CN116199791A - 无外源基序甲型流感病毒h1柄部三聚体蛋白的改造方法 - Google Patents

无外源基序甲型流感病毒h1柄部三聚体蛋白的改造方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，本发明的改造方法包括将甲型流感病毒H1的信号肽序列置换成表达系统的信号肽序列，去掉形成血凝素头部区域的氨基酸序列并在其去掉后的缺失空间引入氨基酸交联序列，使用酶切位点和纯化标签替换C端跨膜区和胞内区氨基酸序列，再采用氨基酸点突变进行蛋白质界面改造，并依据昆虫细胞宿主优化密码子，合成pfastbac载体中，获得带有甲型流感病毒血凝素序列的重组质粒；利用表达系统表达H1柄部蛋白质。本发明通过去掉流感病毒H1头部区域氨基酸序列，再改造血凝素H1柄部氨基酸序列，其不需要外源基序，就可以获得三聚体纯度明显大幅提升、且能够自发的稳定表达的血凝素柄部重组蛋白突变体。

Description

无外源基序甲型流感病毒H1柄部三聚体蛋白的改造方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种无外源基序甲型流感病毒H1柄部三聚体蛋白的改造方法。
背景技术
流感病毒属于正黏病毒科，分为甲、乙、丙、丁四型。甲型流感病毒不仅引起季节性流感感染，还能够通过抗原转换产生新型流感大流行毒株。甲型流感病毒囊膜上的主要糖蛋白血凝素(HA)，负责结合宿主细胞表面受体唾液酸分子，介导病毒侵入宿主细胞。血凝素是研制流感疫苗的主要抗原靶点，血凝素特异性抗体反应的病毒中和效果是评价流感疫苗效力的重要指标。
接种疫苗仍是预防流感病毒感染的最经济有效的途径。传统季节性流感疫苗主要通过诱导血凝素头部特异性中和抗体来提供免疫保护作用，疫苗诱导的免疫保护效果往往只对血凝素头部抗原性匹配的流感毒株提供病毒中和作用。但由于流感病毒血凝素头部高度突变，使得传统季节性流感疫苗保护效率不稳定，不同年份的疫苗免疫保护效率变化范围大约为10％至60％。
研制广谱流感疫苗是流感疫苗研究的热点研究方向。近年来研究发现血凝素柄部区域氨基酸序列和构象相对头部保守得多，该区域的抗原表位诱导的交叉反应性中和抗体能够较大提升交叉免疫保护范围。大量研究表明通过理性设计改造疫苗免疫原能够有效提高流感疫苗免疫原特异性免疫反应的交叉免疫保护作用。我们于2021年9月提交的专利申请号为CN202111069035.7的发明专利已证实稳定血凝素胞外域三聚体和维持表面天然抗原性能够显著提升交叉免疫保护作用，改造后的血凝素胞外域改造蛋白能够提升与识别跨单体抗原表位的单克隆抗体的结合能力，因此，我们推测交叉免疫保护作用提升与增强的柄部抗体反应有关。成功设计只包含血凝素柄部的免疫原并维持其天然抗原性，将避免头部特异性免疫反应的干扰，集中免疫诱导血凝素柄部特异性抗体反应，增强广谱免疫保护。
首先保持可分泌表达的血凝素重组蛋白质的三聚体状态有助于提升蛋白质的天然抗原性。大量研究报道利用外源三聚体基序，例如GCN4、T4 fibritin foldon等，或利用Ferritin纳米颗粒结构支架来辅助去头血凝素柄部蛋白质形成三聚体，能够维持部分天然抗原性。相关动物免疫实验结果表明接种优化后的重组血凝素柄部作为疫苗免疫原能够有效诱导特异性免疫反应和交叉免疫保护。但该类疫苗免疫原也会有效诱导外源基序和蛋白质支架的特异性免疫反应，在人体内诱导这些免疫反应可能带来未知风险。如果可分泌表达的去头血凝素柄部蛋白质能够在没有其他外源基序存在的情况下仍能够稳定地形成三聚体并维持整体的天然抗原性，这样的血凝素柄部蛋白质将会是更优化的候选流感疫苗免疫原。基于蛋白质结构分析和设计三聚体界面，引入氨基酸突变促进界面相互作用，将可能实现稳定的三聚体状态。
发明内容
鉴于目前基于流感病毒血凝素柄部结构域研制广谱流感疫苗免疫原存在的上述不足，本发明提供一种甲型流感病毒血凝素柄部三聚体蛋白质的改造方法，从甲型流感病毒H1N1毒株的血凝素胞外区的氨基酸序列开始理性设计迭代改造血凝素H1柄部蛋白质，通过去除H1头部并在合适位点引入氨基酸点突变从而获得了三聚体纯度明显大幅提升、且能够自发的稳定表达的血凝素H1柄部重组蛋白突变体。
为了达到上述目的，本发明提供一种无外源基序甲型流感病毒H1柄部三聚体蛋白质的改造方法，具体包括：
步骤1：将甲型流感病毒H1的信号肽序列置换成表达系统的信号肽序列，去掉形成血凝素头部区域的氨基酸序列并在其去掉后的缺失空间引入氨基酸交联序列，使用酶切位点和纯化标签替换C端跨膜区和胞内区部分氨基酸序列，再采用氨基酸点突变进行蛋白质界面改造，并依据昆虫细胞宿主优化密码子，利用pfastbac质粒载体多克隆位点将优化改造的H1柄部的编码核酸序列合成在质粒开放阅读框中，获得带有编码甲型流感病毒H1柄部核酸序列的重组质粒；
步骤2：利用表达系统表达所述重组质粒并纯化，获得可稳定表达的无外源基序甲型流感病毒H1柄部三聚体蛋白质；
