JP2007533644A - Ｈｉｖマトリックスタンパク質の部分に基づく免疫原性組成物及びワクチンの開発方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、免疫原性組成物に関する。更に特定すると、本発明は、少なくとも1つのHIVマトリックスタンパク質のミリステート共有結合部位に対する免疫反応を誘導することを対象とする組成物である。本発明は、タンパク質若しくはタンパク質フラグメント、メッセンジャーRNA、またはDNA/RNAという 3つのカテゴリーの実施態様を意図する。DNA/RNA組成物は、裸または組換えのどちらかであって良い。本発明は、更に各種の免疫刺激剤との使用を意図する。

Description

本願は、2003年10月23日出願の米国仮出願第60/513,827号の優先権の利益を享受する。

本発明は、ウイルス学及び免疫学の分野に関する。特に、免疫反応を誘導する方法、並びにそれを達成するためのHIVウイルスのマトリックスタンパク質(p17MA)のアミノ末端及びミリステート共有結合部位に基づく物質に関するが、それらに限らない。

ヒト免疫不全ウイルス(HIV)は、スローまたはレンチウイルス族に属するレトロウイルスであり、後天性免疫不全症候群(AIDS)の原因である。多くのエンベロープを有するウイルスと同様に、HIVは、ウイルス膜と細胞膜を融合し、感染及びウイルス複製を引き起こす。宿主細胞に融合すると、HIVは、ウイルス膜及び細胞膜の両者を超えて宿主細胞に自身のゲノムを移動させる。

HIVは、逆転写を介して標的細胞において相補的なウイルスDNAを作製するための鋳型として自身のRNAを使用する。次いで、ウイルスDNAは、感染した宿主のDNAに挿入されうる。HIVは、リンパ球及びマクロファージの様な表面CD4を有する細胞に感染し、CD4陽性ヘルパーTリンパ球を破壊する（CD4は、Th1及びTh2細胞の両者の一部である分化抗原no.4のクラスターを表す）。細胞膜分子は、白血球が各種のエフェクターサブセットに分化するために使用される。一般的には、分化の群（CD）としても知られている4タイプの細胞膜分子が詳述されている。タイプI及びIIは、細胞膜を横切る異極性を有する膜貫通タンパク質（TP）である。タイプIIITPは、数回細胞膜を横切るため、ポアまたはチャンネルを形成する可能性がある。タイプIVTPは、グリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）に結合される。CD4は、ヘルパー/インデューサーT細胞、単球、マクロファージ、及び抗原提示細胞を含む各種の細胞に発現するタイプI膜貫通タンパク質である。

この過程は、gp41糖タンパク質の構成成分である融合タンパク質に部分的に依存する。Fタンパク質構造は、プロテアーゼ耐性である（Weissenhorn, Nature Vol. 387, pp. 426-430 (1997)）。X線結晶学を使用してFタンパク質の3次元的な特徴が詳述されている。

HIVウイルスの外膜タンパク質であるgp41及びgp120は、お互いに非共有結合的に結合する。HIVビリオンの表面でgp120及びgp41は、三量体単位に集められている。3分子のgp120が、3分子のgp41と会合する。

前記gp120分子は、マクロファージ、単球、並びにヘルパーT細胞の表面に存在するCD4レセプターに結合する。この結合は、2つの分子間の高いアフィニティーによって特徴付けられる。ウイルス表面の高シアル酸含有量は、静電反発力を克服するために必要なしきい値結合エネルギーを減少する（Sun, 2002）。したがって、HIV粒子の標的宿主細胞への膜融合は、以下の工程を含むと解されて良い：
１．ウイルス結合CypAと宿主/細胞のヘパリンとの相互作用
２．CypA/ヘパリン相互作用を介する標的細胞に対するウイルスの結合
３．標的細胞のCD4分子に対するgp120の結合。この過程は、ケモカインレセプター（T細胞にとってはCCR5、マクロファージにとってはCXCR4）としても知られているコレセプタータンパク質を必要とする。ウイルスは、細胞と融合し始め、構造的及び立体配座的変化を引き起こし、他のレセプターを露出する。
４．gp120の立体配座の3次元的及び/または3次構造の変化によるgp41の融合ドメインまたはFタンパク質の露出。
５．gp120の立体配座的変化及び分断の結果としてのgp41分子からgp120の解離。
６．標的細胞の細胞膜を貫通する前のgp41のフォールディング。
７．Fタンパク質のアンフォールディング。
８．ウイルス粒子及び宿主細胞の膜の融合。
融合ペプチドの挿入は、標的宿主細胞の膜の脂質の完全性を崩壊させる。Fタンパク質は、ウイルス及び細胞の膜に結合し、融合タンパク質のアンフォールディングの状況で、標的細胞の細胞膜及びウイルス膜が、互いにつなぎ合わされる。

HIVのウイルス膜は、ウイルスが細胞膜から出芽する際に、感染した宿主細胞の細胞膜から形成される。したがって、エンベロープは、宿主細胞の構成成分である脂質及びタンパク質の幾つかを含む(Stoiber, 1996)(Stoiber, 1997)。幾つかのエンベロープを有するウイルスは、標的細胞レセプターへの結合及び他の標的細胞への進入のために宿主分子に似せたスパイクタンパク質を使用する。しかしながら、これらのスパイクは、免疫系の認識及びウイルスの破壊のための抗原性の表面にもなりうる。HIVは、宿主による免疫のチャレンジ（液性及びCD8介在性）から自身を保護している。立体配座的変化の多様性に加え、gp120は、糖タンパク質のコーティング、シアル酸残基との共有結合、または立体閉塞の様な免疫検出及び攻撃からHIVを隠す他の表面の特徴を提供する(Haurum, 1993)。HIVは、自身に有利になるように各種の免疫反応を活性化する。

HIVウイルス粒子のコアは司令部として機能する。HIVビリオンの内側は、ウイルスタンパク質であるp24（CA）からなるキャプシドである。キャプシドは、2本の一本鎖RNAを保持する。各RNA鎖は、15タンパク質をコードするHIVの9遺伝子の複製を提供する。9遺伝子のうち、3つ（gag、pol及びenv）は必須であると解されている。更なる6遺伝子も、9キロ塩基対RNAゲノム内に見られる（vif、vpu、vpr、tat、rev、及びnef）。より具体的には、env遺伝子は、gp120とgp41に分解されるgp160を作り出すための情報または暗号を保持している。同様に、gag遺伝子はマトリックス（p17またはMA）、キャプシド（p24またはCA）、ヌクレオキャプシド（p9、p6またはNC）をコードしている。pol遺伝子は、インテグラーゼ酵素及びRNアーゼH酵素、更に逆転写酵素を作り出すための遺伝情報をウイルスに提供する。他の6遺伝子は、調節遺伝子であり、感染及び複製の機構の制御を行っている（vif、vpu、vpr、tat、rev、及びnef）。他の遺伝子の中で、nef遺伝子は、効果的な複製のための情報を保持しており、vpu遺伝子は、感染した宿主細胞からの新しいウイルス粒子の放出を調節する情報を保持している。究極的には、HIVが標的細胞に感染するためには、HIVの遺伝物質が標的細胞の細胞質に注入されなければならない。

上記のように、nef遺伝子は、HIVの効率的な複製を促進すると解されている。新しいウイルス粒子の作製は、宿主細胞の膜で起こる。Nefは、複製を最適化する方法で感染細胞の環境に影響を与えるようである。ウイルスタンパク質は、宿主細胞の膜の近くに集まり、膜の中で出芽し、離脱する。これらのタンパク質は、三つの構造タンパク質（gp160、gp120、gp41）と二つの他の内部前駆体ポリタンパク質（Gag及びGag-Pol）である。Gag-Polタンパク質が、2本のプラス鎖RNAを芽にもたらし、同時にプロテアーゼが自身を切断し、遊離する。ウイルスが出芽した後、プロテアーゼが自身を切断することで遊離し、GagまたはGag-Polにおける残りのタンパク質を切断することで、各種の構造タンパク質及び逆転写酵素を放出する。ウイルスタンパク質は、プロテアーゼによって分離されるまで機能的でない。この様に、プロテアーゼは、Gag-Pol及びより小さいGagポリタンパク質の構造タンパク質への切断に関与している。放出されたタンパク質であるp24、p7、及びp6は、新しいキャプシドを形成するが、脂質膜の基礎はp17である。この過程において、gp160は、宿主の酵素によってgp120とgp41に分解される。

前記gag遺伝子は、スプライシングを受けていないウイルスメッセンジャーRNA(mRNA)から発現される、p55(Pr55^gag)とも称される、55キロダルトン(kD)のGag前駆体タンパク質を生じさせる。翻訳の過程において、p55のN末端は、ミリスチル化され、この事が、細胞膜の細胞質面との結合を引き起こす。膜結合Gagポリタンパク質は、感染細胞の表面からのウイルス粒子の出芽を引き起こす他のウイルス及び細胞のタンパク質に加え、ウイルスゲノムRNAの2つのコピーをリクルートする。出芽後、ウイルス成熟の過程において、p55は、ウイルスにコードされているプロテアーゼ（Pol遺伝子の生産物）によってMA（マトリックスまたはp17）、CA（キャプシドまたはp24）、及びNC（ヌクレオキャプシドまたはp9及びp6）と標記される4つの小さいタンパク質に切断される(Cohen, P. T. , et al., The AIDS Knowledge Base, 149 (1999) )。したがって、HIVコアは、p17を含む4つのタンパク質を含有する。要約すると、HIVウイルスは、構造及び酵素ペプチド(gag、pol、及びenv) をコードする3つの大きな遺伝子及び6つの小さい調節遺伝子（vif、vpu、vpr、tat、rev、及びnef）によってコードされている(Sande, Merle A. , et al., The Medical Management of AIDS, Ch. 2 (6th ed. 1999))。

Pr55^gag（gag遺伝子にコードされるポリペプチド）は、ウイルスのプロテアーゼに切断されて、4つの大きなペプチド及び2つの小さなペプチドを生成する。N末端からC末端まで、以下のタンパク質がタンパク質分解的に生産される；マトリックス(p17MA)、キャプシド(p24CA)、ヌクレオキャプシド(p7NC)、及びp6である。2つの小さなペプチドは、p24CAとp7NCの間に位置するp2及びp7NCとp6の間に位置するp1を含む。マトリックスタンパク質は、ウイルス脂質二重層の内部に集まり、それを安定化する(Zhou, Wenjun, et al., J. of Virology, pp 8540-8548 (Dec 1996))。

HIVウイルス複製の2つの重要な工程は、マトリックスタンパク質及びより大きなポリタンパク質前駆体Pr55^gagによって調節されている。(1)マトリックスタンパク質の核標的シグナル。(2) Pr55^gagの細胞膜への強力な局在シグナル。(Lee, Young-Min, et al., J. of Virology, pp 9061-9068 (Nov. 1998))

Pr55^gag局在シグナルは、膜に囲まれている細胞内小器官と細胞膜を区別する事ができる。細胞膜結合の特異性の鍵となる部分は、塩基性残基が豊富なドメイン（アミノ酸17-31）とN末端ミリストイル部分の存在の組み合わせによって与えられている。14炭素脂肪酸ミリステートは、HIVのPr55^gagのN末端に翻訳と同時に結合される。Pr55^gagが細胞膜を標的とする事は、ウイルスの組み立て及び出芽に必須である。(Zhou, 1996)

HIV病の前挿入複合体の活発な核への移行は、2つのウイルスタンパク質、p17MA及びVprによって調節されている。標的細胞膜へのウイルス膜の融合後、マトリックスタンパク質は、脂質二重層の内側の面から解離し、幾つかのマトリックス分子は、ウイルスRNAと共に、核膜を通過して核質に侵入する。そのため、HIV-1は、分裂していない細胞にも感染する事ができ、有糸分裂において生じる核膜の分裂に依存しない。殆どのウイルスは、分裂していない細胞に感染する能力がない(Zhou, 1996)。

Pr55^gagとMAの異なる膜への結合は、ミリストイルスイッチのためである。ミリステートは、MAタンパク質のN末端グリシンアミノ酸に共有結合される(Ono, Akira, et al., J. of Virology," pp 4136-4144 (May 1999) )。ウイルスのプロテアーゼによるPr55^gagの切断において、ミリステート部分が、MA分子の既に存在しているくぼみに挿入する。MA分子の三次元構造におけるこの変化は、アミノ酸9-11（セリン、グリシン、グリシン）における立体配座の変化の結果として生じる。そのため、MA分子は、より大きい前駆体Pr55^gagに比べ、脂質二重層に自身を固定するより少ない静電気力を有する。標的細胞との融合におけるウイルス膜の崩壊は、核への局在を可能にするマトリックス複合体を不安定化する。保護されるくぼみの内及び外のミリステート部分の反転は、ミリストイルスイッチとして既知であり、ADPリボシル化因子(ARF)、リカバリン、及びc-Ablを含む他のタンパク質においても見られる。ヒトゲノムにおけるミリストイル化されているタンパク質の現在の予測は、0.5％と概算している(Resh, Marilyn D., "A myristoyl switch regulates membrane binding of HIV-1 Gag," Proc. Natl. Acad. Sci., Vol 101 (2) 417-418 (Jan 13, 2004))。

ミリスチン化されているタンパク質は、ミリスチン酸[テトラデカン酸 CH₃(CH₂)₁₂COOH]と共有結合する。ミリスチン酸は、カルボン酸である。カルボン酸分子には極性が存在し、アルコール分子の様に互いに及び他の分子種と水素結合を形成する。ミリスチン酸は、実質的に水には不溶性であるが、脂質には可溶性であり、この事が、MA分子に固有に存在する細胞膜局在シグナルを部分的に説明する。

タンパク質の脂肪酸成分は、調節された標的手段として働く事ができる(Tedeschi, Henry, Cell Physiology Molecular Dynamics, ch. 4 (2003) )。幾つかのミリスチル化されているタンパク質のカルボキシル末端は、タンパク質標的及びシグナル伝達において使用される疎水性のアンカーを提供する。脂肪酸部位は、脂質二重層に対して疎水性の相互作用を介して結合する可能性がある。ミリスチン酸は、末端グリシンアミノ酸に翻訳と同時に付加される。

MAポリペプチド(p17)は、p55のミリスチン化されている末端であるN末端由来である。殆どのMA分子は、ビリオン脂質二重層の表面内側に結合されたままであり、粒子を安定化する。MAのサブセットは、ビリオンのより深い層の内側にリクルートされ、そこでウイルス膜と宿主細胞膜の融合が生じた後に核へウイルスDNAを導入する複合体の一部を形成する。MA上の核親和性のシグナルが、細胞の核への輸送装置によって認識されるため、これらのMA分子は、ウイルスゲノムの核への移行を容易にする。この事は重要である。なぜならば、この事によって、HIVがマクロファージの様な分裂していない細胞に感染できるためであり、これはレトロウイルスには独特の性質である(Cohen, P. T. , et al., The AIDS Knowledge Base 149 (1999))。

しかしながら、殆どのHIVワクチンは、ウイルスのエンベロープスパイクに対する中和抗体の生産を誘導するためにエンベロープの糖タンパク質（gp160、gp120及びgp41）の一部を使用する(Johnston, et al., 2001)。幾つかのワクチンは、高い力価の中和抗体を清算する事に成功している。この試みの後ろにある考えは、これらの糖タンパク質に結合する抗体は、ウイルスを中和し、感染を妨害するであろうという事である。免疫系を機能させる事は、次いで、ウイルスの溶解及び破壊へと続くであろう補体系を活性化するであろう。補体系は、抗体の役割を「補う」一連の循環タンパク質である。補体系の構成成分は、順に、または入れ替わりで活性化される。これが、補体カスケードである。補体の結末は、侵入している生物の表面に結合し、細胞膜に穴を開ける事により破壊しようとするタンパク質複合体である膜障害複合体(MAC)である。

免疫反応
したがって、HIVの主な効果は、CD4T+細胞を枯渇させる事であり、それにより免疫反応全体を低下させる。上記の様に、HIV感染は、CD4T+細胞に集中しているが、B細胞、血小板、内皮細胞、上皮細胞、マクロファージ等にも感染する。CD4T+細胞が枯渇させられると、B細胞反応が調節されなくなる。効果の無い抗体を伴う高ガンマグロブリン血症は、HIVの進行の特徴である。更に、細胞障害性CD8T細胞は、無能にされ、ウイルス感染を認識及び攻撃できなくなる。これは、感染CD4細胞において生成されたtatタンパク質の使用による非感染CD8細胞へのトランスフェクションに部分的によるものである。

CD4T+ヘルパー(Th)細胞は、サイトカインを生産し、Th1細胞またはTh2細胞のどちらかに分類されうる。Th1細胞は、細胞性免疫を促進する。一方、Th2細胞は、液性免疫を誘導する。サイトカインは、免疫反応を調節するケミカルメッセンジャーまたはタンパク質性の誘引物質である。HIV病におけるCD4＋ヘルパー細胞の枯渇は、特定のサイトカイン合成の減少を生じさせ、他の合成を促進する。サイトカインの調節不全は、ナチュラルキラー細胞及びマクロファージの活性を低下させる。さらに、インターロイキン-2の損失は、成熟T細胞のクローン性増殖及び活性化を遅らせる。

異なるウイルスの特徴は、細胞性及び液性免疫反応を増大または減少させる。幾つかの株及び進行の段階では、HIVは、過剰に活発であるが効果の無いTh2反応を伴うTh1反応の障害として特徴付けられて良い。Th1とTh2免疫反応の間のバランスは、一部はHIVの株に、一部は感染した動物の遺伝的環境に依存する様である。例えば、長期未発症感染者は、HIV病に対して効果的なTh1反応を備えている（Pantaleo, 1995）。

