＯＲＦ２内のエピトープに基づく合成ペプチド（配列番号１７４）をＵＳ ３−２ｅと称する。ＨＥＶ ＵＳ−１ ＯＲＦ３のカルボキシル末端のエピトープに基づく合成ペプチド（配列番号１７３）をＵＳ ４−２と称する。ＨＥＶのメキシコ、ビルマ及びＵＳ株から誘導したこれらのペプチドをそれぞれ合成し、固相に被覆して、これらの合成ペプチドの相対的有用性を調べるためにＥＬＩＳＡ試験において使用した。
【０２２５】
表４２に示すように、ＨＥＶ ＵＳ−１とＨＥＶのビルマ、メキシコ及びパキスタン株間のアミノ酸同一性は、ＯＲＦ２内の３−２ｅエピトープを含むアミノ酸については約８７．５％から約９１．７％、ＯＲＦ３内の４−２エピトープを含むアミノ酸については約６３．６％から約７２．７％の範囲である。理論に縛られるのは望むところではないが、エピトープをコードする領域の変異性の度合を考慮すると、これらのウイルスに対する株特異的抗体反応が存在すると考えられる。
【０２２６】
【表４２】

【０２２７】
Ｂ．急性ＨＥＶ感染の診断におけるＥＬＩＳＡの使用
ヒトにおける急性ＨＥＶ感染の大部分の症例が、１又はそれ以上のＨＥＶ組換えタンパク質あるいは合成ペプチドに結合するＩｇＭクラス抗体を有することが報告されている。ＨＥＶに対するＩｇＭクラス抗体を有していない人の場合、血清検査だけに急性ＨＥＶ感染の診断の基礎を置くことはできず、ＲＴ−ＰＣＲ及び／あるいはＨＥＶを病因因子として確認するための他の検査が必要であると考えられる。
【０２２８】
Ｃ．合成ペプチドの生成
Ｎ−メチル−モルホリンによってもたらされるｉｎ ｓｉｔｕ活性化により、（ＨＢＴＵ）結合化学と０．０２５μｍｏｌｅスケールでの標準ＦＭＯＣ固相ペプチド合成を用いてＲａｉｎｉｎ Ｓｙｍｐｈｏｎｙ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒでペプチドを調製した。各々の残基での結合時間は４５分で、あらかじめ決定した残基では二重結合とした。樹脂の標準開裂によって保護されていないペプチドを生成し、その後エーテル沈降反応と洗浄を行った。合成したペプチドを表４３に示す。
【０２２９】
【表４３】

【０２３０】
Ｄ．合成したペプチドの分析
合成したペプチドを次のようにアミノ酸組成物に関して分析した。小規模合成（０．０２５μｍｏｌｅ）からの粗ペプチドの品質を、各溶媒中０．１％（ｖ／ｖ）２トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）と共にアセトニトリル／水勾配を用いてＣ１８逆相高速液体クロマトグラフィーによって分析した。分析クロマトグラムから、各合成からの主要ピークを採集し、マススペクトロメトリー（エレクトロスプレー及び／あるいはレーザー脱着質量分析）によって溶出物を分析した。各溶媒中０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリル／水勾配によりＣ１８逆相ＨＰＬＣを用いてペプチドの精製（小規模及び／あるいは大規模）を行った。主要ピークを採集し、使用時まで凍結乾燥した。
【０２３１】
Ｅ．ＥＬＩＳＡ試験
各々のペプチドで１／４インチのポリスチレンビーズを被覆してＨＥＶ ＵＳ−１エピトープの有用性を調べた。詳細には、ペプチドを水又は水プラス氷酢酸に溶かし、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中１０μｇ／ｍＬを含有するように希釈した。合計６０個のポリスチレンビーズをペプチド溶液（１０μｇ／ｍＬ）１４ｍＬと共にシンチレーションバイアルに加え、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中５６℃で２時間インキュベートした。インキュベーション後、液体を吸引し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（登録商標）を含む緩衝液と交換した。ビーズをこの溶液に６０分間曝露させ、液体を吸引して、ビーズをＰＢＳ緩衝液で２回洗浄した。次にビーズを５％ウシ血清アルブミン溶液と共に４０℃で６０分間インキュベートした。インキュベーション後、液体を吸引し、ビーズでＰＢＳで洗浄した。生じたビーズを５％スクロース含有のＰＢＳに３０分間浸した。その後液体を吸引し、ビーズを空気乾燥した。
【０２３２】
ひとつの試験では、１／４インチのポリスチレンビーズを種々の濃度の合成ペプチドで被覆し（各ロット当り約５０個のビーズ）、抗ＨＥＶ血清検査陰性のヒト血清を陰性対照とし、ＨＥＶ感染者からの回復期の血清を陽性対照として使用して、ＥＬＩＳＡ試験（下記に述べる）において評価した。ビーズ被覆工程をスケールアップするために、陽性対照シグナル対陰性対照シグナルの最も高い比率を生じるビーズ被覆条件を選択した。各１，０００個のビーズの２ロットをＨＥＶ ＵＳ−１ ＯＲＦ２及びＯＲＦ３エピトープの両方について作製し、次のように使用した。
【０２３３】
血清又は血漿のサンプルを標本希釈液中で希釈し、サンプル中の抗体が固定化抗原に結合しうる条件下で抗原被覆固相と混合した。洗浄後、生じたビーズを、タマリンあるいは固相に結合したヒト抗体のいずれかと結合するホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）標識抗ヒト抗体と混合した。カットオフ値以上のシグナルを生じた標本を反応性とみなした。
【０２３４】
より詳細には、好ましいＥＬＩＳＡ形式は、抗原被覆した固相を標本希釈液（動物血清と非イオン性界面活性剤を含む緩衝液）で前希釈した血清に接触させることを必要とする。詳細には、血清１０μＬを標本希釈液１５０μＬに希釈し、渦動撹拌した。次にこの前希釈した標本１０μＬをＥＬＩＳＡプレートの各ウエルに加え、その後標本希釈液２００μＬと抗原被覆したポリスチレンビーズを加えた。次いでＥＬＩＳＡプレートをＤｙｎａｍｉｃ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）において絶えず撹拌しながら室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、液体を吸引し、ウエルを蒸留水中で（１回の洗浄につき５ｍＬ）３回洗浄した。次に、複合希釈液（動物血清と非イオン性界面活性剤を含む緩衝液）で希釈したＨＲＰＯ標識ヤギ抗ヒト免疫グロブリン２００μＬを各ウエルに加え、ＥＬＩＳＡプレートを上述したように１時間インキュベートした。その後ウエルを蒸留水中で３回洗浄し、各ウエルから抗原と結合免疫グロブリンを含むビーズを取り出し、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）、０．３％ｏ−フェニレンジアミン−２ＨＣｌ及び０．０２％過酸化水素の溶液３００μＬと共に試験管に入れた。室温で３０分置いた後、１Ｎ硫酸を加えて反応を停止した。生じた４９２ｎｍでの吸光度を記録した。生じた色の強度は被験サンプル中に存在する抗体の量と直接比例した。標本の各々の群について、おそらくＨＥＶエピトープに対する抗体を含むと考えられる標本をそうでない標本と分けるため、予備カットオフ値を設定した。
【０２３５】
パネル１：前スクリーニングしたパネルの試験
ＨＥＶ ＵＳ−１株から誘導されるエピトープの有用性を明らかにするため、標本のパネルをＨＥＶ ＵＳ−１のアミノ酸配列に基づくＥＬＩＳＡによって試験した（表４４）。これらのサンプルはあらかじめ、既存のペプチドと、公表文献中に報告されている（Ｄａｗｓｏｎら（１９９３）前出；Ｐａｕｌら（１９９３）前出）上述した認可済抗ＨＥＶ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の組合せを用いて、ＨＥＶに対する抗体に関して前スクリーニングしておいたものであった。
【０２３６】
パネルの最初の１０メンバーは、ＨＥＶのビルマ及びメキシコ株から誘導したペプチドと組換えタンパク質の組合せを用いた分析後、血清がＨＥＶに対する抗体に関して陰性であった米国のボランティア供血者から得た標本で構成された。標本はすべてＨＥＶ ＵＳ−１から誘導したＥＬＩＳＡと非反応性であった。急性肝炎に罹患し、血清がＨＥＶのビルマ及びメキシコ株に基づくＨＥＶ組換え抗原と合成タンパク質に対するＩｇＧ及びＩｇＭクラス抗体に関して反応性であったため、急性ＨＥＶ感染と診断された個人から、さらに５つの標本を得た。５サンプルのうち３つがエジプトから、１つがインドから、１つがノルウェーから（旅行者）であった。これらの個人の５サンプル全部において、ＲＴ−ＰＣＲによりＨＥＶ ＲＮＡが検出された。これらの５メンバーをＨＥＶ ＵＳ−１単離物に対する抗体に関して試験し、ＩｇＧ及びＩｇＭクラス抗体が各々の症例で検出された（表４４）。従ってこれらのデータは、ＨＥＶのＵＳ−１株からの合成ペプチドの使用が、ＨＥＶへの接触を診断し、急性ＨＥＶ感染を診断する上で有用性を持つことを裏付けている。
【０２３７】
【表４４】

