JPH06321997A

JPH06321997A - Ａｉｄｓワクチンに有用な蛋白およびその製造方法

Info

Publication number: JPH06321997A
Application number: JP4198374A
Authority: JP
Inventors: Chil-Yong Kang; カンキル−ヨン; Lizhong Luo; リュオリッツォン
Original assignee: Korea Green Cross Corp
Current assignee: Korea Green Cross Corp
Priority date: 1992-06-17
Filing date: 1992-07-24
Publication date: 1994-11-22
Also published as: DE69223952T2; KR0172970B1; DE69223952D1; EP0577894B1; US5443828A; EP0577894A1; KR940000577A

Abstract

(57)【要約】【構成】組換えＨＩＶのｇａｇ−ｅｎｖキメラ蛋白、
およびＨＩＶのｇａｇとｅｎｖとを結合して得たキメラ
遺伝子をバキュロウイルスのＤＮＡに挿入し、生成され
た組換えウイルスで昆虫細胞または昆虫を感染させた
後、培養してＨＩＶｇａｇ−ｅｎｖキメラ蛋白を製造
する方法。【効果】このキメラ蛋白はＡＩＤＳワチチンの抗原ま
たはＡＩＤＳ診断用試薬として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はＡＩＤＳワクチンおよび
診断用試薬の抗原として有用なキメラ（ｃｈｉｍｅｒｉ
ｃ）蛋白およびその製造方法に関する。より詳しくは、
組換えバキュロウイルス（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）に
感染させた昆虫細胞中で発現されるＨＩＶのｇａｇ−ｅ
ｎｖキメラ蛋白およびその製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】後天性免疫不全症候群を惹起すレトロウ
イルスとしてヒト免疫不全ウイルスタイプ１とタイプ２
（ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２）が知られている。該ウイル
スに対するワクチンはＨＩＶ感染による症状を防止する
ために理想的な予防治療法としてレトロウイルスの分子
生物学的構造および特性等について研究がなされてい
る。特に、抗ウイルス治療またはサブユニットワクチ
ンの開発を目標にレトロウイルスの蛋白産物が非常な関
心の焦点になっている。

【０００３】ＨＩＶの主要な構造蛋白はｇａｇ、ｐｏ
ｌ、ｅｎｖ等として表示される３個の遺伝子から誘導さ
れる。数種のＡＩＤＳウイルス構造および遺伝子構成が
分子クローンの完全な遺伝子配列およびウイルス蛋白の
直接的配列化によって明らかになった。ＨＩＶ外皮遺伝
子（ｅｎｖ）は分子量１６０，０００の糖蛋白を暗号化
する（ｇｐ１６０）。

【０００４】ウイルスによって感染された細胞において
ｇｐ１６０前駆物質は塩基性アミノ酸の保存された配列
で切断されてＮ−末端糖蛋白ｇｐ１２０およびＣ−末端
糖蛋白ｇｐ４１を生成する。そのうち、ＨＩＶの外膜糖
蛋白ｇｐ１２０はヘルパーＴリンパ球細胞受容体（ｃｅ
ｌｌｕｌａｒｒｅｃｅｐｔｏｒ）（ＣＤ４）を認識
し、中和抗体を誘導するＶ３ループドメイン（Ｖ３
ｌｏｏｐｄｏｍａｉｎ）を有している（Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ２３４，１３９２−１３９５，１９８６、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ８３，７
０２３−７０２７）。

【０００５】ＨＩＶ−１ｇｐ１２０の多様な（ｈｙｐ
ｅｒｖａｒｉａｂｌｅ）３番目のループ区域（アミノ酸
残基３０８−３３１）であるＶ３は主要な免疫支配中和
エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）を含むばかりでなく、抗
原依存性の細胞毒性（ａｎｔｉｇｅｎ−ｄｅｐｅｎｄｅ
ｎｔｃｅｌｌｕｌａｒｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：
ＡＤＣＣ）と細胞毒性Ｔリンパ球（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ
Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ：ＣＴＬ）認識に対するエ
ピトープを有しているので、ＡＩＤＳワクチンの有力な
候補物質である。Ｖ３ループのアミノ酸の大部分がＨＩ
Ｖ株によって異なるが、ループの先端に位置したＧ−Ｐ
−Ｇ−Ｒｍｏｔｉｆは一定である（Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４９，９３２−９３５，１９９０）。

【０００６】最近、ＨＩＶ−２外膜（ｅｎｖｅｌｏｐ
ｅ）糖蛋白の主要中和区域もＨＩＶ−１ｇｐ１２０の
Ｖ３ループ中に多様に変化するｍｏｔｉｆに該当する位
置にあることが報告されている（Ｊ．ｖｉｏｌ．６５，
５０７３−５０７９，１９９１；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８，６０８２−６０８６，
１９９１）。