バランスの取れた免疫反応の形成及び特定のウイルスによって抑制された免疫反応のタイプを増強または補強することを対象とする免疫原性組成物は価値がある(Hogan, 2001)。

細胞性反応
HIVは、経時的に維持されず、究極的には、感染をコントロールできない最初の強い細胞性免疫反応を引き起こす様である(Mcmichael, 2001)。

CD8細胞障害性T-細胞(Tc)は、表面のMHC(主要組織適合遺伝子複合体)クラス1分子によって外来性の抗原を提示する細胞を認識し、攻撃する。CD4ヘルパー細胞(Th)は、ウイルス性微生物を殺すために取り込んでいるマクロファージを刺激する。CD4細胞によって生産されるサイトカインまたはインターロイキンは、病原体に対する免疫反応が主にTH1またはTH2由来のものかどうかを部分的に決定する。感染によっては、CD4細胞は、B-細胞のために選択するインターロイキン-4及びインターロイキン-5を生産する。B細胞は、MHCクラスII分子と複合体化した抗原を提示する。他の感染では、CD4細胞は、細胞障害性T細胞のために選択するIL-2を生産する。抗原の認識における機能の分割及び制限は、MHC制限を意味することがある。MHCクラスIは、一般的に、ウイルスタンパク質の様な内生的に合成された抗原を提示する。一方、MHCクラスIIは、一般的に、抗原提示細胞によってファゴサイトーシスされたバクテリアまたはウイルスタンパク質の様な細胞外性の微生物または抗原を提示する。抗原提示細胞は、次いで、表面のMHCIIタンパク質を使用して抗原に結合する。CD4細胞は、T細胞レセプターを介してこの抗原と相互作用し、活性化される。この事は、Tc細胞障害性反応を生産するための不活化ワクチンの無効性に寄与している(Levinson, 2002)。

上記の様に、T細胞は、細胞性反応を仲介する。抗原提示細胞は、MHC分子（またはヒト白血球抗原-HLA）と共にHIV抗原のペプチド部分（またはエピトープ）を個々のT細胞に対して提示し、T細胞反応を引き起こす。T細胞に提示されるエピトープのタイプは、HLA分子のタイプ（例えばHLA A,B,C,DR,DQ,DP）及びペプチド中のアミノ酸に依存する。HLA分子または変異型エピトープにおける遺伝的制限は、エピトープの回避及びHIVの持続性を引き起こす可能性がある(McMichael, 2001)。上記の様に、Th細胞は、一般的(例えばTh1及びTh2)な免疫反応のためにサイトカインを生産するが、HIVの場合では、Th細胞の感染によってこれが抑制される。HIV抗原に反応するHIV特異的Th細胞は、最終的に感染され、破壊または抑制される。この事は、細胞傷害性T細胞に二次的な効果を引き起こす。細胞傷害性T細胞は、MHCクラスI分子によって結合される感染細胞の異種抗原の認識及び攻撃を含む各種の抗ウイルス性の活性を示す（パーフォリン。グランザイム、FasL、及びサイトカインの生産の様な）。HIVは、感染細胞におけるHLAクラスI分子の発現を減少させることができ、感染したTh細胞を認識及び攻撃するTc細胞の能力を減少させる。更に、Th細胞の感染及び枯渇は、変異型ビリオンを成熟させ及びそれに対応する細胞傷害性T細胞の能力を崩壊させる(McMichael, 2001)。通常は、ウイルスの感染では、細胞傷害性T細胞がウイルスを除外または抑制する。しかし、HIVは、免疫細胞に感染すること、並びにTh細胞及び細胞傷害性T細胞の反応を弱めることによって細胞性免疫反応に対抗する。

したがって、Th1活性を刺激する免疫原性組成物は、好ましいHIVに対する免疫反応を促進する。

液性反応
免疫反応の液性の部門は、刺激によって抗体を生産するプラズマ細胞に分化するB細胞から成る。現れる第一の抗体は、IgMであり、続いて血中におけるIgGまたは分泌組織におけるIgAが存在するようである。これらの抗体の主な働きは、感染症及びそれらの毒に対する保護である。抗体は、ウイルス及び毒を中和するだけでなく、微生物のオプソニン化も行う。オプソニン化は、抗体がウイルスまたはバクテリアをより容易に食細胞に取り込まれ、破壊されるようにする過程である。食細胞は、多形核好中球(PMN)及び組織マクロファージの両者を含む。PMNは、非感染患者の血中における白血球の約60%を含む。PMN及び組織マクロファージの数は、特定の感染症で増加または減少する可能性がある。例えば、腸チフス熱は、白血球数の減少によって特徴付けられる（すなわち白血球減少症）。PMN及びマクロファージの両者は、バクテリア及びウイルスをファゴサイトーシスする。PMNは、ヘルパーT細胞に対して抗原を提示しないが、マクロファージ及び樹状細胞は提示する。

ファゴサイトーシスは、(1)移動、(2)摂取、及び(3)殺滅を含む。感染領域の組織細胞は、ケモカインとして知られる小さいペプチドを生産する。ケモカインは、PMN及びマクロファージを感染領域に誘引する。次いで、バクテリアは、液胞またはファゴソームを形成するバクテリア周辺のPMN細胞膜の陥入によって摂取される。飲み込みまたはオプソニン化は、バクテリアの表面に対するIgG抗体（オプソニン）の結合によって促進される。補体系のC3b構成成分は、オプソニン化を促進する(Hoffman, R. Hematology Basic Principles and Practice Ch. 37 (3rd ed. 2000))。PMN及びマクロファージの細胞膜は、C3b及びIgGのFc部分のためのレセプターを有する。

飲み込みに伴って、呼吸バーストとして知られる代謝パスウェイが引き起こされる。結果として、超酸化ラジカル及び過酸化水素の2つの殺菌剤がファゴソーム内で生産される。活性酸素中間体と通常呼ばれるこれらの高い反応性を有する化合物は、以下の化学反応によって合成される。

O₂+e-→O₂-
2O₂-+2H+→H₂O₂(過酸化水素)+O₂

第一の反応は、酸素分子を還元し、弱い殺菌剤である超酸化ラジカルを形成する。第二の反応は、ファゴソーム内で酵素であるスーパオキシドジスムターゼによって触媒作用を受け、過酸化水素を生産する。一般的には、過酸化水素は、超酸化ラジカルよりも効果的な殺菌剤である。呼吸バーストは、他の殺菌剤である亜酸化窒素(NO）も生産する。NOは、好中球及びマクロファージによるファゴサイトーシスによって摂取されたウイルス及びバクテリアの酸化的殺滅に関わるフリーラジカルを含む。ファゴソーム内のNO合成は、酵素NOシンターゼによって触媒作用され、ファゴサイトーシスの過程によって誘導される。

ファゴソーム内での生物の殺滅は、脱顆粒とそれに続く最も効果的な殺菌剤である次亜塩素酸イオンの生産から成る2段階の過程である。2つのタイプの顆粒が、好中球またはマクロファージの細胞質内で見られる。これらの顆粒は、ファゴソームと融合し、ファゴリソソームを形成する。次いで、顆粒の内容物は空になる。これらの顆粒は、殺滅及び分解に必須な各種の酵素を含むリソソームである。サイズによって区別される2つのタイプのリソソーム顆粒が同定されている。全体の約15％になる大きなリソソーム顆粒は、ミエロペルオキシダーゼ、リゾチーム、及び他の分解酵素を含む幾つかの酵素を含有する。残る85%は、小さい顆粒であり、それらは、ラクトフェリン、並びにプロテアーゼ、ヌクレアーゼ、及びリパーゼの様な他の分解酵素を含有する。微生物の実際の殺滅または破壊は、幾つかは酸素依存性であり幾つかは酸素非依存性である各種の機構によって生じる。最も重要な酸素依存性の機構は、ミエロペルオキシダーゼによって触媒作用される次亜塩素酸イオンの生成である。

Cl^-+H₂O₂→ClO+H₂O

抗体は軽(L)および重(H)ポリペプチド鎖から成る糖タンパク質である。最も単純な抗体は「Y」形を有し、2つのH鎖および2つのL鎖の4つのポリペプチドから成る。ジスルフィド結合がこれら4つの鎖を結合する。個々の抗体分子は、同一のH鎖および同一のL鎖を有する。L鎖およびH鎖は、可変および定常の2つの領域に更に分割される。これらの領域は、三次元的にフォールドされて繰り返されているセグメントまたはドメインを有する。L鎖は、1つの可変(V1)および1つの定常(C1)ドメインから成る。殆どのH鎖は、1つの可変(VH)および3つの定常(CH)ドメインから成る。可変領域は、抗原（ウイルス、バクテリアまたは毒素)との結合に関与する。定常領域は、補体結合および細胞表面受容体への結合を含むいくつかの必要な生物学的機能をコードする。補体結合部位は、CH2ドメインに位置する。

L-及びH-鎖の両者の可変領域は、抗原結合部位を構成するアミノ末端部分に3つの高度な可変（超可変）アミノ酸配列を有する。各超可変領域における5-10アミノ酸のみが、この部位を形成する。抗原-抗体結合は、静電気力及びファンデルワールス力を含む。更に、水素結合及び疎水結合が、抗原と抗体の超可変領域の間に形成される。各抗体の特異性または「唯一性」は、超可変領域に存在する。超可変領域は、抗体の指紋である。

各L-鎖のアミノ末端部分は、抗原結合に関わる。カルボキシ末端部分は、Fcフラグメントに関する。Fcフラグメント（分子の残りまたはFcフラグメントから抗体結合領域を分離する抗体分子のヒンジ領域のタンパク質分解的切断によって生産される）は、定常部分の生物学的活性、特に補体結合を表す。H-鎖は、各々の5つの免疫グロブリンクラスで異なる。IgG、IgA、IgM、IgE、及びIgDの重鎖は、各々γ、α、μ、ε、及びδと標記される。IgG免疫グロブリンクラスは、微生物をオプソニン化する。したがって、Ig（免疫グロブリン）のクラスが、ファゴサイトーシスを促進する(Hoffman, Ronald, et al., Hematology Basic Principles & Practice, ch. 36 & 39 (3rd ed. 2000) ) (Levinson, Warren, Medical Microbiology & Immunology, Ch. 59 & 63 (7th ed. 2002) )。IgGのγH-鎖のレセプターは、PMN及びマクロファージの表面で見られる。IgMは、食細胞表面にμH-鎖のレセプターが存在しないため、微生物を直接オプソニン化しない。しかしながら、IgMは、補体を活性化し、C3bタンパク質は、食細胞表面にC3b結合部位が存在するためオプソニン化できる(Levinson, 2002)。IgG及びIgMは、補体カスケードを開始する事ができる。実際、IgMの単分子は、補体を活性化する事ができる。IgGによる補体の活性化は、2つの架橋されたIgG分子が必要である（IgG1、IgG2、またはIgG3サブクラス、IgG4は補体活性を有さない）。細菌内毒素の様な各種の非免疫性の分子も、補体系を直接活性化できる。

補体系は、通常血清中に存在する約20タンパク質から成る。「補体」という言葉は、これらのタンパク質が抗体及び免疫グロブリンの様な免疫系の他の構成成分を補足または増大することを示している。補体カスケードは、3つの重要な免疫効果を有する：(1)微生物の溶解、(2)炎症に関わり、PMNを誘引する媒体の生成、(3)オプソニン化。

補体カスケードは、3つの経路の内の1つを介して生じる：(1)古典的、(2)レクチン、(3)副経路(Prodinger, Wm. , et. al., Fundamental Immunology, Ch. 29 (1998))。これらの経路は、図１に図示している。破線は、矢印の先端の分子のタンパク質分解的切断が生じていることを示す。複合体の上の線は、酵素活性を示している。C2の大きいフラグメントは、C2aまたはC2bと互換的に標記されることがあるが、約束として、本明細書では小さいフラグメントは「a」、大きいフラグメントは「b」として標記される。そのため、C3転換酵素は、C4b,2bである。ここで留意すべきは、マンノース結合レクチンと会合するプロテアーゼがC2並びにC4を切断する事である。これらの経路の各々が、細胞膜傷害複合体(MAC)の創出を引き起こす。

抗体が、ウイルスまたはバクテリアの特定の構成成分に結合するのに伴い、MACは、微生物の保護カバーに穴をあけ、血漿及び電解質を微生物に進入させる事ができ、同時に、微生物の内部構造の構成成分の放出手段を提供する。

古典的経路において、抗原-抗体複合体は、C1を活性化し、プロテアーゼを形成する。このプロテアーゼは、C2及びC4を切断し、C4b,2b複合体を形成する。C1は、C1q、C1r、及びC1sの3つのタンパク質から成る。C1qは、IgG及びIgMのFc部分に結合する18ポリペプチドから成る。Fcは多価であり、幾つかの免疫グロブリン分子を架橋できる。C1sは、切断されて活性プロテアーゼを形成する前酵素である。カルシウムは、C1の活性化における補因子として必要とされる。更に、C1の活性化は、IgG及び/またはIgMのFcドメインに対するC1qの少なくとも2つの球状頭部の多点での結合を必要とする。多くのFc免疫グロブリンとの結合でC1qにおいて誘導される変化は、C1rsサブユニットに伝達され、Clr二量体のタンパク質分解性自己活性化を引き起こす。次いで、Clr二量体は、C1sをタンパク質分解性活性化または切断する。上記の様に、活性化されたC1sは、C4及びC2のタンパク質分解性の切り継ぎのための触媒部位を有する。酵素複合体であるC4b,2bが生産される。これは、C3a及びC3bの2つのフラグメントにC3分子を切断するC3転換酵素として機能する。C3bは、C4b及びC2bと複合体を形成し、C5転換酵素である新しい酵素(C4b,2b,3b)を生産する。

レクチン経路において、マンナン結合レクチン（MBL、またはマンノース結合タンパク質）は、マンナンを発現する微生物の表面に結合する。MBPは、C1qに似た構造を有する血漿中のCタイプレクチンであり、ファゴサイトーシスを促進するC1qレセプターに結合する。マンノースは、各種の微生物の表面に見られるアルドヘキソースである。レクチン経路の第一の構成成分は、特定のマンノース（またはマンナン）結合タンパク質(MBP)である。C末端糖認識ドメインは、N-アセチルグルコサミンに対するアフィニティーを有し、マンノースリッチな表面被膜を発現する微生物を直接オプソニン化する能力をMBPに与える。血中において、MBPは、C1r様前酵素及びC1s様前酵素(特定のMBP結合セリンプロテアーゼ、または各々MASP-1及びMASP-2)との安定な複合体として循環する。MBP-MASP-1,MASP-2複合体は、適当な糖表面に結合する。この事は、MBPタンパク質における立体配座の変化を引き起こし、この変化は、MASP-1を活性セリンプロテアーゼに変換する内部ペプチド切断によるMASP-1の自己活性化を引き起こす。C1rの様に、活性MASP-1は、MASP-2を切断し、活性化する。活性MASP-2は、C4及びC2の両者をタンパク質分解的に活性化し、C4b,2b（C3転換酵素）酵素複合体の組立を開始する能力を示す。古典的経路の様に、この事が、C5転換酵素の生産を引き起こす。

副経路においては、バクテリアのリポポリサッカリド（内毒素）、菌の細胞壁、及びウイルスエンベロープの様な多くの関連の無い細胞表面構造が、C3(H₂O)及びB因子に対する結合によって、その過程を開始できる。この複合体は、プロテアーゼであるD因子に切断され、より多くのC3bを産生するC3転換酵素として機能するC3b,Bbを生産する。古典的経路の経時的な酵素カスケードに対して、副経路は、正のフィードバックを使用する。主な活性産物であるC3bは、C3b,Bbの補因子として機能すると共に、自身の生産にも関与する。したがって、副経路では、爆発的なC3活性化の準備が継続的にできている。C3活性化の速度は、C3b,Bb酵素複合体の安定性によって決定される。D因子によるB因子のタンパク質分解は、小さいフラグメント(Ba)及び大きいフラグメント(Bb)を生産する。比較的大きいBbフラグメントは、C3(H₂O)またはC3bのどちらかと結合する。Bbにおける触媒部位を介して、C3(H₂O),Bb複合体は、C3からC3a及びC3bにタンパク質分解的に転換できる。この機構によって産生される初期のC3bは、更なるB因子に結合する能力がある。そのため、補体副経路は、C3bの生産を促進する少なくとも2つの正のフィードバックループを有する。図１に示される様に、この経路も、C5転換酵素の生産を引き起こす。

各経路において、C5転換酵素(C4b,2b,3bまたはC3b,Bb,C3B)は、C5をC5a及びC5bに切断する。C5bは、C6及びC7に結合し、C8及びC9と相互作用する複合体を形成し、究極的にはMAC(C5b,6,7,8,9)を生産する (Hoffman, 2000)。

どの補体経路が活性化されるに関わらず、C3b複合体は、補体カスケードの中心的な分子である。免疫学的にC3bは、3つの役割を果たす。
１．MAC(C5b,6,7,8,9)の生産を引き起こす酵素であるC5転換酵素を産生する他の補体構成因子との経時的な結合
２．微生物のオプソニン化。食細胞は、細胞表面にC3bのレセプターを有する。
３．活性化したB細胞の表面のC3bレセプターに対する結合、これは抗体の生産を非常に促進する(Parham, Peter, The Immune System, ch.7 (2nd ed. 2004))。
液性反応は、補体因子Hの様なこの系の特定の調節因子を含む。この事は、HIVによる取り込みに対する脆弱性である。補体カスケードの活性を制限する能力を有する微生物のいずれもが、理論的には免疫系の液性の部門に対して自らを保護するだろう(Stoiber, Herbert,"Role of Complement in the control of HIV dynamics and pathogenis, Vaccine 21: S2/77-S2/82 (2003))。したがって、補体カスケードは、液性の部門のアキレス腱である。

