NO177793B - Fremgangsmåte for fremstilling av et fusjonsprotein, samt nukleinsyre, ekspresjonsvektor og vertscelle som kan anvendes ved fremgangsmåten - Google Patents
Fremgangsmåte for fremstilling av et fusjonsprotein, samt nukleinsyre, ekspresjonsvektor og vertscelle som kan anvendes ved fremgangsmåten Download PDFInfo
- Publication number
- NO177793B NO177793B NO882917A NO882917A NO177793B NO 177793 B NO177793 B NO 177793B NO 882917 A NO882917 A NO 882917A NO 882917 A NO882917 A NO 882917A NO 177793 B NO177793 B NO 177793B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- nucleotide sequence
- amino acid
- protein
- fusion protein
- acid sequence
- Prior art date
Links
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims description 57
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 title claims description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 21
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims description 19
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims description 17
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims description 17
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 89
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 73
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 62
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 56
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 41
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 40
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 40
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 35
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 19
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 19
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 18
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 18
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 claims description 17
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 16
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 15
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 12
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 claims description 9
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 8
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 claims description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 62
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 53
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 53
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 53
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 40
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 31
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 23
- 108010078049 Interferon alpha-2 Proteins 0.000 description 18
- 102100039350 Interferon alpha-7 Human genes 0.000 description 18
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 18
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 18
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 16
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 14
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 14
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 14
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 14
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 14
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 14
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 13
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 13
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 11
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 11
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 10
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 10
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 9
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 9
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 102000011755 Phosphoglycerate Kinase Human genes 0.000 description 7
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 7
- 101001099217 Thermotoga maritima (strain ATCC 43589 / DSM 3109 / JCM 10099 / NBRC 100826 / MSB8) Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 description 7
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 7
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 6
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 5
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 4
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 3
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 3
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 description 3
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 3
- 108700004026 gag Genes Proteins 0.000 description 3
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 3
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 3
- 241000201370 Autographa californica nucleopolyhedrovirus Species 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000013175 Crataegus laevigata Nutrition 0.000 description 2
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 2
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 2
- 101710177291 Gag polyprotein Proteins 0.000 description 2
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001599018 Melanogaster Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 101710190786 PI protein Proteins 0.000 description 2
- 208000000474 Poliomyelitis Diseases 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 2
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 2
- 230000001064 anti-interferon Effects 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 101150098622 gag gene Proteins 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 239000011236 particulate material Substances 0.000 description 2
- 101150047627 pgk gene Proteins 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 150000003445 sucroses Chemical class 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000605 viral structure Anatomy 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N 0.000 description 1
- FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N (4r,7s,10s,13s,16r)-16-acetamido-13-(1h-imidazol-5-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15-tetraoxo-7-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14-tetrazacycloheptadecane-4-carboxamide Chemical compound N1C(=O)[C@@H](NC(C)=O)CSSC[C@@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CC1=CN=CN1 FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical group CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- 102100034035 Alcohol dehydrogenase 1A Human genes 0.000 description 1
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 1
- 102100022717 Atypical chemokine receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000713826 Avian leukosis virus Species 0.000 description 1
- 241001213911 Avian retroviruses Species 0.000 description 1
- 101100427060 Bacillus spizizenii (strain ATCC 23059 / NRRL B-14472 / W23) thyA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000714266 Bovine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 201000006082 Chickenpox Diseases 0.000 description 1
- 241000606153 Chlamydia trachomatis Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 1
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000699662 Cricetomys gambianus Species 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 208000001490 Dengue Diseases 0.000 description 1
- 206010012310 Dengue fever Diseases 0.000 description 1
- 208000000655 Distemper Diseases 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 108700010895 Drosophila ADH Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 101100153154 Escherichia phage T5 thy gene Proteins 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- 241000714165 Feline leukemia virus Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 description 1
- 101000892220 Geobacillus thermodenitrificans (strain NG80-2) Long-chain-alcohol dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 1
- 101710123026 High molecular weight antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000780443 Homo sapiens Alcohol dehydrogenase 1A Proteins 0.000 description 1
- 101000678879 Homo sapiens Atypical chemokine receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 206010020460 Human T-cell lymphotropic virus type I infection Diseases 0.000 description 1
- 241000714260 Human T-lymphotropic virus 1 Species 0.000 description 1
- 241000714259 Human T-lymphotropic virus 2 Species 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 241001500351 Influenzavirus A Species 0.000 description 1
- 101150007280 LEU2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710159527 Maturation protein A Proteins 0.000 description 1
- 101710091157 Maturation protein A2 Proteins 0.000 description 1
- 241000712079 Measles morbillivirus Species 0.000 description 1
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 1
- 241000711386 Mumps virus Species 0.000 description 1
- 241000714177 Murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000714209 Norwalk virus Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- 241000224016 Plasmodium Species 0.000 description 1
- 241000223960 Plasmodium falciparum Species 0.000 description 1
- 241000223810 Plasmodium vivax Species 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 1
- 206010037742 Rabies Diseases 0.000 description 1
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 1
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 1
- 101100313751 Rickettsia conorii (strain ATCC VR-613 / Malish 7) thyX gene Proteins 0.000 description 1
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 description 1
- 241000242678 Schistosoma Species 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000711484 Transmissible gastroenteritis virus Species 0.000 description 1
- 206010046980 Varicella Diseases 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960000182 blood factors Drugs 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012412 chemical coupling Methods 0.000 description 1
- 229940038705 chlamydia trachomatis Drugs 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 208000025729 dengue disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000000635 electron micrograph Methods 0.000 description 1
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000010509 frameshifting mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 101150025049 leuB gene Proteins 0.000 description 1
- WQVJUBFKFCDYDQ-BBWFWOEESA-N leubethanol Natural products C1=C(C)C=C2[C@H]([C@H](CCC=C(C)C)C)CC[C@@H](C)C2=C1O WQVJUBFKFCDYDQ-BBWFWOEESA-N 0.000 description 1
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 201000005404 rubella Diseases 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 101150000850 thrC gene Proteins 0.000 description 1
- 101150072314 thyA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
- C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
- C12N2740/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
Teknisk område
Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av et fusjonsprotein som er i stand til spontant å sammensettes til en partikkel, en nukleinsyre som koder for fusjonsproteinet, en ekspresjonsvektor som omfatter og er i stand til å uttrykke nukleinsyren, og en vertscelle som er i stand til å uttrykke det angitte gen.
Bakgrunn for kjent teknikk
En av de viktigste anvendelser av den nye, rekombinante DNA-teknologi ligger i fremstillingen av sikre vaksiner mot smittsomme sykdommer og syntesen av definerte proteiner mot hvilke antisera kan fremstilles for eksperi-mentelle, industrielle og diagnostiske formål. Teoretisk kan disse mål oppnås ved syntesen av egnede antigener i mikroorganismer slik som gjæren Saccharomyces cerevisiae. Antigenet kan uttrykkes fra en egnet ekspresjonsveJctor som beskrevet i europeisk patentsøknad EPA2-0073635.
Riktig presentasjon av antigenet til et animalsk eller humant immunsystem er en nøkkelbetingelse for en effektiv underenhetsvaksine eller et immunogen. Presentasjon har vært et hovedproblem med potensielle vaksiner og immunogener dannet ved hjelp av rekombinant DNA, såvel som vaksine basert på kjemisk syntetiserte epitoper. Et ideelt immunogen er en polymer av multiple antigene determinanter samlet til en bærer med høy molekylvekt. Et godt immunogen bør også foreligge med det maksimale antall epitoper avdekket. Disse betingelser kan være vanskelige å oppnå ved tilfeldig kjemisk kobling av antigener til en bærer. En ideell situa-sjon ville være hvor antigenet ble presentert i den riktige utforming på overflaten av et stort, partikkelformet kompleks. Videre ville den partikkelformede natur av et slikt system lette rensingen av antigenet ved hjelp av enkle fysiske fremgangsmåter.
Disse betingelser oppnås sjelden ved den enkle syntese av monomere proteiner ved hjelp av rekombinant DNA-teknologi eller kjemisk syntese.
Forut for den foreliggende oppfinnelse var det
eneste selv-sammensettende, partikkelformede antigen-presen-tasjonssystem for fremstilling av immunogener i gjær, basert på sammensmeltningen av antigener (f.eks. Herpes Simplex Virus I (HSV-I)-glycoprotein D eller et poliovirus-antigen) med hepatitt B-overflateantigen (HBsAg)-proteinet via rekombinant DNA-teknologi (Valenzuela et al., 1985, Bio-technologi, 3^, 323). Disse sammensmeltningsproteiner aggregerer under dannelse av 22 nm partikler. Dette system har alvorlige mangler: 1) utbytter er veldig lave; 2) partikler dannes ikke i gjærcellen, men er et biprodukt av ekstraksjonsfremgangsmåten (Hitzeman et al., 1983,
Nucl. Acids Res. 11., 27450) . Dette legger begrensninger på fremstillingsfremgangsmåten; 3) noen sammensmeltninger danner ikke partikler; 4) HBsAg-bestanddelen utøver immundominans i noen tilfeller, dvs. antistoffer dannes fortrinnsvis mot HBsAg.
Kniskern et al. i Gene, 4_6, 135 (1986) har rapportert at hepatitt B-kjerneantigen (HBcAg) danner partikler i gjær på veldig høye nivåer, men det er ikke pub-lisert noen rapport om deres anvendelse til å bære andre epitoper. Ettersom disse partikler er rapportert å være ytterst immunogeniske i mus, kan de utøve immundominans på samme måte som HBsAg-partiklene.