其中，所述表达系统包括基因工程改造或驯化的贴壁或悬浮培养的昆虫细胞表达系统或哺乳动物真核细胞表达系统中的任意一种。
依照本发明的一个方面，所述甲型流感病毒H1包括与毒株A/New Caledonia/20/1999(H1N1)的H1氨基酸序列具有89％以上同源性的H1。
依照本发明的一个方面，所述去掉形成血凝素头部区域的氨基酸序列为HA1/X1至HA1/X2的的氨基酸序列；其中，X1位点可以为D35或S36；X2位点可以为C302、P303、K304或L289；所述氨基酸交联序列为3-5个氨基酸组成的短肽，所述短肽中的氨基酸包含G、T、S、P、A中的一种或多种。
依照本发明的一个方面，所述酶切位点包括：Factor Xa切割位点、凝血酶裂解位点、HRV3C蛋白酶切位点、TEV蛋白酶切位点、肠激酶切位点、SUNO蛋白酶切位点中的至少一种；所述纯化标签包括6×His标签、HA标签、FLAG标签、谷胱甘肽巯基转移酶标签、麦芽糖结合蛋白标签、NusA标签、SUMO标签、Strep-tag标签中的至少一种。
依照本发明的一个方面，所述甲型流感病毒H1柄部的氨基酸点突变的对应突变点包括HA1/R326、HA1/I320、HA1/I323、HA2/F63、HA2/V66、HA2/L73、HA1/L20、HA1/R307、HA2/G1、HA2/G47、HA2/T93、HA2/S124、HA2/N95和HA2/M77。
依照本发明的一个方面，所述甲型流感病毒H1柄部的氨基酸点突变包括HA1/R326X3、HA1/I320X4、HA1/I323X5、HA2/F63Y、HA2/V66X6、HA2/L73X7、HA1/L20C、HA1/R307C、HA2/G1C、HA2/G47C、HA2/T93C、HA2/S124C、HA2/N95X8、HA2/M77X9；其中，所述X3可以为N或Q；所述X4可以为V、N、D或K；所述X5可以为K、R、Q或N；所述X6可以为A、I或T；所述X7可以为S、E、D、G或N；所述X8可以为W、I、L、F或A；所述X9可以为F、L、Y、I、W或A。
依照本发明的一个方面，所述替换C端跨膜区和胞内区氨基酸序列为从HA2/L187至HA2/I222的氨基酸序列；当所述表达系统为昆虫细胞表达系统时，所述表达系统的信号肽序列为MKFLVNVALVFMVVYISYIYA，所述利用表达系统表达所述重组质粒并纯化具体为：利用bac-to-bac昆虫杆状病毒表达系统表达所述重组质粒并纯化，获得可稳定表达的无外源基序甲型流感病毒H1柄部三聚体蛋白质。
依照本发明的一个方面，所述利用bac-to-bac昆虫杆状病毒表达系统表达所述重组质粒并纯化，获得可稳定表达的无外源基序甲型流感病毒H1柄部三聚体蛋白质的过程具体包括：
将带有编码甲型流感病毒H1柄部核酸序列的重组质粒转化到DH10Bac宿主菌获得改造bacmid，将bacmid转染静置培养的昆虫细胞sf9制备P1代改造杆状病毒，将0.3ml P1改造杆状病毒加入20ml生长期状态密度为1×106～2×106ml-1的sf9细胞，制备病毒滴度更高的P2代改造杆状病毒，利用P2改造杆状病毒感染较大体积sf9细胞培养物表达H1突变体改造蛋白；
收集上清液，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法、考马斯亮蓝染色法、Western blotfang法检测并确定带有甲型流感病毒血凝素序列的重组质粒的表达情况和三聚体状态，离心上清液后，通过Ni-NTA树脂亲和纯化法和尺寸排阻色谱法纯化获得可稳定表达的无外源基序甲型流感病毒H1柄部三聚体蛋白质。
依照本发明的一个方面，所述无外源基序甲型流感病毒H1柄部三聚体蛋白质的氨基酸序列包含如SEQ ID 4-8所示；所述无外源基序甲型流感病毒H1柄部三聚体蛋白质的氨基酸序列还包含如SEQ ID 4-8所示。
基于同一发明构思，本发明还公开了上述任一改造方法获得的无外源基序甲型流感病毒H1柄部三聚体蛋白质，所述蛋白质应用于构建其他融合蛋白质形成三聚体。
本发明的有益效果：本发明利用昆虫细胞表达系统或哺乳动物真核细胞表达系统表达重组血凝素蛋白。首先将血凝素分泌信号肽替换为对应表达系统的分泌信号肽；并基于血凝素蛋白质结构分析结果，去掉主要形成血凝素头部区域的氨基酸序列并引入交联序列替换被去掉的头部序列来填补缺失的空间位置；随后使用酶切位点和纯化标签替换H1跨膜区和胞内区的部分氨基酸序列，使得重组蛋白能够分泌表达；再通过引入氨基酸点突变消除融合肽酶切位点、增强重组蛋白质亲水属性、形成二硫键和增强三聚体界面相互作用并能够稳定三聚体结构和重组蛋白质表达产量，最终获得三聚体纯度明显大幅提升、且能够自发的稳定表达的血凝素柄部重组蛋白突变体。
附图说明
图1为本发明实施例所述的A/New Caledonia/20/1999(H1N1)毒株的全长血凝素H1氨基酸序列的分泌信号肽替换为蜂毒素分泌信号肽后的HA1、HA2以及对应的位点序号的示意图；
