CN116063573A

CN116063573A - 一种包含猪瘟病毒E2蛋白和猪圆环病毒2型Cap蛋白的融合蛋白及二联亚单位疫苗

Info

Publication number: CN116063573A
Application number: CN202211403104.8A
Authority: CN
Inventors: 李雪峰; 康斌; 武玉梅; 董鹏; 张金龙; 赵炳武; 李少丽; 王家福
Original assignee: Jinhe Uben Biological Products Co ltd
Current assignee: Jinhe Uben Biological Products Co ltd
Priority date: 2022-11-10
Filing date: 2022-11-10
Publication date: 2023-05-05

Abstract

本发明提供了一种包含猪瘟病毒E2蛋白和猪圆环病毒2型Cap蛋白的融合蛋白及二联亚单位疫苗，涉及兽用生物制品技术领域。本发明将E2、Fc和Cap蛋白融合表达，并在融合蛋白中加入TEV蛋白酶酶切基序。本发明还提供了包含所述融合蛋白的重组载体以及表达所述融合蛋白的重组细胞系，可利用一次表达过程，同时生产两种病毒的亚单位疫苗，纯化过程简单，利用商品化proteinA填料纯化蛋白，不需要蛋白复性、离子交换层析等复杂工艺。利用本发明所述融合蛋白形成的二联亚单位疫苗，猪瘟E2以二聚体形式存在，猪圆环病毒2型Cap蛋白以VLPs形式组成存在。

Description

一种包含猪瘟病毒E2蛋白和猪圆环病毒2型Cap蛋白的融合蛋白及二联亚单位疫苗

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种包含猪瘟病毒E2蛋白和猪圆环病毒2型Cap蛋白的融合蛋白及二联亚单位疫苗。

背景技术

猪瘟病毒(Swine fevervirus，CSFV)为有囊膜病毒，40～60nm，单股正链RNA。CSFV基因组长约123kb，仅含有一个大的开放性阅读框架(ORF)，此ORF翻译成含3898个氨基酸残基，分子量约438kDa的多聚蛋白，并进一步在病毒和宿主细胞蛋白酶的作用下加工为成熟蛋白。在结构蛋白中，最具有免疫防治研究价值的是E0和E2，尤其是E2蛋白是目前亚单位疫苗首选蛋白。

E2蛋白为囊膜糖蛋白，是病毒主要的抗原蛋白，也是三个病毒糖蛋白中保守性最低、最易变异的分子。E2蛋白常以100kDa的同源二聚体形式存在于病毒粒子及猪瘟病毒感染的细胞表面。E2蛋白可诱导产生抗病毒的中和抗体，Hulst用E2双相油包水乳剂免疫猪，能抵抗100LD50 CSFVBrescia毒株强毒的攻击。E2蛋白骨架由370个氨基酸(ORF编码的690～1060氨基酸残基)组成，并以其C端的40个疏水氨基酸锚定在膜上。

猪圆环病毒(Porcine Circovirus，PCV)属于圆环病毒科圆环病毒属，病毒无囊膜、是单链负股环状DNA病毒，是最小的动物病毒之一。传统的观点认为猪圆环病毒存在两个基因型：猪圆环病毒1型(PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2)，其中PCV2具有致病性。猪圆环病毒2型Cap蛋白的N端包含了一个富含精氨酸的核定位序列，负责介导Rep复合物与核酸的相互作用，进而参与病毒的DNA复制。研究表明核定位序列对Cap蛋白的免疫原性具有重要影响，缺失后会导致其诱导中和抗体的能力显著降低。目前虽有全长和N端32个氨基酸截短型的Cap蛋白在杆状病毒中获得表达并可以形成病毒样颗粒(virus-likeparticle，VLP)，但完整Cap蛋白的表达会影响其在表达系统中的表达量，然而整段的缺失却又有可能会影响病毒样颗粒表面的特性及病毒样颗粒的稳定性，从而影响其免疫原性。

现有技术中虽然有关于猪瘟-猪圆环病毒2型的二联疫苗，但是均为采用单独表达后再混合的方案，纯化步骤繁琐，因此亟需利用一次表达过程，同时生产两种病毒的亚单位疫苗方案，并解决表达量受限的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种包含猪瘟病毒E2蛋白和猪圆环病毒2型Cap蛋白的融合蛋白及二联亚单位疫苗，可在一次表达过程中，同时生产两种病毒的亚单位疫苗，并且表达量不受Cap蛋白N端富含碱性氨基酸的核定位信号区的影响，蛋白纯化简单，不需要蛋白复性、离子交换层析等复杂工艺。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种包含猪瘟病毒E2蛋白和猪圆环病毒2型Cap蛋白的融合蛋白，所述融合蛋白的结构从N端到C端包括：信号肽、去掉C端胞内区的猪瘟病毒E2蛋白、Fc、TEV酶切基序和猪圆环病毒Cap蛋白。

