BR112020024048A2

BR112020024048A2 - composição, e, métodos para descolonizar um organismo microbiano, para destruir ou interromper ou inibir ou reduzir a formação de biofilme de um organismo microbiano e para tratar uma infecção microbiana em um indivíduo.

Info

Publication number: BR112020024048A2
Application number: BR112020024048-6A
Authority: BR
Inventors: Cagla Tukel Wilson; Scott Dessain
Original assignee: Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education; Lankenau Institute Of Medical Research
Priority date: 2018-05-25
Filing date: 2019-05-24
Publication date: 2021-02-17
Also published as: US20220227846A1; CN112805296A; MX2020012727A; KR20210095998A; SG11202011717UA; WO2019226978A1; EP3802572A1; AU2019274591A1; EP3802572A4; CA3101680A1; JP2021525798A; US11897942B2; IL278977A; US20210122809A1

Abstract

A presente invenção apresenta composições compreendendo um anticorpo antiamiloide e métodos de tratamento de infecção microbiana e tratamento ou prevenção de biofilmes microbianos usando a composição.

Description

1 / 93 COMPOSIÇÃO, E, MÉTODOS PARA DESCOLONIZAR UM ORGANISMO MICROBIANO, PARA DESTRUIR OU INTERROMPER OU

INIBIR OU REDUZIR A FORMAÇÃO DE BIOFILME DE UM ORGANISMO MICROBIANO E PARA TRATAR UMA INFECÇÃO MICROBIANA EM UM INDIVÍDUO REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica prioridade do Pedido Provisório U.S. nº de 62/676.390, depositado em 25 de maio de 2018, que está aqui incorporada a título de referência, em sua totalidade.

DECLARAÇÃO REFERENTE A PESQUISA OU DESENVOLVIMENTO COM PATROCÍNIO DO GOVERNO FEDERAL

[002] Esta invenção foi feita com o apoio do governo sob o AI132996 concedido pelo National Institutes of Health (NIH). O governo tem certos direitos sobre a invenção.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[003] Os biofilmes bacterianos são de grande relevância e frequentemente deletérios no ambiente médico. Protegidos em uma densa matriz extracelular, os biofilmes bacterianos são altamente resistentes a antibióticos, antimicrobianos e respostas geradas por células imunes inatas (Thurlow et al., 2011, J Immunol, 186(11):6585-96). As estratégias de tratamento para erradicar biofilmes são limitadas. A estratégia de tratamento atual para eliminar infecções associadas ao biofilme é através do uso de antibióticos. Em comparação com as bactérias planctônicas, é necessária uma concentração 100 a 1000 vezes maior de antibióticos para combater infecções associadas ao biofilme (Anwar and Costerton, 1990, Antimicrob Agents Chemother, 34(9):1666-71, Moskowitz et al., 2004, J Clin Microbiol, 42(5):1915-22). Dentro dos biofilmes, as bactérias têm crescimento lento ou são persistentes, tornando ineficaz a maioria dos antibióticos que alvejam a biologia celular ou a replicação bacteriana (Keren et al., 2004, FEMS Microbiol

2 / 93 Lett, 230(1):13-8, Brown et al., 1988, J Antimicrob Chemother, 22(6):777-80, Stewart, 2002, Int J Med Microbiol, 292(2):107-13, Lewis, 2001, Antimicrob Agents Chemother, 45(4):999-1007). Como mais de 65% das infecções são causadas por biofilmes bacterianos (Larsen et al., 2007, Environ Microbiol, 9(12):3077-90, Costerton et al., 1999, Science, 284(5418):1318-22), novos tratamentos para romper os biofilmes bacterianos são necessários. A ruptura da matriz do biofilme intensificaria a suscetibilidade do biofilme ao sistema imunológico inato, bem como ao tratamento com antibióticos, promovendo assim a resolução do biofilme.

[004] Um componente proteináceo principal dos biofilmes entéricos é o curli amiloide. O curli amiloide é o amiloide bacteriano mais bem caracterizado expresso em biofilmes (Hung et al., 2013, MBio, 4(5):e00645- 13). Curli é especificamente expresso por bactérias da família Enterobacteriaceae, embora aproximadamente 40% das espécies bacterianas produzam amiloides como um componente principal dos biofilmes (Larsen et al., 2007, Environ Microbiol, 9(12):3077-90). Definido por sua estrutura de folha beta característica, onde as folhas β são perpendiculares ao eixo da fibra (Sunde et al., 1997, J Mol Biol, 273(3):729-39; Nelson et al., 2005, Nature, 435(7043):773-8; Sunde et al., 1997, Adv Protein Chem, 50:123-59), curli é expresso pelos operons csgBAC e csgDEFG do gene específico curli bidirecional (Chapman et al., 2002, Science, 295(5556):851-5). A produção de curli é um processo altamente regulado. Quando cultivado em condições estressantes, a ativação dos genes csg leva à produção das principais proteínas curli (junto com outras proteínas acessórias), CsgA e CsgB (Chapman et al., 2002, Science, 295(5556):851-5; Zhou et al., 2012, Methods Mol Biol, 849:303-20). Com a ajuda de outras proteínas acessórias, CsgA é produzida como uma unidade monomérica e é secretada extracelular, onde fibriliza na fibrila amiloide curli madura (Robinson et al., 2006, Mol Microbiol, 59(3):870- 81). CsgB auxilia na nucleação de monômeros CsgA e afixa CsgA à superfície

3 / 93 celular (White et al., 2001, J Mol Biol, 311(4):735-49; Hammer et al., 2007, Proc Natl Acad Sci U S A., 104(30):12494-9).

[005] Curli tem inúmeras funções dentro do biofilme entérico. Curli serve como um arcabouço que permite a formação do biofilme tridimensional maduro (Reisner et al., 2003, Mol Microbiol, 48(4):933-46; Costerton et al., 1995, Annu Rev Microbiol, 49:711-45). Formando uma rede semelhante a uma malha, o curli envolve as bactérias criando uma cápsula protetora. O curli expresso pela única bactéria promove a adesão de várias bactérias dentro do biofilme, bem como auxilia na afixação da superfície (Kikuchi et al., 2005, Microbiol Immunol, 49(9):875-84). A produção de outros componentes integrais do biofilme de S. Typhimurium, como a celulose, é dependente da produção de curli. As amiloides são altamente resistentes à degradação proteolítica e química. Amiloides como curli precisam ser expostas a 90 por cento de ácido fórmico ou hexafluoroisopropanol (HFIP) para despolimerizar a fibrila em subunidades monoméricas (Zhou et al., 2013, Methods Mol Biol, 966:53-75). Sem a produção de curli, os biofilmes de S. Typhimurium são desestabilizados e não conseguem formar biofilmes maduros (Kikuchi et al., 2005, Microbiol Immunol, 49(9):875-84).