【０００７】また、ＨＩＶ−１ｇｐ１２０のＣ−末端
３番目に位置する（アミノ酸残基３９７−４３９）ＣＤ
４結合区域（以下“ＣＤ４ＢＤと称する）はＨＩＶ感染
性に必須の役割をする。しかし、この部位は免疫体系に
接近することができないポケット（ｐｏｃｋｅｔ）を形
成するため免疫原性に弱く、この部位に対する高力価の
中和抗体をも現実的には利用することができない。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は抗原性
および免疫原性の優れたＨＩＶのｇａｇキメラ蛋白を提
供することにある。また、本発明の目的はキメラ遺伝子
を含む組換えバキュロウイルスを提供することにある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者は前記目的に合
致したＨＩＶのｇａｇキメラ蛋白およびキメラ遺伝子を
含む組換えバキュロウイルスを得るべく鋭意検討した結
果、Ｖ３ループまたはＶ３＋ＣＤ４ＢＤ実現の担体（ｃ
ａｒｒｉｅｒ）としてＨＩＶ−２ｇａｇ粒子を選択し
た。本発明者はすでに昆虫においてプロテアーゼ遺伝子
の欠損したＨＩＶ−２のｇａｇコード配列の発現がウイ
ルス類似粒子を生成することを報告した（Ｖｉｒｏｌｏ
ｇｙ１７９，８７４−８８０，１９９０）。ｇｐ１２
０の中和エピトープであるＶ３および（または）ＣＤ４
ＢＤを含むキメラｇａｇ粒子の形成はＨＩＶ中和抗体の
効率的生産を可能にする。粒子形態の抗原はエピトープ
の免疫原性を高め、特異エピトープが多数再現する。ま
た、分泌されるキメラ粒子は細胞培養物を遠心分離する
ことによって安定、かつ容易に収集、精製される。本発
明はＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２のｅｎｖ糖蛋白中にｇ
ｐ１２０のＶ３ループまたはＶ３＋ＣＤ４ＢＤ部分を含
む６個の相異なるキメラｇａｇ遺伝子の製造および粒子
形成のためのｇａｇ蛋白の必須区域のマップを明らかに
する。本発明によるキメラｇａｇ粒子はバキュロウイル
ス発現ベクターを利用して昆虫細胞内で発現する。

【００１０】粒子を形成するのに必要なＨＩＶ−２のｇ
ａｇ部分の最小の長さは３７６個のアミノ酸配列であ
り、そのうち３７３番目の位置のプロリン（ｐｒｏｌｉ
ｎｅ）が粒子形成に必須である。本発明によるキメラｇ
ａｇ粒子は特定融合蛋白だけが発現され、ｇａｇとｅｎ
ｖエピトープの抗原性および免疫原性を有しているの
で、組換えサブユニットワクチンに非常に有用に使用
できる。

【００１１】本発明はｇａｇとｅｎｖとを結合したキメ
ラ遺伝子を製造するためにＨＩＶのｇａｇ粒子形成に必
要な最小限のＨＩＶ−２ｇａｇ遺伝子配列マップを提
供する。公知の５１９個のアミノ酸配列において、Ｃ−
末端部位から１４３個のアミノ酸を除いた、Ｎ−末端部
位から３７６個のアミノ酸配列の部分はＨＩＶのｇａｇ
粒子を形成する最短の蛋白である。しかし、当該３７６
個のアミノ酸配列から、さらに４個のアミノ酸を除いて
Ｎ−末端部位から３７２個のアミノ酸配列だけが残存し
ている断片は粒子形成をしない。また、粒子形成に必須
なアミノ酸の位置がＮ−末端から３７５番目と３７７番
目でなく、３７３番目のプロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）の
位置特異的変異（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔ
ａｇｅｎｅｓｉｓ）であることが明らかになった。本発
明者は４２５個のアミノ酸をコードする切断したＨＩＶ
−２ｇａｇの遺伝子にＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の
ｇｐ１２０ｅｎｖ遺伝子配列のうち、Ｖ３とＶ３＋Ｃ
Ｄ４ＢＤ部分とを結合して昆虫細胞において発現させる
ことによって本発明を完成した。

【００１２】ｅｎｖ遺伝子をｇａｇ遺伝子の３’−末端
部分に結合した時のキメラ遺伝子産物がウイルス類似粒
子を形成する。特に、そのうちＨＩＶ−２ｇａｇ（４
２５個アミノ酸）とＨＩＶ−１Ｖ３（９１個アミノ
酸）、ＨＩＶ−２ｇａｇとＨＩＶ−２Ｖ３（９０個
アミノ酸）、ＨＩＶ−２ｇａｇとＨＩＶ−２Ｖ３＋
ＣＤ４ＢＤ（１９８個アミノ酸）の遺伝子産物が分泌形
ウイルス類似粒子を高い水準で発現する（表１参照）。

【００１３】

【表１】

【００１４】また本発明はキメラ遺伝子を含む組換えバ
キュロウイルスを提供する。本発明の組換えバキュロウ
イルスを製造するには、バキュロウイルスとしてオート
グラファカリホルミカニュクレアポリヘドロシス
ウイルス（ＡｕｔｏｇｒａｐｈａＣａｌｉｆｏｒｍ
ｉｃａｎｅｃｌｅａｒｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ
ｖｉｒｕｓ：ＡｃＮＰＶ）またはボムビクスイリデセ
ントウイルス（Ｂｏｍｂｙｘｉｒｉｄｅｓｃｅｎｔ
ｖｉｒｕｓ）を使用して製造することができる。製造
されたキメラ遺伝子をＡｃＮＰＶゲノム内に挿入し、プ
ラーク（Ｐｌａｑｕｅ）精製して組換えウイルスを得
る。この中でＨＩＶ−２のｇａｇが挿入されたＡｃＮＰ
ＶはＡＴＣＣ寄託番号ＶＲ２３１４として、ＨＩＶ−２
のｇａｇ部分とＨＩＶ−１のＶ３が挿入されたＡｃＮＰ
ＶはＡＴＣＣ寄託番号ＶＲ２３１６として、ＨＩＶ−２
のｇａｇ部分とＨＩＶ−２のＶ３が挿入されたＡｃＮＰ
ＶはＡＴＣＣ寄託番号ＶＲ２３１７としてＡＴＣＣに１
９９１年２月２６日付で寄託され、これらは研究の目的
の分譲を保障されている。