优选的，所述信号肽的来源包括小鼠IgGkappa链信号肽和/或家蚕免疫球蛋白信号肽；

所述Fc的来源包括猪IgG Fc。

本发明提供了一种利用CHO细胞表达的上述融合蛋白，所述融合蛋白的结构从N端到C端包括：小鼠IgG kappa链信号肽、去掉C端胞内区的猪瘟病毒E2蛋白、猪IgG Fc、TEV酶切基序和猪圆环病毒2型Cap蛋白；

所述小鼠IgGkappa链信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述去掉C端胞内区的猪瘟病毒E2蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述猪IgG Fc的核苷酸序列如SEQID NO.3所示，所述TEV酶切基序的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述猪圆环病毒2型Cap蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

优选的，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

本发明还提供了一种利用昆虫细胞表达的上述融合蛋白，所述融合蛋白的结构从N端到C端包括：家蚕免疫球蛋白信号肽、去掉C端胞内区的猪瘟病毒E2蛋白、猪IgG Fc、TEV酶切基序和猪圆环病毒2型Cap蛋白；

所述家蚕免疫球蛋白信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述去掉C端胞内区的猪瘟病毒E2蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述猪IgG Fc的核苷酸序列如SEQID NO.10所示，所述TEV酶切基序的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述猪圆环病毒2型Cap蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

优选的，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。

优选的，所述融合蛋白切除信号肽后分泌在培养上清中，切除信号肽后的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。

本发明还提供了一种包含上述融合蛋白的重组载体。

本发明还提供了一种表达上述融合蛋白的重组细胞系。

本发明还提供了上述融合蛋白、上述重组载体或上述重组细胞系在制备猪瘟和猪圆环病毒2型二联亚单位疫苗中的应用。

本发明还提供了一种猪瘟和猪圆环病毒2型的二联亚单位疫苗，以上述重组细胞系表达的融合蛋白为抗原。

有益效果：本发明提供了一种包含猪瘟病毒E2蛋白和猪圆环病毒2型Cap蛋白的融合蛋白，在融合蛋白中加入FC标签，使猪瘟病毒E2蛋白形成二聚体，延长蛋白半衰期，促进抗原递呈。本发明将E2、Fc和Cap蛋白融合表达，使核定位信号位于融合蛋白的中部，消除了其位于蛋白N端时产生的不利影响，使得表达量不受Cap蛋白N端富含碱性氨基酸的核定位信号区的影响，故无需进行特定序列的缺失。本发明在融合蛋白中还加入TEV蛋白酶酶切基序，经TEV酶切产生的猪圆环病毒2型Cap蛋白，最接近天然病毒。

本发明还提供了包含所述融合蛋白的重组载体以及表达所述融合蛋白的重组细胞系，可利用一次表达过程，同时生产两种病毒的亚单位疫苗，纯化过程简单，利用商品化proteinA填料纯化蛋白，不需要蛋白复性、离子交换层析等复杂工艺。利用本发明所述融合蛋白形成的二联亚单位疫苗，猪瘟E2以二聚体形式存在，圆环病毒2型Cap蛋白以VLPs形式组成存在。

附图说明

图1猪瘟病毒ELISA抗体检测实验结果；

具体实施方式

本发明提供了一种包含猪瘟病毒E2蛋白和猪圆环病毒2型Cap蛋白的融合蛋白，所述融合蛋白的结构从N端到C端包括：信号肽、去掉C端胞内区的猪瘟病毒E2蛋白、Fc、TEV酶切基序和猪圆环病毒2Cap蛋白。

本发明所述信号肽的来源优选包括小鼠IgG kappa链信号肽和/或家蚕免疫球蛋白信号肽；所述Fc的来源优选包括猪IgG Fc。

本发明所述融合蛋白利用不同的细胞系进行表达时，需要根据表达细胞的密码子偏好进行密码子优化，因此基于不同的细胞表达体系，虽然融合蛋白的结构相同，但是其核苷酸序列略有不同。