[006] Biofilmes bacterianos são frequentemente associados a infecções e são difíceis de erradicar. Além disso, não há tratamento para limpar biofilmes bacterianos que se formam em dispositivos médicos residentes (cateteres, válvulas cardíacas, articulações artificiais, etc.), de modo que os objetos estranhos geralmente precisam ser removidos e/ou substituídos, com grande custo e morbidade para o paciente. Biofilmes também são componentes importantes de infecções crônicas de feridas bacterianas.

[007] Assim, existe uma necessidade na técnica de métodos para prevenir a formação de biofilme, bem como para romper biofilmes formados para tratamento e prevenção de infecções microbianas. A presente invenção satisfaz essa necessidade não atendida.

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SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[008] Em uma modalidade, a invenção refere-se a uma composição que compreende um anticorpo terapêutico, em que o anticorpo é específico para a ligação a um epítopo de curli e adicionalmente em que o epítopo de curli compreende uma sequência com homologia com um sítio de ligação de anticorpo de uma ou mais proteínas amiloides heterólogas.

[009] Em uma modalidade, o anticorpo inibe a fibrilização de uma ou mais proteínas amiloides heterólogas. Em uma modalidade, o anticorpo inibe a fibrilização de β-amiloide.

[0010] Em uma modalidade, o anticorpo impede a formação de biofilme ou altera a arquitetura do biofilme. Em uma modalidade, o anticorpo é eficaz na redução de massa de biofilme. Em uma modalidade, a massa de biofilme está associada a uma bactéria gram-positiva, uma bactéria gram- negativa ou uma combinação das mesmas.

[0011] Em uma modalidade, o anticorpo é ALZ.3H3, ALZ.2C10, ALZ.4G1, ou ALZ.4A6.

[0012] Em uma modalidade, o anticorpo inibe a fibrilização de β- amiloide e impede a formação de biofilme ou altera a arquitetura do biofilme. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo ALZ.3H3. Em uma modalidade, o anticorpo ALZ.3H3 compreende pelo menos um de uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada conforme estabelecido na SEQ ID NO:2 e uma sequência de aminoácidos da cadeia leve conforme estabelecido na SEQ ID NO:35. Em uma modalidade, o anticorpo ALZ.3H3 compreende pelo menos um de uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada codificada por uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecido na SEQ ID NO:1 e uma sequência de aminoácidos da cadeia leve codificada por uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecido na SEQ ID NO:34.

[0013] Em uma modalidade, o anticorpo impede a formação de biofilme ou altera a arquitetura do biofilme. Em uma modalidade, o anticorpo

5 / 93 é um anticorpo ALZ.4G1. Em uma modalidade, o anticorpo ALZ.4G1 compreende pelo menos um de uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada conforme estabelecido na SEQ ID NO:61 e uma sequência de aminoácidos da cadeia leve conforme estabelecido na SEQ ID NO:63. Em uma modalidade, o anticorpo ALZ.4G1 compreende pelo menos um de uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada codificada por uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecido na SEQ ID NO:60 e uma sequência de aminoácidos da cadeia leve codificada por uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecido na SEQ ID NO:62.

[0014] Em uma modalidade, o anticorpo inibe a fibrilização de β- amiloide. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo ALZ.4A6. Em uma modalidade, o anticorpo ALZ.4A6 compreende pelo menos um de uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada conforme estabelecido na SEQ ID NO:57 e uma sequência de aminoácidos da cadeia leve conforme estabelecido na SEQ ID NO:59. Em uma modalidade, o anticorpo ALZ.4A6 compreende pelo menos um de uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada codificada por uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecido na SEQ ID NO:56 e uma sequência de aminoácidos da cadeia leve codificada por uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecido na SEQ ID NO:58

[0015] Em uma modalidade, a composição é para aplicação a uma superfície de um dispositivo médico.

[0016] Em uma modalidade, a composição compreende um antibiótico.

[0017] Em uma modalidade, a composição compreende um ou mais carreadores ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

[0018] Em uma modalidade, a formulação é uma formulação tópica na forma de um creme, uma loção, uma pomada, um hidrogel, um coloide, um gel, uma espuma, um óleo, um leite, uma suspensão, um lenço, uma esponja, uma solução, uma emulsão, uma pasta, um emplastro, uma compressa, um suabe, um curativo, um spray ou uma atadura.

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[0019] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um método para descolonizar um organismo microbiano compreendendo contactar o organismo microbiano com uma composição compreendendo um anticorpo terapêutico, em que o anticorpo é específico para a ligação a um epítopo de curli e adicionalmente em que o epítopo de curli compreende uma sequência com homologia com um sítio de ligação de anticorpo de uma ou mais proteínas amiloides heterólogas. Em uma modalidade, o anticorpo inibe a fibrilização de uma ou mais proteínas amiloides heterólogas, evita a formação de biofilme, altera a arquitetura do biofilme ou qualquer combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o anticorpo é ALZ.3H3, ALZ.4G1, ALZ.2C10 ou ALZ.4A6.

[0020] Em uma modalidade, o anticorpo inibe a fibrilização de β- amiloide e impede a formação de biofilme ou altera a arquitetura do biofilme. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo ALZ.3H3. Em uma modalidade, o anticorpo ALZ.3H3 compreende pelo menos um de uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada conforme estabelecido na SEQ ID NO:2 e uma sequência de aminoácidos da cadeia leve conforme estabelecido na SEQ ID NO:35. Em uma modalidade, o anticorpo ALZ.3H3 compreende pelo menos um de uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada codificada por uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecido na SEQ ID NO:1 e uma sequência de aminoácidos da cadeia leve codificada por uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecido na SEQ ID NO:34.

[0021] Em uma modalidade, o anticorpo impede a formação de biofilme ou altera a arquitetura do biofilme. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo ALZ.4G1. Em uma modalidade, o anticorpo ALZ.4G1 compreende pelo menos um de uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada conforme estabelecido na SEQ ID NO:61 e uma sequência de aminoácidos da cadeia leve conforme estabelecido na SEQ ID NO:63. Em uma modalidade, o anticorpo ALZ.4G1 compreende pelo menos um de uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada codificada por uma sequência de nucleotídeos

7 / 93 conforme estabelecido na SEQ ID NO:60 e uma sequência de aminoácidos da cadeia leve codificada por uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecido na SEQ ID NO:62.