【０２３８】
パネル２：ＨＥＶ ＵＳ−１単離物の生物ソースにおけるＨＥＶに対する抗体の検出
実施例１で述べた患者から連続的に採血し、その血清をＨＥＶ ＵＳ−１株の生物ソースとして用いた。ＨＥＶのビルマ及びメキシコ株に関して得た血清学的データに基づくと、この患者は、検出可能なＨＥＶに対するＩｇＭクラス抗体がないため、ＨＥＶ陰性と誤って診断されていたはずである。しかし、４日の採血日すべてで、ＨＥＶ ＵＳ−１株に対するＩｇＭクラス（表４５）及びＩｇＧクラス（表４６）抗体が検出された（表４５及び４６）。この患者の血清をＨＥＶ ＵＳ ３−２ｅとＵＳ ４−２ペプチドに対するＩｇＧ及びＩｇＭクラス抗体が存在するかどうかについて分析していれば、急性ＨＥＶ感染の診断が下されていたであろう。この診断はさらに、患者が急性肝炎を発症しており、また最も重要な点として、血清サンプル中に検出可能なＨＥＶ ＵＳ−１株のＲＮＡを有していたという所見によって裏付けられる。これらのデータは、ＨＥＶ ＵＳ−１株から誘導した合成ペプチドがＨＥＶによる急性感染をより正確に診断する上で有用であることを示唆している。
【０２３９】
【表４５】

【０２４０】
【表４６】

【０２４１】
パネル３−潜在的急性ＨＥＶ感染の他の症例
急性肝炎と診断され、ビルマ及びメキシコ株に対するＩｇＭクラス抗体陰性であった５０名の患者からの血清パネルを構築した。５０の血清サンプルのうち１０がＨＥＶのＵＳ株に対する抗体に関して陽性であった（表４７及び４８）。これらのサンプルに関してＲＴ−ＰＣＲを実施したが、１０のサンプルのいずれもＨＥＶ ＲＮＡに関して陽性ではなかった。従って、この実施例が示すように、患者の血清をＨＥＶ ＵＳ−１に対する抗体の存在に関して分析すると、不顕性のウイルス性肝炎を急性ＨＥＶ感染として診断できると考えられる。
【０２４２】
【表４７】

【０２４３】
【表４８】

【０２４４】
実施例９−動物伝播試験
サイノモルガスマカク（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅ）（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）をＳｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＳＦＢＲ），Ｓａｎ Ａｎｔｏｎｉｏ，Ｔｅｘａｓを通して入手した。霊長類の人道的ケアと倫理的使用を確保するためにＳＦＢＲによって設定されたガイドラインに従って動物を飼育し、モニターした。血清ＡＬＴの基線レベルを確立するため、接種前少なくとも４週間にわたって週に２回血清を採取した。基線の平均値プラス標準偏差の３．７５倍に基づいてカットオフ（ＣＯ）値を決定した。２匹のサルにＨＥＶ陽性ＵＳＰ−１血清０．４−０．６２５ｍＬを静脈内経路で接種し、１匹のサルにはＨＥＶ陽性ＵＳＰ−２血清２．０ｍＬを接種した。接種後（ＰＩ）１６週間まで、週に２回血清と糞便サンプルを採集した。血清をＡＬＴの変化に関して検査し、ＣＯより大きな値を陽性とし、肝損傷を示唆するものとみなした。上記実施例８で述べたように血清サンプルをＨＥＶに対する抗体に関して検査した（表４９、図７）。血清と糞便サンプルをＲＴ−ＰＣＲによりＨＥＶ ＲＮＡに関して検査した。ＱＩＡａｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてサルの血清２５−１００μＬを抽出した。１０％糞便懸濁液を実施例１で述べたように抽出した。下記の実施例１２で述べるようにＲＴ ＰＣＲを実施した（図７）。
【０２４５】
２匹のサイノモルガスマカクへのＵＳＰ−１血清０．４−０．６２５ｍＬの静脈内接種は感染を生じさせることができなかったが（データは示していない）、ＵＳ−２患者からの血清２．０ｍＬの接種はウイルス血症と血清中の肝酵素レベルの上昇をもたらした（図７）。ＨＥＶ ＲＮＡはＰＩ１５日目に初めて糞便材料中で検出され、ＰＩ６４日まで陽性のままであった。ＰＩ２８−５６日の間に採集した血清標本はＨＥＶ ＲＮＡ陽性であった。ＰＩ１５、４４−５８、７２及び９３日目にＡＬＴ値の上昇が認められ、ＰＩ５１日目にピークＡＬＴ値（１１６ＵＩ／Ｌ）を記録した。
【０２４６】
４−２と３−２ｅペプチドに関するビルマ、メキシコ及びＵＳ配列に基づく６個のＥＬＩＳＡを使用して抗体反応を評価した。ＵＳ ３−２ｅペプチドアッセイに対してのみ測定可能な反応が見られ（表４９）、ビルマあるいはメキシコペプチドとの交差反応性はみられなかった。ＨＥＶに対するＩｇＭクラス抗体はＰＩ２８日目から５８日目まで検出可能であった。このあと、ＰＩ４４日目に強い抗ＨＥＶ−ＩｇＧ反応が認められた。
【０２４７】
【表４９】