Et tilsvarende system i bakterier er rapportert av Haynes et al., (Bio/Technology, A, 637 (1986)). Tobakk-mosaikkvirus (TMV)-kappeprotein er den totale enhet som setter seg sammen til en partikkelformet struktur. Når TMV-kappeproteinet uttrykkes i E. coli og deretter renses, er det mulig å sette sammen proteinene til polyvalente partikler in vitro. Sammensmeltningsproteiner dannet av TMV-kappeproteinet og et annet protein, kan danne hybride partikler som er immunogeniske. En polioepitop med bare 8 aminosyrer er undersøkt og vist å være immunogenisk selv om den var 4 ganger mindre immunogenisk enn Salk-vaksinen. Dette system har de potensielle fordeler at størrelsen av partiklene kan varieres eksperimentelt, og blandede partikler (dvs. partikler som bærer mer enn én type epitop) mulig kan fremstilles lett. Imidlertid er en ventet mangel at bare relativt små antigener vil være i stand til å føyes til TMV-partikkelen.
Mellor et al. i Nature 313, 243 (1985) fremlegger et sammensmeltningsprotein som innbefatter produktet av en gjær-Ty åpen avlesningsramme 0RF1 (nå betegnet TYA-genet,
en åpen avlesningsramme 0RF2 (nå betegnet TYB-genet) og nucleinsyre som koder for interferon. Imidlertid foreligger det ikke noen fremleggelse eller forslag i denne publika-sjon om at de dannede sammensmeltningsproteiner, eller i virkeligheten ethvert Ty-protein, er eller kan bli i stand til å samle seg sammen til partikler.
Fremleggelse av oppfinnelsen
Det er nå påvist at visse proteiner, uttrykt ved hjelp av det genetiske materiale til retrotransposoner,
viser evnen til selv å samle seg sammen til partikler. Det er også påvist at det er mulig å fremstille sammensmeltningsproteiner basert på slike retrotransposon-avledede, sammensettende proteiner som kan sette seg sammen til antigen-(eller andre biologisk aktive molekyl-) presenterende partikler. Det er videre påvist at lignende sammensmeltningsproteiner kan fremstilles basert på sammensettende proteiner fra RNA-retrovira.
Ifølge et første aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstilling av et fusjonsprotein som er i stand til spontant å sammensettes til en partikkel, hvor fusjonsproteinet omfatter en første aminosyresekvens og en biologisk aktiv andre aminosyresekvens, hvori første aminosyresekvens er et partikkeldannende protein kodet av et retrotransposon eller et RNA-retrovirus, og hvori, hvis den andre aminosyresekvens inneholder mer enn 30 aminosyrerester, de første 30 rester av den andre aminosyresekvens ikke danner en aminosyresekvens naturlig direkte fusjonert til den første aminosyresekvens av angitte retrotransposon eller RNA-retrovirus. Fremgangsmåten er kjennetegnet ved at (a) det fremstilles en ekspresjonsvektor inneholdende nukleinsyre omfattende en første nukleotidsekvens og en andre nukleotidsekvens, hvori den første nukleotidsekvens er komplementær til genetisk materiale i et retrotransposon eller RNA-retrovirus som koder et partikkeldannende protein, hvori den andre nukleotidsekvens koder, eller er komplementær til, en nukleotidsekvens som koder den andre aminosyresekvens, og hvori vektoren er valgt slik at nukleinsyresekvensen er i stand til å bli uttrykt i en enkelt leseramme, og hvori nukleinsyren eventuelt omfatter en nukleotidsekvens som koder for et spesifikt proteolytisk spaltingssete i sammenknytningspunk-tet mellom den første og den andre nukleotidsekvens; (b) en vert transfekteres eller transformeres med ekspresj onsvektoren;
(c) fusjonsproteinet uttrykkes i verten; og
(d) det uttrykte fusjonsprotein får danne partikler spontant;
hvor fremgangsmåten eventuelt videre omfatter ett av eller begge av de følgende trinn: (e) partiklene renses ved sukrosedensitetsgradientsentrifugering; og/eller (f) dersom det proteolytiske spaltingssete er til stede, den partikkeldannende sekvens spaltes fra fusjonsproteinet under anvendelse av et enzym som er spesifikt for det proteolytiske spaltingssete, og det spaltede, biologisk aktive protein renses ved sukrosedensitetsgradientsentrifugering.
Slike partikler vil vanligvis være vesentlig rene,
med dette menes minst 5, 10, 20, 50, 80, 90, 95 eller 9 9 vekt% rene, i økende preferanserekkefølge.
En gitt partikkel kan være sammensatt av et stort antall forskjellige sammensmeltningsproteiner; det vil si sammensmeltningsproteiner hvor den andre aminosyresekvens adskiller seg fra hverandre. To, tre eller endog flere forskjellige andre aminosyresekvenser kan være til stede i en partikkel.
Den første aminosyresekvens kan være produktet av Ty- TYA-genet fra gjær, produktet av copia og copia-lignende bestanddeler fra insekter eller gag-genet fra RNA-retrovira. Retrovira innbefatter humant immunmangelvirus-I og -II (HIV-I, HIV-II), SIV, humant T-celle lymfotropisk virus-I og -II (HTLV-I, HTLV-II) murint leukemivirus,
Moloney murint leukemivirus, bryst-tumorvirus fra mus,
aviær leukosevirus, felint leukemivirus, humant B-celle lymfotropisk virus og bovint leukemivirus. Retrotransposoner, som angitt ovenfor, innbefatter Ty-bestanddelen fra gjær,
de copia og copia-lignende bestanddeler fra insekter som Drosophilia melanogaster, VL30 i mus og IAP-gener i mus.
Foretrukne retrotransposoner innbefatter gjær-retrotransposonet Ty. Det er tidligere vist at Ty styrer syntesen av 60 nm viruslignende partikler (Ty-VLP) (Mellor et al., 1985a, Nature, 318, 513). Det er nå påvist at pl-proteinet, kodet for av TYA-genet, er stabilt og ikke synes å kreve videre behandling. Derfor er aminosyresekvensen kodet for av Ty, fortrinnsvis pl-proteinet kodet for av TYA-genet. Det er kjent (Fulton et al., NAR 13 (11), .1985,
4097) at begge sorter (I og II) av Ty danner pl; slik at begge sorter kan anvendes.
Aminosyresekvensen kodet for av Ty, behøver ikke utgjøre hele pl-proteinet; i stedet kan det utgjøre en del av pl-proteinet kodet for av TYA-genet, hvor denne del kan styre syntesen av Ty-viruslignende partikler (Ty-VLP). Det er fastslått at en del av aminosyresekvensen 286 til 381 (figur 16) er nødvendig for partikkeldannelse. Fortrinnsvis kan aminosyresekvensen kodet for av Ty, avledes fra Tyl-15. Stoppkodonet ved enden av TYA-genet, innbefattes fortrinnsvis ikke; dersom det imidlertid innbefattes, kan sammensmeltningsprotein fortsette å uttrykkes, ennskjønt med lavt utbytte, ved at det viser seg at stoppkodonet kan ignoreres med en frekvens på tilnærmet 1 i løpet av 20 ganger ved hjelp av den rammeskiftende mekanisme beskrevet av Wilson et al., (NAR 14(17), 1986, 7001).
Det er nå derfor vist at Ty-protein pl, produktet
av TYA-genet (Dobson et al., 1984, EMBO.J., 3, 1115) og deler derav som inneholder minst en brøkdel av aminosyresekvensen 286 til 381 som vist i figur 16, er tilstrekkelig for å fremstille Ty-VLP.
Den andre aminosyresekvens (dvs. i bestemte utfør-elsesformer det ikke-Ty-protein-kodende område) kan være enhver aminosyresekvens som enten er kjent i teknikken,
eller som ennå gjenstår å klarlegges. Den biologiske aktivitet kan være en enkel type aktivitet (f.eks. antigenitet), reseptorbindingsaktivitet, terapeutisk aktivitet eller ^ måltreffende aktivitet (dvs. evnen til å finne veien til et spesielt mål), eller det kan foreligge en blanding av to eller flere forskjellige biologiske aktiviteter. Like-ledes kan forskjellige sammensetningsproteiner sette seg sammen til et partikkelformet antigen, og derved forårsake at hele partikkelen viser mer enn én aktivitet.
Som et eksempel kan den andre aminosyresekvens avledes fra et lymfokin-gen slik som et interferon-gen,
eller et gen som koder for et antigen fra et smittsomt materiale som et virus, en bakterie eller en annen (f.eks. protozoisk) parasitt. Det kan f.eks. være et antigen fra influensavirus, et HIV-I eller HIV-II (dvs. HTLV-III, LAV eller AIDS)-virus, et rabies-virus, FMDV-virus, HBsAg,
HBcAg, polio-virus, influensa-virus, parainfluensa-virus, respiratorisk syncytialt virus, rhinovirus, coronavirus, adenovirus, Rotavira, Norwalkvirua, Arbovira f.eks. Dengue, Herpes simplex, Cytomegalovirus, Epstein-Barr-virus, mesling-virus, kusma-virus, Rubella, heste-influensa-virus, heste-rhinopneumonitt, svine-overførbar gastroenteritt-virus, valpesyke, Parovovirus, FeLV, venezuelansk eller Western heste-encefalitt, plasmodium trypanosom, Schistosomer, Chlamydia-trachomatis eller en meningokokk, eller det kan være et fragment av de ovenfor nevnte antigener, eller et peptid som fremkommer fra en kjemisk syntetisert kodingssekvens slik at det fremkommende peptid har vesentlig den samme antigenitet som de ovenfor nevnte antigener eller fragmenter derav.
Nucleotidsekvensen for mange forskjellige virus-
og bakterie-antigener er kjent slik at antigenet kan fremstilles ved hjelp av rekombinante DNA-fremgangsmåter.