HIVの液性反応との相互作用
レトロウイルスは、抗体の非存在下において補体系を活性化する事ができる(Haurum, J., AIDS, Vol. 7 (10), pp. 1307-13 (1993))。HIVエンベロープの糖タンパク質による補体の活性化は、ウイルス感染した細胞で生産される天然のエンベロープタンパク質上、並びにグリコシル化された組換えエンベロープタンパク質上の糖に対するMBPの結合によって仲介されると見られている(Haurum, John, AIDS, Vol 7(10), pp. 1307-13 (1993)) (Speth, C., Immunology Reviews, Vol. 157, pp. 49-67 (1997) )。レトロウイルスエンベロープによる古典的補体経路及びレクチン経路の活性化は、エンベロープ糖タンパク質の糖側鎖に対するMBPの結合によって開始されうる。HIV-1の膜貫通タンパク質であるgp41は、gp120と非共有結合的に結合することが示されている。補体構成成分であるC1qもgp41に結合する。gp41の細胞外部分（細胞外ドメイン）において、3つの部位（aa 526-538、aa 601-613、及びaa 625-655）がgp120及びC1qの両者に結合する。この様に、C1q及びgp120は、構造及び機能の両者に相同性が存在する。カルシウム非依存性であるgp41とgp120の結合とは異なり、gp41とC1qの間の相互作用は、カルシウム依存性である。

HIVが、抗体非依存的な様式で古典的及びレクチン経路を開始させ、この事がHIVによる補体レセプター陽性細胞の感染を引き起こす。C1qのgp41に対する結合は、異なる方法で感染を容易にする可能性がある。C1qは、HIV-1にも感染しているHIV感染細胞に直接結合する。C1qは、コレクチンレセプターとしても知られるC1qレセプターに結合する能力を保持する。更に、gp41は、マクロファージの細胞膜に固定されたC1qと直接相互作用する。いずれの場合も、HIVは、C1qを介してCD4非依存的に細胞に接触するための機会を有する。

gp120とC1qの相同性は、gp120がC1qレセプターと直接相互作用する可能性を高め、それによりCD4非依存的な様式でHIVのマクロファージへの進入を容易にする(Stoiber, Heribert, European Journal of Immunology, Vol 24, pp. 294-300 (1994))。gp120に対する抗体は、C1qと交差反応でき、少なくとも部分的には、HIV-1患者における有意に低いC1qの濃度に関与する可能性がある。C1qは、不溶性の免疫複合体のクリアランスに関与する因子の1つであり、その欠如は、HIV感染者で認められる不溶性の免疫複合体の有意に高い濃度に関与するであろう(Procaccia, S., AIDS Vol 5, p. 1441 (1991))。HIV病を特徴付ける低補体血症は、HIVに関連した日和見感染及びウイルスに関連した悪性度と関係する。

補体活性の調節因子は、細胞膜に結合した状態で見られうる。他のものは、ヒトの血漿及びリンパ液において自由に循環する。多くの補対活性の調節因子(RCA)は、特徴付けられており、3つの経路全てにおける殆ど全ての過程は、正及び負の調節の影響を受ける。3つの酵素複合体（C3転換酵素、C5転換酵素、MAC複合体）は、補体カスケード内の焦点であり、多数のインヒビターまたは触媒の影響を受ける。

補体活性化経路を調節する幾つかのタンパク質は、遊離の可溶性の分子として血漿中を循環し、流体相におけるC3活性化の調節または細胞表面でのMACの形成の阻害のどちらかを行える。補体因子H及び低分子量因子H様タンパク質の様な補体の調節因子が、この機能を仲介することが示されている。補体因子Hは、gp120と相互作用し、シンシチウムの形成及びエンベロープ糖タンパク質(env)複合体の可溶性CD4(sCD4)誘導性の解離を促進する。補体因子Hは、CD4に関わった後に活性化したgp120にのみ結合する。この事は、結合部位がenv複合体に隠されており、gp120とCD4の相互作用後にのみ露出される事を示す(Pinter, C., AIDS Research in Human Retroviruses, Vol. 11, (1995) )。gp120分子は、ヘルパーT細胞のCD4レセプターに結合する。次いで、前記ウイルスは、T細胞と融合する。前記融合ドメインは、gp41に位置する。融合の際に、gp120フラグメントは、分離される。gp41の細胞外ドメインは、gp120の分離後に露出される。gp41上のC1q及び補体因子Hの結合部位が、露出される

HIVは、特定の抗体の非存在下においてもヒトの補体系を活性化する(Stoiber, H, J. Ann. Rev. Immunology, Vol. 15,649-674 (1997) )。この事は、補体が妨げられなければ、ウイルスの不活化を引き起こすであろう。補体の過程は、妨げられなければ、細胞膜障害複合体(MAC)を生産し、ウイルス溶解を引き起こすであろう。しかしながら、HIVは、自身の構造に補体を調節する宿主の各種の分子(例えばDAF/CD55)を組み込む事によってウイルス溶解を避けている。HIVは、感染細胞からの出芽の際、つまりgp41及びgp120構造に対する結合によってウイルス膜にこれらの分子を含む(Stoiber, H. , J. Ann. Rev. Immunology, Vol. 15,649-674 (1997) )。この補体構成成分との相互作用は、感染性、濾胞への局在、及び標的細胞の範囲を促進する補体構成成分のHIVによる利用を可能にする。同時に、HIVは、液性の部門に対して防御する。

補体因子H及びCR1の様なタンパク質は、C3転換酵素における補因子と分解促進活性の両者を有する(Stoiber, H, J. Ann. Rev. Immunology, Vol. 15,649- 674 (1997) )。C3bの完全性は、細胞溶解を達成するために補体カスケードにとって必須である。C3bは、適当な補体レセプターとの相互作用後にセリンプロテアーゼ（補体因子1-CF1）によって急速に切断される。この反応を仲介するタンパク質は、CF1の補因子活性を有する。幾つかのタンパク質は、C3b及びC4bを産生する酵素（転換酵素）の組み立ての阻害、及び/または解離を支持することによって補体活性を下方制御する。この活性は、分解促進と称されており、CD55(DAF)タンパク質分子の特徴である。

補体因子Hを欠損している血清は、HIV及び感染細胞を溶解するが、未感染の細胞は溶解しない(Stoiber, H. , J. Exp. Med. , 183: 307-310 (1996))。補体因子Hの存在下では、補体因子Hの結合がgp41における補体因子H結合部位を標的とするモノクローナル抗体によって阻害された際に、HIVの溶解が起こる事が示されている。補体因子Hを欠くヒト血清は、HIVビリオンを効果的に溶解する。しかし、今までに、ヒトの補体に対するHIV及び補体因子Hの関係のこうした増大する知識を実行する手段を指示するものは存在していない。
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高度な試みが存在するにも関わらず、HIVの治療ワクチンは存在しない。HIVのライフサイクルの各種の過程は、発明者によって標的とされている。今までに、研究は、免疫抑制レトロウイルスHIV-1に対する効果的な免疫反応を促進するであろう組成物を発見していない。殆どのHIVワクチンは、ウイルスのエンベロープスパイクに対する中和抗体の生産を誘導するために、ウイルスの表面糖タンパク質(gp160、gp120、及びgp41) というエンベロープの部分を使用する(Johnston et al., 2001)。幾つかのものは、中和抗体の高い力価を生産することに成功している。この試みの後ろにある考えは、これらの糖タンパク質に結合する抗体は、ウイルスを中和し、感染を阻害するであろうという事である。免疫系を機能させる事は、次いで、ウイルスを溶解し、破壊につなげる補体系を活性化させうる。しかしながら、上記の液性反応の障害は、これらのワクチンの有効性を制限する。多くの薬剤または組成物(AZT、ddl、ddC、d4T、及び3TC)は、逆転写を阻害する。これらの2',3'-ジデオキシヌクレオシドアナログは、特定の株に対して効果的でありうるが、HIVのゲノム変異性に対する脆弱性を有する(Deeks, Steven, The Medical Management of Aids, Ch. 6 (6th ed. 1999) )。これらの薬剤は、毒性、コスト、複合治療法、薬剤-薬剤の相互作用、並びに薬剤耐性の問題に直面している。

HIVのライフサイクルの他の態様を阻害することは、あまり一般的ではない。幾つかの試みは、HIVのPr55^gagと細胞膜の間の相互作用を標的としている。Keener et al.,に対する米国特許第6,627,197号の様な少数の試みは、感染細胞を殺すためにプロテアーゼに活性化されたリシンの標的分子としてPr55タンパク質（ミリスチン酸に結合している）のN末端を利用している。しかしながら、HIVウイルスのマトリックスタンパク質(p17MA)のアミノ末端及びミリステート共有結合部位を利用し、細胞性及び液性免疫反応の両者の各成分を刺激する免疫原性組成物及び方法の必要が存在している。

上記の様に、HIVは、分裂している細胞及びマクロファージの様な分裂していない細胞の両者に感染する能力を有する。したがって、補体調節因子への攻撃または結合によって免疫反応を弱めるのに加え、HIVは、免疫系の細胞部分を弱める。ミリステートは、マトリックスタンパク質に結合し、細胞質における細胞膜との会合を引き起こす。したがって、本発明は、マトリックスタンパク質(p17MA)のアミノ末端を含むHIVマトリックスタンパク質上のミリステート共有結合部位に基づく免疫原性組成物、及びそれを調製し、使用する方法である。本発明は、タンパク質またはタンパク質フラグメント、メッセンジャーRNA、またはDNA/RNAの3つのカテゴリーの実施態様を意図する。DNA/RNA組成物は、裸または組換えのどちらかであって良い。本発明は、各種の免疫刺激剤との使用を更に意図する。

A.序論
本発明は、マトリックスタンパク質(p17MA)のアミノ末端を含む、HIVマトリックスタンパク質上のミリステート共有結合部位に基づく免疫原性組成物である。マトリックスタンパク質の成熟及び未成熟の形態の両者が使用されて良い。更に、タンパク質をコードする遺伝子配列も、組換え実施態様を生産するために使用されて良い。

上記の免疫機能に加えて、抗原の「記憶」の創出という他の機能が存在する。同じ抗原に対する後の曝露は、次いで、より効果的な早い反応を促すであろう。この記憶は、抗原特異的なリンパ球によって創出される。したがって、記憶リンパ球は、他の細胞及び因子に従って、末梢組織における即時の保護及び二次リンパ器官における増加する記憶反応の両者を提供する。活性化されると、リンパ球は増殖し、免疫反応の一端として抗体特異的リンパ球のクローンの数を増大させる。新しい抗原特異的リンパ球は、効果細胞または後の曝露時における反応に利用する事ができる記憶細胞のどちらかになるであろう。免疫記憶は、ワクチンとしての免疫原性組成物の使用を可能にする。

上にも記載の様に、マトリックスタンパク質は、Pr55^gagと共に、(1)マトリックスタンパク質の核標的シグナル (2) Pr55^gagの細胞膜への強力な局在シグナルを調節する(Lee, Young-Min, et al., J. of Virology, pp 9061-9068 (Nov. 1998) )。マトリックスタンパク質の末端に結合しているミリスチン酸部分は、Gagの膜結合のために明らかに重要である。HIV-1におけるmyr-MAの変異は、核におけるmyr-Gagの異常な蓄積を引き起こしうる。また、近位の部位における変異は、Gagの膜結合を減少させる事が示されている(Tang, Chun, Proc. Nat'l Acad. of Sci. 101: 517-522 (Jan 2004))。更に、MA分子のN末端における11アミノ酸のアミノ酸配列は、配列が決定されている：GARASVLSSGG。したがって、HIVウイルスは、11アミノ酸配列に変異が生じると、感染性のウイルスを活発に複製する事ができない(Ono, 1999)(Resh, 2004)。そのため、このアミノ酸配列は高度に保存されており、サブユニットワクチン、組換えワクチン、裸の核酸ワクチン、及びmRNAワクチンに使用されうる

B.サブユニット組成物
本発明のサブユニット免疫原は、免疫反応及び免疫記憶を形成するために、ペプチド若しくはその一部、またはタンパク質若しくはタンパク質セグメントをコードする遺伝子配列を含む。本発明では、望ましい免疫反応は、GARASVLSSGGペプチド若しくはその一部またはコードする遺伝子に向けられたものである。重要なことに、前記組成物は、免疫系に適切に提示されるべきである。核酸、ペプチド、及びタンパク質の単離及び使用は、当業者に既知であり、本明細書で記載される様なものである。

サブユニット組成物の利点の1つは、治療上の応用における感染性の欠如である。そのため、サブユニット組成物は、HIVの様にウイルスが非常に悪性である際に働く可能性がある。HIVの様な幾つかのウイルスは、非常な変異を遂げるため、ワクチンまたは治療に使用される弱毒化株は、より毒性の強い株へと自然な復帰変異を遂げうる。そのため、HIVに関しては、生ウイルスベクターは危険であろう。サブユニット組成物またはワクチンは、ウイルスが容易に培養物において生育できない際にも、使用されうる。サブユニット組成物は、急速及び比較的安価に生産される可能性がある。

例えば、サブユニットワクチンは、現在は酵母細胞におけるクローン遺伝子の発現によって得られるB型肝炎ウイルス表面抗原の使用に適用されている。このワクチンは、台湾において成功裏に使用されており、幼児における原発性肝癌の発生を減少させている様である(Wagner, 1999)。

タンパク質の直接投与は、生ウイルスワクチンと同様には細胞性反応を誘導しないであろう。しかし、サブユニットワクチンの利点は、弱毒化株の場合の穏やかなものまたは毒性ウイルスの場合の厳しいもののどちらかの潜在的な感染性の欠如を含む。更に、本発明は、免疫刺激剤及び他の免疫原性組成物との併用のために意図される。

B細胞の強い刺激及び抗体反応は、感染の直後に全ての主なHIVタンパク質に対して認められる(Goudsmit, 1988)。未知の理由のために、この事は、保護的または効果的な中和抗体の生産を引き起こさない。一方、これらの抗体は、ウイルス表面上の補体フラグメントの沈着により、CD4リンパ球以外の細胞によるHIVの取り込みを促進する可能性があり、それにより、抗原提示細胞(APC)におけるより効率的な局在を促進する(Stoiber, 1997)。中和抗体の促進抗体への転換において、濾胞樹状突起細胞は、重要な役割を担う可能性がある。これまでのワクチン接種により中和抗体を産生する試みは成功していない(Cohen, P. T. , et al.,The AIDS Knowledge Base, Ch 22 (3rd ed. 1999))。

したがって、本発明の組成物は、ヒトまたは他の動物における免疫反応を誘導する方法を含む。「動物」に対する一般参照は、ヒトを含む。前記方法は、前記組成物の調製及び液性または細胞性免疫反応を開始する能力を有する動物に対する投与を含む。免疫反応は、当該技術分野で既知の測定の一般的な方法を使用して検出されて良い。本発明は、実験ツールの開発及び免疫反応の研究のために使用されて良い。更に、本発明は、HIVに感染した対象に投与するため、または感染していないが免疫反応が望まれている対象における免疫反応を生産するためのワクチンの開発の助けとなるだろう。

C.調製の方法
開発、調製、及び投与の各種の方法が、本発明によって意図される。その様な方法は、特定の株に対する効力及び対象動物の反応に基づいて選択されるであろう事が予想される。図２に示される様に、このサブユニット組成物は、タンパク質若しくはペプチドの単離、メッセンジャーRNA、または核酸DNA/RNA発現の様な調製の目的のために分類されて良い。したがって、マトリックスタンパク質は、マトリックスタンパク質ペプチドまたはその一部、及びその遺伝子の発現若しくは遺伝物質を含む。

したがって、本発明は、1つ以上の当業者に利用可能な各種の方法のいずれかを使用して調製されて良く、以下を含むが、それらに限らない。
１．マトリックスタンパク質(p17MA)のアミノ末端を含むHIVマトリックスタンパク質上のミリステート共有結合部位の精製及び単離。
２．マトリックスタンパク質(p17MA)のアミノ末端を含むHIVマトリックスタンパク質上のミリステート共有結合部位を発現するメッセンジャーRNAのクローニング
３．escherichia coli、または酵母のような適切なバクテリアへのマトリックスタンパク質(p17MA)のアミノ末端を含むHIVマトリックスタンパク質上のミリステート共有結合部位の組換えDNA/RNAクローニング及び発現、またはマトリックスタンパク質(p17MA)のアミノ末端を含むHIVマトリックスタンパク質上のミリステート共有結合部位のウイルスまたは裸のDNA/RNA(Aroeti, 1993)
抗原提示細胞は、ファゴサイトーシスによって外来性のタンパク質を取り込み、免疫原の提示及び免疫反応を引き起こす。上記のリストを参照すると、実施態様1は、タンパク質フラグメントによるものであり、一方、実施態様2-3は、核酸及び組換え技術によるものである。実施態様2-3は、核酸のin vitroにおける製造による合成を含んでも良い(Aroeti, 1993)。