【０２４８】
実施例１０：組換えタンパク質ＥＬＩＳＡ
Ａ．組換え構築物
ＨＥＶ−ＵＳゲノムのＯＲＦ２とＯＲＦ３領域からのＨＥＶ−ＵＳ配列によってコードされる大腸菌誘導組換えタンパク質を、ｐＪＯｏｒｆ３−２９（配列番号１９１）；ｃｋｓｏｒｆ２ｍ−２（配列番号１９２）；及びＣＫＳＯＲＦ３２Ｍ−３（配列番号１９３）と称するＣＭＰ−ＫＤＯシンテターゼ（ＣＫＳ）との融合タンパク質として、あるいはｐｌｏｒｆ３−１２（配列番号１９４）；ｐｌｏｒｆ２−２．６（配列番号１９５）；及びＰＬＯＲＦ−３２Ｍ−１４−５（配列番号１９６）と称する非融合タンパク質として発現させた。組換え融合タンパク質の構築においては、米国特許第５，１２４，２５５号に述べられているクローニングベクターｐＪＯ２０１を使用した。このベクターを制限エンドヌクレアーゼＥｃｏ ＲＩとＢａｍ ＨＩで消化し、ＣＫＳを含むフレーム内のＨＥＶ−ＵＳ配列をクローニングした。組換え非融合タンパク質の構築では、ラムダｐＬ発現ベクターｐＫＲＲ８２６を使用した。このベクターを制限エンドヌクレアーゼＥｃｏ ＲＩとＢａｍ ＨＩで消化し、リボソーム結合部位のすぐ下流のＨＥＶ−ＵＳ配列をクローニングした。かかるベクター系は強いラムダプロモーターを含むので、温度感受性リプレッサータンパク質を不活性化する３０℃から４２℃の温度でシフトさせることによって異種タンパク質合成の誘導を行う。構築物をクローニングし、大腸菌Ｋ１２株ＨＳ３６細胞に形質転換してこれらのＨＥＶタンパク質を発現させた。
【０２４９】
ＨＥＶ−ＵＳ配列をＨＥＶ ＵＳ−２ヒト血清あるいはサル１３９０６糞便材料から抽出した核酸から増幅し、上記実施例５で述べたように逆転写した。ＯＲＦ２のカルボキシル側の半分（すなわち配列番号１６７のアミノ酸残基番号３３４−６６０をコードする）を含むＯＲＦ２配列を、Ｅｃｏ ＲＩ制限部位ならびにＡＴＧ開始コドンを含むセンスプライマー、配列番号２０８と、ＦＬＡＧ（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ）と称されるユニークペプチド配列、２つの連続するＴＡＡ終止コドン及びＢａｍ ＨＩ制限部位を含むアンチセンスプライマー、配列番号１９８を用いて作製した。ＬＡ ＴＡＱ（Ｔａｋａｒａ）試薬を製造者が推奨するように使用して、ＰＣＲ反応物５０μＬを生成した。サイクリング条件は、９４℃で２０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で２分間の４０サイクルを含んだ。増幅の前に９４℃で１分間、７２℃で１０分間置いた。生成物をＥｃｏ ＲＩとＢａｍ ＨＩで消化し、所望するベクターに連結した。制限部位の間のＣＫＳ融合クローンのヌクレオチド配列を配列番号１９２に、その翻訳物を配列番号１９９に示す。制限部位の間の非融合クローンのヌクレオチド配列を配列番号１９５に、その翻訳物を配列番号２００に示す。ＯＲＦ３全体（アミノ酸１−１２２）を含むＯＲＦ３配列を、Ｅｃｏ ＲＩ制限部位ならびにＡＴＧ開始コドンを含むセンスプライマー、配列番号２０１と、ＦＬＡＧと称されるユニークペプチド配列、２つの連続するＴＡＡ終止コドン及びＢａｍ ＨＩ制限部位を含むアンチセンスプライマー、配列番号２０２を用いて作製した。実施例５で述べたようにＱｉａｇｅｎ試薬を使用してＰＣＲ反応物５０μＬを生成した。サイクリング条件は、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間の３５サイクルを含んだ。増幅の前に９４℃で１分間、７２℃で１０分間置いた。生じた産物をＥｃｏ ＲＩとＢａｍ ＨＩで消化し、所望するベクターに連結した。制限部位の間のＣＫＳ融合クローンのヌクレオチド配列を配列番号１９１に、その翻訳物を配列番号２０３に示す。制限部位の間の非融合構築物であるクローンのヌクレオチド配列を配列番号１９５に、その翻訳物を配列番号２０４に示す。
【０２５０】
さらに、完全な長さのＯＲＦ３（アミノ酸１−１２３）とＯＲＦ２のカルボキシル側の半分（アミノ酸３３４−６６０）を含むキメラ構築物を作製した。配列番号１９１と配列番号１９２を含むプラスミド約１００ｎｇをＰＣＲ反応物１００μＬ中でテンプレートとして使用した。ＰＣＲの緩衝液と酵素はＬＡ ＴＡＱキット（Ｔａｋａｒａ）からのもので、これを製造者の指示に従って使用した。ＯＲＦ３を配列番号２０１及び２０５に示すプライマーで増幅した。配列番号２０５のアンチセンスプライマーはＦＬＡＧ配列及び配列番号１９１のカルボキシル末端からの終止コドンを排除し、ＡＴＧ開始コドンを排除する配列番号１９２と同一の配列を含む。ＯＲＦ２を配列番号２０８及び１９８のプライマーで増幅した。ＬＡ ＴＡＱを使用し、サイクリング条件は上述した通りであった。生じた産物を１．２％アガロースゲルで分別して分画化した。ＧｅｎｅＣｌｅａｎ ＩＩを使用して、製造者が述べているように（Ｂｉｏ １０１）ゲル切片からＤＮＡを単離した。生成物をガラスビーズからＨ_２Ｏ １５μＬ中に溶出した。ほぼ等しいモル比の各生成物（ＯＲＦ３生成物１０μＬとＯＲＦ２生成物１μＬ）を、１ｘＰＣＲ緩衝液、ｄＮＴＰ ０．５μｌ及びＬＡ ＴＡＱ ０．２５μＬ（Ｔａｋａｒａ）を用いた２５μＬの末端充填反応において混合した。この反応は次のようにサイクルした：９４℃で１分間、９４℃で２０秒間と５５℃で３０秒間及び７２℃で１．５分間の１０サイクル、その後７２℃で１０分間。この反応物５μＬを、ＬＡ ＴＡＱキット（Ｔａｋａｒａ）と配列番号２０１及び１９８を用いた１００μＬの増幅反応に供した。サイクリング条件は、９４℃で１分間、次いで９４℃で２０秒間、５５℃で３０秒間及び７２℃で１．５分間の３５サイクルであった。この後に７２℃で１０分間と４℃での浸漬を行った。適当な大きさの生成物を制限酵素Ｅｃｏ ＲＩとＢａｍ ＨＩで消化した。この生成物をｐＪＯ２０１に連結し、適当な配列を持つクローン（配列番号１９３、その翻訳物を配列番号２０６に示す）を同定した。生じた産物をｐＫＲＲ８２６に連結し、適当な配列を持つクローン（配列番号１９６、その翻訳物を配列番号２０７に示す）を同定した。
【０２５１】
Ｂ．タンパク質の発現と精製
米国特許第５，３１２，７３７号に述べられているように、ＣＫＳ構築物を２つの５００ｍＬ培養物において発現させた（４時間の誘導）。Ｐ_Ｌ構築物を上述したように発現させた。誘導した大腸菌培養物の凍結細胞ペレットをタンパク質精製の出発物質として使用した。リゾチーム、ＤＮアーゼ及びプロテイナーゼ阻害因子を含む緩衝液に細胞を溶解した。１１，０００xｇで遠心分離にかけて可溶性タンパク質を不溶性タンパク質（封入体）から分離した。組換えタンパク質の溶解度を、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）及びＦＬＡＧ(登録商標） Ｍ２抗体を用いたウエスタンブロット分析を通して評価した。
【０２５２】
可溶性組換えタンパク質を、適当な緩衝液に交換したあと、ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ２抗体アフィニティーゲルを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製した（Ｓｕｒｏｗｙら（１９９７）Ｊｏｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７８：１８５１−１８５９）。必要に応じて、ＳｅｐｈａｃｒｙｌR Ｓ−２００ゲル濾過クロマトグラフィーを通して追加精製を行った。このゲル濾過クロマトグラフィーにおいて、サンプルとクロマトグラフィー緩衝液は１０ｍＭ β−メルカプトエタノールを含んだ。精製したタンパク質を、２８０ｎｍで吸光度を測定して定量した。仮定比吸光係数１を使用して、吸光度をタンパク質のｍｇに変換した。前測定した純度の標準品を用いて、ＳＤＳ ＰＡＧＥによって分別したタンパク質の走査デンシトメトリー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）によってタンパク質の純度を測定した。
【０２５３】
Ｃ．ＥＬＩＳＡ
組換えＨＥＶ ＵＳ構築物の潜在的な有用性を調べるため、固相ＥＬＩＳＡを開発し、評価した。すべての組換えＨＥＶ ＵＳ構築物を下記に述べるように固相上に被覆した。簡単に述べると、１／４インチのポリスチレンビーズを、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．６中で希釈した０．５から１０μｇ／ｍＬの濃度にわたる種々の量の（ＰＪＯＯＲＦ３−２９）で被覆した。１つの濃度条件につき６０個のビーズを緩衝液約１４ｍＬ中で被覆し、４０℃で２時間十分に回転させた。被覆溶液を吸引し、残りの被覆工程を上記実施例８、Ｅ項、パラグラフ１で述べたように実施した。
【０２５４】
ｐＪＯｏｒｆ３−２９被覆ビーズを用いたＥＬＩＳＡを開発した。簡単に述べると、血清あるいは血漿を上述したようにＳｐｅｃｉｍｅｎ Ｄｉｌｕｅｎｔ（ＳｐＤ）中で１：１６に希釈した。次にこの前希釈液のアリコート１０μＬを反応トレーのウエルに加え、次いでＳｐＤ ２００μＬを加えた。各々のウエルに１個の被覆ビーズを加え、Ｄｙｎａｍｉｃ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、ダイナミックモードで３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、液体を吸引し、各々のビーズを脱イオン水（各洗浄当り５ｍＬ）で３回洗浄した。次にビーズをＨＲＰＯ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧあるいはＩｇＭ複合体２００μＬと共にインキュベートし、複合希釈液（上述したような）で希釈して、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで複合体を吸引し、ビーズを上記のように洗浄した。実施例８のＥ項で述べたように発色展開させ、吸光度を読み取った。
【０２５５】
この構築物の免疫反応性を確認するため、実験的にＨＥＶ ＵＳ−２に感染させた（実施例９で述べたように）サルＮｏ．１３９０３からの一連の血液標本を、ｐＪＯｏｒｆ３−２９に対するＩｇＭ及びＩｇＧ抗体に関して検査した。図１に示すように、接種後（ＰＩ）５１日目にＩｇＭ抗体が検出され、７２日目まで上昇し続け、ＡＬＴ値のピーク上昇と一致した。ｐＪＯｏｒｆ３−２９に対するＩｇＧ抗体はＰＩ５６日目に初めて検出され、１０７日間まで陽性のままであった（表５０）。
【０２５６】
ＨＥＶ ＵＳ ＯＲＦ３であるがＣＫＳ融合パートナーを欠く第二の構築物、ｐｌｏｒｆ３−１２も、上述したのと同じＥＬＩＳＡ形式で評価した。ｐｌｏｒｆ３−１２に対するＩｇＧ抗体を同じ実験的に感染させたサルからの一連の血液に関して評価した。ｐｌｏｒｆ３−１２に対するＩｇＧ抗体はＰＩ５８日目に検出され、１０７日目まで陽性のままであった（表５０）。
【０２５７】
【表５０】