本发明将Cap蛋白与猪瘟E2、IgG FC标签融合表达，使核定位信号位于融合蛋白的中部，消除了其位于蛋白N端时产生的不利影响。利用本发明所述融合蛋白，作为抗原时可有效活化抗原递呈细胞(APC)，由于APC表面能够表达FcR，所以抗原-Fc融合蛋白能够作为抗原运载工具，借助Fc片段靶向结合APC，缩短抗原在血浆中的游离时间，减少蛋白酶对抗原的降解，提高抗原半衰期，从而加强抗原的递呈。

本发明提供了一种利用CHO细胞表达的上述融合蛋白，所述融合蛋白简称CHO-E2-FC-Cap，结构从N端到C端包括：小鼠IgG kappa链信号肽、去掉C端胞内区的猪瘟病毒E2蛋白、猪IgG Fc、TEV酶切基序和猪圆环病毒2型Cap蛋白；

所述小鼠IgG kappa链信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述去掉C端胞内区的猪瘟病毒E2蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述猪IgG Fc的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述TEV酶切基序的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述猪圆环病毒2型Cap蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

在本发明中，SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.5所示的序列均为经过密码子优化后的序列，其中小鼠IgG kappa链信号肽序列，大小为63个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；去掉C端胞内区的猪瘟石门株E2蛋白序列，大小为999个碱基，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；猪IgG FC序列，大小为681个核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；TEV酶切基序，大小为21个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；猪圆环病毒2型Cap蛋白序列，大小为696个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。本发明在合成所述CHO-E2-FC-Cap序列后，优选还包括在所述序列的两端分别设计HindIII和EcoRI酶切位点，全长为2478个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

本发明对所述昆虫细胞的种类并没有特殊限定，实施例中以昆虫细胞SF9为例进行说明，但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。在本发明中，基于昆虫细胞表达的所述融合蛋白简称SF9-E2-FC-Cap，序列依次为：家蚕免疫球蛋白信号肽序列，大小为60个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；去掉C端胞内区的猪瘟石门株E2蛋白序列，大小为999个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；猪IgG FC序列，大小为681个核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；TEV酶切基序，大小为21个碱基，其核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示；猪圆环病毒2型Cap蛋白序列，大小为696个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；合成后的SF9-E2-FC-Cap序列，序列的两端分别含有BamHI和HindIII酶切位点，全长为2469个碱基，如SEQ ID NO.13所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。

本发明所述CHO-E2-FC-Cap或SF9-E2-FC-Cap经切除信号肽后分泌在培养上清中，切除信号肽后的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示：

RLACKEDYRYAISSTNEIGLLGAGGLTTTWKEYSHDLQLNDGTVKAICVAGSFKVTALNVVSRRYLASLHKGALLTSVTFELLFDGTNPSTEEMGDDFGFGLCPFDTSPVVKGKYNTTLLNGSAFYLVCPIGWTGVIECTAVSPTTLRTEVVKTFRREKPFPHRMDCVTTTVENEDLFYCKLGGNWTCVKGEPVVYTGGQVKQCKWCGFDFNEPDGLPHYPIGKCILANETGYRIVDSTDCNRDGVVISAEGSHECLVGNTTVKVHASDERLGPMPCRPKEIVSSAGPVRKTSCTFNYAKTLKNKYYEPRDSYFQQYMLKGEYQYWFDLDVTDVGRPCPICPACEGPGPSAFIFPPKPKDTLMISRTPQVTCVVVDVSQENPEVQFSWYVDGVEVHTAQTRPKEAQFNSTYRVVSVLPIQHEDWLKGKEFECKVNNKDLPAPITRIISKAKGPSREPQVYTLSPSAEELSRSKVSITCLVTGFYPPDIDVEWKSNGQPEPEGNYRTTPPQQDVDGTYFLYSKLAVDKASWQRGDPFQCAVMHEALHNHYTQKSVSKTQGKENLYFQGYPRRRYRRRRHRPRSHLGQILRRRPWLLHPRHRYRWRRKNGIFNTRLSRTFGYTIKRTTVKTPSWAVDMMRFNINDFLPPGGGSNPRSVPFEYYRIRKVKVEFWPCSPITQGDRGVGSSAVILDDNFVTKATALTYDPYVNYSSRHTITQPFSYHSRYFTPKPVLDSTIDYFQPNNKRNQLWLRLQTAGNVDHVGLGTAFENSIYDQEYNIRVTMYVQFREFNLKDPPLNP

本发明还提供了一种包含上述融合蛋白的重组载体。

在本发明中，不同的序列所设计的重组载体不同，如利用CHO-E2-FC-Cap序列和pEE12.4进行连接，并进行转化克隆，测序正确后，构建得到CHO-E2-FC-Cap-pEE12.4重组质粒。