图2为本发明实施例所述的Western blot分析非还原状态下的迭代改造获得的H1柄部突变体蛋白质H1 stem-1、H1 stem-2、H1 stem-3、H1 stem-4和H1 stem-5的情况；
图3(a)为本发明实施例所述的AKTA蛋白质纯化仪串联Superdex 200Increase10/300GL(Cytiva)尺寸排阻色谱柱纯化H1 stem-1显示的单波长280nm紫外吸光值曲线；图3(b)为AKTA蛋白质纯化仪串联Superdex 200Increase 10/300GL(Cytiva)尺寸排阻色谱柱纯化H1 stem-2显示的单波长280nm紫外吸光值曲线；
图4(a)为本发明实施例所述的非还原状态下SDS-PAGE凝胶电泳和考马斯蓝染色分析H1 stem-1(#1)和H1 stem-2(#2)的情况；图4(b)为本发明实施例所述的还原状态下SDS-PAGE凝胶电泳和考马斯蓝染色分析H1 stem-1(#3)和H1 stem-2(#4)的情况；
图5(a)为本发明实施例所述ELISA方法检测到H1 stem-1、H1 stem-2、H1 stem-3、H1 stem-4和H1 stem-5与流感病毒血凝素特异性广谱单克隆抗体CT149的结合能力情况；图5(b)为本发明实施例所述ELISA方法检测到H1 stem-1、H1 stem-2、H1 stem-3、H1 stem-4和H1 stem-5与流感病毒血凝素特异性广谱单克隆抗体3I14的结合能力情况；图5(c)为本发明实施例所述ELISA方法检测到H1 stem-1、H1 stem-2、H1 stem-3、H1 stem-4和H1stem-5与流感病毒血凝素特异性广谱单克隆抗体FISW84的结合能力情况；图5(d)为本发明实施例所述ELISA方法检测到H1 stem-1、H1 stem-2、H1 stem-3、H1 stem-4和H1 stem-5与流感病毒血凝素特异性广谱单克隆抗体CR9114的结合能力情况；图5(e)为本发明实施例所述ELISA方法检测到H1 stem-1、H1 stem-2、H1 stem-3、H1 stem-4和H1 stem-5与流感病毒血凝素特异性广谱单克隆抗体CR6261的结合能力情况。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另有定义，下文所用专业术语和本领域专业技术人员所理解的含义一致；除非特殊说明，本文所涉及的原料、试剂均可从市场购买，或通过公知的方法制得。
应当理解，当在本申请说明书和所附权利要求书中使用时，术语“包括”指示所描述特征、整体、步骤、操作、元素和/或组件的存在，但并不排除一个或多个其它特征、整体、步骤、操作、元素、组件和/或其集合的存在或添加。
在本申请说明书中描述的参考“一个实施例”或“一些实施例”等意味着在本申请的一个或多个实施例中包括结合该实施例描述的特定特征、结构或特点。由此，在本说明书中的不同之处出现的语句“在一个实施例中”、“在一些实施例中”、“在其他一些实施例中”、“在另外一些实施例中”等不是必然都参考相同的实施例，而是意味着“一个或多个但不是所有的实施例”，除非是以其他方式另外特别强调。术语“包括”、“包含”、“具有”及它们的变形都意味着“包括但不限于”，除非是以其他方式另外特别强调。
在本申请中，术语“蛋白”和“蛋白质”可互换使用。术语“外源基序”和“外源三聚体基序”可互换使用。术语“H1”与“血凝素H1”可互换。
需要说明的是，血凝素简称HA，H1为血凝素(HA)的其中一种亚型。
需要说明的是，本申请的A/NewCaledonia/20/1999(H1N1)毒株的全长HA核苷酸序列由擎科生物公司合成，其对应的氨基酸序列如图1所示；DH10Bac宿主菌购自Invitrogen；sf9细胞购自ATCC。
需要说明的是，本申请所有的氨基酸均采用单字母表示，下表1展示了本申请示例性的氨基酸对应的英文名称、三字母缩写和单字母。
表1氨基酸的英文名称、三字母缩写和单字母
Figure BDA0004064313410000061
Figure BDA0004064313410000071
需要说明的是，本申请的位点表示法和点突变表示法为本领域的通用表示方法。本申请的位点“HA2/M77”表示如图1所示的HA2的第77个对应的M(甲硫氨酸)，其它类似的描述同理；本申请的点突变“HA2/M77I”表示如图1所示的HA2的第77个对应的M(甲硫氨酸)突变成I(异亮氨酸)，其它类似的描述同理。
由于流感病毒血凝素头部高度突变，使得传统季节性流感疫苗保护效率不稳定，不同年份的疫苗免疫保护效率变化范围大约为10％至60％；存在外源三聚体基序或纳米颗粒结构支架的疫苗免疫原也会有效诱导外源基序和蛋白质支架的特异性免疫反应，在人体内诱导这些免疫反应可能带来未知风险。