【０２５８】
ブタＨＥＶとＵＳ−２単離物間の相同性のパーセントが高いため、ｐＪＯｏｒｆ３−２９ＥＬＩＳＡをＵＳブタ群から分離した血清中の免疫反応性ＩｇＧ及びＩｇＭの発現率を測定するのにも使用した（表５１）。抗ヒト複合体の代わりにＨＲＰＯ複合標識抗ブタ免疫グロブリン（ＩｇＧあるいはＩｇＭ）を用いたことを除いて、上述したようにアッセイを行った。
【０２５９】
【表５１】

【０２６０】
反応性標本を確認するため、阻止試験を開発した。簡単に述べると、１：１６の標本前希釈液の１０μＬアリコートを反応トレーの２つのウエルに加えた；１つのウエルは標準アッセイ用とし、もう１つのウエルは阻止アッセイに使用した。標準アッセイのＥＬＩＳＡは、ｐＪＯｏｒｆ３−２９抗原被覆ビーズを加える前に室温で３０分間の前インキュベーション段階を置くことを除いて、上述したように実施した。阻止試験については、固相上の１０倍モル過剰のｐＪＯｏｒｆ３−２９をＳｐＤ（阻止試薬）に加えた。各反応につき阻止試薬２００μＬを加え、室温で３０分間の前インキュベーションを実施した後、ｐＪＯｏｒｆ３−２９抗原被覆ビーズを加えた。アッセイの残りの部分は、抗ヒト複合体の代わりにＨＲＰＯ複合抗ブタ複合体（ＩｇＧ）を使用したことを除いて、ブタアッセイに関して上述したように実施した。
【０２６１】
等式：
［Ａ_{４９２ｎｍ}標準アッセイ−Ａ４９２ｎｍ阻止アッセイ）／Ａ_{４９２ｎｍ}標準アッセイ］×１００
を用いて阻止％を決定した。５０％以上の阻止率を示した標本をＨＥＶ ｐＪＯｏｒｆ３−２９に対するＩｇＧ抗体に関して反応性とみなした。典型的なＩｇＧ陽性及びＩｇＧ陰性ブタサンプルとそれらの阻止結果を表５２に示す。
【０２６２】
【表５２】

【０２６３】
阻止アッセイのほかに、ブタ標本のサブセットに関してウエスタンブロット分析を実施した。簡単に述べると、ＨＥＶ ｐＪＯｏｒｆ３−２９ ５０μｇと「ＣＫＳ単独」タンパク質５０μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分別し、分別したタンパク質をニトロセルロースに移した。ニトロセルロースの３ｍｍ細片を切断し、１０％大腸菌溶解産物を含むタンパク質ベースの緩衝液中で１：１００希釈した一次抗体と共に、軌道回転装置上でひと晩室温でインキュベートした。その翌日、細片を０．３％Ｔｗｅｅｎ／ＴＢＳ（ＴＢＳＴ）で３回洗浄し、その後ＴＢＳＴ中で０．５μｇ／ｍＬに希釈したＨＲＰＯ複合抗ブタＩｇＧ複合体を加えた。細片を回転させながら室温で４時間インキュベートした。次にブロットをＴＢＳＴ中で３回洗浄し、次いでＴＢＳ中で２回洗浄した。４−クロロ−１−ナフトールを基質として用いてブロットを展開した。水を加えて反応を停止し、バンドの強さを記録した。標本がｐＪＯｏｒｆ３−２９について正しい分子量（約４０ｋＤ）のバンドを示し、「ＣＫＳ単独」バンドの領域（約２９ｋＤ）で反応性がなければ、その標本は特異的反応性を持つと判定した。ｐＪＯｏｒｆ３−２９ウエスタンブロットで分析した２０のブタ血清に関する結果を表５３に示す。「ＣＫＳ単独」バンドと非特異的反応性を示したブタ血清はなかった。
【０２６４】
【表５３】

これらのデータは、ＨＥＶ ＵＳ組換えタンパク質がＨＥＶヘの曝露を診断する上で有用であることを示唆している。
【０２６５】
実施例１１−コンセンサスプライマー
アジア、メキシコ及び米国からの単離物の完全な長さの配列間で保存された領域に基づき、ＨＥＶ ＯＲＦ１、ＯＲＦ２及びＯＲＦ３に関するコンセンサスオリゴヌクレオチドプライマーを作製した（図９）。ＯＲＦ１プライマーはビルマ単離物のヌクレオチド５６−７９及び４７３−４５１のメチルトランスフェラーゼ領域内に位置し（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号：Ｍ７３２１８）、長さ４１８ヌクレオチドの生成物を増幅する。ＯＲＦ１プライマーは：
ＨＥＶＣｏｎｓＯＲＦ１−ｓ１；ＣＴＧＧＣＡＴＹＡＣＴＡＣＴＧＣＹＡＴＴＧＡＧＣ（配列番号１４７）；及び
ＨＥＶＣｏｎｓＯＲＦ１−ａ１；ＣＣＡＴＣＲＡＲＲＣＡＧＴＡＡＧＴＧＣＧＧＴＣ（配列番号１４８）
を含む。
【０２６６】
ビルマ単離物の６２９８−６３２１位及び６４９４−６４７０位のＯＲＦ２プライマーは長さ１９７ヌクレオチドの生成物を生じる。ＯＲＦ２プライマーは：
ＨＥＶＣｏｎｓＯＲＦ２−ｓ１；ＧＡＣＡＧＡＡＴＴＲＡＴＴＴＣＧＴＣＧＧＣＴＧＧ（配列番号１５０）；及び
ＨＥＶＣｏｎｓＯＲＦ２−ａ１；ＣＴＴＧＴＴＣＲＴＧＹＴＧＧＴＴＲＴＣＡＴＡＡＴＣ（配列番号；１２６）
を含む。
【０２６７】
第二ラウンドの増幅については、内部プライマーを使用してＯＲＦ１とＯＲＦ２についてそれぞれ２８７及び１４５ヌクレオチドの産物を生成することができる。ＯＲＦ１プライマーは：
ＨＥＶＣｏｎｓＯＲＦ１−ｓ２；ＣＴＧＣＣＹＴＫＧＣＧＡＡＴＧＣＴＧＴＧＧ（配列番号１７７）；及び
ＨＥＶＣｏｎｓＯＲＦ１−ａ２；ＧＧＣＡＧＷＲＴＡＣＣＡＲＣＧＣＴＧＡＡＣＡＴＣ（配列番号１７８）
を含む。
【０２６８】
ＯＲＦ２プライマーは：
ＨＥＶＣｏｎｓＯＲＦ２−ｓ２；ＧＴＹＧＴＣＴＣＲＧＣＣＡＡＴＧＧＣＧＡＧＣ（配列番号１５２）；及び
ＨＥＶＣｏｎｓＯＲＦ２−ａ２；ＧＴＴＣＲＴＧＹＴＧＧＴＴＲＴＣＡＴＡＡＴＣＣＴＧ（配列番号；１２８）
を含む。
【０２６９】
ＰＣＲ反応は、製造者の指示に従って（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）２ｍＭ ＭｇＣｌ_２及び各々のプライマー０．５μＭを含み、実施例５で述べたようなタッチダウンＰＣＲを使用して増幅した。増幅産物を１．５％アガロースゲル上で分離し、適当な大きさのＰＣＲ産物が存在するかどうかを分析した。当該プライマーを使用して、上記実施例８及び図７に示すようにＨＥＶ ＵＳ−２を含む血清及び糞便中のウイルスの存在を検出した。さらに、これらのプライマーは、ビルマ様株６Ａ、７Ａ、９Ａ及び１２Ａならびにギリシャからの２つの異なる単離物（下記の実施例１３参照）ならびにイタリアからのユニーク単離物と米国からの２つの単離物（下記の実施例１３参照）を含めたＨＥＶの多数の異なる変異株と反応性であることが認められた。さらに、これらのプライマーを使用して、中国のＬｉａｏｎｉｎｇ地方からの急性散発性肝炎の臨床診断を下された患者（Ｓ１５）からの単離物を同定した。その結果を下記の表５４に示す。
【０２７０】
【表５４】