C.1.タンパク質に基づく組成物
前記タンパク質のエピトープは、単一のウイルス粒子またはウイルス培養物から単離されて良い。単一の粒子の場合では、酵素性の(タンパク質分解性の)分解が使用されて良い。例えば、成熟タンパク質は、成熟ウイルス粒子を各タンパク質構成成分に分解及び酵素消化する事によってウイルス粒子から単離されて良い。「精製」は、タンパク質が、治療上の使用が可能となるように他の細胞サブユニットまたは汚染物質を実質的に含んでいないことを単に意味する。前記組成物は、完全に純粋である必要は無い。前記タンパク質は、ウイルス培養物から単離されても良い。ウイルス構造の各タンパク質は、ウイルスの複製のために必要な量を超えて生産される。そのため、各ウイルスタンパク質は、タンパク質の特徴的なサイズ、形状、溶解特性、静電ポテンシャル、濃度、並びに/または各種の培地における浮力及び沈降速度に基づいてウイルス分離株から単離及び分離されて良い。そのため、この方法は、免疫反応を誘導するための特定のタンパク質フラグメントまたはペプチドの使用を含む。

C.2.核酸に基づく組成物
一般的には、核酸に基づく組成物は、裸のDNA/RNA、組換えDNA/RNA、またはメッセンジャーRNAを含んで良い。裸のDNAに基づく組成物は、通常、界面活性剤またはフェノールに対する曝露によってヒストン（折りたたまれていない小さい染色体タンパク質）またはタンパク質が取り除かれている結合部位をコードするウイルス抗原のDNAを使用するであろう。組換えDNAは、以下に詳細が議論される様に、異なる生物由来のDNAのフラグメントを再結合することによって作製される遺伝子組換えDNAである。両実施態様のためのDNA/RNAまたはmRNAは、当該技術分野で既知であり、本明細書で一部記載されている方法を使用して単離、精製、及び増幅されて良い。

更に、以下に記載されている様に、mRNAに基づく免疫原性組成物及びワクチンは、裸のDNA/RNAまたはタンパク質をコードするrDNA配列の使用に対する代替的な概念であって良い。メッセンジャーRNAは、その2つ（DNA及びタンパク質）の間の手段であり、細胞にトランスフェクトするために使用されることができ、問題のウイルスタンパク質を生産するために宿主細胞内で翻訳を遂げる。

C2.1.DNA及びRNAの単離
核酸の入手は、(1)処理に好ましい核酸を露出するための細胞の溶解(2)他の細胞構成成分から核酸の分離(3)精製した形態における核酸の回収、という3つの基本的な工程を必要とする(Nicholls, Desmond, An Introduction to Genetic Engineering, Ch. 3 (2d ed. 2002))。「精製」は、核酸が、治療上の使用が可能となるように他の細胞サブユニットまたは汚染物質を実質的に含んでいない事を単に意味する。

多くの方法が、核酸を回収するために使用されて良い。多くは、数工程のみを必要とするかなり単純なものである。幾つかの異なる工程を含む更に複雑な精製方法は、当業界で標準的なものである。市販されているキットは、容易に幅広いソースから核酸を精製する事ができる。

いずれの単離手順においても第1の工程は、出発物質の破壊である。細胞壁を開くために使用される方法は、可能な限り穏やかであるべきであり、好ましくは、細胞壁物質の酵素性の分解及び細胞膜の界面活性剤による溶解を利用する。細胞破壊のより強力な方法が必要な際は、大きなDNA分子を切断する危険があり、この事が後の処理の間の代表的な組換え分子の生産を妨害しうる。

細胞の破壊後、細胞のタンパク質は除去される。フェノールまたはフェノール/クロロホルム混合物は、抽出方法において通常使用される。相を分離するための遠心分離の際に、タンパク質分子は、フェノール相に分けられ、中間相に集積する。それらの固有の親水性によって、核酸は、殆どが上の水相に留まっており、イソプロパノールまたはエタノールを使用して溶液から沈殿させて良い。

DNAの調製が必要な際は、酵素リボヌクレアーゼ（RNアーゼ）が調製物におけるRNAの消化に使用されうる。cDNA合成のためにmRNAが必要な際は、真核生物のmRNAのポリ(A)テールに結合するオリゴ(dT)-セルロースを使用して、更なる精製が実施されうる。この事は、mRNAの実質的な濃縮を提供し、殆どの汚染DNA、rRNA、及びtRNAを除去する事が可能である。

勾配遠心分離は、DNA、特にプラスミド(pDNA)を単離するために頻繁に使用される。DNAは、塩化(Cl)セシウム(Cs)溶液に溶解され、超遠心器において高い速度で回転される。経時的に（ある場合では48時間まで）濃度勾配が形成される。pDNAは、遠心管において1つの位置に容易に確認できるバンドまたは線を形成する。このバンドは、細胞の汚染物を含まず、移されて良い。pDNAの純粋な生成物を提供するために、透析を使用して、CsClが除去される。サイズ排除クロマトグラフィーは、超遠心器の代替物として使用されうる。しかしながら、多くのプラスミドDNAは市販されている(Nicholls, 2002)。

好ましいDNA配列の増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって達成されうる(Nicholls, 2002)。簡単、正確、及び高い特異性は、伝統的なクローニング方法体系に置き換わっているPCRを特徴付ける。PCRの過程では、DNA二本鎖は、加熱され、変性して、二重らせんを解き、DNA鎖を分離する。各一本鎖は、DNAポリメラーゼによって複製される。前記過程は、多数回繰り返され、複製物の数における指数関数的増加を引き起こす。

C.2.2組換え技術
組換えDNAの生産において使用される方法は、理論的には容易であり、当該技術分野において既知である。HIVマトリックスタンパク質の遺伝子は、Escherichia coliの様な担体のDNAに処理されて良い。推奨される担体のリストは図３に示す。図４に示される様に、バクテリア担体は、プラスミド、染色体への挿入、またはその組み合わせによってrDNAを含んで良い。図５に示される様に、ウイルス担体は、染色体への挿入、ウイルス外被へのドナーDNAによってコードされるタンパク質の挿入、または両者の組み合わせによってrDNAを支持する可能性がある。担体が再生産する際に、免疫原が宿主の染色体に挿入されると、免疫原が伝播される。プラスミドDNAは、複製していない細胞内で複製を遂げる事ができる。制限酵素を使用する遺伝子の切断または単離は、本明細書で記載されている様なものであり、既知でもある。

rDNAの調製
電気泳動は、DNAフラグメントの分離、同定、及び精製を可能にする。マトリックスの空隙率が、達成される分離度を決定する。アガロース及びポリアクリルアミドという二つのゲルタイプが、当該技術分野で一般的に使用されている。海草から抽出されるアガロースは、乾燥粉末として市販されており、適当な濃度で緩衝液中において溶解する。冷やすと、アガロースは、固化またはゲル化する。ポリアクリルアミドゲルは、その細孔のサイズがアガロースよりも小さいため、小さい核酸分子を分離するために使用される。ポリアクリルアミドは、1つのヌクレオチドのみにより長さが異なるDNA分子を分離する事ができる。電気泳動は、ゲル中に核酸サンプルを置いて、その全体に電位を加えることよって実施されて良い。DNAは、負電荷のリン酸基を含むため、正電極に向かって移動するであろう。通常ブロモフェノールブルー（充填の前にサンプルに加えられる）であるマーカー色素がゲルの端に届く際に、電位が除去される。ゲル中の核酸は、挿入色素臭化エチジウムを使用する染色によって可視化され、UV光下で試験されて良い(Nicholls, 2002)。100,000塩基対ほどのものを含む大きいDNAフラグメントは、パルスゲル電気泳動として知られる他の過程によって分離されうる。

パルスフィールドゲル電気泳動(PFGE)及び単純なゲル電気泳動は、DNAフラグメントのサイズに基づく分離を可能にする。より小さいフラグメントは、より速く移動する。分離のための移動の全体の速度及びサイズの最適な範囲は、ゲルの化学的性質及び架橋の度合いによって決定される。高度に架橋されたゲルは、小さいDNAフラグメントの分離に最適である。前記の色素の臭化エチジウムは、DNAと結合すると明るい蛍光性の付加化合物を形成する。少量の分離されたDNAフラグメントは、ゲル上で単離されうる。この色素は、DNA塩基の間に結合し（挿入）、紫外線光に照射されるとオレンジに蛍光発光する(Nicholl, 2002)。特定のDNAフラグメントの同定は、相補的な配列を含むプローブによって達成されうる。

電気泳動の全ての方法は、中性pHにおける核酸（RNA及びDNA、一本鎖及び二本鎖）のポリアニオン性の特徴に依存する。つまり、核酸は、リン酸基に多価の負電荷を有する。この事は、電場に置いた際に、分子が正電極に向かって移動するであろう事を意味する。負電荷は、DNA分子に沿って均等に配分されるので、電荷/質量の比は一定であり、そのため、移動度はフラグメントの長さに依存する。前記技術は、サイズによって核酸分子を分離するゲルマトリックス上で好ましく実行される(Nicholls, 2002)。

制限酵素またはエンドヌクレアーゼは、バクテリアによる同族及び異種起源のDNA間の区別を可能にする。これらの酵素は、制限酵素認識部位として知られている特異的な部位でDNAを加水分解及び切断する。この配列認識の特異性は、DNAワクチンの基礎であるDNAフラグメント調製の正確な選択性を可能にする。制限酵素系を有するバクテリアは、修飾することによって自身のDNAにおける制限酵素認識部位を隠す。切断部位またはその付近のアデニンまたはシトシン残基に対するメチル基の付加が、自身の核酸を保護する(Brooks, Geo., Medical Microbiology 102 (23rd ed. 2004))。

バクテリアの制限修飾系は、2つの幅広いクラスに分類される。タイプ1系では、制限及び修飾活性が、単一の複数のサブユニットからなるタンパク質に組み合わされている。タイプ2系は、別々のエンドヌクレアーゼ及びメチラーゼから成る(Brooks, 2004)。

標準的な研究室の手段となっている制限エンドヌクレアーゼとメスの間の類似性は、明らかである。制限エンドヌクレアーゼは、その酵素が単離された名前の付いた生物の3または4文字の省略形によって通常名付けられる(Brooks, 2004)。総称名の初めの文字を含み、種名の初めの二文字である名称の初めの部分を提供するために、前記酵素が形成される生物の総称名及び種名が、使用される。したがって、Escherichia coliの株由来の酵素は、Ecoと名付けられ、Bacillus amyloliquefaciems由来のものはBamと名付けられる(Nichollls, 2002)。

制限エンドヌクレアーゼは、通常、鏡像様式で両DNA鎖のホスホジエステル結合を切断する。制限酵素は、同じDNA配列を認識して切断し、特定の配列でのみ切断する。制限酵素によって認識される多くのDNA配列は、回文構造である。つまり、両DNA鎖は、5'から3'方向に読む際に対称軸の両側に逆方向に向かって同じ塩基配列を有する（自己相補性）。これらの酵素によって作製される切断は、通常「突出」である（すなわち、生産物は、1つの鎖が他方から張り出す末端を有する一本鎖である。）しかしながら、生産物が、二本鎖末端を有する平滑末端である事がある。異なる特異性を有する500を超える制限酵素が、単離され、特徴付けられている。その殆どが、容易に研究室のツールとして入手可能である。

DNAの制限断片は、遺伝子の塩基配列における多型を同定するために使用されて良い。しかしながら、それらは、in vitroで再結合されている異なるソース由来のDNA分子から成るキメラDNAとも呼ばれる組換えDNAを合成するためにも使用されうる。2つの関連の無いDNAフラグメントの突出末端が、相補的な突出末端を有する場合には、互いに接合される可能性がある。相補的な末端は、制限酵素が回文構造を有する鎖を認識する場合に、同じ制限酵素を使用して関連の無いDNA鎖を切断する事によって得られる可能性がある。フラグメントの突出末端が互いに塩基対を形成した後に、DNAリガーゼの働きによって共有結合されうる(Smith, Coleen, Basic Medical Biochemistry: A Clinical Approach, Ch. 17 (2d ed. 1996) )。DNAリガーゼは、ランダムまたはDNA複製若しくは再結合の後に生じる可能性のある壊れたホスホジエステル結合を修復する細胞性酵素である(Nicholls, 2002)。最も良く使用されるDNAリガーゼは、バクテリオファージT4の感染したE. coli細胞から精製されて良いT4 DNAリガーゼである。突出末端によって共に保持されているフラグメントにおける隙間を塞ぐ際に、前記酵素は、最も効率的であるが、適当な条件下で平滑末端DNA分子も接合するであろう。DNAリガーゼは、5'リン酸基と3'ヒドロキシル(OH)基の間にホスホジエステル結合を生産する。前記酵素は、37℃で最も効率的であるが、より低い温度で使用されて良い。しかしながら、一本鎖末端の熱変性が、より高い温度(37℃)で生じる。そのため、この酵素の過程は、ある程度遅くはなるが、より高い精製度を達成するために、より低い温度で達成されて良い(Nicholls, 2002)。

DNA配列の個性のために制限酵素によって生産されるDNAフラグメントの長さは、激しく異なる。殆どの制限酵素は、ある程度ランダムに生じる回文構造を有する配列を認識する。更に、DNAフラグメントの平均長が、その大部分は、制限酵素によって認識される特異的な塩基対の数によって決定される。15塩基配列まで認識する制限酵素が、特徴付けられているが、その殆どは4つ、6つ、または8つの塩基配列を認識する。４塩基の認識は、250塩基対の平均長を有するフラグメントを生産するため、一般的には遺伝子フラグメントの分析または操作に有用である。制限酵素に認識される塩基対の数が増大するにつれて、ヌクレオチド配列の平均長は対数的に増大する。例えば、6塩基を認識する制限酵素は、約4,000塩基対の平均サイズを有するフラグメントを生産する。8塩基を認識する制限酵素は、64,000塩基対の典型的なサイズを有するフラグメントを生産するため、大きな遺伝子領域の分析に有用である(Brooks, 2004)。

DNAワクチンの生産において、バクテリア及び酵母の様な真核細胞由来のプラスミドDNAは、頻繁に供与媒体として使用される。プラスミドは、宿主細胞の核から物理的に分離される遺伝粒子である。原核細胞の核は、エンベロープを有さない。プラスミドは、独立して機能及び複製する事ができる。つまり、プラスミドは細胞の核から独立している。プラスミドは、通常宿主細胞に対して幾つかの生存または増殖の利点を与えるが、細胞の基本的な機能に対して必須ではない。例えば、耐性プラスミドは、抗生剤または抗菌剤耐性に関与する遺伝子を保有する。プラスミドは、DNAの小さい環であるが、三次元構造は、頻繁に数字の8の構造または複雑な構造の形態をとる。それにも関わらず、小さいサイズのプラスミドは、それらに対するin vitroにおける遺伝子操作を受け入れさせる。更に、遺伝子操作後に、それらの小さいサイズが他の細胞への進入を可能にする。そのため、プラスミドは、遺伝子工学において頻繁に使用され、殆どのDNAワクチンの基礎となる(Brooks, 2004)。

多くの制限酵素は、非対称に切断し、突出（付着）末端を有するDNAフラグメントを生産するため、DNAのハイブリダイゼーションが可能である。このDNAは、遺伝子工学による組換えプラスミドを形成するためにプラスミド受容体と共に供与体として使用されうる。同じ制限酵素を使用するプラスミドの切断は、互いに一致する突出末端を有する線状のフラグメントを生産する。プラスミドの2つの末端が再びアニーリングすることを防ぐために、これらの末端から遊離のリン酸基の酵素処理による除去が実施される。この事が、元の環状プラスミドが構造的に無能であり、機能できない事を保障する。遊離のリン酸基を含む他のソース由来の他のDNAフラグメントの存在下におけるライゲーションは、共有結合的な環状DNAにおけるインサートとしてDNAフラグメントを含む組換えプラスミドまたはキメラプラスミドを生産する。プラスミドは、宿主バクテリアにおいて複製するためには環状形態でなければならない(Brooks, 2004)。

本発明のサブユニットのアミノ酸配列である、HIVウイルスのマトリックスタンパク質(p17MA)のアミノ末端及びミリステート共有結合部位が、推定されている。各アミノ酸は、別々のコドンによってコードされる。1つのコドンは、タンパク質鎖に組み込まれる特異的なアミノ酸をコードする、または終結シグナルとして働くであろう遺伝情報を提供するDNAまたはRNA鎖における3つの連続したヌクレオチドのセットである。そのため、本発明のサブユニットの知識が、HIVウイルスのマトリックスタンパク質(p17MA)のアミノ末端及びミリステート共有結合部位のためのDNA及び/またはRNAのヌクレオチド配列の推定を可能にする。DNA配列の伸長の起点は、化学的なオリゴヌクレオチド合成のための既知のヌクレオチド合成手段によって合成されうるDNAプライマーによって決定される。その様な合成手段は、75以上のオリゴヌクレオチドを含むDNA鎖を生産する事ができる(Brooks, 2004)。

化学的に合成されたオリゴヌクレオチドは、プライマーの間のDNAの増幅及び塩基配列決定を可能にする方法であるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のためのプライマーとして働く事ができる。したがって、多くの場合、DNAは、塩基配列を決定するため、または遺伝子工学に使用できる様にするためにクローンが作製される必要が無い。

DNAの塩基配列決定は、異なるヌクレオチド結合の相対的な化学的性質に依存するマクサム・ギルバート法、及び配列中にジデオキシヌクレオチドを含ませることによってDNA配列の伸長を妨害するサンガー法（ジデオキシターミネーション法）を使用して実施されうる。更に、ショットガン法として知られる方法は、ウイルスの全ゲノムの塩基配列決定及び分析を可能にする。この方法では、DNAは、ランダムフラグメントライブラリーを作製するためにランダムにフラグメント化される。これらの不規則なフラグメントは、自動DNAシークエンサーによって塩基配列決定され、当該技術分野において入手可能なコンピューターソフトを使用して正しい順序に組み立て直されて良い(Brooks, 2004)。