【００１５】そのように製造した組換えバキュロウイル
スを、昆虫細胞であるスポドプテラフルギペルダ（Ｓｐ
ｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ：ＳＦ９）細
胞、マメストラブラシカ（Ｍａｍｅｓｔｒａｂｒａ
ｓｓｉｃａ）細胞、トリコポプルシアニ（Ｔｒｉｃｈ
ｐｏｐｌｕｓｉａｎｉ）細胞、ボムビクスモリ（Ｂ
ｏｍｂｙｘｍｏｒｉ）細胞およびボムビクスモリ
カイコよりなる群から選ばれた細胞に感染させてｇａｇ
キメラ蛋白を発現させる。

【００１６】本発明によるｇａｇキメラ蛋白は、ウサギ
において中和抗体を誘発し、ＨＩＶ感染を完全に阻止す
る。本発明によるｇａｇキメラ蛋白はＡＩＤＳワクチン
の抗原またはＡＩＤＳ診断用試薬の抗原として有用であ
る。本発明のＡＩＤＳワクチンはＨＩＶ感染またはＡＩ
ＤＳ疾患を治療または予防するために感染前後に使用す
るワクチンを含み、免疫原に特異な免疫反応を示す。ワ
クチンの形態は通常の吸着剤、安定剤、補助剤、担体等
を含有し、一般の投与経路で人体に投与することができ
る。

【００１７】

【実施例】以下、実施例および参考例を挙げて本発明を
さらに詳述するが、本発明の範囲がこれらの例により限
定されるものではない。

【００１８】実施例１（プラスミドの製造）本発明で使用されるバキュロウイルスであるオートグラ
ファカリホルミカニュクレアポリヘドロシスウイ
ルス（ＡｃＮＰＶ）および組換えＡｃＮＰＶは２７℃に
て１０％の牛胎児血清を含むＴＮＭ−ＦＨ培地を使用
し、ＳＦ９細胞単層において公知の方法によって培養す
る（Ａｄｖ．ＶｉｒｕｓＲｅｓ．３５，１７７−１９
２，１９８８）。ＡｃＮＰＶＤＮＡの野生型（ｗｉｌ
ｄｔｙｐｅ）はＳｍｉｔｈとＳｕｍｍｅｒｓとの方法
によって精製する（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ８９，５１７−
５２７，１９７８）。プラスミドｐＨＸＢ−２Ｄ、ｐ
１ＢＭはそれぞれＨＩＶ−１_HXB2 _DとＨＩＶ−２_NIHZの
すべてのゲノムを含むものであって米国ＮＩＨから分譲
を受けて使用した（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１７９，８７４
−８８０，１９９０）。また、ｐＨＸＢ−２Ｄとｐ１Ｂ
ＭよりサブクローニングしてＨＩＶのｅｎｖを含むｐＵ
Ｃ１９−ｇｐ１２０−ＮＳＳプラスミド、ＨＩＶ−２の
ｅｎｖを含むｐＵＣ１８−ｇｐ１２０プラスミドおよび
ＨＩＶ−２のｇａｇ（４２５個のアミノ酸をコードする
遺伝子）を含むｐＵＣ１９−ＧＡＧプラスミドを製造す
る。

【００１９】実施例２（ｇａｇ遺伝子の製造）粒子形成に必須であるＨＩＶ−２ｇａｇ蛋白区域のマ
ップを作成するために欠損（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）、位置
特異的変異導入法を使用した。図１にＨＩＶ−２ｇａ
ｇの各断片と粒子形成能の関係を示すが、該図よりＮ−
末端の３７６個のアミノ酸が粒子形成に必須であること
がわかる。従来の報告とは対照的にＣ−末端のｚｉｎｃ
−ｆｉｎｇｅｒ区域はｇａｇ粒子形成に必須でない。ま
た、位置特異的変異の実験結果を図２に示すが、その結
果によると３７３番目の位置のプロリン（ｐｒｏｌｉｎ
ｅ）が粒子形成に必須であることがわかる。即ち、外部
エピトープがｇａｇ粒子に組み合わされる（ｐａｃｋａ
ｇｅ）ためにはＨＩＶ−２ｇａｇｒｅａｄｉｎｇ
ｆｒａｍｅの完全な１，１２８塩基対（ｂａｓｅｐａ
ｉｒｓ）が必須であることがわかる。