【０２７１】
実施例１２−一次ヒト胎児腎細胞におけるＨＥＶ ＲＮＡの検出
１０×１０^６細胞を含む凍結細胞ペレットを解凍し、１．０ｍＬのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水に懸濁した。実施例１で述べたようなＵｌｔｒａｓｐｅｃ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、細胞ペレット２０μＬ（２×１０５細胞）からＲＮＡを抽出した。上記の抽出核酸（ＲＮＡ）に関してｃＤＮＡ合成を行い、ランダム六量体で開始させた。次に、実施例１１で述べたように最終濃度０．５μＭでウイルスゲノムのＯＲＦ−１及びＯＲＦ−２領域からの変性プライマーを使用して、上記のｃＤＮＡに関してＰＣＲを実施した。
【０２７２】
上記のアッセイの性能をモニターするため、一次ヒト腎細胞とＨＥＶ ＵＳ−２陽性血清を使用した陽性対照を実験計画に含めた。２×１０^５のＨＥＶ陰性一次ヒト腎細胞を、確認されたＨＥＶ ＵＳ−２陽性血清標本２．５μＬ及び２５μＬでスパイクして、２つの陽性対照セットを調製した。ヒト腎細胞を加えない陽性対照血清も検査した。
【０２７３】
一次ヒト腎細胞ペレットの１９ロットを、ＯＲＦ１とＯＲＦ２からの２つの変性プライマーセットを用いた上記アッセイ法によって検査した。結果を下記の表５５に要約する。検査した細胞ペレットのいずれのロットも、陽性対照で見られたような陽性結果を示さなかった。
【０２７４】
【表５５】