针对上述问题，本发明利用昆虫细胞表达系统或哺乳动物真核细胞表达系统表达重组血凝素蛋白。首先将血凝素分泌信号肽替换为对应表达系统的分泌信号肽；并基于血凝素蛋白质结构分析结果，去掉主要形成血凝素头部区域的氨基酸序列并引入交联序列替换被去掉的头部序列来填补缺失的空间位置；随后使用酶切位点和纯化标签替换H1跨膜区和胞内区的部分氨基酸序列，使得重组蛋白能够分泌表达；再通过引入氨基酸点突变消除融合肽酶切位点、增强重组蛋白质亲水属性、形成二硫键和增强三聚体界面相互作用并能够稳定三聚体结构和重组蛋白质表达产量，最终获得三聚体纯度明显大幅提升、且能够自发的稳定表达的血凝素柄部重组蛋白突变体。
下面将进一步阐述。
本申请实施例提供了一种甲型流感病毒血凝素柄部三聚体蛋白质的改造方法，具体包括以下步骤：
步骤1：将甲型流感病毒H1的信号肽序列置换成表达系统的信号肽序列，去掉形成血凝素头部区域的氨基酸序列并在其去掉后的缺失空间引入氨基酸交联序列，使用酶切位点和纯化标签替换C端跨膜区和胞内区部分氨基酸序列，再采用氨基酸点突变进行蛋白质界面改造，并依据昆虫细胞宿主优化密码子，利用pfastbac质粒载体多克隆位点将优化改造的H1柄部的编码核酸序列合成在质粒开放阅读框中，获得带有编码甲型流感病毒H1柄部核酸序列的重组质粒；
步骤2：利用表达系统表达所述重组质粒并纯化，获得可稳定表达的无外源基序甲型流感病毒H1柄部三聚体蛋白质；
其中，所述表达系统包括基因工程改造或驯化的贴壁或悬浮培养的昆虫细胞表达系统或哺乳动物真核细胞表达系统中的任意一种。
示例性的，哺乳动物真核细胞可以为Madin-Darby犬肾细胞(Madin-Darby CanineKidney，MDCK)、人胚胎肾细胞(Human embryonic kidney，HEK)HEK293或中国仓鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary，CHO)细胞。
在本申请的一些实施例中，氨基酸点突变是通过使用
Figure BDA0004064313410000081
Site-DirectedMutagenesis Kit来完成所有点突变需求。点突变实验步骤参照上述试剂盒(NEB，CatNo.E0554)。
在本申请的一些实施例中，所述甲型流感病毒H1包括与毒株A/New Caledonia/20/1999(H1N1)的H1氨基酸序列具有89％以上同源性的H1。
在本申请的一些实施例中，所述去掉形成血凝素头部区域的氨基酸序列为HA1/X1至HA1/X2的的氨基酸序列；其中，X1位点可以为D35或S36；X2位点可以为C302、P303、K304或L289。
在本申请的一些实施例中，所述氨基酸交联序列为3-5个氨基酸组成的短肽，所述短肽中的氨基酸包含G、T、S、P、A中的一种或多种。
在本申请的一些实施例中，所述酶切位点包括：FactorXa切割位点、凝血酶裂解位点、HRV3C蛋白酶切位点、TEV蛋白酶切位点、肠激酶切位点、SUNO蛋白酶切位点中的至少一种；所述纯化标签包括6×His标签、HA标签、FLAG标签、谷胱甘肽巯基转移酶标签、麦芽糖结合蛋白标签、NusA标签、SUMO标签、Strep-tag标签中的至少一种。
在本申请的一些实施例中，所述甲型流感病毒H1柄部的氨基酸点突变的对应突变点包括HA1/R326、HA1/I320、HA1/I323、HA2/F63、HA2/V66、HA2/L73、HA1/L20、HA1/R307、HA2/G1、HA2/G47、HA2/T93、HA2/S124、HA2/N95和HA2/M77。
需要说明的是，本申请的上述突变点是固定的，但本申请的上述点突变不是固定的，即上述突变点具体突变成哪种氨基酸不是固定的。
在本申请的一些实施例中，所述甲型流感病毒H1柄部的氨基酸点突变包括HA1/R326X3、HA1/I320X4、HA1/I323X5、HA2/F63Y、HA2/V66X6、HA2/L73X7、HA1/L20C、HA1/R307C、HA2/G1C、HA2/G47C、HA2/T93C、HA2/S124C、HA2/N95X8、HA2/M77X9；其中，所述X3可以为N或Q；所述X4可以为V、N、D或K；所述X5可以为K、R、Q或N；所述X6可以为A、I或T；所述X7可以为S、E、D、G或N；所述X8可以为W、I、L、F或A；所述X9可以为F、L、Y、I、W或A。
需要说明的是，本申请的上述突变点是固定的，但本申请的上述点突变不是固定的，即上述突变点具体突变成哪种氨基酸不是固定的。如与上述点突变的1-3个点突变不同，且在此基础上增加一些非上述的突变点进行突变也属于本申请的保护范围(也可实现相同的技术效果)。
在本申请的一些实施例中，所述替换C端跨膜区和胞内区氨基酸序列为从HA2/L187至HA2/I222的氨基酸序列；当所述表达系统为昆虫细胞表达系统时，所述表达系统的信号肽序列为MKFLVNVALVFMVVYISYIYA，所述利用表达系统表达所述重组质粒并纯化具体为：利用bac-to-bac昆虫杆状病毒表达系统表达所述重组质粒并纯化，获得可稳定表达的无外源基序甲型流感病毒H1柄部三聚体蛋白质。