【００２０】実施例３（キメラ遺伝子の製造）ｇａｇとｅｎｖキメラ蛋白を表現するプラスミドを製造
するためにｐＵＣ１９−ＧＡＧ内にＨＩＶ−１とＨＩＶ
−２のＶ３およびＶ３＋ＣＤ４ＢＤ部分のｅｎｖ遺伝子
をサブクローニングして挿入する。組換えプラスミドで
あるｐＵＣ１９−ｇｐ１２０−ＮＳＳ（ＨＩＶ−１）と
ｐＵＣ１８−ｇｐ１２０（ＨＩＶ−２）を鋳型として使
用して特定地域を適当なオリゴヌクレオチドプライマ
ー（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｉｍｅｒ
ｓ）により増幅させた。即ち、ＨＩＶ−１Ｖ３区域
（９１個アミノ酸、２７３−３６３位置）に対応するｅ
ｎｖＤＮＡ断片、ＨＩＶ−２のＶ３区域（９０個アミ
ノ酸、２９４−３８３位置）に対応するｅｎｖＤＮＡ
断片およびＶ３＋ＣＤ４ＢＤ（１９８個アミノ酸、２９
４−４９１位置）の増幅は、ＰＣＲ法によって前記の組
換えプラスミドを使用して行なう。すべてのプライマー
（ｐｒｉｍｅｒｓ）は５’末端にＢｇｌＩＩｓｉｔｅ
を有するようにしてｇｐ−１２０ＤＮＡ断片がｐＵＣ１
９−ＧＡＧのＢｇｌＩＩ位置に挿入されるようにした。
ＨＩＶのｐＵＣ１９−ＧＡＧＢｇｌＩＩｓｉｔｅは
公知のｃｒｏｓｓｏｖｅｒｌｉｎｋｅｒｍｕｔａｇ
ｅｎｅｓｉｓ（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１７７，１０６−１
１５，１９９０；Ｇｅｎｅ４７，２６１−２６７，１
９８６）によって生成された３４５ヌクレオチド位置
（ＰｓｔＩｓｉｔｅ下流）および１２７５位置（終
止コドンのすぐ前Ｃ−末端）につくられる。ＨＩＶ−１
ｇｐ１２０のＶ３＋ＣＤ４ＢＤ（１９４個アミノ酸、
２７３−４６６位置）を示す５８２塩基対ＢｇｌＩＩ断
片はｐＵＣ１９−ｇｐ１２０−ＮＳＳから分離してｐＵ
Ｃ１９−ＧＡＧのＣ−末端ＢｇｌＩＩ位置に挿入させ
た。ＨＩＶ−１Ｖ３ＤＮＡ断片はそれぞれ８１６よ
り８３６ヌクレオチドまで、１０７５より１０８９ヌク
レオチドまで相補性のＬ−１プライマー（５’−ＣＧ
ＡＡＧＡＴＣＴＧＴＣＡＡＴＴＴＣＡＣＧＧ−３’）お
よびＬ−２プライマー（５’−ＧＣＡＧＡＴＣＴＴＴ
ＧＣＴＴＡＡＡＧＡＴＴＡ−３’）を使用して増幅させ
た。ＨＩＶ−１のＶ３＋ＣＤ４ＢＤＤＮＡ断片はｐＵ
Ｃ１９−ｇｐ１２０−ＮＳＳｇｐ１２０の８１６ヌク
レオチド位置および１３９８ヌクレオチド位置において
ＢｇｌＩＩ断片によって生産する。Ｌ−３プライマー
（５’−ＣＧＡＧＡＴＣＴＣＡＴＴＧＴＡＡＧＡＧＣＣ
−３’）およびＬ−４プライマー（５’−ＧＣＡＧＡ
ＴＣＴＴＣＴＧＣＡＧＴＴＡＧＴＣＣ−３’）はそれぞ
れＨＩＶ−２ｇｐ１２０の８７９より８９３ヌクレオチ
ドまで、１１３５より１１４９ヌクレオチドまで相補性
を有し、ＨＩＶ−２Ｖ３ＤＮＡ断片を合成するのに
使用される。プライマーＬ−３とＨＩＶ−２ｇｐ１２
０の１４５９より１４７３ヌクレオチドまで相補性を有
するＬ−５プライマー（５’−ＧＣＡＧＡＴＣＴＣＴ
ＴＴＡＣＴＧＡＴＧＴＡＧ−３’）はＨＩＶ−２Ｖ３
＋ＣＤ４ＢＤＤＮＡ断片を合成するのに使用される。
ＰＣＲ（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃ
ｔｉｏｎ）はＧｅｎｅａｍｐＫｉｔ（Ｎｏｒｗａｌ
ｋ、ＣＴ）が提供する手順によって行なう。簡単に説明
すると、２０ngの一本鎖（ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ）ｇｐ
１２０遺伝子ＤＮＡを２００μＭのｄＮＴＰ、２．５ｕ
ｎｉｔのＴａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、２０μＭのオ
リゴヌクレオチドプライマー（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅ
ｏｔｉｄｅｐｒｉｍｅｒ）を含む１００μｌのＰＣＲ反
応混合物（１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０mM ＫＣ
ｌ、０．０１％ｇｅｌａｔｉｎ）に添加する。Ｖ３およ
びＶ３＋ＣＤ４ＢＤ遺伝子は３０ＰＣＲｃｙｃｌｅ
（９４℃１分、４５℃２分、７２℃３分）間増幅させ
る。Ｖ３およびＶ３＋ＣＤ４ＢＤ断片を有するキメラｇ
ａｇ遺伝子生産物はＳｅｑｕｅｎａｓｅＫｉｔ（Ｕｎ
ｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＣｏ
ｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を利用した二本鎖のＤＮＡのジデ
オキシＤＮＡシークエンシング（ＤｉｄｅｏｘｙＤＮ
Ａｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）によって確認した。以上の
方法によってｇａｇＭ−１Ｖ３、ｇａｇＣ−１Ｖ３、ｇ
ａｇＣ−１Ｖ３＋１ＣＤ４ＢＤ、ｇａｇＭ−２Ｖ３、ｇ
ａｇＣ−２Ｖ３、ｇａｇＣ−２Ｖ３＋２ＣＤ４ＢＤ等の
キメラ遺伝子を製造する（Ｖ３とＣＤ４ＢＤ前の１、２
はそれぞれＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２由来であることを示
し、ｇａｇＭはｇａｇ遺伝子の中間部位に、ｇａｇＣは
ｇａｇ遺伝子の末端部位に結合したキメラ遺伝子を示
す）。本キメラ遺伝子の製造過程を図３及び図４に示
す。