当所述融合蛋白为SF9-E2-FC-Cap时，本发明优选使用BamHI和HindIII酶切所述SF9-E2-FC-Cap序列和pFastBac1载体序列，回收酶切后的SF9-E2-FC-Cap和pFastBac1序列片段，并进行连接转化克隆，测序验证后，构建得到SF9-E2-FC-Cap-pFastBac1转移载体。

本发明还提供了一种表达上述融合蛋白的重组细胞系。

本发明对所述重组细胞系的构建方法并没有特殊限定，利用本领域的常规构建方法即可，如在构建得到CHO-E2-FC-Cap-pEE12.4重组质粒后，利用CHO-K1细胞转染及高表达细胞池筛选，从而筛选出稳转细胞株(高表达细胞株)，并对高表达细胞株进行无血清悬浮驯化得所述重组细胞系。本发明优选对所述重组细胞系进行细胞摇瓶发酵，发酵结束后收获细胞上清液，并利用商品化proteinA填料纯化蛋白。本发明在得到所述纯化蛋白后，优选还包括根据每8μg蛋白的量加入1U TEV蛋白酶的比值进行酶切，将酶切蛋白装入透析袋中进行VLPs自组装，取出透析袋内液体，镍柱上样，去除含有His标签的TEV酶，流穿液即为含有猪瘟病毒E2蛋白二聚体和圆环病毒2型VLPs的抗原液，可应用于制备猪瘟和猪圆环病毒2型二联亚单位疫苗。

本发明在得到所述SF9-E2-FC-Cap-pFastBac1转移载体后，优选还包括将其转化感受态细胞DH10Bac，37℃培养后，使用蓝白斑筛选法进行筛选并进行PCR鉴定，获得SF9-E2-FC-Cap-Bacmid重组杆粒；并将所述SF9-E2-FC-Cap-Bacmid重组杆粒转染处于对数生长期的SF9细胞，培养后收获P₁代的重组杆状病毒SF9-E2-FC-Cap-rBV，并连续传代至P₃代，将P3代病毒离心，上清为病毒液；用P₃代毒感染High Five细胞，培养后，收集上清，上清液中含有目的蛋白。本发明对所述目的蛋白的纯化、酶切和抗原液的制备方法均相同，在此不再赘述。

本发明所述应用，优选与上述相同，在此不再赘述。

本发明在得到上述抗原液后，优选还包括将所述抗原液用PBS缓冲液稀释至终浓度60μg/mL，与ISA201 VG佐剂按照46:54体积比混合乳化，即为猪瘟、猪圆环病毒2型二联亚单位疫苗。

下面结合实施例对本发明提供的一种包含猪瘟病毒E2蛋白和猪圆环病毒2型Cap蛋白的融合蛋白及二联亚单位疫苗进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

CHO细胞表达序列合成

参考猪瘟石门株E2蛋白和猪圆环病毒2型国内流行株的Cap蛋白基因序列，根据CHO细胞密码子的偏好性优化密码子，合成CHO-E2-FC-Cap序列，序列的两端分别含有HindIII和EcoRI酶切位点，全长为2478个碱基，如SEQ ID NO.6所示。CHO-E2-FC-Cap序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

实施例2

构建CHO-E2-FC-Cap-pEE12.4重组质粒

使用HindIII和EcoRI酶切实施例1合成的CHO-E2-FC-Cap序列和pEE12.4载体，回收酶切后的CHO-E2-FC-Cap序列和pEE12.4序列片段，并进行连接转化克隆，测序正确后构建得到CHO-E2-FC-Cap-pEE12.4重组质粒。

实施例3

CHO-K1细胞转染及高表达细胞株筛选

1、准备细胞：

取传代培养24小时内，汇合度在80％～90％的CHO-K1细胞一皿(10cm细胞培养皿)，弃去培养基，加10mL PBS洗细胞一次，弃去PBS，加入15mL无血清无抗生素的DMEM/F12培养基，置于37℃5％CO₂细胞培养箱中培养。

2、转染质粒

按照

2000说明书，分别用1.5mL无血清无抗生素的DMEM/F12培养基稀释24ug的E2-FC-Cap-pEE12.4重组质粒和60μL的

2000，混匀室温放置5分钟。将两管液体混合，室温放置20分钟。取准备好的CHO-K1细胞，逐滴加入前述混合试剂，然后放入37℃5％CO₂细胞培养箱。培养4～6小时后弃去培养基，加入10mL DMEM/F12培养基(10％血清，1％双抗(青霉素和链霉素，下同)，不含谷氨酰胺)，置于37℃5％CO₂细胞培养箱中培养。