在本申请的一些实施例中，所述利用bac-to-bac昆虫杆状病毒表达系统表达所述重组质粒并纯化，获得可稳定表达的无外源基序甲型流感病毒H1柄部三聚体蛋白质的过程具体包括：
将带有编码甲型流感病毒H1柄部核酸序列的重组质粒转化到DH10Bac宿主菌获得改造bacmid，将bacmid转染静置培养的昆虫细胞sf9制备P1代改造杆状病毒，将0.3ml P1改造杆状病毒加入20ml生长期状态密度为1×106～2×106ml-1的sf9细胞，制备病毒滴度更高的P2代改造杆状病毒，利用P2改造杆状病毒感染较大体积sf9细胞培养物表达H1突变体改造蛋白；
收集上清液，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法、考马斯亮蓝染色法、Western blotfang法检测并确定带有甲型流感病毒血凝素序列的重组质粒的表达情况和三聚体状态，离心上清液后，通过Ni-NTA树脂亲和纯化法和尺寸排阻色谱法纯化获得可稳定表达的无外源基序甲型流感病毒H1柄部三聚体蛋白质。
在本申请的一些实施例中，所述无外源基序甲型流感病毒H1柄部三聚体蛋白质的氨基酸序列包含如SEQ ID 4-8所示。
需要说明的是，本申请的无外源基序甲型流感病毒H1柄部三聚体蛋白质的氨基酸序列不限于SEQ ID 4-8。理由如下：
所述甲型流感病毒H1包括与毒株A/New Caledonia/20/1999(H1N1)的H1氨基酸序列具有89％以上同源性的H1；
所述去掉形成血凝素头部区域的氨基酸序列为HA1/X1至HA1/X2的氨基酸序列；其中，X1位点可以为D35或S36；X2位点可以为C302、P303、K304或L289；
所述酶切位点包括：Factor Xa切割位点、凝血酶裂解位点、HRV3C蛋白酶切位点、TEV蛋白酶切位点、肠激酶切位点、SUNO蛋白酶切位点中的至少一种；
所述纯化标签包括6×His标签、HA标签、FLAG标签、谷胱甘肽巯基转移酶标签、麦芽糖结合蛋白标签、NusA标签、SUMO标签、Strep-tag标签中的至少一种。
所述氨基酸交联序列为3-5个氨基酸组成的短肽，所述短肽中的氨基酸包含G、T、S、P、A中的一种或多种；
本申请的包含的突变点是固定的(所述甲型流感病毒H1柄部的氨基酸点突变的对应突变点包括HA1/R326、HA1/I320、HA1/I323、HA2/F63、HA2/V66、HA2/L73、HA1/L20、HA1/R307、HA2/G1、HA2/G47、HA2/T93、HA2/S124、HA2/N95和HA2/M77)，但本申请中包含的点突变不是固定的(所述甲型流感病毒H1柄部的氨基酸点突变包括HA1/R326X3、HA1/I320X4、HA1/I323X5、HA2/F63Y、HA2/V66X6、HA2/L73X7、HA1/L20C、HA1/R307C、HA2/G1C、HA2/G47C、HA2/T93C、HA2/S124C、HA2/N95X8、HA2/M77X9；其中，所述X3可以为N或Q；所述X4可以为V、N、D或K；所述X5可以为K、R、Q或N；所述X6可以为A、I或T；所述X7可以为S、E、D、G或N；所述X8可以为W、I、L、F或A；所述X9可以为F、L、Y、I、W或A)；
表达系统不同，其信号肽序列不同；
因此，采用本申请的改造方法获得的无外源基序甲型流感病毒H1柄部三聚体蛋白质的氨基酸序列不限于SEQ ID 4-8。
下面将结合具体的实施例进一步阐述本发明。
实施例1
(1)蛋白质氨基酸序列点突变：
我们将利用昆虫细胞表达重组血凝素蛋白，首先将A/New Caledonia/20/1999(H1N1)毒株的血凝素的分泌信号肽替换为蜂毒素分泌信号肽MKFLVNVALVFMVVYISYIYA，获得氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，其氨基酸序列的HA1、HA2以及对应的位点序号如图1所示(GenBank Protein Accession:ACD37430.1)，依据如图1所示的HA1、HA2以及对应的位点并基于血凝素蛋白质结构分析结果，去掉主要形成血凝素头部区域的氨基酸序列(如图1所示的HA1/S36至HA1/K304)并引入交联序列GGGG替换被去掉的头部序列来填补缺失的空间位置，获得氨基酸序列如SEQ ID NO：2；随后使用酶切位点IEGR和6×His标签HHHHHH组成的IEGRHHHHHH的氨基酸序列替换H1跨膜区和胞内区的氨基酸序列从HA2/L187至HA2/I222，获得氨基酸序列SEQ ID NO：3；使得重组蛋白能够分泌表达。