【０２７５】
実施例１３：追加ＵＳ型単離物の同定と伸長
Ａ．Ｉｔ１と称する、イタリアからの単離物の同定
血清２５−５０μＬをＰＢＳで１００μＬに希釈し、ＲＮアーゼ不含の水１００μＬで最終的な溶出を行った点を除き、ＱＩＡａｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して製造者が述べているように血清２５−５０μＬからＲＮＡを抽出した。ＲＴ反応をランダムに開始させた。ＰＣＲは、上記実施例５で述べたようなＨＥＶ ＵＳ−１プライマーを使用した。配列番号９４及び配列番号９６のプライマーで増幅した後、２９４ｂｐの産物を生成した。生成物を実施例３で述べたようにクローニングし、配列決定して、配列番号１７９に示している。
【０２７６】
Ｉｔ１単離物ゲノムの伸長を次のように実施した。上記実施例５で述べたように血清２５−５０μＬからＲＮＡを抽出した。ＲＴ反応をランダムに開始させた。ＰＣＲは、上記実施例３で述べたように、タッチダウンＰＣＲを用いて実施例１１で上述したＨＥＶ ＣＯＮＳＥＮＳＵＳプライマーを使用した。配列番号１４７及び１４８に示すプライマーを使用して、配列番号１８０に示す配列を持つ産物を生成した（反応物ｚ２、４１８ｂｐ）。配列番号１５０及び１２６に示すプライマーを使用して、配列番号１８１に示す配列を持つ産物を生成した（反応物ｚ３、１９７ｂｐ）。１ｘＰＣＲ緩衝液と２０％Ｑ溶液（Ｑｉａｇｅｎ）の存在下で、配列番号１８２及び１８３に示すプライマーを使用して、配列番号１８４に示す配列を持つ産物を生成した（反応物ｚ４、２３４ｂｐ）。ＰＣＲ１では配列番号１５０と８５に示すプライマーを使用して、またＰＣＲ２では配列番号１５２と８５に示すプライマーを使用して、上記実施例３で述べたような３’ＲＡＣＥによってゲノムの３’末端を単離し、配列番号１８５に示す配列を持つ産物を生成した（反応物ｚ５、８９０ｂｐ）。生成物を実施例３で述べたようにクローニングし、配列決定して、コンセンサス配列を生成した。これらの領域を図８に示し、配列番号１８０、１８４及び１８６に表している。これらの領域のアミノ酸翻訳産物を、配列番号１８７、１８８、１９０及び１９７に示すアミノ酸配列に表わしている。
【０２７７】
Ｂ．Ｇ１及びＧ２と称される、ギリシャからの２つの単離物の同定
風土病地域に旅行したことのない２名の患者が急性肝炎を発症し、ビルマ単離物に基づくプライマーで分析された（Ｐｓｉｃｈｏｇｉｏｕ Ｍ．Ａ．ら、（１９９５）「非Ａ・非Ｂ型肝炎患者のコホートにおけるＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）感染」Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２３，６６８−６７３）。Ｇ２患者だけがＰＣＲ陽性と認められた。上記実施例１２で述べたようにＲＮＡを単離し、上記実施例１１で述べたコンセンサスプライマーによるＰＣＲを実施した。ＯＲＦ１とＯＲＦ２のプライマーセットは、両方の患者から予想される大きさの産物を生成した。生成物を上記実施例３で述べたようにクローニングし、配列決定した。Ｇ１患者からのＯＲＦ１とＯＲＦ２のコンセンサスプライマーを用いて生成した産物をそれぞれ配列番号２０９と２１１に示す。Ｇ２患者からのＯＲＦ１とＯＲＦ２のコンセンサスプライマーを用いて生成した産物をそれぞれ配列番号２１３と２１５に示す。ＰＣＲ陽性であることからＧ１が同定されたことは、ビルマベースの株特異的プライマーに比べてコンセンサスプライマーの有用性を明らかにしている。
【０２７８】
ＰＣＲにランダム始動ｃＤＮＡを使用し、増幅が９４℃で２０秒間、６０℃で３０秒間、及び７２℃で１分間の１０サイクルと、続いて９４℃で２０秒間、５５℃で３０秒間、及び７２℃で１分間の１０サイクル、さらに９４℃で２０秒間、５０℃で３０秒間（−０．３℃／サイクル）、及び７２℃で１分間の３０サイクルを含むことを除いて、上記実施例３で配列番号１９の生成に関して述べたように、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８のプライマーを使用してＧ１とＧ２からの追加配列を得た。この後７２℃で７分間の伸長サイクルを実施した。Ｇ１患者から生成した産物を配列番号２１７に示す。Ｇ２患者から生成した産物を配列番号２２０に示す。
【０２７９】
ＵＳ、中国、ギリシャ、イタリア、メキシコ及びビルマ様単離物のヌクレオチド配列の整列を行い、これらの単離物の相互の類縁関係を調べた。イタリア単離物の相違性がゲノムのＯＲＦ１領域からの生成物の比較によって裏付けられ、ビルマ（Ｂ１）、メキシコ（Ｍ１）及びＵＳ（ＵＳ−１）からの基本型単離物との核酸同一性パーセントはそれぞれ７７．６％、７８．４％及び８４．６％であった（表３６）。また、ゲノムのＯＲＦ２領域からの生成物の比較によってもイタリア単離物の相違性が裏付けられ、ビルマ、メキシコ及びＵＳからの基本型単離物とそれぞれ８３．３％、７９．７％及び８７．８％の核酸同一性パーセントを有していた（表３７）。ビルマ、メキシコ及びＵＳからの基本型単離物からのヌクレオチド同一性は、これら２つの領域にわたって７５．５％から８２．４％の範囲である。これらの同じ領域に関して、ビルマ様群を含む単離物は９１．２％以上というはるかに高い同一性を有している。
【０２８０】
ＯＲＦ１とＯＲＦ２の増幅配列を比較すると、ギリシャの２名の患者からの単離物が互いにかなり異なることを示唆し、ＯＲＦ１とＯＲＦ２のこれらの領域でそれぞれ８４．４％と８７．２％のヌクレオチド同一性を示した。ヌクレオチドレベルでは、ギリシャ、イタリア及びＵＳ単離物間の同一性パーセントは、ＯＲＦ１産物に関しては８１．９％から８６．８％の範囲であり（表３６）、ＯＲＦ２産物に関しては８２．４％から８７．８％の範囲である（表３７）。これらの数値は、ＯＲＦ１とＯＲＦ２の両方に関して９１．２％以上というビルマ様単離物間での最も低いヌクレオチド同一性パーセントを下回る。ＵＳ、イタリアあるいはギリシャ単離物とビルマあるいはメキシコ単離物間でＯＲＦ１フラグメントから誘導したアミノ酸の同一性を比較すると、８７．８％から９３．５％の範囲である（表３６）。これらの数値は、ビルマとメキシコ単離物間の差に等しいか若しくはそれより小さく（９３．５％から９５．１％）（表３６）、非風土病地域からの単離物が風土病地域に由来する単離物とは異なることを示唆している。
【０２８１】
分析したウイルス配列間の相対的な進化的距離は、対合距離から作製した根なし進化系統樹を見れば容易に明白であり、その枝の長さは単離物間の相対的な遺伝的関係に比例する。ＯＲＦ１（図１０）あるいはＯＲＦ２（図１１）のいずれかの配列の整列に基づく進化系統樹は、全体的なトポロジーにおいて極めて類似している。ビルマ様単離物とメキシコ単離物が系統樹の一方の端の主要な枝をなす。ヒトＵＳ単離物は、メキシコ及びビルマ単離物からは遠位の異なる群を形成する。ＯＲＦ２からのブタＨＥＶ様配列はＵＳヒト単離物と緊密に関係している。３つのヨーロッパ単離物はさらに３本の異なる枝を形成し、イタリア単離物がＵＳ単離物と最も緊密に関係している。
【０２８２】