3、加压筛选

转染后24h，取转染后CHO-K1细胞和未转染的CHO-K1细胞(阴性对照)各一皿，弃去上清培养基，加入10mL DMEM/F12培养基(10％血清+25μM MSX，1％双抗，不含谷氨酰胺)，加压筛选7d，中间观察细胞，死细胞多时，换液为相同培养基。

4、稳转细胞株筛选

25μM MSX加压筛选至阴性对照细胞基本死光时，约7天，开始细胞株筛选。取转染后CHO-K1细胞，弃掉培养基，PBS洗一次，加入500μL 0.25％胰酶，室温2～5min，消化至细胞为单细胞，加入10mL DMEM/F12培养基(10％血清+25μM MSX，1％双抗，不含谷氨酰胺)终止消化反应，用移液器吹散细胞，细胞计数。用DMEM/F12培养基(10％血清+25μM MSX，1％双抗，不含谷氨酰胺)稀释细胞至10⁴cells/mL，转移至96孔板，每孔200μL，放入37℃5％CO₂细胞培养箱中培养。待96孔板长满时，取上清，ELISA检测，高表达的阳性细胞株继续扩大培养、冻存。

实施例4

高表达细胞株无血清悬浮驯化

在DMEM/F12培养基(10％血清，1％双抗，不含谷氨酰胺)中复苏高表达细胞株，并继续使用该培养基传代2到3次至细胞生长稳定，当细胞密度达到2×10⁶cells/mL后进行传代，传代细胞密度控制在0.3-0.5×10⁵cells/mL，培养基为10％血清的DMEM/F12培养基与

基础培养基(购自健顺生物)以75:25的比例混合，将细胞置于37℃，5％CO₂，转速为110rpm的恒温摇床中进行培养。当细胞密度3～4天后达到2×10⁶cells/mL且细胞活率>90％，传代时10％血清的DMEM/F12培养基与

基础培养基以50:50的比例混合，细胞密度控制在0.3～0.5×10⁶cells/mL。如细胞生长慢，可离心上清，留20％原培养基，加入80％的10％血清的DMEM/F12培养基与

基础培养基比例为75:25的混合培养基，继续培养；重复前述步骤，逐步增加

基础培养基所占的比例直到100％的

基础培养基。

实施例5

细胞摇瓶发酵

从恒温摇床中取出摇瓶细胞，稀释细胞至0.3～0.5×10⁵cells/mL接种30mL

基础培养基至一个125mL摇瓶中，置于37℃，5％CO₂，转速为110rpm的恒温摇床中进行培养。每天检测葡萄糖浓度，当葡萄糖浓度小于4g/L时，添加葡萄糖溶液到培养液中葡萄糖浓度为4g/L。分别在第3天、第5天、第7天、第9天添加3％的

补料培养基。第12天，收获培养细胞上清。

实施例6

昆虫细胞表达序列合成

参考猪瘟石门株E2蛋白和猪圆环病毒2型国内流行株的Cap蛋白基因序列，根据昆虫细胞密码子的偏好性优化密码子，合成SF9-E2-FC-Cap序列的核苷酸序列如SEQ IDNO.13所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。

实施例7

杆状病毒转移载体构建

使用BamHI和HindIII酶切实施例6合成的SF9-E2-FC-Cap序列和pFastBac1载体序列，回收酶切后的SF9-E2-FC-Cap和pFastBac1序列片段，并进行连接转化克隆，测序正确后构建得到SF9-E2-FC-Cap-pFastBac1转移载体。

实施例8

杆粒制备

将实施例7制得的SF9-E2-FC-Cap-pFastBac1转移载体转化感受态细胞DH10Bac，37℃培养后，使用蓝白斑筛选法进行筛选并进行PCR鉴定，获得SF9-E2-FC-Cap-Bacmid重组杆粒。杆粒转化和筛选方法参考Invitrogen公司Bac-to-BacTM杆状病毒表达系统用户指南进行操作。

实施例9

重组杆状病毒收获

将实施例8获得的SF9-E2-FC-Cap-Bacmid重组杆粒利用转染试剂

转染处于对数生长期的SF9细胞，培养72h后，收获P₁代的重组杆状病毒SF9-E2-FC-Cap-rBV。将收获的P₁代重组杆状病毒继续在SF9细胞上进行传代培养至P₃代，将P₃代病毒离心，上清为病毒液，通过噬斑法测定P₃代病毒滴度。按照接种量为1个MOI，用P₃代毒感染High Five细胞，培养96h后，细胞培养上清含有目的蛋白。