我们通过引入氨基酸点突变HA1/R326Q消除融合肽酶切位点，引入点突变HA1/I320K、HA1/I323K、HA2/F63Y、HA2/V66I、HA2/L73S增强重组蛋白质亲水属性，引入点突变HA1/L20C、HA1/R307C、HA2/G1C、HA2/G47C、HA2/T93C、HA2/S124C形成二硫键，同时引入HA2/N95I和HA2/M77X9位点的氨基酸突变，得到氨基酸序列为：MKFLVNVALVFMVVYISYIYADTICIGYHANNSTDTVDTVCEKNVTVTHSVNLLEDGGGGYVCSAKLRMVTGLRNKPSKQSQCLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINCITNKVNSVIEKMNTQYTAIGKEFNKSERRX9ENLNKKVDDGFLDIWCYIAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKCQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNNECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEGRHHHHHH；其中，X9是选自以下组的氨基酸，该组氨基酸可以为：I、L、F、Y、W，其分别对应点突变HA2/M77I、HA2/M77L、HA2/M77F、HA2/M77Y、HA2/M77W且其对应的氨基酸序列如SEQ ID NO：4-8，分别为H1 stem-1、H1stem-2、H1 stem-3、H1 stem-4、H1 stem-5。通过上述氨基酸点突变来增强三聚体柄部界面相互作用并能够稳定三聚体结构和重组蛋白质表达产量。我们通过使用
Figure BDA0004064313410000121
Site-Directed Mutagenesis Kit来完成所有点突变需求。点突变实验步骤参照上述试剂盒(NEB，Cat No.E0554)。
(2)表达血凝素柄部重组蛋白：
将重组pfastbac质粒转化到DH10Bac宿主菌，待重组质粒筛选实验中蓝白斑显色后，用吸头挑白斑划线生长，待长出单克隆菌落后再挑白斑划线。确保白斑划线无蓝斑杂菌后，挑白斑单克隆菌落扩大培养，提取重组bacmid，分别通过限制性内切酶酶切法和用M13正反引物做PCR扩增特异性核酸片段来鉴定重组bacmid。
在六孔板中接种2ml，密度5×105ml-1的SF9细胞，27℃温箱过夜培养；细胞铺满80％时用于转染。转染后，将六孔板放入27℃培养箱孵育72小时。倒置光学显微镜下观察细胞是否发生病变。将六孔板中的培养基吸到1.5ml EP管，冷藏保存。
将300μl P1代细胞悬浮液加入20ml，密度1×106至2×106ml-1的SF9细胞中，放入28℃摇床中培养72h，每天计数活细胞比例。活细胞比例降至50％左右，收集并分装P2代培养上清液。取适量上清和沉淀样品，SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白条带，分别通过考马斯蓝染色法和Western blot法检测蛋白样品纯度和分子量大小。
将1ml P2代上清液加入500ml，密度1×106至2×106ml-1的SF9细胞中，放入27℃摇床中培养72h，每天计数活细胞比例。活细胞比例降至50％左右，收集并分装10ml P3代培养上清液。取适量上清和沉淀样品检测蛋白质表达和分子量大小。将培养物在4000g离心力作用下离心20min后，所得上清液用0.45μm滤膜过滤后用于亲和层析纯化重组蛋白。
取4ml Ni-NTA琼脂糖含镍亲和树脂填料(Ni SepharoseTM 6Fast Flow,17-5318-01,GE Healthcare)置于层析柱用于亲和纯化带6×His标签的重组蛋白，依次用5倍柱体积超纯水、平衡液洗涤层析柱。以1-2ml/min流速上样挂柱，依次用5ml20mM、50mM、100mM、200mM、500mM咪唑洗脱液洗脱蛋白质样品，确定各蛋白的最佳洗脱浓度。将高纯度的洗脱样品集中，使用10kDa孔径超滤管进行浓缩和脱盐。采用SDS-PAGE和考马斯蓝染色法和Western blot方法再次检测纯化后的重组蛋白，采用BCA法检测蛋白样品浓度。使用AKTA蛋白质纯化仪串联Superdex 200Increase 10/300GL(Cytiva)层析柱进一步纯化浓缩后的蛋白质样品H1 stem-1和H1 stem-2，使用含20mM Tris，150mM NaCl，pH7.0的缓冲液洗脱蛋白质，纯化过程中收集主峰峰尖处(出峰体积大约为13ml)正负200μl的洗脱蛋白质样品。使用10kDa孔径超滤管进行浓缩。采用SDS-PAGE和考马斯蓝染色法和Western blot方法再次检测纯化后的重组蛋白，采用BCA法检测蛋白样品浓度。