等価物
本発明は、その精神あるいは基本特性から逸脱することなく他の特定形態として具体化されうる。前記の実施態様は、それ故、ここで述べる本発明を制限するものではなく、すべての点において例示とみなされるべきである。従って本発明の範囲は前記の説明ではなく付属の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の意味及び等価性に属するすべての変更は、特許請求の範囲内に包含されることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＨＥＶゲノムの略図であり、ＯＲＦ１領域、ＯＲＦ２領域およびＯＲＦ３領域の相対的な位置を示す。
【図２】 入院１日目〜入院３７日目のＵＳＰ−１患者の血清アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（四角）および血清総ビリルビン（菱形）のレベルを示すグラフである。
【図３】 ＨＥＶのＵＳ−１ゲノムの略図であり、本研究中において単離されたクローンの相対的な位置が示されている。
【図４】 ＨＥＶのＵＳ−２ゲノムの略図であり、本研究中において単離されたクローンの相対的な位置が示されている。
【図５】 全長のＨＥＶ ＵＳ−１、ＨＥＶ ＵＳ−２および１０個の他のＨＥＶ単離物に由来するヌクレオチド配列の関係を表す無根系統樹を示す。枝分かれの長さは、配列間の進化的距離に比例している。位置あたりのヌクレオチド置換を表すスケールを示す。内部の節の数は、１００個の複製体から得られたブートストラップ値（すべての樹の割合として表される）を示す。示されている単離体は下記の通りである：ビルマ株、Ｂ１、Ｂ２；中国株、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４；パキスタン株、Ｐ１；インド株、Ｉ１、Ｉ２；メキシコ株、Ｍ１；および合衆国株、ＵＳ−１、ＵＳ−２。
【図６】 ＯＲＦ２／３の領域に由来するヌクレオチド配列（すなわち、配列番号８９の第５０９４位〜第７１１４位のヌクレオチド残基に対応する配列）の関係を表す無根系統樹を示す。枝分かれの長さは、配列間の進化的距離に比例している。位置あたりのヌクレオチド置換を表すスケールを示す。内部の節の数は、１００個の複製体から得られたブートストラップ値（すべての樹の割合として表される）を示す。示されている単離体は下記の通りである：ビルマ株、Ｂ１、Ｂ２；中国株、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４；パキスタン株、Ｐ１；インド株、Ｉ１、Ｉ２；メキシコ株、Ｍ１；ブタ株、Ｓ１；および合衆国株、ＵＳ−１、ＵＳ−２。
【図７】 ＵＳＰ−２患者から採取された血清が接種された前後におけるサルのアラニンアミノトランスフェラーゼ（四角）、血清アスパラギン酸トランスフェラーゼ（丸印）、およびγ−グルタミルトランスフェラーゼ（三角）のレベルを示すグラフである。ＨＥＶ ＵＳ−２のＲＮＡが血清および便のサンプルに存在する時期、ならびに抗ＨＥＶ ＵＳ−２のＩｇＭおよびＩｇＧが検出可能であった時期もあわせて示す。
【図８】 Ｉｔ１ゲノムの概略図であり、この研究中において単離されたクローンの相対的な位置が示されている。
【図９ａ】 ビルマ株（Ｂ１）、メキシコ株（Ｍ１）、中国株（Ｃ１）、パキスタン株（Ｐ１）およびＵＳ−１の配列比較であり、ａ）ＯＲＦ１、ｂ）ＯＲＦ２／３、およびｃ）ＯＲＦに関するＨＥＶコンセンサスプライマーの設計が示されている。好ましいコンセンサスプライマーを四角で囲って示す。
【図９ｂ】 ビルマ株（Ｂ１）、メキシコ株（Ｍ１）、中国株（Ｃ１）、パキスタン株（Ｐ１）およびＵＳ−１の配列比較であり、ａ）ＯＲＦ１、ｂ）ＯＲＦ２／３、およびｃ）ＯＲＦに関するＨＥＶコンセンサスプライマーの設計が示されている。好ましいコンセンサスプライマーを四角で囲って示す。
【図９ｃ】 ビルマ株（Ｂ１）、メキシコ株（Ｍ１）、中国株（Ｃ１）、パキスタン株（Ｐ１）およびＵＳ−１の配列比較であり、ａ）ＯＲＦ１、ｂ）ＯＲＦ２／３、およびｃ）ＯＲＦに関するＨＥＶコンセンサスプライマーの設計が示されている。好ましいコンセンサスプライマーを四角で囲って示す。
【図１０】 配列番号８９の第２６位〜第３９６位のヌクレオチド残基に対応する長さが３７１ヌクレオチドのＯＲＦ１ヌクレオチド配列の関係を表す無根系統樹を示す。位置あたりのヌクレオチド置換を表すスケールを示す。内部の節の数は、１０００個の複製体から得られたブートストラップ値（すべての樹の割合として表される）を示す。示されている単離体は下記の通りである：ビルマ株、Ｂ１、Ｂ２；中国株、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４；パキスタン株、Ｐ１；インド株、Ｉ１、Ｉ２；メキシコ株、Ｍ１；イタリア株、Ｉｔ１；ギリシア株、Ｇ１、Ｇ２；および合衆国株、ＵＳ−１、ＵＳ−２。
【図１１】 配列番号８９の第６３０７位〜第６４５４位のヌクレオチド残基に対応する長さが１４８ヌクレオチドのＯＲＦ１ヌクレオチド配列の関係を表す無根系統樹を示す。位置あたりのヌクレオチド置換を表すスケールを示す。内部の節の数は、１０００個の複製体から得られたブートストラップ値（すべての樹の割合として表される）を示す。示されている単離体は下記の通りである：ビルマ株、Ｂ１、Ｂ２；中国株、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４；パキスタン株、Ｐ１；インド株、Ｉ１、Ｉ２；メキシコ株、Ｍ１；イタリア株、Ｉｔ１；ギリシア株、Ｇ１、Ｇ２；ブタ株、Ｓ１；および合衆国株、ＵＳ−１、ＵＳ−２。
【図１２】 図１２は、好ましいＨＥＶ−ＵＳ組換えタンパク質構築物の概略図を示す。
図１２Ａには、最初と最後のアミノ酸の位置が示されているＨＥＶのＯＲＦ２構造タンパク質およびＯＲＦ３構造タンパク質が示されている。存在する免疫優勢エピトープが、それぞれのＯＲＦ内の線分によって示されている。
図１２Ｂには、発現ベクターにクローニングされ、そして最初と最後のアミノ酸の位置が示されているＯＲＦ３領域が示されている（配列番号２０３または配列番号２０４）。
図１２Ｃには、発現ベクターにクローニングされ、そして最初と最後のアミノ酸の位置が示されているＯＲＦ２領域が示されている（配列番号１９９または配列番号２００）。
図１２Ｄには、発現ベクターにクローニングされて、そしてキメラ構築物の各成分の最初と最後のアミノ酸の位置が示されているＯＲＦ２／３キメラ構築物が示されている（配列番号２０６または配列番号２０７）。ＯＲＦ３／２構築物から除かれた配列を点線によって示す。
図１２Ｂ〜Ｄにおいて、各構築物のカルボキシル末端に存在するＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドが、塗りつぶした四角によって示されている。
【図１３】 ＵＳＰ−２患者から採取された血清が接種された前後におけるサルのアラニンアミノトランスフェラーゼ（四角）、ＩｇＧ（丸印）およびＩｇＭ（星印）のレベルを示すグラフである。
【配列表】