Disse DNA-kodingssekvenser kan anvendes for å kode for den andre aminosyresekvens til sammensmeltningsproteinet fremstilt ifølge den foreliggende oppfinnelse. F.eks. er nucleotidsekvensen for antigen som angår vanlige sykdommer som kikhoste og malaria, kjent. Kikhoste, Bordatella pertussis, WO 87/03301, 4. juni 1987; Malaria Plasmodium vivax og P. falciparum, Dame, et al., Science, 225:593, 1984; Enea, et al.,
Science, 225;628, 1984; Young, et al., Science, 225:958, 1984. Andre vanlige sykdommer hvor man kjenner antigen-nucleotidsekvensen, er: hepatititt, EPO 218.474 og EPO 020.251; herpes, EPO 216.195 og Japan 61-97630,
rabies, WO 87/00179; brennkopper, EPO 210.931 og polio,
WO 86/01828 og Japan 61-47585.
En første del av den andre aminosyresekvens kan
være en linker-sekvens som i noen tilfeller lett kan spaltes. Resten av den andre aminosyresekvens kan således spaltes av i et rensningstrinn.
Slike partikkelformede antigener er derfor anvendelige i fremstillingen av vaksiner. Den andre aminosyresekvens kan således kode for en aminosyre-
sekvens til et antigen ifølge et av de ovenfor nevnte smitte-stoffer. Vaksinen innbefatter et partikkelformet antigen og en fysiologisk akseptabel ikke-toksisk bærer, slik som sterilt fysiologisk saltvann eller steril PBS. Sterilitet vil vanligvis være vesentlig for parenteralt administrerbare vaksiner. Ett eller flere egnede hjelpestoffer kan også være til stede. Eksempler på egnede hjelpestoffer innbefatter muramyl-dipeptid, aluminiumhydroxyd og saponin.
Det bør bemerkes at slike vaksiner kan fremvise mer enn ett antigen. Det kan anvendes enten en blanding av forskjellige partikkelformede antigener, eller det kan anvendes en homogen populasjon av partikkelformede antigener med flere enn én epitop (fremstilt f.eks. ved å tillate en blanding av forskjellige hybride proteiner å aggregere til partikler, eller ved ekspresjon av flere enn ett partikkelformet antigen i den samme celle); alternativt kan en vaksine inneholde en blanding av disse sorter partikkelformede antigener.
I et ytterligere aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en nukleinsyre omfattende en første nukleotidsekvens og en andre nukleotidsekvens, hvor sekvensene til sammen koder for et fusjonsprotein som er i stand til spontant å danne en partikkel, kjennetegnet ved at den første nukleotidsekvens er komplementær til genetisk materiale i et retrotransposon eller RNA-retrovirus som koder for et partikkeldannende protein, hvori den andre nukleotidsekvens koder for eller er komplementær til en nukleotidsekvens som koder for en annen aminosyresekvens, idet nukleinsyren er i stand til å bli uttrykt i en enkelt leseramme for å danne et fusjonsprotein som ikke naturlig fremstilles av angitte retrotransposon eller RNA-retrovirus, og hvori, hvis den andre nukleotidsekvens inneholder mer enn 90 baser, at de første 90 baser ikke danner en nukleotidsekvens uttrykt som en del av et fusjonsprotein naturlig produsert av retrotransposonet eller RNA-retroviruset, hvori den første og den andre nukleotidsekvens eventuelt er bundet av en tredje nukleotidsekvens som koder for et proteolytisk spaltingssete i fusjonsproteinet.
Det vil vanligvis være tilfelle at nucleinsyren kan uttrykkes uten tilfelle av spleising eller antiterminering. Det vil vanligvis ikke foreligge noe rammebytte.
I visse utførelsesformer av oppfinnelsen tilveiebringer vi et TYA-genderivat som kan sammensmeltes med enhver ikke-Ty-proteinkodingssekvens under dannelse av et TYA-sammensmeltningsgen. TYA-sammensmeltningsgenet danner
et sammensmeltningsprotein som sammensettes til hybride Ty-VLP. Disse hybride Ty-VLP utgjør et partikkelformet
antigen (eller annen partikkel)-presentasjonssystem med høy molekylvekt som kan fremstilles med meget høye utbytter, og som kan renses ved hjelp av enkle fysiske fremgangsmåter.
Vi tilveiebringer videre ifølge foreliggende oppfinnelse en ekspresjonsvektor innbefattende nucleinsyre som beskrevet ovenfor. Et eksempel er pMA5620 som innbefatter TYA-genderivatet og som styrer fremstillingen på høyt nivå
av hybride Ty-VLP i gjær.
Ekspresjonsvektorer ifølge foreliggende oppfinnelse vil vanligvis inneholde en promotor. PGK er en foretrukket promotor, men enhver annen promotor kan anvendes om nød-vendig eller ønskelig. Eksempler innbefatter GAPD, GALl-10, PHQ5, ADH1, CYC1, Ty delta-sekvens, PYK og hybride promotorer dannet av bestanddeler fra mer enn én av disse promotorer eller enhver annen promotor.
Oppfinnelsen innbefatter også vertsceller, kjennetegnet ved at de er valgt fra klassen bestående av bakterie-, gjær-, pattedyr- og insektceller innbefattende en ekspresjonsvektor ifølge krav 10, og er i stand til å uttrykke det angitte gen.
På grunn av den flerverdige natur av de partikkelformede antigener er det sannsynlig at det vil være lettere å fremstille antistoffer enn med konvensjonelle antigener,
og at disse antistoffer vil ha spesifikke karakteristika.
Det kan således tilveiebringes antistoffer mot fusjonsproteiner fremstilt ifølge oppfinnelsen som er antigeniske. Antistoffene kan være polyklonale (erholdt f.eks. ved injis-ering av antigener i en kanin) eller monoklonale antistoffer, fremstilt ved hjelp av hybridomceller. På grunn av de partikkelformede antigeners flerverdige natur er det sannsynlig at in vitro-immunisering kan oppnås lettere enn med andre former for antigen; dette kan lette fremstillingen av humane, monoklonale antistoffer. Hybridomceller kan fremstilles ved sam-mensmeltning av miltceller fra et immunisert dyr med en tumor-celle. Egnede, utsondrende hybridomceller kan deretter utvel-ges. (Se Koehler & Milstein, Nature, 1976, 296, 495).
Fusjonsproteiner fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse, er anvendelige som diagnostiske reagenser. Partikkelformede antigener for diagnostiske formål er spesielt fordelaktige fordi de kan adskilles fysisk ved hjelp av sentrifugering eller filtrering, og de kan direkte spres på faste støttematerialer som glass eller plastikk-slides, dyppepinner,.makro- eller mikroperler, prøverør og brønner i mikrotiterplater. De partikkelformede antigener kan også dispergeres i fibrøse eller oppsugende materialer slik som absorberende skiver (se U.S. patent 4.632.901), strimler eller kromatografikolonner som det faste støtte-materiale. Partiklene og sammensmeltningsproteinene fester seg lett til faste støttematerialer. Partiklene kan etter rensning oppsplittes i sammensmeltningsproteiner, og sammensmeltningsproteinet kan dispergeres på overflater som angitt ovenfor. Disse reagenser er anvendelige for mange forskjellige diagnostiske tester. F.eks., en testprøve som formodes å inneholde antistoff mot det partikkelformede antigen og et fluorescerende, enzym- eller radio-merket antistoff, reageres kompetitivt med det partikkelformede antigen eller sammensmeltningsprotein på et fast støtte-materiale og mengden av merket antistoff som binder seg til det partikkelformede antigen på det faste støttemateriale. Slike partikkelformede antistoffer er også anvendelige for agglutineringsreaksjoner med antistoffer. De dyktige diagnoseteknikere vil erkjenne mange forskjellige anvendelser av slike partikkelformede antigener og av fusjonsproteiner fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse for diagnostiske formål.
Oppfinnelsen illustreres nå ved hjelp av de følgende eksempler,- ved hjelp av de ledsagende tegninger, i hvilke: Figur 1 viser et fotografi av Ty-viruslignende partikler (Ty-VLP) renset fra MD40-4c transformert med plasmid pMA91-ll. Figur 2 viser et skjematisk diagram av fremstillingen av pMA5620 og pMA5620-8. Figur 3 viser et skjematisk diagram av plasmid pMA5620-8, med et utvidet diagram av nøkkelbestanddelene i dette eksempel ifølge oppfinnelsen og nucleotidsekvenser av nøkkel-koblingssteder. Figur 4 viser fotografier av SDS-polyacrylamidgel-analyser av fraksjoner fra en sucrosegradient-adskillelse av partikler og proteiner fra MD40-4c inneholdende pMA91-ll, pMA91 og pMA5620-8. Figur 5 viser et fotografi av hybride Ty:IFN-VLP renset fra MD40-4c inneholdende pMA5620-8. Figur 6 viser fotografier av Western-blots av sucrosegradientfraksjoner fra ekstrakter av MD40-4c inneholdende pMA5620-8. a) viser resultatet ved anvendelse av anti-Ty-VLP-antistoff; b) viser resultatene ved anvendelse av anti-interferon-antistoff. Figur 7 viser et fotografi av Coomassie-fargede SDS-polyacrylamidgelanalyser av proteiner i det rensede, hybride Ty:IFN-VLP-preparatet (1) og totale ekstrakter av MD40-4c transformert med pMA5620-8 (2) og ikke-transformert MD40-4c (3) . Figur 8 viser fotografier av Western-blots ved anvendelse av anti-Ty-VLP-antistoff (b), anti-hybrid-Ty:IFN-VLP-antistoff (d) og de tilsvarende "pretappede" sera (a + c). Hver prøve anvendes mot totale ekstrakter av MD40-4c inneholdende pMA91 (1) og pMA91-l (2). Plasmid pMA91-l styrer syntesen av IFN-alfa2. pMA91 er en negativ kontroll som ikke danner noe interferon. Figur 9 viser nucleotidsekvensen av det 262 bp Spel:Spel-fragment inneholdende HA-kodoner 25-111, henvist til i eksempel 5. Figur 10 viser et diagram av plasmid pMA5620-ha23. Figur 11 viser en SDS-PAGE-analyse av sucrosegradientfraksjoner av ekstrakter fra MD40-4c transformert med pMA5620 eller pMA5620-ha23. Proteiner er farget med Coomassie-blått. Figur 12 viser en elektronmikrograf av renset
Ty:HA-VLP.