如图2所示为取P2代上清样品在非还原条件下进行Western blot分析H1柄部蛋白质三聚体状态，由图2可知，P2代上清液中包含有分泌表达的H1柄部重组蛋白质。H1 stem-3没有明显条带的原因可能是编码该蛋白质的P2代重组杆状病毒滴度不足导致取样时蛋白质浓度过低。H1 stem-1、H1 stem-2、H1 stem-4和H1 stem-5等H1柄部突变体重组蛋白质在P2代已高效表达，在非还原状态下蛋白质条带处于H1柄部三聚体大小约120kDa。
由于所有改造的H1柄部蛋白质突变体的C端包含6×His纯化标签，我们使用AKTA蛋白质纯化仪串联Ni-NTA树脂填充柱亲和纯化蛋白质样品。为了进一步提高重组蛋白质纯度，我们采用尺寸排阻色谱柱进一步纯化H1 stem-1和H1 stem-2蛋白质样品，其纯化效果如图3所示，由图3可知，AKTA蛋白质纯化仪串联Superdex 200Increase 10/300GL(Cytiva)尺寸排阻色谱柱纯化H1 stem-1(图3(a))和H1 stem-2(图3(b))显示的单波长280nm紫外吸光值曲线。位于13ml出峰体积处的主峰为洗脱后H1柄部三聚体蛋白质样品。收集洗脱液出峰较窄范围的样品并进行蛋白质浓缩。使用SDS-PAGE凝胶电泳和Western blot分析H1柄部突变体蛋白质在非还原状态和还原状态下(二硫键被还原)的蛋白质条带位置变化。经过两次柱层析纯化的蛋白质样品H1 stem-1和H1 stem-2的条带纯度非常高。HA柄部三聚体蛋白大小位置大约为120kDa，单体蛋白质大小位置大约为35kDa。具体如图4所示。
(3)鉴定血凝素柄部重组蛋白抗原性：
通过酶联免疫吸附法(ELISA)检测抗原和抗体结合能力，该方法能够初步判断改造后蛋白质的抗原性。本实验中采用的抗体为人源单克隆抗体，包括CR9114、CT149、FISW84、3I14、CR6261，以上交叉反应性中和抗体均为文献报道的分离自流感疫苗接种者或流感病毒感染者。在酶联免疫板中铺200ng/μl血凝素柄部抗原或BSA作为阴性对照，于4℃条件下过夜铺板。使用PBST清洗孔板后每孔加入300μl含10％脱脂奶粉的PBST溶液在室温条件下封闭孔板1小时，吸出封闭液后加入梯度稀释的单克隆抗体溶液。抗体稀释液的起始浓度为5μg/ml，随后5倍梯度稀释7次制备不同浓度的抗体稀释液样品。每孔加入50μl一抗抗体稀释液，在室温条件下孵育一抗1.5小时，使用PBST清洗3次后，加入50μl，0.2ng/μl浓度的HRP交联的羊抗人二抗在室温条件下孵育1小时。使用PBST清洗3次后，每孔加入50μlTMB显色液，室温显色5min，待阳性孔和阴性孔显示明显差异后，每孔加入50μl，1M H2SO4终止反应。上述ELISA方法检测到各蛋白质突变体与流感病毒血凝素特异性广谱单克隆抗体具有不同程度的结合能力。ELISA检测H1柄部突变体与广谱单克隆抗体结合能力如图5所示。由图5可知，H1 stem-1、H1 stem-2、H1 stem-3、H1 stem-4和H1 stem-5与光谱单克隆抗体结合效率高，其中，H1 stem-1和H1 stem-2与广谱单克隆抗体结合效率最高。说明本申请改造方法得到血凝素柄部重组蛋白具有抗原性。
本实施例利用昆虫细胞表达重组血凝素蛋白，首先将血凝素分泌信号肽替换为蜂毒素分泌信号肽(MKFLVNVALVFMVVYISYIYA)；并基于血凝素蛋白质结构分析结果，去掉主要形成血凝素头部区域的氨基酸序列(HA1/S36至HA1/K304)并引入交联序列(GGGG)替换被去掉的头部序列来填补缺失的空间位置；随后使用酶切位点(Factor Xa切割位点：IEGR)和纯化标签(6×His标签：HHHHHH)替换H1跨膜区和胞内区的氨基酸序列(HA2/L187至HA2/I222)，使得重组蛋白能够分泌表达；再通过引入氨基酸点突变(HA1/R326Q、HA1/I320K、HA1/I323K、HA2/F63Y、HA2/V66I、HA2/L73S、HA1/L20C、HA1/R307C、HA2/G1C、HA2/G47C、HA2/T93C、HA2/S124C、HA2/N95I和HA2/M77X9)消除融合肽酶切位点、增强重组蛋白质亲水属性、形成二硫键和增强三聚体界面相互作用并能够稳定三聚体结构和重组蛋白质表达产量，最终获得三聚体纯度明显大幅提升、且能够自发的稳定表达的血凝素柄部重组蛋白突变体。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本发明公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种无外源基序甲型流感病毒H1柄部三聚体蛋白质的改造方法，其特征在于，所述方法具体包括：
步骤1：将甲型流感病毒H1的信号肽序列置换成表达系统的信号肽序列，去掉形成血凝素头部区域的氨基酸序列并在其去掉后的缺失空间引入氨基酸交联序列，使用酶切位点和纯化标签替换C端跨膜区和胞内区部分氨基酸序列，再采用氨基酸点突变进行蛋白质界面改造，并依据昆虫细胞宿主优化密码子，利用pfastbac质粒载体多克隆位点将优化改造的H1柄部的编码核酸序列合成在质粒开放阅读框中，获得带有编码甲型流感病毒H1柄部核酸序列的重组质粒；