ワクチン接種のために設計されたプラスミドDNAの必須の構成成分は、開始シグナル（プロモーター-エンハンサー）及び停止シグナル（ポリアデニル化シグナル/転写停止配列）を含む。前記開始及び停止シグナルは、ウイルス、バクテリア、または哺乳動物の各種のソースから選択されうる。抗生物質耐性または特異的な酵素活性の様なプラスミドの活性のマーカーが、含まれる可能性があり、完全に機能的なプラスミドが開発されている事を示すには有利である可能性がある。イントロンを含む配列を含む事も有利であり、イントロンは最終的にタンパク質に翻訳されない配列を含むが、多くのコンストラクトのトランスフェクトされた細胞株内における発現を大幅に改善する事が示されている。主にDNAワクチンに使用されているプロモーター/エンハンサーは、CMV前初期プロモーター(pCMVIE)エンハンサー及びラウス肉腫ウイルス(RSV)LTRである。数百のプラスミドが、異なる製造業者から市販されている。基本的なプラスミドワクチンベクターは、V1Jとして知られている。このベクターは、pCMVIE、CMV由来のイントロンA、ウシ成長ホルモン(BGH)ポリアデニル化/転写停止配列、及びアンピシリン耐性をコードする遺伝子(amp^r)を含む。lacオペロン及びマルチクローニングサイトが欠失されているpUCプラスミドDNAの配列は、この組換えプラスミドの構造の基本的なコンストラクトとして働く。2つの別々の制限酵素認識部位は、供与DNAの挿入のために位置づけられている。V1Jは、哺乳動物細胞では複製せず、宿主ゲノムDNAへのプラスミドの挿入を促進する事が知られている配列のいずれも含まず、この事が幅広い安全限界を保障している。更に、V1Jは、E. coliにおける増殖によって大量に生産されうる。これらの性質は、細胞が形質転換する挿入が起こる可能性を最小にする事によって、組換えDNAの過程の安全の保障に役立つ。

動物におけるワクチン接種の最高の結果は、プラスミドの通常の塩水溶液を使用する事によって得られている。ブピバカイン及びスクロースの溶液を含む他の媒体が使用されているが、動物においてこれらの方法体系に伴う免疫原性は促進されていない(Kaufman, Stefan, Concepts in Vaccine Development, ch2 3. 7. 3, (1996) )。プラスミド塩製剤の筋肉内注射に続き、小さい割合の筋管がDNAを取り込み、発現させる。しかしながら、この事が、有意な免疫反応を得るために十分であった(Kaufman, Stefan, Concepts in Vaccine Development, Ch. 3. 7 (1996) )。

液性及び細胞障害性T細胞反応の両者は、裸のDNAワクチンに伴って生じる事が既知である。測定可能な抗原特異的血清抗体反応の非存在下においてさえ、T細胞の強い増殖は、1μgに至るまで少ない動物モデルにおける低いDNA投与量で認められた。この事は、DNAワクチンによってT細胞反応を誘導するために抗体産生よりも少ない抗原が必要とされる可能性がある事を示す。そのため、HIV病に対する免疫の最も可能性のある関連は、HIV病に対して向けられた強い細胞障害性T細胞反応であろうために、HIVワクチン技術に伴うより少ない事（抗原）は、より重要なことを意味する。HIV病に対する強い液性反応の開発は、より悪い予後と関連している。低い投与量のDNAワクチンは、タイプ1ヘルパーT細胞(T_H1)の生産を刺激する。T_H1細胞は、CD8⁺活性を刺激する事により細胞性免疫反応を促進する事が示されているサイトカインII-2及びガンマ-インターフェロンを産生する(Kaufmann, 1996)。

HIV感染のためには、強いT_H1様の反応が、高いCD4細胞数及び低いウイルスの力価の維持、並びに2次的な日和見感染の防止において重要となっている(Kaufmann, 1996)。

不活化ウイルス、組換えタンパク質、またはペプチドの様な抗原を投与する事よりも宿主において抗原を発現する事の利点は、以下を含む、(1)宿主細胞における固有の不活化の過程（例えば化学的架橋）による抗原性の潜在的な損失を避ける、(2) 宿主細胞によってコードされる立体配座並びに糖及び脂質結合を含む翻訳後修飾を有するタンパク質の合成、(3)細胞障害性Tリンパ球(CTL)反応の誘導を引き起こす細胞内抗原処理及びMHCクラスI分子による提示、(4)MHC抗原決定基の選択を可能にする(Kiyono, Hiroshi, Mucosal Vaccines. Ch. 8 (1996))。

IM DNAワクチン接種後の抗原提示は、強い細胞障害性T細胞反応を生じさせる。IM DNAワクチンの使用によりCTL反応を誘導するための3つのモデルが提唱されている。
１．樹状細胞、マクロファージ、及びランゲルハンス細胞を含む抗原提示細胞によるDNAの取り込み及び抗原の発現。
２．抗原提示細胞として働く、またはその役割を果たすトランスフェクトされたミオサイトによる抗原の提示。
３．トランスフェクトされたミオサイトから次に適当なT細胞に抗原を提示する抗原提示細胞への抗原の移動(Kiyono,1996)。

DNAワクチンは、複数の動物種における各種の抗原に対する特異的な免疫反応、抗体、CD8細胞、及びCD4細胞を誘導するために使用されており、以下を含むが、それらに限らない。
１．マウスにおけるB型肝炎表面抗原(Davis, et. al., 1993,1994)。
２．マウスにおける単純ヘルペスウイルス1糖タンパク質B(Manickan et. al., 1995)
３．ウシにおけるウシヘルペスウイルス1糖タンパク質IV(Cox et. al., 1993)
４．マウスにおける狂犬病ウイルス糖タンパク質(Xiang, et. al., 1994,. 1995)
５．マウスにおけるマラリアスポロゾイト周囲タンパク質(Sedegah, et. al., 1994; Hoffman et. al., 1994)
６．マウスにおけるリーシュマニアgp63(Xu and Liew 1995)
７．マウスにおけるリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)NP(Pedroz Martins, et al. 1995; Yokoyama et. al., 1995)
８．マウスにおける癌胎児性抗原(Conry, et. al., 1994)
９．ラットにおけるMHCクラスI抗原(Geissler, et. al., 1994)
10．ウサギにおけるワタオウサギパピロマウイルス(CRPV)L1(Donnelly et. al., 1996)
11．マウスにおけるM結核抗原85複合体タンパク質(Huygen et. al., 1996) (Kaufmann, 1996)

より具体的には、CTL反応を誘導するDNAワクチンの能力は、数回示されてもいる。インフルエンザNP（核タンパク質）での使用が初めに示された。NPは、ウイルスの保存された内部のタンパク質であり、交差反応するCTLの標的である。前記NPのDNAは、マウスにおいてCTL反応を誘導し、ワクチン接種の潜在能力を示す寿命の要素を示した。興味深いことに、インフルエンザNPまたはマトリックスタンパク質をコードするDNAによって誘導される細胞性免疫は、鼻汁におけるウイルスの排出の減少によって測定される様なフェレットの保護にも役割を果たした。DNAワクチンによって誘導されるCTL反応は、以下にも同様に示されている。
１．狂犬病ウイルス糖タンパク質(Xiang, et al., 1994)
２．マラリアスポロゾイト周囲タンパク質(Sedegah, et al., 1994)
３．リンパ性脈絡髄膜炎ウイルスNP(Pedroz Martins, et al., 1995; Yokoyama, et. al., 1995; Zarozinski et al., 1995)
４．HIVエンベロープタンパク質(Wang, et al., 1994; Shiver et al., 1995)
５．ヒト第IX因子(Katsumi, et al., 1994)
６．MHCクラスI(Geissler, et al., 1994; Plautz, et al., 1994; Hui et al., 1994)

免疫処置後1から2年間のCTL反応の検出が、上記のモデルの幾つかで示されている。DNAワクチンの投与は、1mcgで開始するべきである。CTL試験が実施されるべきであり、十分なCTL反応が記録される最も低い投与量が好ましい。

以下に議論される様に、IM DNAワクチンと共に製剤されたカチオン性脂質が、低レベルの遺伝子発現を実際に生じさせた。しかしながら、DNAの取り込みを促進するカチオン性脂質の使用は、粘膜投与系に関して記載されている。カチオン性脂質は、非特異的な機構またはまだ特徴付けられていない特異的な細胞膜輸送機構を介して粘膜表面のDNAの取り込みを促進する。DNAの粘膜投与は、HIV複製の好ましい部位である胃腸及び尿生殖器管内膜の多くの細胞タイプ、並びにパイエル板を含む各基底膜下の細胞に潜在的にトランスフェクトする事ができる。粘膜表面における細胞による取り込みの潜在的な促進に加え、カチオン性脂質は、DNAの分解からの保護も行う。in vitroの研究は、DNA/カチオン性脂質が複合体でないDNAよりも長い半減期を有する事を示している(Puyal, et al., 1995)。そのため、粘膜のDNAワクチンのための好ましい実施態様は、カチオン性脂質を含むであろう。

DNAワクチンの非経口の投与は、強い全身の液性及び細胞性免疫反応を誘導するが（用量依存的に）、有意な粘膜免疫反応の産生を生じさせない。そのため、特定の場合において、粘膜及び全身の免疫反応の両者を誘導するであろうワクチンを設計する事が望ましい可能性がある(Kiyono, 1996)。この事は、異なる経路（非経口及び粘膜）で投与されるDNAワクチンによって達成されうる。この方法は、非経口の初回免疫に続いて粘膜刺激を使用(Keren, et al., Infect. Immun., 56: 910-915 (1988) ) 及び逆に使用して (Forrest, et al., Infect. Immun. 60: 465-471 (1992) ) 幾つかの系において試験されている。幾つかのベクターを使用して、DNA/カチオン性脂質の粘膜への投与は、局所的及び全身の免疫反応の両者を生じさせた。組換えBCGワクチンは、異種抗原に対する局所的なIgA及び血清IgG抗体を誘導し (Langerman, et al., 1994)、経口で投与された組換えサルモネラベクターは、細胞性免疫を誘導した(Aggarwal, et al., 1990)。

DNAワクチン技術を利用する好ましい実施態様は、非経口的（好ましくは筋肉内）に投与される裸のDNAワクチンと粘膜に投与されるカチオン性脂質/DNAワクチンの組み合わせであろう。

そのため、要約すると、組換えバクテリアDNAワクチンを生産するためには、以下の工程であろう。
１．市販されている供給源から適切なプラスミドベクターの選択
２．目的のHIV DNAの単離
３．プラスミドDNA及びHIV DNAの制限酵素による切断/修飾の達成
４．HIVから特定の遺伝子の単離
５．選択されたHIV DNA遺伝子のPCRによる増幅
６．プラスミドDNAから遊離のリン酸(PO₄)基の酵素による除去
７．E. coliの様なバクテリア細胞にプラスミドDNAを形質転換
８．DNA鎖を共に封じるためのリガーゼの投与

形質転換の過程を達成するために、受容細胞は、コンピテントにされる必要がある。コンピテンスは、外来性のRNAまたはDNAを吸収する細胞の能力に関する。これを達成する工程は、
１．塩化カルシウムの氷冷溶液に受容細胞を浸透させる（この事が、まだ完全に理解されていない方法でコンピテンシーを誘導する）
２．細胞とプラスミドDNAを混合し、20から30分間氷上でインキュベート
DNAが細胞に進入する事を可能にするためにヒートショック（42℃で2分）
４．形質転換された細胞をブイヨン中で37℃、60から90分間インキュベート。この事が、プラスミドを確立させて、究極的には、プラスミド核酸の表現型の発現を可能にする。
５．複製に適切な選択培地上にプラスミドベクターを有する細胞をセットする
図３に示される様に、rDNA/RNAは、バクテリアまたはウイルス媒体によって投与されて良い。

C2.3組換え担体
C2.3.1バクテリア担体
生弱毒化バクテリアは、DNA/RNAの担体として働いて良い。バクテリアは、マトリックスタンパク質(p17MA)のアミノ末端及びマトリックスタンパク質上のHIVウイルスにおけるミリステート共有結合部位またはそれらの一部をコードする遺伝子を運び、発現する。前記バクテリアは、キャプシドタンパク質DNA/RNAが増幅、精製、及び投与されて良い環境を提供する。バクテリア担体は、当該技術分野で慣例のもの、サルモネラ属、BCG、E. Coli、Streptococcus gordonii、Lactocci/Lactobacilli、コレラ菌、Yersinia enterocholitica、フレクスナー赤痢菌、及びリステリア菌といった典型的なタイプを含んで良い。サルモネラ属、BCG、及びE. coliは好ましい。

組換えのためにこれまで探索されたバクテリアの間で、弱毒化サルモネラ種は、最も激しく精査されている。Bacillus Calmette Guerin(BCG)を含む他のバクテリアも研究されている。E. coli、ビブリオ属、エルジニア属、及び赤痢菌属を含む弱毒化腸内病原菌は、組換えワクチン技術の基盤として使用されている。グラム陽性Streptococcus gordonii、Staphylococcus xylosus、及びlactococciまたはlactobacilliを含む共生生物として一般的に解される他の生物は、組換え方法体系において使用されている。最近、リステリア菌が、潜在的な組換えワクチンベクターとして導入されている。これらの生物の多くは、コロニーを作る及び/または粘膜表面に感染する能力に基づいて、これらの表面への投与を可能にする。そのため、消化管関連リンパ系組織(GALT)は、非経口摂取後の血清からの抗体の拡散よりも粘膜への免疫を介して直接的に刺激される。パイエル板を含むGALTは、病気の性的な伝播におけるHIVの感染及び複製の主な部位である。

圧倒的多数の注意が、腸内病原菌、特にサルモネラに向けられている。前記バクテリアは、組換えが生じうる前に弱毒化の過程を遂げる。それを実施する際において、バクテリアは無毒になり、腸チフスまたは他のサルモネラ由来の病気を引き起こす事が不可能になる。その様な変異の第一の記載は、1951年にp-アミノ安息香酸(pab)の代謝経路において明らかにされた。その後、細胞の溶解を引き起こすガラクトース-1-ホスフェートの細胞質への蓄積を生じさせるS. typhimurium及びS. typhi(Ty21a株) のgal E変異体が、単離された。S. typhimuriumにおけるHoiseth及びStockerは、芳香族経路において必須な成分である酵素、5-エノールピルビル-シキミ酸-3-ホスフェートシンテターゼをコードする幅広く使用されるサルモネラ栄養要求性変異体であるaro Aを発表した。S.typhimuriumのaro C及びaro D遺伝子を含むこの経路において作製される更なる変異体は、高度に弱毒化された生物を生じる。アデニル酸シクラーゼ及びサイクリックAMPレセプタータンパク質をコードする調節遺伝子cya、crpの変異は、各々非常に成功する事が証明されてもいる。更に、cya及びcrp変異は、ペプチドグリカン合成に必須であるアスパラギン酸ガンマ-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするasdの変異と併用して使用されても良い。更に、phoP（ホスファターゼ）及びompR（外膜タンパク質）の様な他の調節遺伝子の変異は、ワクチンベクター株の弱毒化要素として成功することが証明されている (Hughes, Huw, Bacterial Vectors for Vaccine Delivery, Designer Vaccines Principles for Successful Prophylaxis, Ch. 8 (1998)) 。

3つの個別の方法が、サルモネラにおける異種抗原の発現に使用されており、(1)プラスミド、(2)外来性の遺伝子のサルモネラ染色体への挿入、(3)フラゲリン、ナイセリア、IgAプロテアーゼ前駆体、1anB、phoE、ompAを含むサルモネラバクテリアの各種担体タンパク質による細胞表面への異種抗原の輸送と記載されている。代替的な細胞画分を標的とするエピトープの他の担体は、マルトース結合タンパク質(malE)、LTB、破傷風毒素のCフラグメント(tetC)、ガラクトシダーゼ、pagC、及びB型肝炎のコア抗原(HBcAg)との融合を含む(Hughes, 1998)。

組換えサルモネラは、動物研究において異種抗原に対する液性及び細胞性反応の両者を誘導する多くのウイルス抗原の発現に成功裏に使用されている。インフルエンザの各種タンパク質が、動物においてサルモネラバクテリアベクターを使用して成功裏に発現されており、それらは、核タンパク質(NP)及びヘマグルチニンタンパク質(HA)のエピトープを含む。サルモネラに成功裏に挿入されている他のウイルスDNA配列は、B型肝炎ウイルス、HIV、及び単純ヘルペスを含む。

殆どの研究は、異種抗原のために経口投与系を使用しているが、他のものは、非経口免疫方法を使用している。それら両者は、組換えワクチンと同時またはその後に使用されうる。HIV病の組換えバクテリアワクチンを使用して取り組まれる必要のある他の変形例は、特異的な細胞画分に対する異種抗原の標的を含む。興味深いことに、BCG及びリステリア属は、細胞性反応を誘導するためにより有利な様であるため、HIV病の組換えワクチン技術のための好ましい経路であろう(Hughes, 1998)。

弱毒化サルモネラバクテリアの使用は、大腸において最初に複製し、大腸末端の内側の免疫原性の媒体であり、ウイルスが性的に伝播する殆どの場合において最初のHIV複製の部位であるパイエル板において免疫反応が生じる点で有利性を確かに有する。そのため、サルモネラバクテリアは、HIV病に関する組換えワクチン技術の好ましい方法体系を提供するであろう。