Figur 13 viser Western-blots av proteiner fra sucrosegradientfraksjoner av ekstrakter fra MD40-4c transformert med pMA5620-ha23. Blottene ble undersøkt med anti-Ty-VLP-antistoff og anti-helt influensavirus-antistoff. Figur 14 viser Western-blots av renset Ty:HA-VLP, helt influensavirus NT60 (H3) og helt influensavirus PR8 som er undersøkt, fra venstre til høyre, med normalt "pre-tappet" kaninserum, anti-Ty-VLP-antiserum, normalt "pre-tappet" kaninserum, anti-Ty:HA-VLP-antiserum og anti-helt influensavirus-serum. Figur 15 viser strategien for fremstilling av pMA5620-358 fra pMA5620. pMA5620-358 inneholder de første 280 kodoner til TYA. Figur 16 viser DNA-sekvensen og aminosyresekvensen av TYA fra 1 til 381 aminosyrer som inneholder 286- til 381-segmentet, hvor minst en del av dette er nødvendig for partikkeldannelse.
Symboler for aminosyrer er:
Eksempel 1
Anvendte stammer var E. coli AKEC28 (C600, thrC, thyA, trpC1117, hsdRK, hsdK) og S. cerevisiae MD40-4c (urd.2, trpl, leu.2-3, leu2-112, his3-ll, his_3-15) . E. coli-media ble fremstilt ifølge Miller (Miller, 1972, Experiments in Molecular Genetics, CSH p433), og gjærmedia ble fremstilt ifølge Hawthorne og Mortimer (Hawthorne og Mortimer, 1960, Genetics 45, 1085).
E. coli ble transformert ved anvendelse av standard fremgangsmåter (Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning -
A Laboratory Manual, CSH pl9 9). Gjær ble transformert som beskrevet av Hinnen et al., (Hinnen et al., 1978, Proe. Nati. Acad. Sei. 75, 1929).
Standard fremgangsmåter ble anvendt for restriksjons-fordøyelse og plasmidfremstillinger (Maniatis et al., 1982, op. eit.). Restriksjonsenzymer og T4 DNA-ligase ble anvendt ifølge leverandørenes bruksanvisninger. Bal 31-exonucleasefordøyelser ble utført som beskrevet av Dobson et al. (Dobson et al., 1982, Nucl. Acids Res. 10, 5463). Utslettelsesendepunkter ble bestemt ved DNA-sekvensanalyse (Sanger et al., 1977, Proe. Nati. Acad. Sei. 7_4' 5463). BamHI syntetiske oligonucleotidlinkere ble erholdt fra Pharmacia.
Plasmid DNA ble isolert fra E. coli preparativt som beskrevet av Chinault og Carbon (Chinault og Carbon, 1979, Gene 5_, 111) og for hurtig analyse ved hjelp av fremgangsmåten ifølge Holmes og Quigley (Holmes og Quigley, 1981, Anal. Biochem. 114, 193).
Ty-VLP ble renset som følger: Gjærceller ble dyrket selektivt ved 30°C til en tetthet på 8 x 10 celler pr. ml Cellene ble deretter inndampet ved hjelp av sentrifugering ved lav hastighet, vasket en gang i iskaldt vann og resus-pendert i TEN buffer (10 mM Tris, pH 7,4; 2 mM EDTA;
140 mM NaCl) ved 1 ml pr. 1 liter celler. Cellene ble knust ved hvirvling med glassperler (40-mesh; BDH) ved 4°C inntil
>70% var nedbrutt. Perlene ble bunnfelt ved sentrifugering ved lav hastighet, deretter ble supernatanten innsamlet og avfallet fjernet ved sentrifugering i en mikrosentrifuge i 20 minutter. Ty-VLP ble deretter bunnfelt fra supernatanten ved sentrifugering ved 100.000 gil time ved 4°C og ved re-suspendering over natten i TEN-buffer. De resuspenderte Ty-VLP ble sentrifugert i en mikrosentrifuge i 15 minutter ved 4°C for å fjerne celleavfall før supernatanten legges på toppen av en 15-45% (vekt/volum) sucrosegradient i 10 mM
Tris, pH 7,4; 10 nM natriumklorid etterfulgt av sentrifugering ved 76.300 g i 3 timer ved 15°C. Fraksjoner ble innsamlet gjennom bunnen av røret, og toppfraksjonene ble identifisert ved å eluere aliquoter av fraksjonene gjennom SDS-PAGE-geler og farging med Coomassie-blått. VLP ble konsentrert ved sentrifugering av toppfraksjonene ved 100.000 gil time ved 4°C.
Proteinekstrakter fra hele gjærceller ble fremstilt som tidligere beskrevet (Mellor et al., 1983, Gene 2_4, 1). Gel-fremgangsmåter var ifølge Laemmli (Laemmli, 1970,
Nature 227, 68). Proteinkonsentrasjoner ble målt ved hjelp av en fargebindings-analyse (Bradford, 1976, Anal. Biochem. 72, 248) erholdt fra Bio-Rad Laboratories.
Et polyklonalt heste-anti-interferon-(IFN)-alfa-antistoff ble innkjøpt fra Boehringer Mannheim. Anti-Ty-VLP-antisera ble fremstilt i kaniner ved hjelp av standard fremgangsmåter.
Western-blotting ble utført som beskrevet av Towbin et al., (Towbin et al., 1979, Proe. Nati. Acad. Sei. 76, 4350). Bundet antistoff ble påvist enten ved anvendelse av et kanin-anti-hest andre antistoff konjugert til pepperrotperoxydase (Miles Scientific) eller et geite-anti-kanin andre antistoff, etterfulgt av et peroxydase-anti-peroxydase (PAP)-kompleks dyrket i kaniner (Sigma). Den enzymatiske reaksjon ble utviklet som beskrevet av De Blas og Cherwinski (De Blas og Cherwinski, 1983, Anal. Biochem. 133, 214).
Plasmid, pMA91-ll, er tidligere beskrevet (Dobson
et al., 1984, EMB0.J. 3_, 1115): det inneholder de første 1450 nucleotider i hovedtranskripsjonsenheten til Ty-bestanddelen, Tyl-15, som er innføyd i høy-effektivitets-ekspresjonsvektoren pMA91 (Mellor et al., 1983, op. eit.; Kingsman og Kingsman, 19 85, Biotech. og Genet. Eng. Rev. 3, 377). Ty-bestanddelen ble avledet fra pKT40b som beskrevet av Dobson et al. (op. eit.); pKT40b er deponert hos National Collection of Industrial Bacteria, Aberdeen, U.K., under registreringsnummer NCIB 12427. I sin tur består ekspresjonsvektoren pMA91 av plasmid pBR322-sekvenser som
tillater replikasjon og seleksjon i E. coli, av det gjær-
2 mikron plasmide replikasjonsutgangspunkt som tillater effektiv autonom replikasjon i gjær, av gjær- LEU2-genet som en utvelgbar markør i både gjær- leu2 og E. coli- leuB-mutanter, og et Bg_/II-ekspresjonssete som adskiller det ikke-kodende område mot replikasjonsretningen i gjær-PGK-genet fra -1500 til -1 fra 3<1->området av PGK som inneholder alle signalene for gjær-transkripsjonsterminering. Plasmid pMA91 er også beskrevet i USA-4615974, selv om det bør nøye bemerkes at plasmidet betegnet som pMA3013 i figur 15 ifølge dette US-patent, er det som nå er kjent som plasmid pMA91. Plasmidet vist i den nedre del av figur 1 ifølge USA-4615974, har senere fått nytt navn.
Ty-ekspresjon fremdrives derfor fra promotoren hos det ytterst effektive gjær-fosfoglyceratkinase-gen ( PGK),
og gjærekstrakter av stammer som inneholder pMA91-ll, overproduserer omfattende mengder pl-protein som er'det primære translasjonsprodukt av TYA-genet (Dobson et al., 1984, op. eit.; Mellor et al., 1985a, op. eit.). Vi påviser nå at ekstrakter av gjærtransformanter som inneholder pMA91-ll, inneholder Ty-VLP i store mengder (figur 1). Derfor inneholder TYA alene tilstrekkelig informasjon for å danne Ty-VLP, og pl-proteinet funnet i ekstrakter av MD40-4C inneholdende pMA91-ll, samles til partikler (figurene 1 og 4). Denne informasjon tilveiebringer grunnlaget for den foreliggende oppfinnelse.
Fremstillingene av en plasmid vektor, pMA5620, som kan styre syntesen av enhver hybrid Ty-VLP-partikkel, er vist skjematisk i figur 2. Dette gjorde det påkrevet å fremstille en vektor som inneholdt et egnet restriksjons-endonuclease-sete innen TYA-genet slik at enhver kodingssekvens kan innføyes i dette sete for å skape et TYA-hybrid gen. Det er imidlertid vesentlig at det innen et slikt hybrid foreligger tilstrekkelig TYA-kodingssekvens for å styre syntesen av Ty-VLP.