[0022] Em uma modalidade, o anticorpo inibe a fibrilização de β- amiloide. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo ALZ.4A6. Em uma modalidade, o anticorpo ALZ.4A6 compreende pelo menos um de uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada conforme estabelecido na SEQ ID NO:57 e uma sequência de aminoácidos da cadeia leve conforme estabelecido na SEQ ID NO:59. Em uma modalidade, o anticorpo ALZ.4A6 compreende pelo menos um de uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada codificada por uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecido na SEQ ID NO:56 e uma sequência de aminoácidos da cadeia leve codificada por uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecido na SEQ ID NO:58

[0023] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um método para destruir ou romper ou inibir ou reduzir a formação de biofilme de um organismo microbiano compreendendo contactar o organismo microbiano com uma composição compreendendo um anticorpo terapêutico, em que o anticorpo é específico para a ligação a um epítopo de curli e adicionalmente em que o epítopo de curli compreende uma sequência com homologia com um sítio de ligação de anticorpo de uma ou mais proteínas amiloides heterólogas. Em uma modalidade, o anticorpo inibe a fibrilização de uma ou mais proteínas amiloides heterólogas, evita a formação de biofilme, altera a arquitetura do biofilme ou qualquer combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o organismo microbiano é uma bactéria.

[0024] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um método para tratar uma infecção microbiana em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição compreendendo um anticorpo terapêutico, em que o anticorpo é específico para a ligação a um epítopo de curli e adicionalmente em que o epítopo de curli

8 / 93 compreende uma sequência com homologia com um sítio de ligação de anticorpo de uma ou mais proteínas amiloides heterólogas. Em uma modalidade, o anticorpo inibe a fibrilização de uma ou mais proteínas amiloides heterólogas, evita a formação de biofilme, altera a arquitetura do biofilme ou qualquer combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o anticorpo é ALZ.3H3, ALZ.4G1, ALZ.2C10 ou ALZ.4A6.

[0025] Em uma modalidade, a infecção microbiana é uma infecção bacteriana. Em uma modalidade, a infecção bacteriana é caracterizada por colonização de uma bactéria. Em uma modalidade, a infecção bacteriana é caracterizada por formação de biofilme.

[0026] Em uma modalidade, a infecção microbiana é uma infecção tópica. Em uma modalidade, a infecção tópica é uma ferida, úlcera ou lesão.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0027] A Figura 1A até a Figura 1C representam resultados experimentais exemplificativos que demonstram que o anticorpo monoclonal ALZ.3H3 rompe a arquitetura e integridade do biofilme de S. Typhimurium. A Figura 1A representa resultados experimentais exemplificativos que demonstram que a arquitetura do biofilme de S. Typhimurium é alterada com diferentes tratamentos. A Figura 1B representa imagens exemplificativas usadas para quantificar as partículas no biofilme. A Figura 1C representa um gráfico exemplificativo que demonstra o número de partículas na porção dispersa dos biofilmes (mais de 20 µM da superfície) na Figura 1A.

[0028] A Figura 2A até a Figura 2C representam resultados experimentais exemplificativos que demonstram que o anticorpo monoclonal ALZ.3H3 altera a integridade do biofilme de biofilmes preestabelecidos de S. Typhimurium. A Figura 2A representa um esquema que demonstra o projeto experimental. A Figura 2B representa resultados experimentais exemplificativos que demonstram a arquitetura do biofilme S. Typhimurium com cada tratamento. A Figura 2C representa um gráfico exemplificativo que

9 / 93 demonstra o número de partículas na porção dispersa dos biofilmes (mais de 20 µM da superfície) na Figura 2B.

[0029] A Figura 3 representa uma curva de dose de ensaio de violeta cristal de ALZ.3H3.

[0030] A Figura 4A e a Figura 4B representam análises de biofilmes de S. Typhimurium. A Figura 4A representa uma análise confocal de biofilmes de S. Typhimurium cultivados na presença (10 ug/ml, 25 ug/ml, 50 ug/ml, 250 ug/ml, 500 ug/ml) ou ausência (não tratada) de 3H3. Os biofilmes foram corados com syto9 (coloração de ácido nucleico verde para bactérias) e corante amiloide vermelho do Congo (curli vermelho). Biofilmes formaram imagem usando Leica TCS confocal a 63x. Reconstruções de biofilme 3D criadas com o software ImageJ 3D viewer. A barra de escala representa 50um. A Figura 4B representa a espessura do biofilme (um) de biofilmes de S. Typhimurium cultivados na presença (10 ug/ml, 25 ug/ml, 50 ug/ml, 250 ug/ml, 500 ug/ml) ou ausência (não tratada) de 3H3. Espessura medida usando software de microscopia confocal Leica TCS.

[0031] A Figura 5A até a Figura 5B representam resultados experimentais exemplificativos que demonstram que ALZ.3H3 reduz a fibrilação de curli. A Figura 5A representa resultados experimentais exemplificativos que demonstram que os anticorpos pan-amiloides evitam a fibrilização em um ensaio de Tioflavina T. A Figura 5A representa resultados experimentais exemplificativos que demonstram o tempo de latência necessário para os monômeros se autoassociarem na presença de anticorpos pan- amiloides.

[0032] A Figura 6 representa ensaios de violeta cristal de S. Typhimurium (STM) e E.coli UTI89. STM ou UTI89 foram cultivados na ausência ou presença de 3H3 (250 ug/ml, 125 ug/ml, 50 ug/ml, 25 ug/ml, 10 ug/ml, 1 ug/ml), bem como 0,5 mg/ml de controle A6 ou anticorpo anti-Dengue por 72 horas a 26°C em uma placa de 96 poços estéril. O mutante S.

10 / 93 Typhimurium curli (csgBA) e o mutante UTI89 curli (csgBA) também foram cultivados como controles negativos.

[0033] A Figura 7 representa resultados experimentais exemplificativos que demonstram sinergismo entre ALZ.3H3 e o tratamento com antibióticos reduz a formação de biofilme de S. Typhimurium in vitro.

[0034] A Figura 8 representa as unidades formadoras de colônias por biofilme cultivado com ou sem 3H3 e Ampicilina. Biofilmes de S. Typhimurium (STM) or E.coli UTI89 foram cultivados na ausência ou presença de 3H3 (250 ug/ml, 125 ug/ml, 50 ug/ml, 25 ug/ml, 10 ug/ml, 1 ug/ml), bem como cultivados com 0,5 mg/ml de anticorpo controle A6 em cima de lamínulas de vidro esterilizadas por 72 horas a 26°C em uma placa de 24 poços estéril. O mutante S. Typhimurium curli (csgBA) e o mutante UTI89 curli (csgBA) também foram cultivados como controles negativos. Em condições selecionadas, os biofilmes foram incubados por mais 24 horas a 26°C com 30 ug/ml de Ampicilina (Amp). A lamínula de vidro estéril, que foi usada como uma superfície para o crescimento do biofilme, foi colocada em um tubo cônico estéril de 15 ml que continha 3 ml de PBS estéril. O biofilme foi sonicado por 10 segundos em uma configuração de 4 usando um ThermoFisher Sonic Dismembrator. As bactérias foram enumeradas por diluição em série 1:10 em PBS estéril e plaqueamento em placas de ágar.