【００２１】実施例４（組換えバキュロウイルスの製造
方法）まず、実施例３で製造したキメラ遺伝子をＢａｍＨ１
によって切断した後、分離してバキュロウイルス転移ベ
クター（ｔｒａｎｓｆｅｒｖｅｃｔｏｒ）のｐＡｃＹ
Ｍ１に挿入する。ＳＦ９細胞を感染性の野生型ＡｃＮＰ
ＶＤＮＡ（１μｇ）と組換えプラスミドＤＮＡ（４μ
ｇ）の混合物により標準手順を利用してコトランスフェ
クション（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させる
（Ａｄｖ．ＶｉｒｕｓＲｅｓ．３５，１７７−１９
２，１９８８）。前記の方法によって製造された組換え
バキュロウイルスのうち、ＨＩＶ−２のｇａｇが挿入さ
れたＡｃＮＰＶ（ＡｃＨＩＶ２ＧＡＧＹＫと称する）は
寄託番号ＶＲ２３１４、ＨＩＶ−２のｇａｇ部分とＨＩ
Ｖ−１のＶ３が挿入されたＡｃＮＰＶ（ＡｃＨＩＶ２Ｇ
ＡＧ＋１Ｖ３ＹＫと称する）は寄託番号ＶＲ２３１６、
ＨＩＶ−２のｇａｇ部分とＨＩＶ−２のＶ３が挿入され
たＡｃＮＰＶ（ＡｃＨＩＶ２ＧＡＧ＋２Ｖ３ＹＫと称す
る）は寄託番号ＶＲ２３１７として、ＡＴＣＣに１９９
１年２月２６日付で寄託されており、これらは研究目的
の分譲を保障されている。組換えバキュロウイルスは２
７℃で４日培養した後、培養浮遊物を収集して、ＳＦ９
細胞の８０％会合単層（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔＭｏｎｏ
ｌａｙｅｒ）で滴定する。ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ−陰性
組換えＡｃＮＰＶを得るためにｐｏｌｙｈｅｄｒａ−欠
損プラークを収集し、３回の連続プラーク（ｐｌａｑｕ
ｅ）分析によって精製して２×１０⁸ＰＦＵ／ml以上の
ウイルスを生産する。

【００２２】実施例５（キメラｇａｇ粒子の発現）ＳＦ９細胞５ＰＦＵ／ｃｅｌｌの多数感染地域に、キ
メラ遺伝子を含む組換えＡｃＮＰＶまたは野生型ＡｃＮ
ＰＶを感染させて、２７℃で培養する。培養（約３〜５
日）した後、細胞を収集して、ＰＢＳで２回洗浄する。
すべての細胞溶解物（ｌｙｓａｔｅｓ）は蒸留水で細胞
ペレットを再懸濁させて、２×溶解緩衝液（１０％ β
−メルカプトエタノール、１０％ＳＤＳ、２５％グ
リセロール、１００mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH７．０、
０．０４％ブロモフェノールブルー）を等容積添加
する。細胞溶解物をＳＤＳ含有１２％ポリアクリルアミ
ドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にて電気泳動分析し、蛋
白バンドはクマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅｂｌ
ｕｅ）で染色して観察することができる（Ｎａｔｕｒｅ
２２７，２８３−３０３，１９８７）。その後、ＡＩ
ＤＳ患者の血清とＢｉｏ−ＲａｄＩｍｍｕｎｅＢｌ
ｏｔＡＫｓｙｓｔｅｍを利用してウエスタンブロ
ッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ）分析
を行なう。その結果を図５に示した。図５Ａは組換えバ
キュロウイルスであるＡｃ−ｇａｇＭ−１Ｖ３、Ａｃ−
ｇａｇＣ−１Ｖ３とＡｃ−ｇａｇＣ−１Ｖ３＋１ＣＤ４
ＢＤにより生成された蛋白を示す。本来のＨＩＶ−２ｇ
ａｇ蛋白がＣ−末端で９３個のアミノ酸を欠損している
のでＨＩＶ−１ｇｐ１２０のＶ３（９１個のアミノ
酸）またはＶ３＋ＣＤ４ＢＤ（１９４個のアミノ酸）を
ｇａｇｇｅｎｅに挿入したことにより、５５ＫＤａ蛋
白と６６ＫＤａ蛋白をそれぞれ生産したものと思料され
る。図５Ａで示したように、５５ＫＤａと６６ＫＤａに
共に存在する濃く染色された蛋白バンドはＡｃ−ｇａｇ
Ｍ−１Ｖ３（レーン２）、Ａｃ−ｇａｇＣ−１Ｖ３
（レーン３）とＡｃ−ｇａｇＣ−１Ｖ３＋１ＣＤ４Ｂ
Ｄにより感染されたＳＦ９細胞の溶解物では観察された
が、模型（ｍｏｃｋ）または野生型バキュロウイルス感
染細胞の溶解物では存在しない。ウエスタンブロッティ
ング分析によりｐ５５またはｐ６６融合蛋白がＨＩＶ−
１陽性ヒト血清プール（ｐｏｏｌ）によって認識される
（図５Ｂ，レーン２，３，４）。この結果は、ｇａｇ蛋
白にＨＩＶ−１のＶ３またはＶ３＋ＣＤ４ＢＤの挿入が
組換えＡｃＮＰＶ−ＨＩＶ−２ｇａｇのものより高い水
準の蛋白発現を招来することを示す（図５Ａ、レーン
１）。ＨＩＶ−２ｇｐ１２０からのＶ３とＶ３＋ＣＤ
４ＢＤ遺伝子を含むＡｃ−ｇａｇＭ−２Ｖ３、Ａｃ−ｇ
ａｇＣ−２Ｖ３およびＡｃ−ｇａｇＣ−２Ｖ３＋２ＣＤ
４ＢＤを分析したときも同じ結果を得た。