实施例10

蛋白纯化

收集实施例5或9中的细胞培养上清，4℃，8000g离心30min，取上清，过0.8μm滤膜。5～10倍柱体积PBS平衡ProteinA柱料，处理好的细胞上清重复上柱3次，10倍PBST冲洗柱料，2倍PBS冲洗柱料，2倍柱料体积的0.1M甘氨酸(pH3.0)洗脱蛋白，收集洗脱液，加入1MTris(pH9.0)中和到pH7.5，即为纯化蛋白。

实施例11

酶切蛋白及VLPs自组装

依据BCA蛋白质定量检测试剂盒(购自上海生工)说明，测定纯化蛋白浓度，计算蛋白总质量，按照每8μg蛋白加入1U TEV蛋白酶(His-tag，购自碧云天生物)，按体积加入10×酶切缓冲液(500mMNaH₂PO₄，150mM NaCl，10mM EDTA，10mM DTT，1％Tween-20，pH8.0)，4℃酶切12～16h。酶切完成后，将酶切蛋白装入透析袋(3500D)，透析液为50mMNaH₂PO₄，500mMNaCl，pH8.0，透析12～16h，期间换液2～3次。第一次透析完成后，4℃静置8～12h，完成VLPs自组装。更换透析液为PBS缓冲液，透析12～16h，期间换液2～3次。第三次透析完成后，取出透析袋内液体，镍柱上样，去除含有His标签的TEV酶，流穿液即为含有猪瘟病毒E2蛋白二聚体和圆环病毒2型VLPs的抗原液。用含200mM咪唑的PBS缓冲液洗脱镍柱，收集洗脱液，即为回收的TEV蛋白酶，经酶活测定，可直接用于下次生产的酶切过程。

实施例12

疫苗制备

将实施例11的抗原液用PBS缓冲液稀释至终浓度60μg/mL，与ISA201VG佐剂按照46:54体积比混合乳化，即为猪瘟、猪圆环病毒病二联亚单位疫苗。

实施例13

猪瘟病毒免疫攻毒实验

1、免疫程序

筛选21～28日龄健康易感仔猪10头(阻断ELISA法检测猪瘟抗体，阻断率应小于30％)，随机分成2组，空白对照组5头，疫苗免疫组5头，疫苗免疫组免疫猪瘟、猪圆环病毒病二联亚单位疫苗，空白对照组免疫PBS。每次免疫在仔猪耳根后肌肉注射1mL，一免后21天加强免疫一次。免疫前和二免后21天采集血清，测定猪瘟中和抗体(见实施例14)和ELISA抗体(IDEXX猪瘟病毒抗体检测试剂盒)。

2、攻毒和发病标准

一免后21天，仔猪肌肉注射石门系血毒1ml(不低于10⁵最小致死量，购自中国兽医药品监察所)，连续观察14天。

猪瘟石门系血毒攻毒后发病判定标准：

①死亡。

②体温升高(≥41℃)，至少持续3日。

③临床症状精神萎靡、食欲废绝等。

符合①或同时符合②与③，即可判为发病。

3、实验结果

猪瘟病毒ELISA抗体阻断率实验结果如图1所示，免疫前阻断率低于30％，均为猪瘟病毒抗体阴性，疫苗免疫组二免后21天阻断率不低于60％，最高可达93.31％，说明猪瘟、猪圆环病毒病二联亚单位疫苗有较好的免疫原性。二免后21天，猪瘟病毒中和抗体与攻毒实验结果如表1所示，结果表明疫苗免疫组猪瘟病毒中和抗体效价不低于1:64，猪瘟、猪圆环病毒病二联亚单位疫苗能够为仔猪提供抵抗猪瘟病毒100％保护。