[0035] A Figura 9 representa resultados experimentais exemplificativos que demonstram que o tratamento com ALZ.3H3 reduz a formação de biofilme de S. Typhimurium em um ensaio de cateter in vitro.

[0036] A Figura 10 representa resultados experimentais exemplificativos que demonstram que o tratamento com ALZ.3H3 reduz a formação de biofilme de S. Typhimurium em um ensaio de cateter in vivo, e o sinergismo entre ALZ.3H3 e o tratamento com antibiótico reduz ainda mais a formação de biofilme de S. Typhimurium.

[0037] A Figura 11 representa a sobrevivência percentual de

11 / 93 camundongos após a inserção do cateter de S. Typhimurium com tratamento com ALZ.3H3 e Ampicilina.

[0038] A Figura 12 representa um gel SDS:PAGE corado com coomassie de ligantes difusíveis derivados de beta amiloide (ADDLs), também conhecidos como globulômeros, produzidos a partir de Aβ42.

[0039] A Figura 13 representa a ligação de anticorpos antiamiloide a Aβ42 ADDLs e monômeros Aβ42, avaliados por ELISA.

[0040] A Figura 14 representa uma análise de ressonância de plasma de superfície (SPR) para ligação ao peptídeo amiloide de ilhota agregado IAPP e filamentos helicoidais emparelhados com tau (TAU PHF) isolados de homogenatos de cérebro com AD. As concentrações de anticorpos usadas neste estudo foram 110 nM para o IAPP e 66,7 nM para o Tau-PHF.

[0041] A Figura 15 representa imagens exemplificativas de ligação dos mAbs 4G1 e 3H3 às linhagens de células tau40 HEK-293 (tau40) e HEK-293 (293). As imagens são mostradas com mAb humano apenas (coluna da esquerda), TAU-5 apenas (coluna central) ou mescladas. 60X.

[0042] A Figura 16 representa resultados experimentais exemplificativos que demonstram a fibrilização de Aβ42 de oligômeros beta amiloides sozinhos ou na presença de mAbs antiamiloide, 3H3, 4G1 e 4A6.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0043] A presente invenção baseia-se, em parte, na descoberta de que anticorpos com atividade de ligação a pan-amiloide têm a capacidade de inibir a formação de biofilme evitando a fibrilização de amiloide. Portanto, a invenção fornece composições e métodos para prevenir a formação de biofilme, alvejando o componente amiloide de biofilmes usando anticorpos pan- amiloides. Em uma modalidade, a invenção fornece composições e métodos de uso de um anticorpo monoclonal antiamiloide que alveja o biofilme por meio de alvejamento de curli. Em um aspecto, a invenção se refere ao uso de um anticorpo antiamiloide em que o anticorpo é específico para uma estrutura de

12 / 93 folha beta amiloide. Em uma modalidade, o anticorpo é ALZ.3H3 ou ALZ.4G1.

[0044] Em uma modalidade, a invenção fornece composições e métodos para alvejar um novo antígeno como curli e, assim, mudar o paradigma para o tratamento de infecções profundas e associadas a corpo estranho/biofilme. Em uma modalidade, a invenção fornece melhorias para o tratamento de bactérias resistentes a múltiplos fármacos, alvejando um antígeno que não tem resistência cruzada com fenótipos de resistência a fármacos existentes.

[0045] Em uma modalidade, a invenção fornece um novo alvo terapêutico que permite o tratamento de bactérias produtoras de biofilme usando um anticorpo monoclonal humano que pode combater uma diversidade de biofilmes bacterianos gram positivos e gram negativos. Em uma modalidade, o anticorpo pode remover um biofilme de um dispositivo médico permanente.

[0046] Em uma modalidade, a invenção se refere a um método de tratamento de um indivíduo infectado com uma espécie microbiana, o método compreendendo a administração ao indivíduo de pelo menos um anticorpo, em que o pelo menos um anticorpo se liga especificamente a uma estrutura de folha beta amiloide. Em uma modalidade, o método compreende adicionalmente a administração de um antibiótico. Em uma modalidade, o anticorpo da invenção (por exemplo, anticorpo monoclonal antiamiloide) e ser combinado com antibióticos para reduzir a massa do biofilme por alvejamento de curli.

[0047] Em outro aspecto, a invenção se refere a um método para tratar, reduzir ou prevenir a formação de biofilme, em que a composição compreende pelo menos um anticorpo, em que o pelo menos um anticorpo se liga especificamente a uma estrutura de folha beta amiloide. Em uma modalidade, o método compreende adicionalmente a administração de um antibiótico.

[0048] Em uma modalidade, a invenção fornece métodos de revestimento da superfície de um dispositivo médico (por exemplo, cateter)

13 / 93 com uma composição da invenção para reduzir a massa de biofilme.

[0049] Em uma modalidade, a invenção também fornece o uso das composições da invenção em combinação com agentes (como DNase) que têm como alvo outros componentes da matriz extracelular. Em uma modalidade, as composições da invenção podem ser usadas para tratar a matriz de biofilme associada ao excesso de DNA, como biofilmes de Pseudomonas aeruginasa. Definições

[0050] Salvo definição em contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado que o entendido vulgarmente na técnica à qual pertence esta invenção. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes aos aqui descritos possam ser usados na prática ou testes da presente invenção, os métodos e materiais preferidos são descritos.

[0051] Para fins de interpretação deste relatório específico, as seguintes definições serão aplicadas e, sempre que apropriado, os termos usados no singular também incluirão o plural e vice-versa.

[0052] Como usado aqui, cada um dos seguintes termos tem o significado associado a ele nesta seção. Também deve ser entendido que a terminologia aqui usada é com a finalidade de descrever modalidades particulares apenas e não se destina a limitar.

[0053] Os artigos “um” e “uma” são usados aqui para se referir a um ou mais de um (isto é, a pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. A título de exemplo, “um elemento” significa um elemento ou mais de um elemento.

[0054] “Cerca de”, como usado aqui, quando se refere a um valor mensurável, tal como uma quantidade, uma duração temporal e similares, pretende abranger variações de ± 20% ou ± 10%, mais preferivelmente ± 5%, ainda mais preferivelmente ± 1%, e ainda mais preferivelmente ± 0,1% do valor especificado, como tais variações são apropriadas para realizar os métodos descritos.