形質転換及びトランスフェクションの技術は、組換えDNAを細胞内に導入するために利用可能である最も単純な方法を表す。E. coli細胞のクローニングに関して、形質転換は、プラスミドDNAの取り込みを意味し、トランスフェクションは、バクテリオファージDNAの取り込みを意味する。バクテリオファージは、バクテリアに感染するウイルスである。他のウイルスの様に、それらは、RNAまたはDNAのどちらか（両者ではない）を含み、一見単純な繊維状バクテリアウイルスから収縮性の末端を有する比較的複雑な形態へと構造において変化する。宿主バクテリアとのそれらの関係は、非常に特異的である。形質転換は、任意の細胞による任意のDNAの取り込みを記述するためにより一般的な使用もなされる(Nicholls, 2003)。

コンピテント細胞の少ない割合のみが、形質転換を遂げられる。したがって、前記過程は、多くの個別の組換え体が必要である、または出発物質が制限される場合のクローニング実験において律速段階になりうる。厳密に実施されると、投入したDNAの1μg当たり10⁹個の形質転換された細胞（形質転換体）が認められうるが、1μg当たり約10⁶から10⁷個の形質転換体の形質転換の頻度が、より現実的である(Nicholls, 2003)。

形質転換方法の別法は、物理的方法による細胞へのDNAの導入である。1つの典型的な技術は、マイクロインジェクション、つまり極細針を使用して、DNAを直接核に注入する事である。この技術は、植物及び動物細胞の両者に成功裏に使用されている。前記細胞は、穏やかな吸引によってガラス管に固定され、前記針は、膜に穴を開けるために使用される。前記技術は、機械的なマイクロマニピュレーター及び顕微鏡を必要とし、手動で実施される(Nicholls 2003)。マイクロインジェクションは、HIV病のDNAバクテリア組換えワクチン生産物のための好ましい実施態様を提供する。

C.2.3.2ウイルス担体
組換えウイルスワクチンは、宿主が保護されるべき病原菌由来の遺伝子を発現するために操作されて良い。前記ベクターは、外来性の遺伝子を宿主に運ぶための媒体として働き、核酸の転写及び翻訳後に、核酸にコードされるタンパク質を宿主の免疫系に提示する。いずれのワクチンについても、当然、許容性の主な基準は、安全性及び効力である。安全性は、2つの観点から取り組まれて良い。免疫原の安全性は、事前の弱毒化または担体ウイルスに対する宿主の事前のワクチン接種により、良い安全の記録を有するウイルスベクターの使用によって、確実にされうる。第二に、ウイルスは、合理的及び信頼できる方法で安全性を改善するために操作されて良い(Hughes, 1998)。既に免疫を受けている宿主へのウイルスベクターの使用は、免疫原が記憶免疫反応によって急速に破壊されるであろうという不利性を確かに有する。それにも拘らず、幾らかの組換えDNAまたはRNAの転写及び翻訳が生じるであろう。好ましい方法体系は、組換えワクチンのための担体としての弱毒化された無毒のウイルス（担体ウイルスに対する事前の免疫無しで）の使用であろう。

したがって、バクテリアまたは酵母の様にウイルスも、組換え技術において使用されて良い。担体として、ウイルスは、容易に細胞に感染し、細胞障害性T細胞免疫反応を刺激する。担体ウイルスは複製できて良いため、全体及び完全な免疫反応が産生される可能性がある。次いで、免疫系の液性及び細胞性の部門の両者が、活性化されるであろう。一般的なウイルス担体は、ポリオウイルス、アデノウイルス株2、4、5、及び7、並びにポックスウイルスを含んで良い。組換え技術において使用されるポックスウイルスの幾つかは、ワクシニア、カナリア痘、ALVAC（カナリア痘由来）、鶏痘、きゅう痘、及び豚痘を含む。組換え技術において使用される他のウイルスベクターは、ヘルペスウイルス(HSV-1、VZV(帯状ヘルペス)、EBV(エプスタインバーウイルス))、アルファウイルス、パラミクソウイルス、インフルエンザ、及びD型肝炎を含む。これらの内、好ましい実施態様は、そのウイルス構造及び生活環の知識が大量に存在しているため、ポリオウイルスに基づく。ポリオウイルスに対する事前の免疫は、免疫反応の制限において考慮すべき事柄であろう。HSV-1の様な慢性のウイルス感染は、宿主免疫系が細胞障害性活性を刺激する少量の背景に存在する免疫原を受けるであろうために魅力的な別法を提供する。

1つの微生物から他の微生物のゲノムへの遺伝子の導入は、有毒な株を生じる可能性がある。これを避けるために、前記担体ウイルスは、治療における組成物の使用のいずれもが実際に無毒であることを確実にするために、改変されるべきである。この事は、開発される無数のウイルスモザイクの組み合わせを可能にするだろう。ワクチンとして使用される、またはウイルスゲノムに加えられるであろう際に、導入される遺伝子は、担体ウイルスの複製には必要ない遺伝子と置き換わって良い(Wagner, 1999)。ウイルス感染のための免疫原性組成物またはワクチンの生産及び使用において慣用されている組換え技術の方法は、当業者に既知であり、容易に利用可能である(Porter, 1995)(Stahl, 1997)。

組換えウイルスワクチンベクターに使用されるウイルスは、ポックスウイルス（鶏痘、カナリア痘、きゅう痘、粘液腫、及び豚痘を含むワクシニアウイルス）、アデノウイルス（特に塩基配列決定されているタイプ2及び5、並びにアデノウイルスタイプ4及び7は、副作用の証明がされずに商業的にではなく米国軍隊のために広く使用されている）、ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、及びインフルエンザウイルスである。HIV遺伝子は、ワクシニアウイルスベクターに接合されており、動物において幾つかの制限される成功を伴っている。アデノウイルスを使用して、遺伝子は、必須ではないE3領域（4kb以下）また必須のE1領域に挿入されうる。興味深いことに、E3領域から単純ヘルペスウイルス(HSV)の糖タンパク質Bを発現する組換えアデノウイルスのコンストラクションが、McDermott et alによって実施されている。この組換えウイルスを使用して摂取されたマウスは、in vitroでHSVを中和したgBに特異的な抗体を生産した。更に、マウスは、アデノウイルス組換え体を使用した一回の摂取の後に致死性のHSVの攻撃から保護された。Jacobs, et al.は、ダニ媒介脳炎(TBE)ウイルス由来の非構造遺伝子であるNS1を発現するためにE1領域を利用している。彼らは、この複製欠損系を使用したマウスのモデルにおける致死性の攻撃に対する保護を明らかにしている。E1欠損アデノウイルスは、複製が欠損した性質よって導入される特別な安全因子を有する。前記E3遺伝子は、ウイルスに対する免疫保護を提供する。そのため、E3遺伝子を欠く組換えアデノウイルスベクターは、弱毒化されて無毒であり、組換えウイルス技術と共にアデノウイルスベクターを使用する好ましい実施態様を表す。E3領域にコードされているgp19タンパク質は、感染細胞において主要組織適合遺伝子複合体(MHC)クラスI抗原の発現を減少させる。前記gp19タンパク質は、転写、翻訳、小胞体若しくはゴルジ体におけるタンパク質修飾、またはそれらの組み合わせのレベルで働く可能性がある。この遺伝子が欠損しているアデノウイルスベクターは、より強いCD8細胞障害性反応を誘導するより効果的な方法で、外来性の遺伝子にコードされるタンパク質を免疫系に提示できる可能性がある。更に、B型肝炎表面抗原は、E3の欠損の存在及び非存在下の両者において、アデノウイルス株4及び7から発現されており、動物モデルにおいて、良い抗体反応が、E3配列が欠損しているこれらのベクターにおいて認められている。機能的なE3配列を含むベクターは、弱いまたはごくわずかな反応のみを生産した(Hughes, 1998)。

ヘルペスウイルスは、大きいゲノムを有しており、幾つかの遺伝子は、in vitroでは必須でなく、in vivoにおいてより重要であるものとして同定されている。必須ではない遺伝子の欠損は、幾つかの部位での組換えを可能にし、ビリオン当たり一回より多い組換えを可能にするであろう。ヘルペスウイルスワクチンベクターの制限された数の例が、天然の宿主で試験されており、幾らかの成功を伴っている。例えば、Dan Ziji, et al.は、偽狂犬病ウイルス並びに豚コレラウイルスに対するブタの保護を報告している。

インフルエンザは、組換えワクチン技術における潜在的なウイルスワクチンベクターのリストに最近加えられている。難感染性の宿主におけるインフルエンザは、比較的無毒である。インフルエンザの核酸の操作は、逆遺伝学を使用して達成されうる。Castrucci, et al.は、シアル酸を切断するインフルエンザノイラミニダーゼ酵素の主成分のLCMV核タンパク質由来のCTLエピトープを発現する組換えインフルエンザウイルスを構築している。この組換えワクチンの単回投与が、有毒性の無毒化していないLCMVによる将来的な攻撃に対してマウスを保護した。多くのインフルエンザ株が、特徴付けられており、それらの多くは、発現するヘマグルチニン及びノイラミニダーゼタンパク質においてのみ異なる。そのため、繰り返しの摂取の効果を制限するであろうウイルスベクター自身に対する免疫を開発するという問題が無く、異なるインフルエンザ株は、特異的なウイルスタンパク質に対する宿主のワクチン接種に続いて使用されうる。低温に適応した弱毒化インフルエンザウイルスは、ワクチンとして数年間大規模に使用されている。これらのワクチンの蓄えが、組換えウイルスワクチンのため、特に複数回の摂取が必要である際に使用されるであろう。

Rodriguez, et al.は、組換えインフルエンザベクターの効力を試験した。げっ歯類マラリア寄生体であるPlasmodium yoeliiのスポロゾイド周囲タンパク質のCD8⁺ T細胞エピトープは、同じビリオンにおけるヘマグルチニン及びノイラミニダーゼの2つの異なるインフルエンザタンパク質において発現された。更に、同じエピトープのただ1つのコピーを発現するワクシニアウイルス組換え体が、構築された。その両者のベクター系は、エピトープ特異的T細胞のかなりのレベルを誘導する事が見られた。殆どの有効な方法は、インフルエンザ組換え体を使用する初回投与に続いてワクシニア組換え体を使用する追加投与から成る(Hughes, 1998)。

2つの別々の組換えウイルスベクターが、HIV病に関する最適な免疫反応のために続いてまたは同時に使用されて良い。

ポリオ(Sabin)に対する生ワクチンは、そのウイルス自身の弱毒化株である。これらのワクチンは非常に安全及び効果的であることが証明されているが（1961年に初めて導入された）が、有毒性への不定期の復帰変異が方法体系を複雑にした。米国小児科学会は、活発に複製する能力が無い古いソールクワクチン（1955年に導入された）を支持した。しかしながら、その安全性にも拘らず、ソールクワクチンは、より少ない適当な免疫反応を生産する。ポリオウイルスビリオンの厳格な区画化のために、少ないアミノ酸をコードする小さいDNA配列のみがウイルスゲノムに切断されうる。

ポリオウイルスは、その糞便/経口伝播経路のためにエンテロウイルスとして分類される。ポリオは、HIV病のようにプラス鎖RNAウイルスである。2つの間で区別するために、両者共にプラス鎖RNAであるが、レトロウイルスは、ビリオン関連酵素（逆転写酵素）によってDNAに転換されるRNAを必要とする。しかしながら、ポリオは、逆転写酵素を必要としない。ポリオRNAは、細胞のメッセンジャーRNAの様に機能する。それらのウイルスの両者は、二十面体構造に覆われている。ポリオは、エンベロープを有さないが、HIVはエンベロープを有するウイルスである。

ポリオ特異的細胞性免疫反応は、最近研究されている。ポリオウイルスに対する細胞性反応の産生は、経口的にワクチン接種されたボランティアにおいて示されている(Simmons, et al., 1993; Graham et al., 1993)。この事は、前記のような理由のため、重要であり、T細胞免疫は、HIV病に対する免疫保護と最も関連するであろう(Kiyono, 1996)。

興味深いことに、ポリオウイルスは、全身及び粘膜の抗体の両者を刺激するために経口だけでなく経鼻的にも投与されうる。ポリオウイルスに基づく組換えワクチンベクターの開発は、ウイルスについての莫大な知識が入手可能であるため取り組まれている。完全なウイルスRNAゲノムは、塩基配列決定されており、ウイルスタンパク質が同定されている(Kitamura, 1981)(Racaniello, 1981)。ウイルスゲノムの感染性cDNAが産生されており、その事が、ウイルスを遺伝学的に操作することを可能にしている(Racaniello, 1981)(Semler, 1984)。完全なウイルスの三次元構造は既知であり、主な抗原性エピトープは、分子レベルで同定されている(Hogle, 1985)。ポリオウイルスが細胞への進入を得るために利用するレセプター(PVR)は、クローンが作製され、核酸配列が決定されている(Mendelsohn, 1989; Ren, 1992)。更に、発現されたポリオウイルスレセプターを有するトランスジェニックマウスが、繁殖されており、そのため、そのマウスにはポリオウイルス感染に対する感受性が存在する。そのため、全ての病気、特にHIV病に関する組換えポリオウイルスベクターの研究のための動物モデルが存在する。

ポリオウイルスの入手可能な膨大な情報が、そのウイルスを組換えポリオウイルス/HIVベクターの開発のための理想的な標的にする。ポリオウイルスワクチンが、粘膜部位に投与されうるため、及び扁桃腺組織への初めの投与後にポリオがパイエル板において複製するために、組換えポリオワクチンが、HIV病の組換えウイルスワクチンのための好ましい実施態様である。

感染性ポリオウイルスcDNAの有用性は、RNAの複製能を損なうこと無く欠失されうるポリオウイルスゲノムの領域に対する更なる研究を促進している(Racaniello, 1981)(Semler, 1984)。これらのRNA分子またはレプリコンは、細胞に導入された際の自己複製の性質を保持している。Kaplan及びRacanielloによる初期の研究は、P1領域の大部分を含む欠失を有するポリオウイルスレプリコンを示している(Kaplan, 1988)。HIV-1のgag、pol、またはenv遺伝子の1.5kb以下のフラグメントを含むポリオウイルスレプリコンは、研究室の実験の対象とされている(Choi, 1991)。外来性の遺伝子が挿入され、翻訳されるリーディングフレームが、P2-及びP3-タンパク質をコードする残存するキャプシド配列の間に保持された。これらのRNAの細胞へのトランスフェクションは、これらのゲノムの複製、並びに側方のキャプシドタンパク質との融合タンパク質として外来性のタンパク質の発現を生じさせた(Kiyono, 1996)。

ポリオウイルスcDNAは、組換えタンパク質を発現する大きな遺伝子に適応させるために改変されている。これらのベクターでは、ポリオウイルスの完全なP1領域は欠失されており、HIV-1 gag（約1.5kb）の完全な遺伝子を含むレプリコンが構築された。このレプリコンの細胞へのトランスフェクションは、HIV-1 Gag前駆体タンパク質であるPr55^gagの生産を生じさせ、そのタンパク質は遠心分離後に細胞の上清から溶出され、電子顕微鏡を使用して視覚化された(Porter, 1996)(Kiyono, 1996)。

要するに、ポリオウイルスレプリコン系を使用してグリコシル化タンパク質をコードする遺伝子を含む幅広い種類の外来性の遺伝子を発現する事が可能である(Kiyono, 1996)。

C2.4 mRNA発現
宿主細胞の活性化は、ウイルスDNAのメッセンジャーRNA(mRNA)へのHIVの転写を生じさせる。HIVにおいて、ウイルスRNAは、メッセンジャー及びゲノムRNAの両者として働く。ウイルスDNAは、mRNAに転写される。ウイルスmRNAは、細胞質に移動し、そこで、ウイルスタンパク質を生産するために細胞のリボソーム及びトランスファーRNAと会合する様になる。メッセンジャーRNAは、ウイルスの遺伝情報を伝達する遺伝物質の安定な鎖である。メッセンジャーRNAは、その安定性及び効率性のために免疫原性組成物における使用にとって魅力的なものである。メッセンジャーRNAは、タンパク質のコードにとってDNAよりも効率的である。

RNAまたはDNAは、各種のタンパク質をコードする。その途中の工程は、mRNAの生産である。タンパク質またはタンパク質群のmRNAは、DNAにおけるチミジンがRNAにおいてウラシルに置き換えられるという例外を含むが、それをコードするDNA鎖（またはRNA鎖）と一致する。また、DNAにおける糖部分は、デオキシリボースであり、RNAにおける糖部分は、リボースである。mRNAは、キャッピングの過程を遂げ、その過程で、5'末端に7-メチルグアノシン3ホスフェートが付加され、3'末端の非翻訳領域に約100塩基のポリ(A)テールが付加される。キャップは、リボソームの適切な結合のために必要であり、テールは、リボソームの翻訳の終結のシグナルを伝える。転写は、DNAがmRNAに「書き換えられる」過程である。翻訳は、mRNAがタンパク質に「翻訳される」過程である。