Plasmid pMA91-ll ble spaltet med Bglll, fordøyd med Bal 31-exonuclease flere ganger, og re-ligert under til-stedeværelse av overskudd av Barn HI-linkere (CCGGATCCGG). Utslettelsesendepunktene av de dannede plasmider ble bestemt ved DNA-sekvensanalyse. Plasmid pMA91-357 er et utslettelsesderivat i hvilket 265 bp er fjernet. Dette plasserer BamHI-linkeren ett nucleotid bakenfor kodon 381 hos TYA (figur 3).
For å tilveiebringe både transkripsjons-terminerings-sekvenser og translasjons-stoppkodoner i alle tre avlesningsrammer, ble de utslettede PGK-3'-terminatorsekvenser til pMA91-357 erstattet med et 287 bp BamHI-Sali-DNA-fragment isolert fra plasmid pDT86. Dette DNA-fragment er et modifisert 3'-transkripsjons-terminatorfragment fra gjær-PGK-genet som inneholder translasjons-stoppkodoner i alle tre avlesningsrammer i replikasjonsretningen fra BamHI-setet (figurene 2 og 3). Dette terminatorfragment begynner med en BamHI-linker (CCGGATCCGG) bundet til det siste kodon med betydning i PGK-kodingssekvensen og strekker seg til Hindlll-setet 279 nucleotider bakenfor PGK-kodingssekvensen (Hitzeman et al., 1982, Nucl. Acids Res. 10, 7791). I disse fremstillinger er Hindlll-setet omdannet til et Sall-sete ved anvendelse av en syntetisk linker. Terminator-fragmentet er ikke kritisk, og ethvert fragment som inneholder termineringskodoner i alle tre avlesningsrammer etterfulgt av gjær-transkripsjonsterminator, vil være tilstrekkelig. Det dannede plasmid, pMA5620, inneholder et entydig BamHI-sete hvori enhver egnet sekvens kan innføyes for å fremstille et hybrid protein som vil samles til hybride Ty-VLP.
For å teste pMA5620 ble en interferon-alfa2 (IFN)-cDNA anvendt som en antigen-kodingssekvens-modell. Et 540 bp BamHI IFN-alfa2-cDNA-fragment, betegnet fragment 8 (Mellor et al., 1985b, Gene _33, 215), ble innføyd i det entydige BamHI-setse i plasmid pMA5620. Det dannede plasmid er betegnet pMA5620-8 (figurene 2 og 3).
VLP ble fremstilt fra gjærstamme MD40-4c, transformert med plasmid pMA5620-8, og fraksjoner fra en 15-45% sucrosegradient ble eluert gjennom en SDS-PAGE-gel. Proteinene i gradienten ble visualisert ved hjelp av farging med Coomassie-blått (figur 4). Beliggenheten i gradienten av det på forhånd beregnede 70 kd TYA-1FN-sammensmeltningsprotein viste i avgjørende grad den partikkelformede natur av proteinet. Elektronmikroskopi av fraksjonene bekreftet at partiklene var til stede (figur 5). For å fastslå at .dette 70 kd partikkelformede protein virkelig var et Ty(50 kd):IFN(20 kd) sammensmeltningsprotein, ble fraksjoner fra sucrosegradienter på nytt eluert gjennom SDS-PAGE-geler, og de adskilte proteiner ble overført til nitrocellulose-filtere. Ett filter ble undersøkt med et Ty-VLP-antistoff kjent for å reagere med Ty-proteiner, og et annet ble undersøkt med et anti-IFN-alfa-antistoff (figur 6). I begge tilfeller reagerte 70 kd-proteinet sterkt, noe som viser at dette protein inneholdt både Ty- og IFN-epitoper.
Effektiviteten av fremgangsmåten for rensning av hybride Ty:IFN-VLP er illustrert i figur 7. Det 70 kd hybride protein er det langt viktigste materiale i fremstillingen.
For å undersøke virkningsfullheten av disse hybride Ty:IFN-VLP i å frembringe et immunsvar til modellantigenet, interferon, ble et antiserum mot konsentrerte, hybride Ty:IFN-VLP renset fra gjærekstrakter og transformert med pMA5620-8, dyrket i kaniner. Et ekstrakt av MD40-4c transformert med plasmid pMA91-l som overproduserer IFN-alfa2 (Mellw et al., 1985b, op. eit.), ble kjørt på en SDS-PAGE-gel ved siden av et ekstrakt av MD40-4c transformert med pMA91 som ikke danner noe interferon. De adskilte proteiner ble overført til nitrocellulose og undersøkt med enten Ty-VLP-antisera eller Ty:IFN-VLP-antisera (figur 8). Mens begge antisera reagerte med tilstedeværende Ty-proteiner i ekstraktene, reagerte derimot bare anti-hybrid-Ty:IFN-VLP-antisera med 20 kd IFN-proteinet i ekstraktet som inneholdt plasmid pMA91-l.
Disse data viser: 1) pMA5620-8 styrer syntesen av et hybrid-sammensmeltningsprotein som er sammensatt av de første 381 aminosyrer i Ty-protein pl og et ikke-Ty-protein. I dette tilfelle interferon-alfa2; 2) dette sammensmeltningsprotein danner hybride Ty:IFN-VLP; 3) de hybride Ty:IFN-VLP kan lett isoleres; 4) de hybride Ty:IFN-VLP presenterer modellantigenet, interferon-alfa2, til kanin-immunsysternet. Det er derfor rimelig å vente at pMA5620
vil styre syntesen av ethvert hybrid Ty-VLP, og at ethvert antigen som er til stede i en slik partikkel, vil presen-teres til ethvert pattedyr-immunsystem, f.eks. rotte, hamster, hund, katt, storfe, sau, gris og menneske. Tydeligvis kan interferon-cDNA anvendt som et eksempel her, erstattes med enhver annen bit av DNA som kan kode for et fullstendig protein eller en del av et protein.
Den partikkelformede natur av dette antigen-presentasjonssystem, og lettheten med hvilken de hybride Ty-VLP kan renses, gjør denne oppfinnelse anvendelig som et middel for å stimulere dannelsen av antistoffer mot definerte antigener, som et middel for å skape nye vaksiner, som et middel for å fremstille definerte antigener for fremstilling av monoklonalt antistoff, og som et middel for å fremstille antigener for anvendelse i diagnostiske analysefremgangs-måter.
Hybride Ty:IFN-VLP kan derfor anvendes til å dyrke anti-IFN-antistoffer (enten monoklonale eller polyklonale, men fortrinnsvis monoklonale) som deretter kan anvendes til rensningen av IFN.
Eksempel 2
Copia-bestanddelen av Drosophilia melanogaster er bemerkelsesverdig lik Ty-bestanddelen av gjær, både når det gjelder genetisk organisasjon og viruslignende partikkeldannelse (Mount & Rubin, 1985, Mol. Cell. Biol. 5_, 1630). Området av copia som er ekvivalent med TYA, er benevnt gag ved analogi med retrovirus-organisasjon. Derfor kan ekspresjon på høye nivåer av gag-området av en copia-bestanddel i et insektcelle-ekspresjonssystem, vise seg å føre til proteiner som setter seg sammen til partikler lignende Ty-VLP. Dersom gag sammensmeltes med kodingssekvensen til et annet protein, kan det dannede sammensmeltningsprotein også vise seg å sette seg sammen til en hybrid copia-partikkel analog med de Ty:IFN-hybride partikler beskrevet ovenfor.
For å tilveiebringe copia-partikler som et antigen-presentasjons- og rensningssystem, manipuleres gag fra plasmid pPW220 (Potter & Brosein, 1979, Cell 17, 415) ved hjelp av standard rekombinant-DNA-fremgangsmåter for inn-føyelse i en typisk høyeffektivitets Baculovirus ekspresjonsvektor som pAc373 (Smith et al., 1983, J. Virol. 46, 584)
for å fremstille plasmid pAc373-gag. Ekspresjonen fremdrives ved hjelp av polyhedrin-promotoren. En interferon-cDNA innføyes deretter, i ramme, i 3<1->enden av gag for å fremstille plasmid pAc373-gag-IFN. Dette plasmid er direkte analogt med pMA5620-8 (se eksempel 1 ovenfor). pAc373-gag-IFN innføres deretter i Baculovirus, Autographa californica nukleær polyhedrosis-viruset (AcNPV) ved in vivo rekombina-sjon i Spodoptera frugiperda-celler (Smith et al., 1983,
Mol. Cell. Biol. 4_, 2156) . Rekombinante vira høstes fra okklusjons-minus-plakker og anvendes for å reinfisere friske S. frugiperda-celler. Hybride copia:IFN-partikler høstes
ved 72-96 timer etter infeksjon og fraksjoneres på en sucrosegradient for å adskille partiklene fra forurensning av Baculovirus. Partikler identifiseres ved hjelp av elektronmikroskopi og Western-blotting som beskrevet for Ty-IFN-hybride partikler (se eksempel 1 ovenfor).
Eksempel 3
Den generelle fremgangsmåte ifølge eksempel 2
følges, med unntak av et rekombinant plasmid inneholdende gag-IFN-sammensmeltningen uttrykt av Drosophila-ADH-gen-promotoren (Benyajati et al., 1983, Cell 3_3' 125) innføres i enhver insektcelle (f.eks. Drosophila Schneider 2-celler)
ved hjelp av enkel DNA-formidlet transfeksjon.
Eksempel 4
TYA-genet til gjær-Ty-bestanddelen er direkte analog med gag-genene hos fugle-retrovira og pattedyr-retrovira. Fordi produktet av TYA alene kan danne partikler, er det sannsynlig at ethvert gag-protein vil utføre det samme, og derfor kan virke som grunnlaget for et antigen-presentasjons-og rensningssystem.