[0055] O termo “análogo” ou “análogo funcional” refere-se a uma

14 / 93 forma modificada relacionada de um polipeptídeo, em que pelo menos uma substituição, deleção ou adição de aminoácido foi feita de modo que o dito análogo retenha substancialmente a mesma atividade biológica que a forma não modificada, in vivo e/ou in vitro.

[0056] O termo “anticorpo”, como aqui usado, refere-se a uma molécula de imunoglobulina que se liga especificamente a um antígeno. Os anticorpos podem ser imunoglobulinas intactas derivadas de fontes naturais ou de fontes recombinantes e podem ser porções imunorreativas de imunoglobulinas intactas. Os anticorpos na presente invenção podem existir em uma variedade de formas incluindo, por exemplo, anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais, Fv, Fab e F(ab)2, bem como anticorpos de cadeia simples e anticorpos humanizados (Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426).

[0057] O termo “antígeno” ou “Ag” como usado aqui é definido como uma molécula que provoca uma resposta imune. Essa resposta imune pode envolver a produção de anticorpos ou a ativação de células específicas imunologicamente competentes, ou ambas. O versado na técnica entenderá que qualquer macromolécula, incluindo virtualmente todas as proteínas ou peptídeos, pode servir como um antígeno. Além disso, os antígenos podem ser derivados de DNA recombinante ou genômico. Um versado na técnica entenderá que qualquer DNA, que compreende uma sequência de nucleotídeos ou uma sequência de nucleotídeos parcial que codifica uma proteína que desencadeia uma resposta imune codifica, portanto, um “antígeno” tal como esse termo é usado aqui. Além disso, um versado na técnica entenderá que um antígeno não necessita ser codificado apenas por uma sequência de nucleotídeos de comprimento completo de um gene. É prontamente evidente

15 / 93 que a presente invenção inclui, mas não está limitada ao uso de sequências de nucleotídeos parciais de mais do que um gene e que essas sequências de nucleotídeos são arranjadas em várias combinações para desencadear a resposta imune desejada. Além disso, um versado na técnica entenderá que um antígeno não necessita ser codificado por um “gene”. É prontamente evidente que um antígeno pode ser gerado sintetizado ou pode ser derivado de uma amostra biológica.

[0058] Como aqui usado, o termo “antimicrobiano” refere-se a uma capacidade de matar ou inibir o crescimento de microrganismos, incluindo, mas não se limitando a bactérias, vírus, leveduras, fungos e protozoários, ou para atenuar a gravidade de uma infecção microbiana. Os compostos ou composições antimicrobianos da presente invenção são compostos ou composições que podem ser usados para limpeza ou esterilização, ou podem ser usados no tratamento de doenças e infecções. As aplicações podem incluir usos antimicrobianos in vitro e in vivo. “Aplicar” uma composição antimicrobiana pode incluir a administração de uma composição em um indivíduo humano ou animal.

[0059] O termo “agente” inclui qualquer substância, metabólito, molécula, elemento, composto ou uma combinação dos mesmos. Inclui, mas não está limitado a, por exemplo, proteína, oligopeptídeo, molécula orgânica pequena, glicano, polissacarídeo, polinucleotídeo e similares. Pode ser um produto natural, um composto sintético, um composto químico ou uma combinação de duas ou mais substâncias. A menos que especificado de outra forma, os termos “agente”, “substância” e “composto” podem ser usados alternadamente. Além disso, um “agente de teste” ou “agente candidato” é geralmente um agente sujeito para uso em um ensaio da invenção.

[0060] O termo “ligação” refere-se a uma associação direta entre pelo menos duas moléculas, devido a, por exemplo, interações covalentes, eletrostáticas, hidrofóbicas, iônicas e/ou ligações de hidrogênio.

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[0061] Como aqui usado, o termo “biofilme” refere-se a acréscimos microbianos encerrados em matriz a superfícies biológicas ou não biológicas nas quais os microrganismos estão dispersos e/ou formam colônias. O biofilme normalmente é feito de polissacarídeos e outras macromoléculas. A formação de biofilme representa um modo protegido de crescimento que permite que as células sobrevivam em ambientes hostis.

[0062] Como usado aqui, o termo “formação de biofilme” se destina a incluir a formação, crescimento e modificação das colônias microbianas contidas com estruturas de biofilme, bem como a síntese e manutenção de uma matriz de polissacarídeo das estruturas de biofilme. Também dentro do escopo desse termo está a formação de biofilmes à base de proteínas que não secretam polissacarídeos na matriz, mas que compreendem proteínas que permitem que as bactérias formem arquitetura de biofilme.

[0063] “CDRs” são definidas como as sequências de aminoácidos da região determinante de complementaridade de um anticorpo que são as regiões hipervariáveis das cadeias pesadas e leves de imunoglobulina. Ver, por exemplo, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987). Existem três CDRs de cadeia pesada e três de cadeia leve (ou regiões de CDR) na porção variável de uma imunoglobulina. Assim, “CDRs”, como aqui usado, refere-se a todas as três CDRs da cadeia pesada, ou todas as três CDRs da cadeia leve (ou ambas as CDRs da cadeia pesada e leve, se apropriado). A estrutura e o enovelamento da proteína do anticorpo podem significar que outros resíduos são considerados parte da região de ligação ao antígeno e seriam assim considerados por um versado. Ver, por exemplo, Chothia et al., (1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable regions; Nature 342, p 877-883.

[0064] Um “anticorpo quimérico” refere-se a um tipo de anticorpo engenheirado que contém uma região variável de ocorrência natural (cadeia

17 / 93 leve e cadeias pesadas) derivada de um anticorpo doador em associação com regiões constantes de cadeia leve e pesada derivadas de um anticorpo aceitador.

[0065] “Contato” refere-se a um processo no qual duas ou mais moléculas ou dois ou mais componentes da mesma molécula ou moléculas diferentes são colocados em proximidade física de modo que sejam capazes de sofrer uma interação. O termo “contato” inclui, mas não está limitado a, impregnar, compor, misturar, integrar, revestir, esfregar, pintar, pulverizar, imergir, rolar, espalhar e mergulhar.

[0066] Como aqui usado, por “terapia de combinação” entende-se que um primeiro agente é administrado em conjunto com outro agente. “Em conjunto com” refere-se à administração de uma modalidade de tratamento além de outra modalidade de tratamento. Como tal, “em conjunto com” refere- se à administração de uma modalidade de tratamento antes, durante ou após a dispensação da outra modalidade de tratamento ao indivíduo. Essas combinações são consideradas parte de um único regime de tratamento.