免疫原性組成物内におけるmRNAに対する多くの理論的な利点が存在する。これらは、以下を含むが、それらに限らない。(1)mRNAは、核膜を越える必要が無い(2)mRNAは、核質に進入する必要が無い(3)mRNAは、宿主DNAに挿入する必要が無い(4)mRNAは、転写の過程を遂げる必要が無い(5) mRNAのタンパク質への翻訳を可能にするために、宿主の翻訳酵素及びリボソームは、細胞質内でmRNAに利用可能である(6)ウイルスタンパク質の生産における多くの工程が妨害されるため、細胞内DNAと比べてmRNAを使用すると、速い免疫反応が、示されるべきである(7)mRNAは、複数回再利用されうるため、多くのタンパク質配列が1つのmRNA鋳型から翻訳されうる。そのため、極少量のmRNAのみが、細胞質に進入する必要がある(8) タンパク質の細胞内での生産はmRNAを使用して達成されるであろうため、細胞表面のMHCクラスIタンパク質と会合し、CD8⁺細胞障害性T細胞反応を誘導するであろう。

mRNAの生産は、直接的である。特定のHIVタンパク質の特異的なアミノ酸配列の知識を使用して、その相補的なRNA配列が、推定されうる。次いで、RNA配列は、5'及び3'末端がそれぞれキャップされ、テールが付加されうる。更に、当該技術分野において既知である様に、メッセンジャーRNAは、それ自身で、自動核酸配列合成によって生産されうる。

C.2.5 裸のDNA/RNAに基づく組成物のためのCD8⁺T細胞反応の促進
DNAに基づく組成物は、従来のワクチンを超える多くの潜在的な利点を提供して良い。単回投与、長期持続免疫、細胞性免疫、並びに液性免疫は、組換えDNA技術によって導入されるウイルス粒子の細胞内生産を使用して明らかにされうる。対照的に、エンドサイトーシスによって取り込まれるタンパク質に基づくサブユニットワクチンは、一般的にCD8+T細胞認識のために細胞を刺激しない。

HIV及び他のウイルス病原体の1つの回避する戦略は、非免疫細胞に進入し、複製する事である。例えば、上皮細胞は、クラミジア種及びリケッチア種によって侵入され、肝細胞は、プラスモディウム種及びリステリア菌の標的である。上記の様に、HIVは、主にCD4細胞を標的とするが、中枢神経系の様な他の非免疫組織は侵入される。促進されるCD8細胞障害性反応の刺激において、標的細胞の幅広い範囲が免疫系によって認識される可能性がある。上記の様に、CD8⁺T細胞は、全ての有核細胞に存在するMHCクラスI分子と関連して抗原を認識し、CD8⁺T細胞にいずれのタイプの感染宿主細胞の検出も可能にさせる。対照的に、CD4⁺T細胞は、MHCクラスIIを発現する宿主細胞に制限され、適用範囲においてより制限される。マクロファージ、樹状細胞、及びB細胞は、MHCクラスI及びMHCクラスIIを有する。更に、皮膚のランゲルハンス細胞は、クラスI及びクラスII両者のMHCタンパク質を有する(Kaufmann, 1996)。したがって、CD8⁺T細胞反応を促進する構成要素は、本発明のために意図される。図６に示される様に、各種の構成要素は、CD8⁺T細胞反応を促進するために裸のDNA/RNAの実施態様と組み合わされて良く、その幾つかは本明細書で記載されている。

例えば、バクテリア由来のDNA内における特異的な低メチル化CpGモチーフが強力なアジュバント効果を示しうる事が示されており、その効果は、部分的に、DNAに基づくワクチンの特性であるTh1-タイプの反応の誘導に関与する。DNAに基づくワクチンの有意な特徴は、殆どの従来のワクチンとは異なり、免疫接種を受けた動物において、液性、細胞性反応を刺激する特有の能力を有する。強力なTh1-タイプ免疫反応を誘導する能力は、多くの病原体（ウイルス、バクテリア、及び寄生虫による病気）に関して、抗体の存在ではなく細胞性免疫が保護と関連するため、非常に重要である(Lewis, 1999)。

細胞障害性T細胞活性を促進する更なる方法は、結核菌ヒートショックタンパク質70(HSP70)とサブユニットをコードする現実の裸のDNA/RNAとの結合である。HSP70は、タンパク質の折りたたみ、移行、及び分解において機能する細胞質のHSPである(Chen, 2000)。HSP反応性T細胞は、接合したペプチドとの反応によって強いヘルパー効果を及ぼしうる。HSPは、T-ヘルパー前炎症反応を誘導し、TNF-α及びIFNの分泌を誘導する(Chen, 2000)。免疫学的には、小胞体に位置するCa²⁺結合タンパク質であるカルレティキュリン(CRT)は、HSPと関連する。そのタンパク質は、抗原プロセシング及び提示と関連するトランスポーターによって小胞体に輸送されたペプチドと会合する(Wen-fang Cheng, 2002)。CRTは、CD8活性を促進する。

抗原のプロテアソームによる分解は、MHCクラスI提示を促進しうる(Chien-fu-hung, 2003)。したがって、細胞障害性T細胞活性を促進する更なる方法は、ガンマ-チューブリンとDNA/RNA配列との結合である。中心体は、プロテアソームにおいて豊富である細胞画分である。中心体は、有糸分裂及び小管の生産において重要である。中心体は、MHCクラスI抗原プロセシングのための重要な部位でもある。ガンマ-チューブリンのDNA/RNAへの結合は、タンパク質の中心体への細胞内局在を生じさせ、CD8+T細胞免疫反応を促進するであろう(Chan, 2000)。同様に、本発明の組成物は、B細胞反応を促進するためにマトリックスタンパク質のDNA/RNA配列に結合されたリソソーム結合膜タンパク質(LAMP-1)をコードするDNA/RNA配列を使用して良い(Chen, 2000)(Chien-fu-hung, 2003)。

C.2.6 サブユニットに基づく組成物のためのCD8+T細胞反応の促進
上記の様に、サブニットタンパク質ワクチンは、CD8+T細胞認識のための細胞を刺激しない可能性がある。しかしながら、完全なタンパク質を使用するCTL反応の初回刺激は、ISCOM（抗原を細胞質に輸送し、細胞障害性T細胞の誘導を可能にするウイルスタンパク質を含む脂質ミセルのマトリックス）またはリポソームの様な免疫刺激性の複合体への抗原の混入によって達成されている。更に、カチオン性脂質は、動物における抗原提示細胞のクラスIMHC経路を促進するために使用されている。使用される1つのカチオン性脂質は、DNAトランスフェクションに使用される市販されているカチオン性脂質であるDOTAP（N-[1-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウム硫酸メチル）である。標的細胞を刺激する事ができる他のカチオン性脂質は、市販されている。これらの脂質は、1つ以上の正に荷電したアンモニウム基と結合している2つの長い疎水性アルキル鎖を有するDOTAPと構造的に類似している。カチオン性脂質の働きの提案されている機構は、細胞膜との融合へと続く、全体として正電荷を有する高分子脂質複合体と負に荷電した細胞表面との相互作用を含む。対照的に、pH感受性のリポソームは、エンドソームの酸性環境との接触で不安定化し、エンドソームの膜を破裂及び/またはそれと融合して、その内容物を細胞質に放出すると解される(Walker, 1992)。

ISCOMは、植物で見られる複雑なグリコシドであるサポニンを含む。サポニンは、アジュバント特性を有する。サポニンは、約8から10モノサッカリドの親水性オリゴサッカリド配列を有する。ISCOMの調製は、当業者に既知である。ISCOMは、ステロイドまたはトリテルペンも有するために、その基本的な構造は、両親媒性である。この事が、ISCOMによる疎水性タンパク質と会合される脂質マトリックスの形成を可能にする。ISCOMの脂質の特性は、標的細胞との膜融合を可能にする。ISCOMの脂質マトリックスにおいて懸濁されたタンパク質は、標的細胞に取り込まれる様になり、免疫排除にさらされる(Kiyono, 1996)。

サブユニットワクチンの可溶性タンパク質とDOTAPの間の複合体の形成は、タンパク質の負電荷とカチオン性脂質との間のイオン性相互作用によって生じる。したがって、サブユニットワクチンの成熟または改変は、必要でない。そのため、会合は、細胞への適用または実験動物若しくはヒトへの注射の事前にDOTAP溶液または他のカチオン性脂質におけるサブユニットタンパク質の混合のみを必要とする。したがって、カチオン性脂質は、クラスIMHCの抗原の提示を引き起こす細胞内の事象の研究のための容易に利用可能な投与媒体であり、ウイルスに対するCD8⁺T細胞反応を促進するための組換えウイルスの代替物として働く(Walker, 1992)。

ISCOMまたは脂質担体は、最小限の毒性を有するアジュバントとして働く。それらは、タンパク質及びペプチドを細胞質に輸送し、ペプチドに対するクラスIに制限されるT細胞反応を可能にする。そのため、それらは、CD8活性を促進するためサブユニットワクチンと共に使用されうる。細胞質への侵入を得るために、ISCOMの脂質ミセルは、上記の様に細胞膜に融合し、ISCOM内に捕らえられた粒子は、小胞体に輸送されうる。小胞体の内部に輸送されると、これらの粒子は新しく合成されたMHCクラスI分子に結合する。最終的なタンパク質の修飾のために、前記粒子は、ゴルジ体を介する。次いで、それらは、ペプチドMHCクラスI複合体として細胞表面に輸送される(Parham, Peter, The Immune System, Ch. 12 (2004))。

そのため、本発明の組成物は、好ましくは、T細胞活性の促進またはCTL反応の初回刺激のために、ISCOM、リポソームに含ませる、及び/またはカチオン性脂質に溶解されるべきである。

C.3. 結論-調製の方法
したがって、本発明は、HIVウイルスのマトリックスタンパク質(p17MA)のアミノ末端及びミリステート共有結合部位に対する免疫反応を誘導するため、及びその免疫記憶を創出するために使用されるであろうタンパク質に基づく組成物と核酸に基づく組成物の両者を含む。核酸に基づく組成物は、DNA、RNA、またはmRNAであって良い。組換え核酸担体は、バクテリアまたはウイルスであって良い。好ましくは、組成物は、CD8+T細胞反応を促進するための1つ以上の構成成分を含む。

タンパク質に基づく組成物は、当該技術分野で既知である方法を使用して開発及び投与されて良い。核酸に基づく、動物に投与される組成物またはワクチンの目的のためには、市販されている遺伝子銃は好ましい投与の方法である。この技術は、表皮及び真皮内の細胞にDNAに覆われた金粒子を直接侵入させるために設計された器具を利用する。DNAは、樹状細胞に直接侵入し、CD8+T細胞の直接初回刺激を引き起こす(Chen, 2000)。特に、DNAに覆われた金粒子による遺伝子銃の投与は、核酸に基づくサブユニット組成物のためのCD8+T細胞免疫反応を促進する組成物構成成分に関する使用のために好ましいものであって良い(Chien-Fu Hung, 2003)。核酸に基づく組成物の投与の経路は、図７及び以下に要約されている。

D.更なる代替的な実施態様及び免疫刺激剤の記載
本発明によって意図される免疫反応は、免疫反応を刺激する非特異的または特異的な物質の使用によって促進されて良い。本発明は、以下の代替的な実施態様として記載されているものを含む適当な免疫刺激剤またはアジュバントと混合されて良い。その様な組成物は、応用のために適当なものとして使用されて良い。当該技術分野で既知である慣用されている刺激剤またはアジュバントは、フロイント不完全アジュバント、リポソーム等を含む。好ましい実施態様は、慣用されているアジュバント及び/または更に本明細書で記載される組成物から選択される1つ以上の刺激剤を含む。さらに、DNAは補体活性を増大させるため、DNAワクチンおよびアジュバントとして同時に使用されて良い。（DPTワクチンは、三つの別々のワクチン粒子からなる。百日咳構成成分は、他の二つのためのアジュバントとして働く（Parham, 2004）。HIV病のDNAワクチン（好ましくは、HIVウイルスのマトリックスタンパク質(p17MA)のアミノ末端及びミリステート共有結合部位をコードしている）が、HIVウイルスサブユニットワクチンにおけるマトリックスタンパク質(p17MA)のアミノ末端及びミリステート共有結合部位のためのアジュバントとして働くであろう類似した状況が存在する。）

組換えバクテリアまたはウイルスベクターの免疫原性を促進するために、シアル酸は、バクテリアの細胞膜、またはウイルスのタンパク質被膜及び/若しくはエンベロープ（ウイルスがエンベロープを有する場合）構造から除去される必要がある。ノイラミニダーゼを使用する処理は、バクテリアまたはウイルスのタンパク質構造を変化させること無く、シアル酸残基を効果的に除去するであろう。

代替的な実施態様では、組成物は、マンノースまたはマンナンから成るポリサッカリドに共有または別の様式で結合されて良い。結合または共役は、当業者に既知の方法を使用して達成されて良い。マンノースは、微生物及び病原体でのみ見られる糖であり、人体においては通常は見られない。マンノース結合タンパク質(MBP)は、コラーゲン性の構造の領域を含むC-タイプレクチンであるコレクチンである。このタンパク質は、正常のヒトの血清に存在し、3つのポリペプチド鎖から成る各サブユニットから成り、コラーゲン様の三重らせん及び3つのC末端に球状の糖認識ドメイン(CRD)を形成する。6つのサブユニットが、共に、古典的補体経路のC1qのチューリップ様の構造の花束に似た全体の構造を形成する。MBPの糖への結合は、C1r₂ C1s₂の活性化へと続く古典的補体経路を開始する。この事は、直接的に末端細胞膜障害複合体の挿入、または微生物表面の補体の沈着によるオプソニン化のどちらかを介する補体による殺滅を生じさせる。MBPは、MASP（1及び2）セリンプロテアーゼと呼ばれる他の新規に記載されるセリンプロテアーゼを介して、C2及びC4を活性化する可能性もある。したがって、MBPは、おそらく食細胞のコレクチンレセプターに対するコラーゲン性のストークの結合によって介される補体から独立したオプソニン化活性も示す(Presanis J. S. , et al., Biochemistry and Genetics of Mannan-binding Lectin (MBL) , Biochemical Society Transactions, Vol. 31, pp 748- 752 (2003))。表面にマンノースまたはマンナンを有する生物のいずれもが、補体活性化のレクチン経路を刺激するであろう。その様なポリサッカリドに結合される組成物は、血清中のマンノース結合レクチンと結合し、補体系のレクチン経路を活性化するであろう。したがって、この代替的な実施態様は、それによりワクチンに対する全体的な免疫反応を促進するであろう。

他の代替的な実施態様では、組成物は、補体副経路を刺激または活性化する物質と組み合わせられて良い。例えば、テイコ酸の特定の形態が、補体副経路の強力なアクチベーターである事が既知である(Winkelstein J. A. , J. of Immun., Vol. 120, pp 174-178 (1978))。更に、酵母細胞由来であって良いザイモサンは、サイトカインを誘導し、補体副経路系と同時に免疫反応を刺激しうる。ザイモサンは、オプソニン化を伴って、または伴わずにマクロファージによってファゴサイトーシスされるため、補体副経路を活性化するという有用な免疫の性質を有する。ザイモサンとマクロファージの相互作用は、Th-1反応を促進すると解されている。CD4細胞は、Th-1細胞とTh-2細胞に分類されうる。Th-1細胞は、IL-2の生産によって細胞障害性T細胞を活性化し、Th-2細胞は、主にIL-4及びIL-5の生産によってB細胞を活性化する。ザイモサンによって生産されるTh-1反応のレベルは、C3切断フラグメントであるC3b及びiC3bによって調節される。増幅されたC3bは、ザイモサンの受容される表面に沈着し、マクロファージ、樹状細胞、または他の抗原提示細胞を集める。マクロファージ、樹状細胞、及び抗原提示細胞は、ザイモサンのオプソニン化後、抗原特異的なマクロファージの活性化が生じた後に、Th-1細胞に対して抗原を提示する(Fearon D. T. , et al., Proc. Natl. Acad. Sci, Vol. 74, pp 1683-1687 (1977) )。そのため、ザイモサンは、HIV病に対する液性及び細胞性免疫反応の両者を促進するアジュバントとして使用されうる。したがって、前記組成物は、テイコ酸またはザイモサンの様な補体副経路を刺激する物質に共有または他の様式で結合されて良い。

HIV特異的なDNAワクチンにおけるザイモサンのアジュバント効果は、プラズマベクター(pCMV160IIIb)を使用して最近示されている。実験用マウスにおいて、前記プラスミドワクチンが、ザイモサンの存在または非存在条件で接種された。プラスミドベクターだけを使用した際に対して、ザイモサンがプラスミドベクターと共に接種された際に、高レベルの液性免疫反応及びHIV特異的遅延型超過敏症(DTH)反応の両者が、確認された。HIV特異的細胞障害性T細胞リンパ球活性も促進された。前記効果は、補体の活性化、特に副経路を介した、その（ザイモサンの）リクルート、及びマクロファージ、樹状細胞、または抗原提示細胞の活性化の結果に基づく事が示されている。これらの結果は、ザイモサンが効果的な免疫刺激剤である事を示す(Ara, 2001)。

そのため、組成物の免疫原性を促進するために、マンノース、テイコ酸、ザイモサン、またはそれらの幾つかの組み合わせは、サブユニットワクチンのタンパク質構成成分に結合されて良い。好ましくは、ポリサッカリドは、16個の別々のサッカリド単位から成るであろう(Pangburn, Michael K., Immun., Vol. 142, pp 2766- 2770 (1989) )。サブユニットワクチンの糖/アジュバント構成成分の好ましいソースは、Cryptococcus neoformans血清型Cという酵母細胞の莢膜ポリサッカリドであろう(Sahu Arvind, et al., Biochem. J., Vol 302, pp 429-436 (1994))。この酵母細胞は、各トリマンノース繰り返し単位から4つの分岐したキシロース糖を提示する。C3補体構成成分のチオールエステル部位は、特異的な糖配列への強い選択性を示す。この事は、C3のC3aフラグメント及びC3bへの切断を生じさせる。C3b分子は、3つの補体経路の全てにおける焦点である。