For å tilveiebringe retrovirale gag-proteiner som antigen-rensnings- og presentasjonssystemer, manipuleres gag-genet fra HIV-I ved hjelp av standard rekombinant DNA-fremgangsmåter for å innføyes i gjær-ekspresjonsvektoren pMA91 og i et derivat av pattedyr-ekspresjonsvektoren pSV2 (Southern og Berg, 1982, J. Mol. Appl. Genet. 1, 327) som inneholder et pattedyr- dhfr-cDNA (Kaufman et al., 1985,
Mol. Cell. Biol. 5, 1750), for å fremstilel hhv. pMA91-HIVgag og pSV25-HIVgag. Et interferon-cDNA innføyes deretter, i ramme, i begge disse molekyler ved 3-enden av gag for å fremstille hhv. pMA91-HIVgag-IFN og pSV25-HIVgag-IFN. Disse molekyler er analoge med pMA5620-8 (se eksempel 1 ovenfor). pMA91-HIVgag-IFN anvendes deretter for å transformere gjærstamme MD40-4c, og pSV25-HIVgag-IFN anvendes for å trans-fektere CHO- dhfr-celler. Stabile transformanter formeres,
og celleekstrakter prepareres og fraksjoneres på sucrosegradienter. Hybride HIVgag:IFN-partikler identifieres ved hjelp av elektronmikroskopi og Western-blotting. Som beskrevet for Ty:IFN-hybride partikler (se eksempel 1 ovenfor).
Eksempel 5
Fremgangsmåten ifølge eksempel 4 følges, med unntak av at pSV2 5-HIVgag-IFN innføres i COS-celler (Gluzman et al., 1977, J. Virol. 24, 534), og hybride partikler høstes mellom 3 og 9 dager etter transfeksjon.
Eksempel 6
I dette eksempel viser vi at hybride Ty-VLP inneholdende en del av et influensavirus-hemagglutinin (HA),
kan fremstilles, og at disse hybride Ty:HA-VLP bevirker dannelsen av anti-HA-antistoffer i kaniner.
Strategien for disse eksperimenter var vesentlig
den samme som for fremstillingen og analysen av de hybride
Ty:IFN-VLP beskrevet i eksempel 1. MRC12/80 anti-helt influensavirus-antistoff ble erholdt fra the World Influenza Centre ved NIMR, Mill Hill, U.K. og ble dyrket mot influensavirus-stamme A/Scotland/840/74 x A/PR/8/34 (H3N2). Et område av HA-kodingssekvensen tilsvarende kodoner 25-111 av HAl-området hos influensavirus A/Memphis/102/72 (H3N2), ble utvalgt for fremstillingen av hybride Ty:HA-VLP på grunnlag av dataene ifølge Wilson et al., (1984, Cell 37, 767). Et 262 bp Spel:Spel (figur 9), tilsvarende kodoner 25-111, ble renset fra en egnet for-døyelse av plasmid MX29. MX29 er plasmid pATl53 (Twigg og Sherratt, 1980, Nature 283, 216) med et H3-HA-cDNA avledet fra HA-RNA fra influensavirus-stamme A/Memphis/102/72 G:C anbrakt bakerst i Pstl-setet. De klebrige ender av Spel:Spel-fragmentet ble fylt igjen ved anvendelse av DNA-polymerase I, og deretter ble fragmentet butt-ende-ligert til HincII-setet av plasmid pSP46 for å fremstille pSP46-ha23. pSP46 er et derivat av pSP64 (Promega Biotec) i hvilket Hindlll-setet av pSP64 er omdannet til et Bglll-sete. Et BamHI:BglII-fragment, betegnet ha23, ble renset fra pSP46-ha23. ha23 inneholder det gjenfylte 262 bp Spel:Spel-fragment. ha23 ble deretter innføyd i BamHI-
setet av pMA5620 for å fremstille pMA5620-ha23 (figur 10). Dette plasmid ble deretter anvendt for å transformere gjærstamme MD40-4c til leucin-uavhengighet.
VLP ble fremstilt fra gjærstamme MD40-4c transformert med pMA5620-ha23 eller pMA5620 og fraksjonert på en 15-45% sucrosegradient. Fraksjoner ble kjørt på en SDS-PAGE-gel, og proteiner ble visualisert ved hjelp av Coomassie-blått (figur 11). Beliggenheten i gradienten av det på forhånd beregnede TYA-HA-sammensmeltningsprotein viste den partikkelformede natur av proteinet. Elektronmikroskopi av fraksjonene bekreftet at partikler var tilstede (figur 12).
For å bekrefte at partiklene inneholdt HA-antigener, ble fraksjonerte ekstrakter av MD40-4c inneholdende pMA5620-ha23 fra lignende gradienter, på nytt kjørt på SDS-PAGE-geler, og deretter ble adskilte proteiner elektroblottet på nitrocellulosefiltre. Et filter ble underøkt med anti-Ty-VLP-antistof f kjent for å reagere med Ty-proteiner, og
et annet filter ble undersøkt med anti-HA-antistoff. I begge tilfeller reagerte det antatte Ty:HA-sammensmeltningsprotein sterkt, noe som viste at dette protein inneholdt både Ty- og HA-epitoper (figur 13).
For å undersøke virkningsfullheten av disse hybride Ty:HA-VLP i å frembringe et immunsvar til HA, ble det dyrket et antiserum i kaniner mot konsentrerte, hybride Ty-HA-VLP renset fra ekstrakter av MD40-4c transformert med pMA5620-ha23. Dette antiserum ble deretter anvendt for å undersøke proteiner fra oppsplittede, hele influensavirus ved hjelp av Western-blotting. Tre proteinprøver ble anvendt. Den første proteinprøve besto av rensede Ty:HA-VLP anvendt for å dyrke antiserumet. Den andre proteinprøve besto av hele influensavirus PR8 (H3). Den tredje protein-prøve besto av hele influensavirus NT60 (Hl). Både PR8 og NT60 ble erholdt fra professor George Brownlee,
Sir William Dunn School of Pathology, Oxford, U.K. Figur 14 viser at anti-Ty:HA-VLP-antistoffet reagerer med HAl-området av H3-HA, men ikke med Hl-HA. Denne reaksjon kan ikke påvises med hverken pre-tappet serum eller med anti-Ty-VLP-antistof f . Som en positiv kontroll ble prøvene under-søkt med anti-helt virus-antistoff. I dette tilfelle reagerte både Hl-HA og H3-HA med antiserumet. De hybride Ty:HA-VLP bevirker dannelsen av anti-HA-antistoff spesifikt for en epitop av H3-antigen.
Disse data viser at pMA5620-ha23 styrer syntesen av et hybrid sammensmeltningsprotein sammensatt av de første 381 aminosyrer av Ty-protein pl og en liten del av et virus-protein, influensavirus HA. Dette sammensmeltningsprotein danner hybride Ty:HA-VLP. De hybride Ty:HA-VLP kan lett isoleres og presenterer de små HA-bestanddelene til kanin-immunsystemet på en slik måte .at anti-HA-antistoffer dannes. Disse antistoffer kan skjelne mellom Hl-HA og H3-HA i en Western-blot. Tydeligvis kan HA-bestanddelen av de hybride Ty:HA-VLP erstattes med enhver annen influensavirus-bestanddel eller enhver annen virusbestanddel, og det er rimelig å vente at lignende resultater vil erholdes.
Eksempel 7
For å skape en serie av avskårede TYA-gener inneholdende kontinuerlig mindre sekvens ved 3'-enden, ble en standard Bal-31-fordøyelse utført ved anvendelse av pMA5620 som startmolekylet. Plasmid pMA 5 620 ble spaltet med BamHI, fordøyd med Bal-31 flere ganger og religert under tilstede-værelse av overskudd av BamHI-linkere (CCGGATCCGG). Utslettelsesendepunktene av de dannede plasmider ble bestemt ved hjelp av DNA-sekvensanalyse. En av disse utslettelsene inneholder bare de første 2 86 kodoner av TYA og betegnes 358. De utslettede PGK-terminatorsekvenser av 358 ble erstattet ved å ligere det store PvuII-BamHI-fragment fra pMA5620 med det 680 bp PvuII-BamHI-fragment fra 358. Det dannede plasmid er betegnet pMA5620-358 (figur 15).
Interferon-alfa-2-cDNA-BamHI-fragmenter med to ube-tydelig forskjellige 3'-terminaler (IFN-8 og IFN-2; Mellor et al., 1985, Gene 33, 215; Mellor et al., 1985, Nature 313,
243) ble innføyd, i ramme, i BamHI-setene for pMA5620 og pMA5620-358, for å danne plasmider pMA5620-8 og pMA5620-358-2.
Plasmider pMA91-ll, pMA5620 og pMA5620-358 ble anvendt for å transformere gjærstamme MD40-4c til leucin-uavhengighet. De dannede transformanter ble sammenlignet med henblikk på TYA-RNA dannet fra plasmidene, og med henblikk på mengdene av pl eller avskårede pl-proteiner, som bestemt ved hjelp av Western-blotting ved anvendelse av anti-Ty-VLP-antistoff. Mengdene av RNA og protein var de samme i hver transformant.
Ekstrakter fra hver transformant ble deretter analysert ved hjelp av fraksjonering på 15-45% sucrosegradienter etterfulgt av farging med Coomassie-blått av både pMA91-ll og pMA5620, det foreligger pl eller avskårede pl-proteiner i området av gradienten som er karakteristisk for partikkelformede strukturer. For pMA5620-358 kan det imidlertid ikke observeres noe partikkelformet materiale.