步骤2：利用表达系统表达所述重组质粒并纯化，获得可稳定表达的无外源基序甲型流感病毒H1柄部三聚体蛋白质；
其中，所述表达系统包括基因工程改造或驯化的贴壁或悬浮培养的昆虫细胞表达系统或哺乳动物真核细胞表达系统中的任意一种。
2.根据权利要求1所述的无外源基序甲型流感病毒H1柄部三聚体蛋白质的改造方法，其特征在于，所述甲型流感病毒H1包括与毒株A/NewCaledonia/20/1999(H1N1)的H1氨基酸序列具有89％以上同源性的H1。
3.根据权利要求2所述的无外源基序甲型流感病毒H1柄部三聚体蛋白质的改造方法，其特征在于，所述去掉形成血凝素头部区域的氨基酸序列为HA1/X1至HA1/X2的氨基酸序列；其中，X1位点可以为D35或S36；X2位点可以为C302、P303、K304或L289；所述氨基酸交联序列为3-5个氨基酸组成的短肽，所述短肽中的氨基酸包含G、T、S、P、A中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的无外源基序甲型流感病毒H1柄部三聚体蛋白质的改造方法，其特征在于，所述酶切位点包括：FactorXa切割位点、凝血酶裂解位点、HRV3C蛋白酶切位点、TEV蛋白酶切位点、肠激酶切位点、SUNO蛋白酶切位点中的至少一种；所述纯化标签包括6×His标签、HA标签、FLAG标签、谷胱甘肽巯基转移酶标签、麦芽糖结合蛋白标签、NusA标签、SUMO标签、Strep-tag标签中的至少一种。
5.根据权利要求2所述的无外源基序甲型流感病毒H1柄部三聚体蛋白质的改造方法，其特征在于，所述甲型流感病毒H1柄部的氨基酸点突变的对应突变点包括HA1/R326、HA1/I320、HA1/I323、HA2/F63、HA2/V66、HA2/L73、HA1/L20、HA1/R307、HA2/G1、HA2/G47、HA2/T93、HA2/S124、HA2/N95和HA2/M77。
6.根据权利要求5所述的无外源基序甲型流感病毒H1柄部三聚体蛋白质的改造方法，其特征在于，所述甲型流感病毒H1柄部的氨基酸点突变包括HA1/R326X3、HA1/I320X4、HA1/I323X5、HA2/F63Y、HA2/V66X6、HA2/L73X7、HA1/L20C、HA1/R307C、HA2/G1C、HA2/G47C、HA2/T93C、HA2/S124C、HA2/N95X8、HA2/M77X9；其中，所述X3可以为N或Q；所述X4可以为V、N、D或K；所述X5可以为K、R、Q或N；所述X6可以为A、I或T；所述X7可以为S、E、D、G或N；所述X8可以为W、I、L、F或A；所述X9可以为F、L、Y、I、W或A。
7.根据权利要求1所述的无外源基序甲型流感病毒H1柄部三聚体蛋白质的改造方法，其特征在于，所述替换C端跨膜区和胞内区部分氨基酸序列为从HA2/L187至HA2/I222的氨基酸序列；当所述表达系统为昆虫细胞表达系统时，所述表达系统的信号肽序列为MKFLVNVALVFMVVYISYIYA，所述利用表达系统表达所述重组质粒并纯化具体为：利用bac-to-bac昆虫杆状病毒表达系统表达所述重组质粒并纯化，获得可稳定表达的无外源基序甲型流感病毒H1柄部三聚体蛋白质。
8.根据权利要求7所述的无外源基序甲型流感病毒H1柄部三聚体蛋白质的改造方法，其特征在于，所述利用bac-to-bac昆虫杆状病毒表达系统表达所述重组质粒并纯化，获得可稳定表达的无外源基序甲型流感病毒H1柄部三聚体蛋白质的过程具体包括：
将带有编码甲型流感病毒H1柄部核酸序列的重组质粒转化到DH10Bac宿主菌获得改造bacmid，将bacmid转染静置培养的昆虫细胞sf9制备P1代改造杆状病毒，将0.3mlP1改造杆状病毒加入20ml生长期状态密度为1×106～2×106ml-1的sf9细胞，制备病毒滴度更高的P2代改造杆状病毒，利用P2改造杆状病毒感染较大体积sf9细胞培养物表达H1突变体改造蛋白；
收集上清液，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法、考马斯亮蓝染色法、Westernblotfang法检测并确定带有甲型流感病毒血凝素序列的重组质粒的表达情况和三聚体状态，离心上清液后，通过Ni-NTA树脂亲和纯化法和尺寸排阻色谱法纯化获得可稳定表达的无外源基序甲型流感病毒H1柄部三聚体蛋白质。
9.根据权利要求1-8任一所述的无外源基序甲型流感病毒H1柄部三聚体蛋白质的改造方法，其特征在于，所述无外源基序甲型流感病毒H1柄部三聚体蛋白质的氨基酸序列包含如SEQID4-8所示。
10.根据权利要求1-8任一所述改造方法获得的无外源基序甲型流感病毒H1柄部三聚体蛋白质，其特征在于，所述蛋白质应用于构建其他融合蛋白质形成三聚体。
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