表1猪瘟病毒中和抗体与攻毒实验结果

实施例14

猪瘟病毒中和抗体实验

以猪瘟病毒CVCCAV65株(购自中国兽医药品监察所)、PK15细胞作为试验用病毒和细胞，以FITC标记WH303单抗作为免疫荧光染色单抗。试验前一日，用胰酶将PK15细胞消化后，使用含10％FBS的MEM重悬细胞，铺入96孔细胞培养板，细胞接种密度为2×10⁵细胞/mL，每孔接种0.1mL，置于37℃，5％CO₂条件下培养至汇合率为70％～80％的细胞单层(1～2天)。将待检血清56℃灭活30分钟，用无血清MEM细胞培养液稀释二免后21天血清样品，稀释度为2¹，2²，2³，2⁴，2⁵，2⁶，2⁷，2⁸混合均匀。将猪瘟病毒液按照测定的病毒毒价，用含2％FBS的MEM细胞培养液稀释到200个TCID₅₀/0.1ml。取100μL血清稀释液，与等体积的猪瘟病毒(200TCID₅₀)混合均匀，最终毒量为100TCID₅₀/0.1ml，置于37℃，5％CO₂的培养箱中培养1～2小时；用无血清MEM细胞培养液漂洗细胞单层，然后加入血清病毒混合物，0.1mL/孔，每个稀释度做2个重复，同时设置不加中和病毒的正常阴性对照细胞，置于37℃，5％CO₂的条件下培养1小时。吸出反应物，加入MEM维持液(含2％胎牛血清(无BVDV抗体)，56℃灭活30分钟、1％双抗)])，37℃继续培养72小时。采用间接免疫荧光方法进行染色和结果判定。取出96孔板，弃去孔中液体，用PBS缓冲液漂洗三次，在吸水纸拍干，置于通风橱下干燥5分钟。每孔加入-20℃预冷的固定液(甲醇和丙酮1:1混合)100μL，-20℃放置30分钟以上。弃去孔中固定液，PBS缓冲液漂洗三次。将FITC标记WH303单抗稀释至工作浓度，每孔加入50μL，37℃避光反应1小时。弃去孔中液体，用PBS缓冲液漂洗三次，将96孔板置于荧光倒置显微镜下观察结果。当细胞胞浆中出现亮绿色荧光时，判为染色阳性；细胞胞浆无着染，判为染色阴性。血清的2个复孔中，2孔均为染色阳性的最高稀释度，即为血清样品的中和抗体效价。

实施例15

猪圆环病毒2型免疫攻毒实验

1、免疫程序

14～21日龄PRRSV ELISA抗体阴性(IDEXX ELISA试剂盒检测)、PCV2ELISA抗体阴性(见实施例16)和猪圆环病毒2型荧光定量PCR检测试剂盒检测阴性(购自湖南冠牧生物科技有限公司)健康易感仔猪15头，随机分成3组，每组5头。第1组每头颈部肌肉注射猪瘟、猪圆环病毒病二联亚单位疫苗1mL，一免后21天按相同途径和剂量进行加强免疫；第2组为非免疫攻毒对照，每头颈部肌肉注射1mLPBS；第3组为非免疫非攻毒空白对照。免疫前和二免后21天，采血测定ELISA抗体水平(见实施例16)。

2、攻毒和发病标准

二免疫后21日，所有仔猪称重，第1、2组仔猪经滴鼻和肌肉接种各2.5mL猪圆环病毒2型ZJ/C株(病毒含量为1.0×10⁷TCID₅₀/mL，由杭州佑本生物疫苗有限公司提供)。攻毒后第4日、7日，分别在每头猪的两侧腋下及两侧臀部共4个点对所有猪接种用弗氏不完全佐剂乳化的钥孔血蓝蛋白(KLH/ICFA，0.5mg/mL)，每个点接种1mL，同时腹腔注射巯基乙酸培养基10mL/头。攻毒后第11、19日再次腹腔注射巯基乙酸培养基10mL/头。攻毒后连续观察28天。根据相对增长率和病毒抗原检测结果判定。免疫攻毒组至少4头保护，非免疫攻毒对照组应至少4头发病。

圆环病毒2型攻毒后发病判定标准：

①相对增长率

攻毒试验组(A组和B组)仔猪与空白对照组(C组)仔猪相比，若相对增长率≥5.0％，则判定该仔猪生长发育不良，有猪圆环病毒2型引起的临床症状。

相对增长率(％)＝(a－b)/c×100％

a空白对照组平均日增重＝(攻毒后28日空白对照组仔猪体重之和－攻毒当日空白对照组仔猪体重之和)/(28日×5头)

b攻毒试验组仔猪平均日增重＝(攻毒后28日攻毒试验组仔猪体重之和－攻毒当日攻毒试验组仔猪体重之和)/(28日×5头)