Et interferon-alfa-2-cDNA ble sammensmeltet, i ramme, med hvert av plasmidene pMA5620 og pMA5620-358 for å danne plasmider pMA5620-8 og pMA5620-358-2. Disse plasmider ble anvendt for å transformere gjærstamme MD40-4c til leucin-uavhengighet, og Ty-homolog RNA og pl og pl:interferon-sammensmeltningsproteiner ble målt som beskrevet ovenfor. Nivåene av RNA og protein er de samme for begge transformanter, og også de samme som pMA5620. Når ekstrakter av gjærtransformanter inneholdende pMA5620-8 ble analysert på 15-45% sucrosegradienter, ble et 70 kD pl:interferon-sammensmeltningsprotein observert i området av gradienten som er karakteristisk for partikkelformede strukturer. Det ble imidlertid ikke observert noe partikkelformet materiale når ekstrakter som inneholdt pMA5620-358-2, ble analysert.
Således krever Ty-VLP-dannelse minst en del av sekvensen mellom aminosyrene 286 og 381. DNA og aminosyresekvensen til pl er vist i (figur 16) ,' denne figur viser også DNA og aminosyresekvensen av aminosyrene 286 til 3 81.
Eksempel 8
Enzym- immunanalysefremgangsmåte med VLP- antigen
96-brønners mikrotiterplater overtrekkes med VLP-antigen (viruslignende partikler med antigen) ved å inkubere 50 ul av 20 ug/ml VLP i 50 mM natriumcarbonatbuffer, pH 9,5, i hver brønn i to timer ved romtemperatur. Overskudd av VLP-antigen vaskes ut av brønnene ved hjelp av tre fem-minutters vaskinger med fosfatbufret, fysiologisk saltvann (PBS), pH 7,4. For å minimalisere bakgrunnsreaksjoner, blokkeres brønnene med 100 ul av 2% casein i PBS i 1 time ved romtemperatur, etterfulgt av tre fem-minutters vaskinger med PBS inneholdende 0,1% "Tween"-20 (PBS-T). Primært antistoff i en testprøve fortynnes i PBS-T inneholdende 0,5% casein (PBS-CT). En egnet fortynning kan være en tre-gangers fortynningsserie fra 1/10 til 1/7.290. Primært antistoff reagerer med den ikke-Ty-bestanddel av ethvert hybrid Ty-VLP. 50 ul fortynnet, primært antistoff tilsettes de egnede brønnene og inkuberes i to timer ved rom-
temperatur. Overskudd av primært antistoff fjernes ved tre fem-minutters vaskinger med PBS-T. Sekundært antistoff er pepperrotperoxydase-merket anti-art IgG og fortynnes 1/1.500 i PBS-CT. 50 ul fortynnet, sekundært antistoff tilsettes hver brønn og inkuberes i to timer ved romtemperatur, etterfulgt av fem fem-minutters vaskinger med PBS-T. Sub-stratet er 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin ved en konsentra-sjon på 0,1 mg/ml i 0,1 M natriumacetat, justert til pH 6,0 med 0,5 M sitronsyre, pluss 0,03% hydrogenperoxyd. 50 ul substrat tilsettes hver brønn, og fargereaksjonen utvikles i 10 minutter. Reaksjonen avsluttes ved tilsetning av 25 ul 0,5 M svovelsyre til hver brønn. Fargeutvikling fastsettes ved måling ved 450 nm ved anvendelse av en mikroplate-avleser. På denne måte utføres en direkte bestemmelse av det primære antistoff i testprøven.
Eksempel 9
Spaltning av exogent protein fra hybride TY- VLP
I situasjoner hvor hybride Ty-VLP anvendes for å rense pl-sammensmeltningsproteiner, er det fordelaktig å fjerne sammensmeltningsproteinets pl-bestanddel for å etterlate den exogene eller ikke-pl-bestanddel. Dette krever spaltning ved koblingspunktet for pl-sekvensen og ikke-pl-sekvensen. Dette tilveiebringer en måte for anvendelse av Ty-VLP for å fremstille autentiske proteiner. En måte for å oppnå dette mål er å innføre et spesifikt, proteolytisk spaltningssete ved pl/ikke-pl-koblingen.
For å fremstille ikke-sammensmeltningsinterferon
fra Ty-VLP, ble et derivat av pMA5020, betegnet pMA5623, fremstilt. Dette er identisk med pMA5620 med unntak av at ved kodon 381 i TYA tilføres ytterligere fire kodoner før BamHI-linkeren. Disse kodoner koder for aminosyresekvensen Ile-Glu-Gly-Arg som er et spaltningssete for blodkoagula-sjonsfaktoren Xa (Nagai & Thogersen, 1984, Nature, 309, 810). Koblingsområdet for en konstruksjon analog med pMA5620-8, pMA5623-8, er som følger:
Når pMA5623-8 transformeres inn i gjærstamme MD40-4c, fremstilles et pl:IFN-sammensmeltningsprotein som samler seg til hybride IFN:Ty-VLP. I kontrast med transformanter som inneholder pMA5620-8, medfører imidlertid inkubasjon av det partikkelformede sammensmeltningsprotein med bovin blodfaktor Xa en spaltning av interferonet fra partiklene på grunn av tilstedeværelsen av spaltningssetet ved proteinets sammensmeltnings-koblingssted.
Hybride IFN-Ty-VLP renses derfor fra ikke-partikkelformede proteiner ved hjelp av en første serie sucrose-tetthetsgradientfraksjonering, som beskrevet tidligere.
IFN spaltes deretter av og renses fra det partikkelformede pl-protein ved hjelp av en andre serie sucrose-tetthets-gradientfraksjonering for å erholde rent, "autentisk" interferon.
Interferonets kodingssekvens illustrert i dette eksempel, kan erstattes med enhver annen kodingssekvens, og således kan denne strategi anvendes for å uttrykke og rense ethvert protein.
Claims (14)
1. Fremgangsmåte for fremstilling av et fusjonsprotein som er i stand til spontant å sammensettes til en partikkel, hvor fusjonsproteinet omfatter en første aminosyresekvens og en biologisk aktiv andre aminosyresekvens, hvori første aminosyresekvens er et partikkeldannende protein kodet av et retrotransposon eller et RNA-retrovirus, og hvori, hvis den andre aminosyresekvens inneholder mer enn 30 aminosyrerester, de første 30 rester av den andre aminosyresekvens ikke danner en aminosyresekvens naturlig direkte fusjonert til den første aminosyresekvens av angitte retrotransposon eller RNA-retrovirus,
karakterisert ved at (a) det fremstilles en ekspresjonsvektor inneholdende nukleinsyre omfattende en første nukleotidsekvens og en andre nukleotidsekvens, hvori den første nukleotidsekvens er komplementær til genetisk materiale i et retrotransposon eller RNA-retrovirus som koder et partikkeldannende protein, hvori den andre nukleotidsekvens koder, eller er komplementær til, en nukleotidsekvens som koder den andre aminosyresekvens, og hvori vektoren er valgt slik at nukleinsyresekvensen er i stand til å bli uttrykt i en enkelt leseramme, og hvori nukleinsyren eventuelt omfatter en nukleotidsekvens som koder for et spesifikt proteolytisk spaltingssete i sammenknytningspunk-tet mellom den første og den andre nukleotidsekvens; (b) en vert transfekteres eller transformeres med ekspresj onsvektoren; (c) fusjonsproteinet uttrykkes i verten; og (d) det uttrykte fusjonsprotein får danne partikler spontant;
hvor fremgangsmåten eventuelt videre omfatter ett av eller begge av de følgende trinn: (e) partiklene renses ved sukrosedensitetsgradientsentrifugering; og/eller (f) dersom det proteolytiske spaltingssete er til stede, den partikkeldannende sekvens spaltes fra fusjonsproteinet under anvendelse av et enzym som er spesifikt for det proteolytiske spaltingssete, og det spaltede, biologisk aktive protein renses ved sukrosedensitetsgradientsentrifugering.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at retrotransposonet er gjærretrotransposon Ty eller et "copia"-lignende elememt.
3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at den Ty-kodede aminosyresekvens er pl-proteinet kodet av TYA-genet.
4. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at den Ty-kodede aminosyresekvens er en del av pl-proteinet kodet av en del av TYA-genet, hvilken del er i stand til å styre syntesen av Ty-viruslignende partikler (Ty-VLP).
5. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at den Ty-kodede aminosyresekvens er avledbar fra Tyl-15.
6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at partikkelen dannes fra et flertall av fusjonsproteiner.
7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at partikkelen dannes fra fusjonsproteiner hvori de andre aminosyresekvenser ikke alle er de samme som hverandre.
8. Nukleinsyre omfattende en første nukleotidsekvens og en andre nukleotidsekvens, hvor sekvensene til sammen koder for et fusjonsprotein som er i stand til spontant å danne en partikkel,
karakterisert ved at den første nukleotidsekvens er komplementær til genetisk materiale i et retrotransposon eller RNA-retrovirus som koder for et partikkeldannende protein, hvori den andre nukleotidsekvens koder for eller er komplementær til en nukleotidsekvens som koder for en annen aminosyresekvens, idet nukleinsyren er i stand til å bli uttrykt i en enkelt leseramme for å danne et fusjonsprotein som ikke naturlig fremstilles av angitte retrotransposon eller RNA-retrovirus, og hvori, hvis den andre nukleotidsekvens inneholder mer enn 90 baser, at de første 90 baser ikke danner en nukleotidsekvens uttrykt som en del av et fusjonsprotein naturlig produsert av retrotransposonet eller RNA-retroviruset, hvori den første og den andre nukleotidsekvens eventuelt er bundet av en tredje nukleotidsekvens som koder for et proteolytisk spaltingssete i fusjonsproteinet.
9. Nukleinsyre,
karakterisert ved at den koder for et fusjonsprotein fremstilt ved fremgangsmåten ifølge krav 1.
10. Ekspresjonsvektor,
karakterisert ved at den omfatter nukleinsyre ifølge krav 8 og er i stand til å uttrykke nukleinsyren.