【００２３】実施例６（キメラ蛋白の精製）実施例５のように培養した細胞浮遊物を２０分間、１０
００×ｇで遠心分離する。培養浮遊物中のキメラ粒子は
１時間、８０，０００×ｇで超遠心分離（Ｂｅｃｋｍａ
ｎｎＳＷ２８Ｒｏｔｅｒ）した後、０．１％、ＴＷ
ＥＥＮ２０、１０μｇ／mlアプロチニン（Ａｐｒｏｔｉ
ｎｉｎ）を含むＰＢＳに再懸濁し、４℃で保管する。キ
メラ蛋白粒子のバンドは２０〜６０％不連続蔗糖濃度勾
配遠心分離方法により分離、収集した後、ＰＢＳで１０
倍以上に希釈し、８０，０００×ｇで１時間超遠心分離
する。収集されたペレットをＰＢＳで徐々に懸濁する。
ｇａｇＣ−１Ｖ３とｇａｇＣ−２Ｖ３粒子は、５０％蔗
糖フラクション部分から、ｇａｇＣ−２Ｖ３＋２ＣＤ４
ＢＤ粒子は６０％蔗糖フラクションの上層から精製され
る。精製されたキメラ粒子に対する電子顕微鏡分析の結
果を図６に示した。図６中、Ａは製造されたＨＩＶ−２
ｇａｇ粒子、Ｂはキメラｇａｇ−１Ｖ３粒子、Ｃは
キメラｇａｇ−２Ｖ３粒子、Ｄはキメラｇａｇ−２
Ｖ３＋２ＣＤ４ＢＤ粒子に対する電子顕微鏡写真であっ
て、互いに形態が非常に類似することがわかる。図中の
右下の長さは１００nmを示す。単に、ｇａｇ粒子とキメ
ラｇａｇ粒子との差異点はキメラｇａｇ粒子の直径が約
１３０nmであってｇａｇ粒子より約２０〜３０％大き
く、成熟したＨＩＶ−１粒子の直径と類似する点であ
る。

【００２４】参考例１（キメラｇａｇ粒子の抗原性）キメラｇａｇ粒子の抗原性はイムノブロッティング（ｉ
ｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）分析法によって調べた。
即ち、精製されたキメラｇａｇ粒子とＨＩＶ−１、ＨＩ
Ｖ−２のｇｐ１２０をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけてニトロ
セルロースフィルターに電気泳動させる。その後、
¹²⁵Ｉにて標識された蛋白Ａ（ＰｒｏｔｅｉｎＡ）に
対するウサギ抗血清と共に反応させた。その結果を図７
に示す。図中のレーン１はＨＩＶ−２ｇａｇ蛋白、レ
ーン２はＳＦ９細胞で発現した非糖化（ｎｏｎｇｌｙｃ
ｏｓｙｌａｔｅｄ）ｇｐ１２０蛋白、レーン３はｇａｇ
とＨＩＶ−１Ｖ３キメラ蛋白、レーン４はｇａｇとＨＩ
Ｖ−１Ｖ３＋ＣＤ４ＢＤ蛋白、Ｃは細胞対照群、Ｗは野
生型ＡｃＮＰＶ感染細胞の対照群を示す。ＨＩＶ−２
ｇａｇ蛋白は抗ｇｐ１２０血清にて認識されないが（図
７Ａ、図７Ｂ、レーン１）、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−
２の非糖化ｇｐ１２０は対応する血清に強い反応性を
示す（図７Ａ、図７Ｂ、６Ｂ、レーン２）。５５ＫＤａ
と６６ＫＤａ融合蛋白は特にＨＩＶ−１またはＨＩＶ−
２ｇｐ１２０に対するウサギ抗血清により認識される
（図７Ａ、図７Ｂ、レーン３，４）。即ち、キメラ蛋白
がｇｐ１２０に特異的な抗血清により検出され、挿入配
列であるＶ３またはＶ３＋ＣＤ４ＢＤに抗原性があるこ
とが認められる。

【００２５】参考例２（キメラｇａｇ−Ｖ３粒子の免疫
原性の確認実験）ＨＩＶのｇａｇまたはｅｎｖ蛋白に対する共同抗体を誘
導する粒子の生成能を調べるために、ウサギに精製した
ｇａｇＣ−１Ｖ３とｇａｇＣ−２Ｖ３キメラ粒子を４週
間隔にて４回にわたって免疫化した。ウサギ免疫血清
を、免疫化２週後に収集してＨＩＶ−１とＨＩＶ−２の
ｇｐ１２０を認識するかどうかを調べた。図８に示した
ように、ｇａｇＣ−１Ｖ３とｇａｇＣ−２Ｖ３キメラ粒
子に対する抗血清が担体ＨＩＶ−２蛋白のみならず（図
８Ａ、図８Ｂ、レーン１）、ＨＩＶ−１（図８Ａ、レー
ン２）とＨＩＶ−２（図８Ｂ、レーン２）の非糖化ｇｐ
１２０を認識する（図８Ａ、レーン２）。対照的に野生
型ＡｃＮＰＶに感染されたＳＦ９細胞（図８、Ｗｔ）と
非感染ＳＦ９細胞（図８、Ｃ）は共に抗血清を認識する
蛋白を有しない。その結果から、キメラｇａｇＣ−１Ｖ
３とｇａｇＣ−２Ｖ３粒子のＶ３ループ区域が抗原性と
免疫原性を有していることが明らかである。