更に、全てのグルコース分子及びポリサッカリドは、組成物から除去されるべきである。細胞培養物へのインスリンの添加は、細胞外グルコースの細胞膜を越える細胞質への輸送を促進する。遊離の可溶性グルコース分子は、C3b沈着の速度及び程度の両者を阻害する(Sahu Arvind, 1994)。

代替的な実施態様では、ヘパリンの効果が阻害されて良い。ヘパリンは、効果的な補体因子Hの機能に必須な補因子である(Maillet, Francoise, et al., Mol. Immun., Vol. 25, pp 917-923 (1988)) (Maillet, Francoise, et al., Molecular Immun., Vol. 20, pp 1401-1404 (1983) )。更に、CypAは、宿主細胞への結合の際に結合パートナーとしてヘパリンを使用する(Saphire, Andrew C. S. , et al., European Molecular Bio. J. 18 : 6771-6785 (1999) )。上記の様に、補体因子Hは、補体副経路において、主要な制限するタンパク質である。補体副経路は、微生物またはワクチンに対して反応する免疫系の第一の部門である。プロタミンは、ヘパリンに結合し、抗凝血を起こしている患者において効果的なヘパリンを減少させるために使用される(Furie, Bruce, Oral Anticoagulant Therapy, Hematology Basic Principles & Practice, Ch. 121 (3rd ed. 2000) )。最近では、より少ない毒性のヘパリンアンタゴニストである低分子量プロタミン(LMWP)が、入手可能になっている。プロタミン、またはこの実施態様のために好ましくはLMWPが、補体副経路の制限における補体因子Hの活性を弱めるために、組成物の構成成分として含まれて良い(Liang J. F, et al., Biochemistry, Vol. 68, pp 116-120 (2002))。あるいは、ヘパリナーゼがヘパリンを酵素的に分解する事が知られている。

デキストランとして知られている、グルコースの、分岐され、部分的に加水分解されたポリサッカリドは、効果的な血漿増量剤として使用されている(Hoffman, Ronald, Hematology Basic Principles and Practice, 2177 (3rd ed. 2000) )。硫酸デキストランは、ポリサッカリドデキストランの硫酸エステルのナトリウム塩である。5×10³より大きい分子量を有する可溶性硫酸デキストランは、補体副経路の誘導物質である。デキストラン中の100グルコース残基あたりの硫酸基の数が、補体副経路におけるデキストランの活性化潜在能力を決定する。硫酸化の最適な程度は、50-60SO₄/100グルコース分子であった(Burger, R. , et al., Immunology, Vol. 29. pp 549-554 (1975))。

硫酸化セファデックス(SS)は、デキストランの架橋された不溶性形態である。可溶性の硫酸デキストランの様に、SSは、補体の古典的経路と同様に補体副経路も活性化する。3つの変数が、補体活性の両経路に対するSSの活性を調節する。
（1）硫酸化の量；15.6重量%以下の高い硫酸化含有量は、高い補体の活性化を生じさせる。2.43％未満の硫酸エステル含有量では、補体活性化は示されなかった。
（2）SSの濃度；40-50μg/mlで最大のC3代謝回転となり、より高い濃度は、補体活性化を生じさせる。
（3）温度；4℃で活性の全損失であり、最大のC3代謝回転は、37℃で示された（Burger, R., et al., Immunology, 33:827 (1997)）。デキストラン（>5000分子量）の可溶性及び不溶性形態の両者は、補体副経路を活性化する。この事は、補体因子Hの効果の阻害によって達成される(Burger, R. , et al., European J. Immunology, pp. 291-295 (1981) ) 。低分子量硫酸デキストラン(<5000)は、補体因子Hの結合を促進するため、補体副経路の活性を制限する(Seppo Meri, et. al., Proc. Natl. Acad. Sci, Vol 87, pp 3982-3986 (1990) )。DNA様ヘパリンも補体因子Hの結合を誘導する(Gardner, William D. , Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol. 94, pp 61-67 (1980))。

そのため、分子量>5000で50-60SO₄/100グルコース分子である硫酸デキストランの免疫原性を促進する事は、組成物に含まれうる。同様に、37℃で濃度40-50μg/mlである15.6重量%のSO₄を有するSSは、組成物の免疫原性を促進するであろう。低分子量のデキストランは、補体因子Hの結合を誘導し、補体活性を減少するため組成物に含まれないであろう。

更なる代替的な実施態様では、C3転換酵素を安定化する物質が本発明と共に使用されて良い。三つの補体経路の全てが、C3bの産生を引き起こし、そのC3bは、微生物の表面または免疫原性組成物に存在する微生物の構成成分に共有結合する。C3bは、C3転換酵素として知られている酵素によって生産される。ヘビNaja kaouthia由来のコブラ毒因子（CVF）は、この酵素を安定化する（Alper, C. A., et al., Science, Vol. 191, pp. 1275-1276 (1976))。内生の補体副経路のC3転換酵素(C3b,Bb)の半減期は1.5分であるのに対して、CVF C3b,Bb C3/C5転換酵素の半減期は、7時間である。C3b,Bbは、補体因子Hによって分解され、C3bは、補体因子Hと第I因子の組み合わせた働きによって不活化される。対照的に、因子CVF,C3,Bbは、全ての調節的補体タンパク質に耐性を示す（Kock, Michael A., et al., J. of Biol. Chemistry, Vol. 279 pp. 30836-30843 (2004)）。C3b,Bbは、C5に作用するために更なるC3bを必要とするが、CVF,Bbは、直接C5を切断できる。そのため、CVF,Bb酵素は、連続してC3及びC5を活性化する（Kock, 2004）。

コブラ毒におけるCVFの生物学的機能には、毒の構成成分を血流中に進入させる働きがあると解されている。この事は、血管透過性を増大するアナフィラトキシンC3a、C5a、及びBbの放出を引き起こす補体活性化によって達成される（Vogel, Carl W., Immunoconjugates, Ch. 9 (1987)）。コブラ毒由来であるにも拘らず、CVFは、非毒性のタンパク質である。CVFは、毒を含むコブラ毒由来の他の酵素、ポリペプチド等から単離されうる。

したがって、CVFの投与は、C3bの爆発的な生産を生じさせる（Vogel, 1987）（Kock, 2004）。図８は、C3とCVFの間の構造的な相同性を図示している。微生物の表面上のC3bは、末梢循環、及びリンパ節の胚中心内のT細胞及びB細胞並びにリンパ節内の濾胞樹状細胞によって認識される。C3bは、強力なオプソニンである。オプソニンは、同時に免疫系の幾つかの部門を引き起こす（Hoffman, Ronald, Hematology Basic Principles and Practice, Ch. 27 (3rd ed. 2000）。したがって、他の実施態様では、CVFは、組成物の構成成分として使用されて良い。

CVFの好ましい形態は、dCVF（De-α-ガラクトシル化 CVF）である（Gowda, D. C., et al., "Immunoreactivity and function of Oligosaccharides in Cobra Venom Factor," J. of Immn., pp. 2977-2986, (Dec 21 1993))。自然に分泌されるCVFは、αガラクトシル化Le^X抗原エピトープであるGalα1-3Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAcβ1を含むフコシル化された二分岐の複合型N結合型鎖である独特のポリサッカリドによって特徴付けられる。このポリサッカリドの除去は、37℃、18から23時間、Ph8.0の条件で、CVFをペプチドNグリコシダーゼF（N-グリカナーゼ）とインキュベートすることによって達成される。この新規なポリサッカリドのCVFからの除去は、ヒトIgGの1%がCVFの末端Galα1-3Galβ1配列と反応するために必要である。しかしながら、このポリサッカリドの除去は、分子の補体結合性質を妨げることも分子の半減期を短くすることも無い。dCVFは、免疫原性組成物を含むポリサッカリド単位に共有結合する。

他の実施態様では、ニッケル化合物が、組成物に加えられて良い。ニッケルは、古典的及び補体副経路の両者におけるC3転換酵素活性の促進において効果的であることが示されている（Fishelson, Z., et al., J. of Immun., Vol. 129, pp. 2603-2607 (1982)）。平均的な成人の平均的なニッケルの取り込みは、一日に60から260μgであると見積もられており、その環境衛生基準用量は、0.02 mg/kg(体重)/日（mg/kg/d）である（U.S. EPA, 2003）。本発明は、基準用量を十分に下回るほぼ平均的な1日ごとの取り込み量のニッケル、好ましくはニッケル塩化物を含むであろうことが意図されている。そのため、本発明は、免疫反応を促進するためのニッケルの使用により生産されて良い。

要約
本発明のためのワクチン剤を構成する組成物の調製のために、精製、合成、または遺伝子工学の既知の方法が使用されて良い。当業者は、HIVウイルスのマトリックスタンパク質(p17MA)のアミノ末端及びミリステート共有結合部位のフラグメントを単離及び精製、またはそれをコードする配列を調製して良い。タンパク質フラグメント、裸のDNA/RNA、組換えDNA/RNA、またはメッセンジャーRNAは、担体または賦形剤の様な投与の予想される方法のために適当に製薬組成物に含まれて良い。本発明に従う免疫反応が望まれる動物または対象に、組成物を投与して良い。治療上効果的な投与量は、望まれる程度まで特異的な免疫抑制を後進させるために必要な量であり、クロム遊離試験、細胞内サイトカイン試験、リンパ増殖試験(LPA)、インターフェロンガンマ（IFN-ガンマ）ELISpot試験、及びMHC四量体結合試験の様な標準的な方法を使用して決定されるであろう。MHC四量体結合試験が好ましい。これらと同様の臨床試験が非感染性の対象の免疫反応の測定に適用されるであろう。

免疫原性組成物の分析及び開発は、評価のために不活化粒子の広範囲の投与を含むべきである。動物試験は、サイズ、種、及び免疫学的特徴の相違を考慮すべきである。ヒトと動物の間の免疫学的相違が、毒性分析を動物試験に委ねる事が予想される。臨床試験は、少人数における安全性と投与量から、数百人のボランティアの第二段階における安全性及び免疫原性、大規模な有効性試験まで少なくとも標準的な3段階のモデルを含むであろう。臨床試験は、他の免疫抑制疾患、妊娠、劇薬の使用等のための除外の様な慣例の適当な除外基準を含むべきである。サブユニットタンパク質を使用する試験のための開始用量は、年少者には10μg/株であり、成人には20μg/株である。裸のDNAワクチンのためには、全年齢において1μg/株の開始用量が適当であろう。

投与は、各種の経路においてなされて良く、例えば、経口、経頬、経粘膜、経舌、経鼻、経直腸、経膣、眼内、筋肉内、リンパ内、静脈内、皮下、経皮、皮内、腫瘍内、局所、経肺、吸入によって、注射によって、または移植によって等により投与されて良い。組成物の各種の形態は、カプセル、ジェルキャップ、錠剤、腸溶カプセル、被包性粒子、粉、坐薬、注射、軟膏、クリーム、インプラント、パッチ、液体、吸入、またはスプレー、全身、局所的、または他の口腔媒体、溶液、懸濁液、輸液などを含んで良いが、それらに制限されない。HIV感染の第一の標的の幾つかは、皮膚並びに直腸及び膣の粘膜における上皮細胞及びランゲルハンス細胞であるため、投与の好ましい実施態様は、直腸及び/または膣の坐薬と組み合わせた経皮的なものである。HIVは、主に直腸及び膣の交わりによって罹患される。そのため、ワクチンの直腸及び/または膣の坐薬投与は、好ましい投与方法体系であろう。更に、本発明は、天然の形態、組換えた形態、変異した形態、断片、融合タンパク質、及びサイトカインの他のアナログと誘導体を含むサイトカイン、混合物、他の生理活性物質、並びに製剤補助剤等の様な他の治療剤と組み合わせて良い。当業者は、注射のためには、リンガー溶液または塩緩衝液のような水溶液における製剤が適当であって良いことを認識している。リポソーム、エマルション、及び溶剤は、投与媒体の他の例である。経口投与は、カプセル、錠剤、液体、丸薬などに適切である、スクロース、セルロース等の様な担体を必要とするであろう。

上の記載は、本発明の特定の実施態様について述べているが、本発明の精神から逸脱すること無く、他の変形例が作り出されて良い事は理解されるであろう。添付の特許請求の範囲は、本発明の真の範囲及び精神に含まれるものとして、その様な変形例を含むことを意図している。

図１は、ヒト補体カスケード経路の図である。 図２は、本発明の免疫原性組成物内のHIVのマトリックスタンパク質(p17MA)のアミノ末端及びミリステート共有結合部位の実施態様のカテゴリーの図である。 図３は、組換えDNAに利用可能な典型的な担体の図である。 図４は、組換えバクテリア組成物またはワクチンへのミリステートのためのマトリックスタンパク質共有結合部位をコードする遺伝物質のスプライシングを示す図である。 図５は、組換えウイルス組成物またはワクチンへのミリステートのためのマトリックスタンパク質共有結合部位をコードする遺伝物質のスプライシングを示す図である。 図６は、裸のDNA組成物と共に使用するための免疫刺激剤のリストである。 図７は、従来のDNAの投与の経路の図である。 図８は、C3とCVFの鎖構造及びそれらの関係を示す概略図である。

Claims (32)

1. HIVに対する免疫反応を誘導する組成物であって、薬剤的に許容される支持体において、HIVマトリックスタンパク質の少なくとも1つのミリステート共有結合部位の有効量を含む組成物。
2. 前記結合部位が、組換え担体によって発現される、請求項１に記載の組成物。
3. 前記組換え担体が、ウイルスである、請求項２に記載の組成物。
4. 前記ウイルスが、ヘルペスウイルスである、請求項３に記載の組成物。
5. 前記ヘルペスウイルスが、エプスタインバーウイルスである、請求項４に記載の組成物。
6. 前記ウイルスが、ポリオウイルスである、請求項３に記載の組成物。
7. ノイラミニダーゼ、トリプシン、または他の適当なシアル酸を除去する酵素を使用して処理される、請求項３に記載の組成物。
8. 前記組換え担体が、バクテリアである、請求項２に記載の組成物。
9. 前記バクテリアが、Bacillus Calmette Guerinである、請求項８に記載の組成物。
10. 前記バクテリアが、リステリア菌である、請求項８に記載の組成物。
11. ノイラミニダーゼ、トリプシン、または他の適当なシアル酸を除去する酵素を使用して処理される、請求項８に記載の組成物。
12. 前記組換え担体が、酵母である、請求項２に記載の組成物。
13. 前記酵母が、Saccharomyces cerevisiaeである、請求項１２に記載の組成物。
14. 前記結合部位が、メッセンジャーRNAによって発現される、請求項１に記載の組成物。
15. HIVに対する免疫反応を誘導する薬剤の調製のための、請求項１に記載の組成物の使用。
16. 動物における免疫反応を誘導する方法であって、薬剤的に許容される支持体において、HIVマトリックスタンパク質の少なくとも1つのミリステート共有結合部位の有効量を含む組成物の投与を含む方法。
17. 前記組成物が、経口、経頬、経粘膜、経舌、経鼻、経直腸、経膣、眼内、筋肉内、リンパ内、静脈内、皮下、経皮、皮内、腫瘍内、局所、経肺、吸入、注射、または移植によって投与される、請求項１６に記載の方法。
18. 前記組成物が、カプセル、ジェルキャップ、錠剤、腸溶カプセル、被包性粒子、粉、坐薬、注射、軟膏、クリーム、インプラント、パッチ、液体、吸入、またはスプレーによって投与される、請求項１６に記載の方法。
19. 免疫刺激剤と組み合わされる、請求項１に記載の組成物。
20. 前記免疫刺激剤が、アジュバントである、請求項１９に記載の組成物。
21. 前記免疫刺激剤が、前記組成物に結合する能力がある形態における少なくとも1つのマンノースから成るポリサッカリドを含む、請求項１９に記載の組成物。
22. 前記免疫刺激剤が、前記組成物に結合する能力がある形態におけるテイコ酸を含む、請求項１９に記載の組成物。
23. 前記免疫刺激剤が、前記組成物に結合する能力がある形態におけるザイモサンを含む、請求項１９に記載の組成物。
24. 前記免疫刺激剤が、前記組成物に結合する能力があるポリサッカリドカプセルを有するcryptococcus neoformans 血清型 Cを含む、請求項１９に記載の組成物。
25. 前記免疫刺激剤が、ヘパリンに結合する能力がある形態におけるプロタミンを含む、請求項１９に記載の組成物。
26. 前記免疫刺激剤が、ヘパリナーゼを含む、請求項１９に記載の組成物。
27. 前記免疫刺激剤が、C3bの生産を促進するのに適した形態におけるコブラ毒因子を含む、請求項１９に記載の組成物。
28. 前記コブラ毒因子が、dCVFである、請求項２７に記載の組成物。
29. 前記免疫刺激剤が、C3転換酵素活性を促進するのに適した形態におけるニッケルを含む、請求項１９に記載の組成物。
30. 前記免疫刺激剤が、補体因子Hを吸収する能力がある硫酸化ポリアニオンを含む、請求項１９に記載の組成物。
31. 補体因子Hを増強する能力がある前記組成物内のポリアニオンが、実質的に除去される、請求項１に記載の組成物。
32. HIVに対する免疫反応を誘導する組成物であって、薬剤的に許容される支持体において、HIVマトリックスタンパク質のGARASVLSSGGペプチドの有効量を含む組成物。

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