11. Ekspresjonsvektor ifølge krav 10, karakterisert ved at den er valgt fra klassen bestående av bakterie-, gjær-, pattedyr- og insektekspresjons-vektorer.
12. Ekspresjonsvektor ifølge krav 11, karakterisert ved at den inneholder et derivat av TYA-genet med et restriksjonsenzymspaltingssete innen TYA-genet, i hvilket er innskutt den andre nukleotidsekvens.
13. Ekspresjonsvektor ifølge krav 11, karakterisert ved at den inneholder de første 381 kodoner av TYA-genet.
14. Vertscelle,
karakterisert ved at den er valgt fra klassen bestående av bakterie-, gjær-, pattedyr- og insektceller innbefattende en ekspresjonsvektor ifølge krav 10, og er i stand til å uttrykke det angitte gen.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB868626148A GB8626148D0 (en) | 1986-11-01 | 1986-11-01 | Antigen presentation & purification system |
| GB878708531A GB8708531D0 (en) | 1987-04-09 | 1987-04-09 | Fusion proteins & particles |
| US07/036,807 US5041385A (en) | 1986-11-01 | 1987-04-10 | Vector expressing fusion proteins and particles |
| PCT/GB1987/000764 WO1988003563A1 (en) | 1986-11-01 | 1987-10-28 | Fusion proteins and particles |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO882917D0 NO882917D0 (no) | 1988-06-30 |
| NO882917L NO882917L (no) | 1988-08-29 |
| NO177793B true NO177793B (no) | 1995-08-14 |
| NO177793C NO177793C (no) | 1995-11-22 |
Family
ID=27263194
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO882917A NO177793C (no) | 1986-11-01 | 1988-06-30 | Fremgangsmåte for fremstilling av et fusjonsprotein, samt nukleinsyre, ekspresjonsvektor og vertscelle som kan anvendes ved fremgangsmåten |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0330661B1 (no) |
| JP (2) | JP2708046B2 (no) |
| AU (1) | AU606896B2 (no) |
| CA (1) | CA1339263C (no) |
| DE (1) | DE3788807T2 (no) |
| ES (1) | ES2010231A6 (no) |
| NO (1) | NO177793C (no) |
| WO (1) | WO1988003563A1 (no) |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3788806T2 (de) * | 1986-11-01 | 1994-07-07 | British Bio Technology | Kugelförmige hybrid-hiv-antigene. |
| US5631154A (en) * | 1988-06-10 | 1997-05-20 | Therion Biologics, Incorporated | Self assembled, defective, non-self-propagating lentivirus particles |
| US5614404A (en) * | 1988-06-10 | 1997-03-25 | Theriod Biologics, Incorporated | Self-assembled, defective, non-self-propagating lentivirus particles |
| US5747324A (en) * | 1988-06-10 | 1998-05-05 | Therion Biologics Corporation | Self-assembled, defective, non-self-propagating lentivirus particles |
| WO1990005787A1 (en) * | 1988-11-23 | 1990-05-31 | The Regents Of The University Of California | Position-specific insertion vectors and method of using same |
| CA2016897A1 (en) * | 1989-05-17 | 1990-11-17 | John W. Wills | Retrovirus-mediated secretion of recombinant products |
| WO1990015133A1 (en) * | 1989-05-30 | 1990-12-13 | Nippon Zeon Co., Ltd. | Method of producing core structure of retro virus and particle produced thereby |
| AU5848390A (en) * | 1989-06-01 | 1991-01-07 | Applied Biotechnology, Inc. | Self-assembled, defective, non-self-propagating viral particles |
| WO1991019803A1 (en) * | 1990-06-19 | 1991-12-26 | Applied Biotechnology, Incorporated | Self assembled, defective, nonself-propagating viral particles |
| GB9107631D0 (en) * | 1991-04-10 | 1991-05-29 | British Bio Technology | Proteinaceous particles |
| GB9223084D0 (en) * | 1992-11-04 | 1992-12-16 | Imp Cancer Res Tech | Compounds to target cells |
| FR2703996B1 (fr) * | 1993-04-16 | 1995-07-21 | Transgene Sa | Ensemble de transposition destine au transfert d'un gene d'interet dans le genome d'une cellule eucaryote. |
| US7476517B2 (en) | 1999-06-30 | 2009-01-13 | Evotec Ag | Virus like particles, their preparation and their use preferably in pharmaceutical screening and functional genomics |
| US20040014033A1 (en) | 1999-06-30 | 2004-01-22 | Evotec Biosystems Ag, A Corporation Of Germany | Virus like particles, their preparation and their use preferably in pharmaceutical screening and functional genomics |
| WO2001002551A2 (en) * | 1999-06-30 | 2001-01-11 | Evotec Oai Ag | Virus like particles, preparation and use in screening and functional genomics |
| DE60037263T2 (de) * | 2000-12-29 | 2008-10-09 | Evotec Ag | Virus-ähnliche Partikel, ihre Herstellung und ihre Verwendung beim pharmazeutischen Screening und funktionelle Genomanwendungen |
| FI116198B (fi) | 2001-07-16 | 2005-10-14 | Valtion Teknillinen | Polypeptidien immobilisointimenetelmä |
| LT5414B (lt) | 2005-04-13 | 2007-04-25 | Biotechnologijos Institutas | Monokloninių antikūnų gavimo būdas, hibridomos, gautos šiuo būdu ir rekombinantinės chimerinės į virusus panašios dalelės su įterptais kitų baltymų fragmentais kaip imunogenai hibridomų gavimui šiuo būdu |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8324800D0 (en) * | 1983-09-15 | 1983-10-19 | Pasteur Institut | Antigens |
| JPS6193199A (ja) * | 1984-10-13 | 1986-05-12 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 抗インタ−フエロン−γモノクロ−ナル抗体 |
-
1987
- 1987-10-28 JP JP62506664A patent/JP2708046B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1987-10-28 WO PCT/GB1987/000764 patent/WO1988003563A1/en active IP Right Grant
- 1987-10-28 EP EP87906926A patent/EP0330661B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-10-28 AU AU81057/87A patent/AU606896B2/en not_active Ceased
- 1987-10-28 DE DE3788807T patent/DE3788807T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1987-10-30 ES ES878703105A patent/ES2010231A6/es not_active Expired
- 1987-10-30 CA CA000550668A patent/CA1339263C/en not_active Expired - Fee Related
-
1988
- 1988-06-30 NO NO882917A patent/NO177793C/no not_active IP Right Cessation
-
1996
- 1996-05-23 JP JP8128724A patent/JPH09248191A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO882917D0 (no) | 1988-06-30 |
| DE3788807D1 (de) | 1994-02-24 |
| CA1339263C (en) | 1997-08-12 |
| JPH09248191A (ja) | 1997-09-22 |
| ES2010231A6 (es) | 1989-11-01 |
| NO177793C (no) | 1995-11-22 |
| DE3788807T2 (de) | 1994-06-30 |
| EP0330661B1 (en) | 1994-01-12 |
| JPH02501026A (ja) | 1990-04-12 |
| AU606896B2 (en) | 1991-02-21 |
| JP2708046B2 (ja) | 1998-02-04 |
| WO1988003563A1 (en) | 1988-05-19 |
| NO882917L (no) | 1988-08-29 |
| EP0330661A1 (en) | 1989-09-06 |
| AU8105787A (en) | 1988-06-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5463024A (en) | Fusion proteins and particles | |
| US4918166A (en) | Particulate hybrid HIV antigens | |
| NO177793B (no) | Fremgangsmåte for fremstilling av et fusjonsprotein, samt nukleinsyre, ekspresjonsvektor og vertscelle som kan anvendes ved fremgangsmåten | |
| US6060064A (en) | Chimeric virus-like particle antigen presentation and delivery system | |
| CA2025598C (en) | Chimaeric hepadnavirus core antigen proteins | |
| US20100143406A1 (en) | Methods of enhancing protein incorporation into virus like particles | |
| CA2084180A1 (en) | Expression of specific immunogens using viral antigens | |
| EP0329671B1 (en) | Particulate hybrid hiv antigens | |
| Gedvilaite et al. | Segments of puumala hantavirus nucleocapsid protein inserted into chimeric polyomavirus-derived virus-like particles induce a strong immune response in mice | |
| Tagliamonte et al. | HIV-Gag VLPs presenting trimeric HIV-1 gp140 spikes constitutively expressed in stable double transfected insect cell line | |
| JPH1059868A (ja) | Ａｉｄｓの原因ウィルスの糖蛋白質からなるワクチン | |
| KR0172970B1 (ko) | Aids백신에 유용한 키메릭 단백 및 그의 제조방법 | |
| AU626288B2 (en) | Gene expression system (particularly for rotavirus vp7 protein) involving a foreign signal peptide and optionally a transmembrane anchor sequence | |
| CN116041448A (zh) | 新型冠状病毒免疫原性物质、其制备方法和应用 | |
| US5077213A (en) | Recombinant vaccinia virus | |
| DK172990B1 (da) | Fusionsprotein, partikler omfattende dette, vaccine omfattende sådanne partikler, nukleinsyre, som koder for fusionsprotei | |
| US20200109176A1 (en) | Compositions And Methods For Making And Using Virus-Like Particles (VLPs) | |
| CN116063573A (zh) | 一种包含猪瘟病毒E2蛋白和猪圆环病毒2型Cap蛋白的融合蛋白及二联亚单位疫苗 | |
| CN116199791A (zh) | 无外源基序甲型流感病毒h1柄部三聚体蛋白的改造方法 | |
| Kang | Vaccine production by recombinant DNA technology. | |
| WO1993021332A1 (en) | Hybrid particles |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |
Free format text: LAPSED IN APRIL 2003 |