[0067] Conforme usado aqui, o termo “administração simultânea” significa que a administração da primeira terapia e a de uma segunda terapia em uma terapia de combinação se sobrepõem temporalmente uma à outra.

[0068] Uma “doença” é um estado de saúde de um animal em que o animal não consegue manter a homeostase e em que, se a doença não é melhorada, a saúde do animal continua a deteriorar-se. Em contraste, um “distúrbio” em um animal é um estado de saúde em que o animal é capaz de manter a homeostase, mas no qual o estado de saúde do animal é menos favorável do que seria na ausência do distúrbio. Se não for tratado, um distúrbio não causa necessariamente uma diminuição adicional no estado de saúde do animal.

[0069] Uma “quantidade eficaz”, como usado aqui, significa uma quantidade que fornece um benefício terapêutico ou profilático.

[0070] O termo “expressão” como usado aqui é definido como a

18 / 93 transcrição e/ou tradução de uma sequência de nucleotídeos particular acionada pelo seu promotor.

[0071] “Vetor de expressão” refere-se a um vetor que compreende um polinucleotídeo recombinante que compreende sequências de controle de expressão operativamente ligadas a uma sequência de nucleotídeos a ser expressa. Um vetor de expressão compreende elementos de ação cis suficientes para a expressão; outros elementos para expressão podem ser fornecidos pela célula hospedeira ou em um sistema de expressão in vitro. Os vetores de expressão incluem todos aqueles conhecidos na técnica, tais como cosmídeos, plasmídeos (por exemplo, nus ou contidos em lipossomas) e vírus (por exemplo, lentivírus, retrovírus, adenovírus e vírus adenoassociados) que incorporam o polinucleotídeo recombinante.

[0072] Como aqui usado, o termo “anticorpo de cadeia pesada” ou “anticorpos de cadeia pesada” compreende moléculas de imunoglobulina derivadas de espécies de camelídeos, seja por imunização com um peptídeo e subsequente isolamento de soro, ou por clonagem e expressão de sequências de ácido nucleico que codificam tais anticorpos. O termo “anticorpo de cadeia pesada” ou “anticorpos de cadeia pesada” abrange adicionalmente moléculas de imunoglobulina isoladas de um animal com doença de cadeia pesada, ou preparadas pela clonagem e expressão de genes VH (imunoglobulina de cadeia pesada variável) de um animal.

[0073] “Homólogo” refere-se à similaridade de sequência ou identidade de sequência entre dois polipeptídeos ou entre duas moléculas de ácido nucleico. Quando uma posição em ambas as sequências comparadas é ocupada pela mesma subunidade de monômero de base ou de aminoácido, por exemplo, se uma posição em cada uma das duas moléculas de DNA for ocupada por adenina, então as moléculas são homólogas nessa posição. A porcentagem de homologia entre duas sequências é uma função do número de posições correspondentes ou homólogas compartilhadas pelas duas sequências dividido

19 / 93 pelo número de posições comparadas multiplicado por 100. Por exemplo, se 6 de 10 das posições em duas sequências são correspondentes ou homólogas, então as duas sequências são 60% homólogas. A título de exemplo, as sequências de DNA ATTGCC e TATGGC partilham 50% de homologia. Geralmente, uma comparação é feita quando duas sequências estão alinhadas para fornecer homologia máxima.

[0074] Um “anticorpo humanizado” refere-se a um tipo de anticorpo manipulado com suas CDRs derivadas de uma imunoglobulina de doador não humano, as partes restantes derivadas de imunoglobulina da molécula sendo derivadas de uma (ou mais) imunoglobulina(s) humana(s). Além disso, os resíduos de suporte de estrutura podem ser alterados para preservar a afinidade de ligação (ver, por exemplo, 1989, Queen et al., Proc. Natl. Acad Sci USA, 86:10029-10032; 1991, Hodgson et al., Bio/Technology, 9:421). Um anticorpo aceitador humano adequado pode ser um selecionado a partir de uma base de dados convencional, por exemplo, a base de dados KABAT, a base de dados Los Alamos e a base de dados Swiss Protein, por homologia com as sequências de nucleotídeos e de aminoácidos do anticorpo doador. Um anticorpo humano caracterizado por uma homologia com as regiões estruturais do anticorpo doador (com base em aminoácidos) pode ser adequado para fornecer uma região constante da cadeia pesada e/ou uma região estrutural variável da cadeia pesada para inserção das CDRs de doador. Um anticorpo aceitador adequado capaz de doar regiões estruturais constantes ou variáveis da cadeia leve pode ser selecionado de uma maneira similar. Deve-se notar que as cadeias pesadas e leves do anticorpo aceitador não precisam se originar do mesmo anticorpo aceitador. A técnica anterior descreve várias maneiras de produzir tais anticorpos humanizados (ver por exemplo EP-A-0239400 e EP-A-054951).

[0075] O termo “imunoglobulina” ou “Ig”, conforme usado neste documento, é definido como uma classe de proteínas, que funcionam como anticorpos. Os anticorpos expressos por células B são algumas vezes chamados

20 / 93 de BCR (receptor de células B) ou receptor de antígeno. Os cinco membros incluídos nesta classe de proteínas são IgA, IgG, IgM, IgD e IgE. IgA é o principal anticorpo que está presente nas secreções corporais, como saliva, lágrimas, leite materno, secreções gastrointestinais e secreções de muco dos tratos respiratório e geniturinário. IgG é o anticorpo circulante mais comum. IgM é a principal imunoglobulina produzida na resposta imune primária na maioria dos indivíduos. É a imunoglobulina mais eficiente na aglutinação, fixação do complemento e outras respostas de anticorpos, e é importante na defesa contra bactérias e vírus. IgD é a imunoglobulina que não tem função conhecida de anticorpo, mas pode servir como um receptor de antígeno. IgE é a imunoglobulina que medeia a hipersensibilidade imediata, causando liberação de mediadores de mastócitos e basófilos após a exposição ao alérgeno.

[0076] Conforme usado neste documento, o termo “resposta imune” inclui respostas imunes mediadas por células T e/ou mediadas por células B. Respostas imunes exemplificativas incluem respostas de células T, por exemplo, produção de citocinas e citotoxicidade celular, e respostas de células B, por exemplo, produção de anticorpos. Além disso, o termo resposta imune inclui respostas imunes que são indiretamente afetadas pela ativação de células T, por exemplo, produção de anticorpos (respostas humorais) e ativação de células responsivas a citocinas, por exemplo, macrófagos. As células imunes envolvidas na resposta imune incluem linfócitos, como células B e células T (células CD4+, CD8+, Th1 e Th2); células de apresentação de antígeno (por exemplo, células de apresentação de antígeno profissionais, como células dendríticas, macrófagos, linfócitos B, células de Langerhans e células de apresentação de antígeno não profissionais, como queratinócitos, células endoteliais, astrócitos, fibroblastos, oligodendrócitos); células assassinas naturais; células mieloides, como macrófagos, eosinófilos, mastócitos, basófilos e granulócitos.