Claims (17)

1. ヒト個体から分離された試験サンプル中におけるＵＳ型またはＵＳ亜型のヒトＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）の存在を検出するための方法であって、但し該ＵＳ型またはＵＳ亜型のヒトＨＥＶは配列番号８９または配列番号１６４に示される核酸配列を含むゲノムを有しており、以下の工程
   （ａ）前記サンプルを、前記ウイルスのマーカーに特異的に結合する結合パートナーと接触させる工程であって、前記サンプル中に前記マーカーが存在する場合に前記マーカーは前記結合パートナーに結合して、マーカー−結合パートナーの複合体を形成する工程；および
   （ｂ）前記サンプル中の前記ウイルスの存在を示す前記複合体の存在を検出する工程
   を含み、前記結合パートナーが、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号２２３もしくは配列番号２２４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖、または配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号２２３および配列番号２２４のいずれかをコードする核酸もしくはその相補鎖である方法。
2. 前記マーカーは前記ウイルスに結合し得る抗体である、請求項１に記載の方法。
3. 前記抗体は免疫グロブリンＧまたは免疫グロブリンＭである、請求項２に記載の方法。
4. 前記結合パートナーは、単離されたポリペプチド鎖である、請求項１に記載の方法。
5. 前記ポリペプチド鎖は固体支持体に固定化される、請求項４に記載の方法。
6. 前記結合パートナーは、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号２２３および配列番号２２４からなる群から選択されるポリペプチド鎖に特異的に結合し得る単離された抗体である、請求項１に記載の方法。
7. 前記抗体はモノクローナル抗体である、請求項６に記載の方法。
8. 前記結合パートナーは、単離された核酸である、請求項１に記載の方法。
9. 前記試験サンプルは哺乳動物細胞株である、請求項１に記載の方法。
10. 前記哺乳動物細胞株はヒト胎児腎臓細胞株である、請求項９に記載の方法。
11. 配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号１７３、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号２２３および配列番号２２４に示されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド鎖。
12. 配列番号１７３、配列番号２２３または配列番号２２４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖に特異的に結合し得る単離された抗体。
13. 検出可能な部分をさらに含む、請求項１２に記載の単離された抗体。
14. 配列番号８９および配列番号１６４に示されているヌクレオチド配列、または配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号２２３および配列番号２２４のいずれかをコードする核酸もしくは前記配列のいずれかに相補的な核酸配列を含む単離された核酸。
15. 請求項１４の単離された核酸を含むベクター。
16. 請求項１５に記載のベクターを含有する宿主細胞。
17. ＵＳ型ヒトＨＥＶまたはＵＳ亜型ヒトＨＥＶに対して非ヒト哺乳動物を免疫する方法であって、前記非ヒト哺乳動物に、請求項１１に記載のポリペプチドを、ＵＳ型ヒトＥ型肝炎ウイルスまたはＵＳ亜型ヒトＥ型肝炎ウイルスに特異的に結合し得る抗体の産生を刺激するのに十分な量で投与することを含む方法であり、但し該ＵＳ型またはＵＳ亜型ヒトＨＥＶは配列番号８９または配列番号１６４に示される核酸配列を含むゲノムを有することを特徴とする、前記方法。

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