【００２６】参考例３（ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２キ
メラｇｐ１２０−Ｖ３粒子の免疫血清についてのｉｎ
ｖｉｔｒｏウイルス感染の中和実験）キメラ粒子に対する逆転写酵素（Ｒｅｖｅｒｓｅｔｒ
ａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ：ＲＴ）能とｇａｇｐ２４生産
によって分析されるＨＩＶ感染性を中和させるか否かに
関する実験のためにウサギ抗血清を製造した。ウサギ抗
血清は精製されたキメラ粒子を２５μｇずつ１ケ月間隔
で４回にわたって筋肉注射して製造し、ウイルスとして
はＨＩＶ−１_IIIBとＨＩＶ−２_RODにて感染されたＨ９
細胞株を用いた。ウサギの抗ｇａｇＣ−１Ｖ３血清と抗
ｇａｇＣ−２Ｖ３血清をそれぞれＨＩＶ−１_IIBの５０
００ＴＣＩＤ₅₀またはＨＩＶ−２_RODの８０００Ｔ
ＣＩＤ₅₀を示す１００μｌのウイルスと混合しＨ９細胞
に感染させて、生成されるｇａｇ蛋白の量、培養培地で
のＲＴ活性度を感染した後（１−１６日）、日数による
ウイルス生成量によって分析した。その結果を図９〜図
１２に示した。図９と図１０はＨＩＶ−１に対するＲＴ
活性度およびｇａｇｐ２４の生成如何を観察した図で
あり、図１１と図１２はＨＩＶ−２に対するＲＴ活性お
よびｇａｇｐ２６の生成如何を観察した図である。そ
の結果によると、感染後９日まではｇａｇＣ−１Ｖ３と
ｇａｇＣ−２Ｖ３キメラ粒子に対する抗血清は完全にＨ
ＩＶ−１とＨＩＶ−２の生産をそれぞれ中断させる。し
かし、感染後１２日では少量のＨＩＶ−１が抗ｇａｇＣ
−１Ｖ３血清によって処理した培地において検出された
が、ｇａｇＣ−２Ｖ３キメラ粒子に対する抗血清はＨＩ
Ｖ−２感染性を完全に中和させる状態を維持する。しか
し、前免疫化血清（ｐｒｅ−ｉｍｍｕｎｅｓｅｒｕ
ｍ）としてＲＴとｇａｇｐ２４蛋白の生成に何らの減
少も認められなかった。なお、ＨＩＶ−２ウサギの抗ｇ
ｐ１２０血清がＨＩＶ−１に対するウサギのＨＩＶ−１
抗ｇｐ１２０血清よりもっと強いＨＩＶ−２中和能を示
した。すなわち、本発明によるキメラ蛋白がＨＩＶ−１
およびＨＩＶ−２に対する優れた中和能を示すことがわ
かる。

【００２７】

【発明の効果】本発明のキメラ蛋白はＡＩＤＳワクチン
の抗原またはＡＩＤＳ診断用試薬として有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＨＩＶ−２のｇａｇを位置特異的変異（ｓｉｔ
ｅｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）導入法
により切断したｇａｇ断片とその粒子形成能を示した図
である。

【図２】ＨＩＶ−２ｇａｇ断片のアミノ酸配列の位置特
異的変異と粒子形成能との関係を示した図である。

【図３】キメラｇａｇ−ｅｎｖ遺伝子の製造過程の一部
を示す図である。

【図４】キメラｇａｇ−ｅｎｖ遺伝子の製造過程の一部
を示す図である。

【図５】組換えバキュロウイルスから発現されたキメラ
粒子を代表する蛋白をクマシーブルー染色とウエスタン
ブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎ
ｇ）方法により示した図である。