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[0077] Conforme usado neste documento, o termo “organismo microbiano” ou “micróbio” ou “microbiano” ou “microrganismo” refere-se a um domínio (Bactéria) de microrganismos procarióticos redondos, espirais ou em forma de bastonete unicelulares, multicelulares ou acelulares que podem não ter paredes celulares ou são Gram-positivos ou Gram-negativos ou alteração dos mesmos (ou seja, Mycobacterium) se eles têm paredes celulares, que muitas vezes são agregados em colônias ou móveis por meio de flagelos, que normalmente vivem no solo, água, matéria orgânica, ou nos corpos de plantas e animais, que geralmente são autotróficos, saprofíticos ou parasitários na nutrição e que são conhecidos por seus efeitos bioquímicos e patogenicidade. O termo pretende abranger células procarióticas ou eucarióticas ou organismos com um tamanho microscópico e inclui bactérias, vírus, arqueias e eubactérias de todas as espécies, bem como microrganismos eucarióticos, como leveduras e fungos. O termo também inclui culturas de células de quaisquer espécies que podem ser cultivadas para a produção de um bioquímico. Em um exemplo não limitativo, a atividade de um organismo microbiano pode ser medida calculando a redução logarítmica no número do microrganismo.

[0078] Conforme usado neste documento, o termo “colonização microbiana” refere-se à formação de grupos populacionais compactos do mesmo tipo de microrganismo, como as colônias que se desenvolvem quando uma célula microbiana começa a se reproduzir. A colonização microbiana pode ou não causar sintomas da doença. A descolonização refere-se a uma redução no número de organismos microbianos presentes. Quando os organismos microbianos estão completamente descolonizados, os organismos microbianos foram erradicados e não são detectáveis.

[0079] Uma “mutação”, como usada aqui, refere-se a uma mudança na sequência de ácidos nucleicos ou polipeptídeos em relação a uma sequência de referência (que é preferivelmente uma sequência normal de ocorrência natural

22 / 93 ou “tipo selvagem”) e inclui translocações, deleções, inserções, e substituições/mutações pontuais. Um “mutante” como usado aqui, refere-se a um ácido nucleico ou proteína compreendendo uma mutação.

[0080] A administração “parenteral” de uma composição imunogênica inclui, por exemplo, injeção subcutânea (s.c.), intravenosa (i.v.), intramuscular (i.m.) ou intradérmica (i.d.) ou técnicas de infusão.

[0081] Os termos “paciente”, “sujeito”, “indivíduo” e similares são aqui usados indistintamente, e referem-se a qualquer animal, ou a células do mesmo, in vitro ou in situ, aberto aos métodos aqui descritos. Em certas modalidades não limitativas, o paciente, sujeito ou indivíduo é um humano.

[0082] Conforme usado neste documento, o termo “farmaceuticamente aceitável” refere-se a um material, como um carreador ou diluente, que não anula a atividade biológica ou propriedades do composto e é relativamente não tóxico, ou seja, o material pode ser administrado a um indivíduo sem causar efeitos biológicos indesejáveis ou interagir de forma deletéria com nenhum dos componentes da composição em que está contido.

[0083] Conforme usado neste documento, a linguagem “sal farmaceuticamente aceitável” refere-se a um sal dos compostos administrados preparados a partir de ácidos não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis, incluindo ácidos inorgânicos, ácidos orgânicos, solvatos, hidratos ou clatratos dos mesmos. Exemplos de tais ácidos inorgânicos são clorídrico, bromídrico, iodídrico, nítrico, sulfúrico, fosfórico, acético, hexafluorofosfórico, cítrico, glucônico, benzoico, propiônico, butírico, sulfossalicílico, maleico, láurico, málico, fumárico, succínico, tartárico, ansônico, pamoico, p- tolunenossulfônico e mesílico. Ácidos orgânicos apropriados podem ser selecionados, por exemplo, de classes alifáticas, aromáticas, carboxílicas e sulfônicas de ácidos orgânicos, exemplos dos quais são fórmico, acético, propiônico, succínico, canforsulfônico, cítrico, fumárico, glucônico, isetiônico, lático, málico, múcico, tartárico, para-toluenossulfônico, glicólico,

23 / 93 glucurônico, maleico, furoico, glutâmico, benzoico, antranílico, salicílico, fenilacético, mandélico, embônico (pamoico), metanossulfônico, etanossulfônico, pantotênico, benzenossulfônico (besilato), esteárico, sulfanílico, algínico, galacturônico, e similares. Além disso, os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, a título de exemplo não limitativo, sais de metais alcalinoterrosos (por exemplo, cálcio ou magnésio), sais de metais alcalinos (por exemplo, dependentes de sódio ou potássio) e sais de amônio.

[0084] Conforme usado neste documento, o termo “carreador farmaceuticamente aceitável” significa um material, composição ou carreador farmaceuticamente aceitável, tal como uma carga líquida ou sólida, estabilizador, agente de dispersão, agente de suspensão, diluente, excipiente, agente espessante, solvente ou material encapsulante, envolvido no carregamento ou transporte de um composto útil dentro da invenção dentro ou para o paciente de modo que possa desempenhar a função pretendida. Normalmente, essas construções são carregadas ou transportadas de um órgão, ou parte do corpo, para outro órgão ou parte do corpo. Cada carreador deve ser “aceitável” no sentido de ser compatível com os outros ingredientes da formulação, incluindo o composto útil dentro da invenção, e não prejudicial para o paciente. Alguns exemplos de materiais que podem servir como carreadores farmaceuticamente aceitáveis incluem: açúcares, tais como lactose, glicose e sacarose; amidos, tais como amido de milho e amido de batata; celulose e seus derivados, tais como carboximetilcelulose de sódio, etilcelulose e acetato de celulose; tragacanto em pó; malte; gelatina; talco; excipientes, tais como manteiga de cacau e ceras de supositórios; óleos, tais como óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de cártamo, óleo de gergelim, azeite, óleo de milho e óleo de soja; glicóis, tais como propileno glicol; polióis, tais como glicerina, sorbitol, manitol e polietileno glicol; ésteres, tais como oleato de etila e laurato de etila; ágar; agentes tamponantes, tais como hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; agentes tensoativos; ácido algínico; água

24 / 93 livre de pirogênios; solução salina isotônica; solução de Ringer; álcool etílico; soluções de tampão de fosfato; e outras substâncias compatíveis não tóxicas utilizadas em formulações farmacêuticas. Conforme usado neste documento, “carreador farmaceuticamente aceitável” também inclui todos e quaisquer revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos e agentes de retardo de absorção e similares que são compatíveis com a atividade do composto útil dentro da invenção e são fisiologicamente aceitáveis para o paciente. Os compostos ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições. O “carreador farmaceuticamente aceitável” pode incluir adicionalmente um sal farmaceuticamente aceitável do composto útil dentro da invenção. Outros ingredientes adicionais que podem ser incluídos nas composições farmacêuticas usadas na prática da invenção são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em Remington’s Pharmaceutical Sciences (Genaro, Ed., Mack Publishing Co., 1985, Easton, PA), que é aqui incorporado por referência.