c攻毒试验仔猪平均日增重＝(攻毒后28日该仔猪体重－攻毒当日该仔猪体重)/28日

②病毒抗原检测

攻毒后28日，前腔静脉采血分离血清，用猪圆环病毒2型荧光定量PCR检测Ct值≤35。

符合①和②中任何一项，即可判为发病。

3、实验结果

猪圆环病毒2型ELISA抗体检测与攻毒结果如表2所示，免疫前S/P值小于0.2，均为猪圆环病毒2型ELISA抗体阴性，二免后21天疫苗免疫组S/P值最小0.791，最高1.343，均为抗体阳性。攻毒后28天，疫苗免疫PCV2攻毒组仔猪病毒抗原均为阴性(Ct值＞35)，相对增重率小于5％，5/5保护，PBS免疫PCV2攻毒组5/5发病。说明猪瘟、猪圆环病毒病二联亚单位疫苗有很好的免疫原性，为仔猪提供抵抗猪圆环病毒2型100％保护。

表2猪圆环病毒2型ELISA抗体检测与攻毒结果

实施例16

猪圆环病毒2型ELISA抗体检测

PBS缓冲液平衡ProteinA柱，将实施例11所述含有猪瘟病毒E2蛋白二聚体和猪圆环病毒2型VLPs的抗原液，重复上样3次，流穿液即为只含有猪圆环病毒2型VLPs的抗原液。经BCA法定量浓度，用PBS缓冲液稀释至0.2μg/mL包被酶联反应板，100μL/孔，4℃包被16h。包被结束后，弃去孔中液体，每孔加入PBST洗液300μl，漂洗1次。每孔加入新鲜配制的封闭液(5％脱脂乳，PBS)200μL，37℃封闭2h。封闭结束后，弃去孔中液体，每孔加入PBST洗液300μL，漂洗1次，于吸水滤纸上拍干。将待测血清用PBS缓冲液稀释100倍，加入抗原包被板，37℃孵育1h。弃去孔中液体，每孔加入洗液300μL，漂洗3次。用含5％脱脂乳的PBS将兔抗牛HRP二抗稀释10000倍，每孔加入100μL，37℃孵育1h。弃去孔中液体，每孔加入PBST洗液300μl，漂洗3次。每孔加入TMB显色液100μL，室温避光显色10min。每孔加入50μl终止液，酶标仪上读取450nm吸光值。判断抗体阳性标准：S/P≥0.4，P＞1.0。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种包含猪瘟病毒E2蛋白和猪圆环病毒2型Cap蛋白的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的结构从N端到C端包括：信号肽、去掉C端胞内区的猪瘟病毒E2蛋白、Fc、TEV酶切基序和猪圆环病毒2型Cap蛋白。

2.根据权利要求1所述融合蛋白，其特征在于，所述信号肽的来源包括小鼠IgG kappa链信号肽和/或家蚕免疫球蛋白信号肽；

所述Fc的来源包括猪IgG Fc。

3.一种利用CHO细胞表达的权利要求1或2所述融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的结构从N端到C端包括：小鼠IgG kappa链信号肽、去掉C端胞内区的猪瘟病毒E2蛋白、猪IgGFc、TEV酶切基序和猪圆环病毒2型Cap蛋白；

所述小鼠IgG kappa链信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述去掉C端胞内区的猪瘟病毒E2蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述猪IgG Fc的核苷酸序列如SEQID NO.3所示，所述TEV酶切基序的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述猪圆环病毒2型Cap蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

4.一种利用昆虫细胞表达的权利要求1或2所述融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的结构从N端到C端包括：家蚕免疫球蛋白信号肽、去掉C端胞内区的猪瘟病毒E2蛋白、猪IgGFc、TEV酶切基序和猪圆环病毒2型Cap蛋白；

所述家蚕免疫球蛋白信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述去掉C端胞内区的猪瘟病毒E2蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述猪IgG Fc的核苷酸序列如SEQ IDNO.10所示，所述TEV酶切基序的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述猪圆环病毒2型Cap蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

5.根据权利要求3或4所述融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白切除信号肽后分泌在培养上清中，切除信号肽后的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。

6.一种包含权利要求1或2所述融合蛋白、权利要求3～5任一项所述融合蛋白的重组载体。

7.一种表达权利要求1或2所述融合蛋白、权利要求3～5任一项所述融合蛋白的重组细胞系。

8.权利要求1或2所述融合蛋白、权利要求3～5任一项所述融合蛋白、权利要求6所述重组载体或权利要求7所述重组细胞系在制备猪瘟和猪圆环病毒2型二联亚单位疫苗中的应用。

9.一种猪瘟和猪圆环病毒2型的二联亚单位疫苗，其特征在于，以权利要求7所述重组细胞系表达的融合蛋白为抗原。