【図６】蔗糖勾配遠心により精製されたキメラ粒子の電
子顕微鏡写真を示した図である。

【図７】キメラ粒子のＨＩＶ−１ｇｐ１２０とＨＩＶ
−２ｇｐ１２０に対するイムノブロッティング結果を
示した図である。

【図８】キメラ粒子のウエスタンブロッティング結果
を示した図である。

【図９】キメラ蛋白抗血清とＨＩＶ−１の反応における
ＲＴ活性度を示す図である。

【図１０】キメラ蛋白抗血清とＨＩＶ−１の反応におけ
るｇａｇｐ２４生成を示す図である。

【図１１】キメラ蛋白抗血清とＨＩＶ−２の反応におけ
るＲＴ活性度を示す図である。

【図１２】キメラ蛋白抗血清とＨＩＶ−２の反応におけ
るｇａｇｐ２６の生成を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｑ 1/04 6807−4Ｂ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】組換えＨＩＶのｇａｇ−ｅｎｖキメラ蛋
白。
【請求項２】ｇａｇがＨＩＶ−２のｇａｇである請求
項１記載のｇａｇ−ｅｎｖキメラ蛋白。
【請求項３】ｇａｇがＮ−末端部位から少なくとも３
７６〜４２５個のアミノ酸配列を有するものである請求
項２記載のｇａｇ−ｅｎｖキメラ蛋白。
【請求項４】ｇａｇがＨＩＶウイルス類似粒子を形成
するものである請求項３記載のｇａｇ−ｅｎｖキメラ蛋
白。
【請求項５】ｇａｇがＨＩＶウイルス類似粒子の形成
に必須のＮ末端から３７３番目のプロリンを含むもので
ある請求項４記載のｇａｇ−ｅｎｖキメラ蛋白。
【請求項６】ｅｎｖがＨＩＶｇｐ１２０のＶ３ルー
プである請求項２記載のｇａｇ−ｅｎｖキメラ蛋白。
【請求項７】ｅｎｖがＨＩＶｇｐ１２０のＶ３＋Ｃ
Ｄ４ＢＤである請求項２記載のｇａｇ−ｅｎｖキメラ蛋
白。
【請求項８】ｅｎｖがＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２の
ｅｎｖである請求項６または７記載のｇａｇ−ｅｎｖキ
メラ蛋白。
【請求項９】組換えバキュロウイルスで発現される請
求項１記載のｇａｇ−ｅｎｖキメラ蛋白。
【請求項１０】寄託番号ＡＴＣＣＶＲ２３１６とし
て寄託された組換えバキュロウイルスで発現される請求
項９記載のｇａｇ−ｅｎｖキメラ蛋白。
【請求項１１】寄託番号ＡＴＣＣＶＲ２３１７とし
て寄託された組換えバキュロウイルスで発現される請求
項９記載のｇａｇ−ｅｎｖキメラ蛋白。
【請求項１２】昆虫細胞でＨＩＶのｇａｇ−ｅｎｖキ
メラ蛋白を発現させるためにキメラＨＩＶｇａｇ−ｅｎ
ｖ遺伝子が挿入された組換えバキュロウイルス。
【請求項１３】寄託番号ＡＴＣＣＶＲ２３１６とし
て寄託された請求項１２記載の組換えバキュロウイル
ス。
【請求項１４】寄託番号ＡＴＣＣＶＲ２３１７とし
て寄託された請求項１２記載の組換えバキュロウイル
ス。
【請求項１５】ＨＩＶのｇａｇとｅｎｖとを結合して
製造したキメラ遺伝子をバキュロウイルスのＤＮＡに挿
入し、得られた組換えウイルスにて昆虫細胞または昆虫
を感染させた後、培養して採取することを特徴とするＨ
ＩＶｇａｇ−ｅｎｖキメラ蛋白の製造方法。
【請求項１６】Ｎ−末端部位から少なくとも３７６〜
４２５個のアミノ酸配列を有するｇａｇをコードする遺
伝子とＨＩＶｅｎｖ遺伝子とによって得られるキメラ
遺伝子を使用することを特徴とする請求項１５記載のＨ
ＩＶｇａｇ−ｅｎｖキメラ蛋白の製造方法。
【請求項１７】キメラ遺伝子を使用してＨＩＶ類似粒
子を形成せしめることを特徴とする請求項１６記載の製
造方法。
【請求項１８】ＨＩＶｅｎｖ遺伝子がｇｐ１２０の
Ｖ３ループまたはＶ３＋ＣＤ４ＢＤをコードする遺伝子
である請求項１６記載のＨＩＶｇａｇ−ｅｎｖキメラ
蛋白の製造方法。
【請求項１９】ＰＣＲ法を利用してＶ３ループまたは
Ｖ３＋ＣＤ４ＢＤ遺伝子断片を製造し、これをプラスミ
ドに挿入することを特徴とする請求項１８記載の製造方
法。
【請求項２０】ＨＩＶ−１Ｖ３ＤＮＡ断片を製造
するために下記の２個のプライマーを使用することを特
徴とする請求項１９記載の製造方法。Ｌ−１プライマー（５’−ＣＧＡＡＧＡＴＣＴＧＴＣＡ
ＡＴＴＴＣＡＣＧＧ−３’）、Ｌ−２プライマー（５’−ＧＣＡＧＡＴＣＴＴＴＧＣＴ
ＴＡＡＡＧＡＴＴＡ−３’）
【請求項２１】ＨＩＶ−２Ｖ３ＤＮＡ断片を製造
するために下記の２個のプライマーを使用することを特
徴とする請求項１９記載の製造方法。Ｌ−３プライマー（５’−ＣＧＡＧＡＴＣＴＣＡＴＴＧ
ＴＡＡＧＡＧＣＣ−３’）、Ｌ−４プライマー（５’−ＧＣＡＧＡＴＣＴＴＣＴＧＣ
ＡＧＴＴＡＧＴＣＣ−３’）
【請求項２２】ＨＩＶ−２Ｖ３＋ＣＤ４ＢＤＤＮ
Ａ断片を製造するために下記の２個のプライマーを使用
することを特徴とする請求項１９記載の製造方法。Ｌ−３プライマー（５’−ＣＧＡＧＡＴＣＴＣＡＴＴＧ
ＴＡＡＧＡＧＣＣ−３’）、Ｌ−５プライマー（５’−ＧＣＡＧＡＴＣＴＣＴＴＴＡ
ＣＴＧＡＴＧＴＡＧ−３’）
【請求項２３】バキュロウイルスがオートグラファ
カリホルミカニュクレアポリヘドロシスウイルス
であることを特徴とする請求項１５記載の製造方法。
【請求項２４】昆虫細胞がスポドプテラフルギペル
ダ細胞、マメストラブラシカ細胞およびトリコポプルシ
アニ細胞よりなる群より選ばれた少なくとも１種の細
胞であることを特徴とする請求項１５記載の製造方法。
【請求項２５】バキュロウイルスがボムビクストリ
デセントウイルスであり、宿主細胞がボムビクスモ
リ細胞またはボムビクスモリカイコであることを特
徴とする請求項１５記載のＨＩＶｇａｇ−ｅｎｖキメ
ラ蛋白の製造方法。
【請求項２６】不連続蔗糖濃度勾配遠心分離法により
精製することを特徴とする請求項１５記載の製造方法。
【請求項２７】５０〜６０％蔗糖濃度で精製すること
を特徴とする請求項２６記載の製造方法。
【請求項２８】組換えＨＩＶのｇａｇ−ｅｎｖキメラ
蛋白および生理学的に許容される添加物を含むＡＩＤＳ
ワクチン組成物。
【請求項２９】寄託番号ＡＴＣＣＶＲ２３１６とし
て寄託された組換えバキュロウイルスで発現されるｇａ
ｇ−ｅｎｖキメラ蛋白を含む請求項２８記載のワクチン
組成物。
【請求項３０】寄託番号ＡＴＣＣＶＲ２３１７とし
て寄託された組換えバキュロウイルスで発現されるｇａ
ｇ−ｅｎｖキメラ蛋白を含む請求項２８記載のワクチン
組成物。