[0085] Conforme usado neste documento, o termo “sal” abrange sais de adição de ácidos livres ou bases livres que são compostos úteis dentro da invenção. Os sais de adição de ácido adequados podem ser preparados a partir de um ácido inorgânico ou de um ácido orgânico. Exemplos de ácidos inorgânicos incluem os ácidos clorídrico, bromídrico, iodídrico, nítrico, carbônico, sulfúrico, fosfórico, perclórico e tetrafluoroborônico. Ácidos orgânicos apropriados podem ser selecionados a partir de classes alifáticas, cicloalifáticas, aromáticas, aralifáticas, heterocíclicas, carboxílicas e sulfônicas de ácidos orgânicos, exemplos dos quais incluem ácido fórmico, acético, propiônico, succínico, glicólico, glucônico, lático, málico, tartárico, cítrico, ascórbico, glucurônico, maleico, fumárico, pirúvico, aspártico, glutâmico, benzoico, antranílico, 4-hidroxibenzoico, fenilacético, mandélico, embônico (pamoico), metanossulfônico, etanossulfônico, benzenossulfônico, pantotênico, trifluorometanossulfônico, toluenossulfônico, 2-

25 / 93 hidroxietanossulfônico, p-tolenossulfuônico, ciclo-hexilaminossulfônico, esteárico, algínico, β-hidroxibutírico, salicílico, galactárico e galacturônico. Sais de adição de base adequados de compostos úteis dentro da invenção incluem, por exemplo, sais metálicos incluindo sais de metais alcalinos, metais alcalinoterrosos e metais de transição, tais como, por exemplo, sais de lítio, cálcio, magnésio, potássio, amônio, sódio e zinco. Os sais de adição de base aceitáveis também incluem sais orgânicos feitos de aminas básicas, como, por exemplo, N,N’-dibenziletilenodiamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilenodiamina, meglumina (N-metil-glucamina) e procaína. Todos esses sais podem ser preparados por meios convencionais a partir do composto de base livre correspondente, fazendo reagir, por exemplo, o ácido ou base apropriada com a base livre correspondente.

[0086] Conforme usado neste documento, o termo “prevenir” ou “prevenção” significa nenhum distúrbio ou desenvolvimento de doença se nenhum tivesse ocorrido, ou nenhum distúrbio ou desenvolvimento de doença adicional se já houvesse desenvolvimento do distúrbio ou doença. Também é considerada a capacidade de prevenir alguns ou todos os sintomas associados ao distúrbio ou doença.

[0087] Pelo termo “liga-se especificamente”, como usado aqui em relação a um anticorpo, entende-se um anticorpo que reconhece um antígeno específico, mas não reconhece ou liga substancialmente outras moléculas em uma amostra. Por exemplo, um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno de uma espécie também pode se ligar a esse antígeno de uma ou mais espécies. Mas, essa reatividade entre espécies não altera por si só a classificação de um anticorpo como específico. Em um outro exemplo, um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno também pode se ligar a diferentes formas alélicas do antígeno. No entanto, essa reatividade cruzada por si só não altera a classificação de um anticorpo como específico. Em alguns casos, os termos “ligação específica” ou “se ligam especificamente” podem ser usados em

26 / 93 referência à interação de um anticorpo, uma proteína ou um peptídeo com uma segunda espécie química, para significar que a interação é dependente da presença de uma estrutura particular (por exemplo, um determinante antigênico ou epítopo) sobre as espécies químicas; por exemplo, um anticorpo reconhece e se liga a uma estrutura proteica específica em vez de às proteínas em geral. Se um anticorpo é específico para o epítopo “X”, a presença de uma molécula contendo o epítopo X (ou livre, A não marcado), em uma reação contendo “X” marcado e o anticorpo, reduzirá a quantidade de X marcado ligado ao anticorpo.

[0088] O termo “terapêutico”, como aqui usado, significa um tratamento e/ou profilaxia. Um efeito terapêutico é obtido pela supressão, diminuição, remissão ou erradicação de um estado de doença.

[0089] Conforme usado neste documento, o termo “quantidade terapeuticamente eficaz” de um composto da presente invenção refere-se a uma quantidade do composto da presente invenção que irá provocar a resposta biológica ou médica de um indivíduo, ou melhorar os sintomas, desacelerar ou retardar a progressão da doença, ou prevenir uma doença, etc. Em uma modalidade, o termo refere-se à quantidade que inibe ou reduz a colonização ou infecção microbiana. Em uma modalidade, o termo se refere à quantidade que inibe ou reduz a infecção bacteriana, ou previne ou destrói a formação de biofilmes bacterianos. Quando aplicado a um ingrediente ativo individual, administrado sozinho, o termo refere-se apenas àquele ingrediente. Quando aplicado a uma combinação, o termo refere-se às quantidades combinadas dos ingredientes ativos que resultam no efeito terapêutico, administrado em combinação, seja em série ou simultaneamente.

[0090] Como usado aqui, o termo “tratar” ou “tratamento” de qualquer doença ou distúrbio refere-se, em uma modalidade, a melhorar a doença ou o distúrbio (isto é, interromper ou reduzir o desenvolvimento da doença ou pelo menos um dos sintomas clínicos da mesma). Em uma outra modalidade, “tratar” ou “tratamento” refere-se à melhora de pelo menos um parâmetro

27 / 93 físico, que pode não ser discernível pelo paciente. Em ainda uma outra modalidade, “tratar” ou “tratamento” refere-se a modular a doença ou o distúrbio, tanto fisicamente (por exemplo, estabilização de um sintoma discernível), fisiologicamente (por exemplo, estabilização de um parâmetro físico), ou ambos. Em ainda outra modalidade, “tratar” ou “tratamento” refere- se a prevenir ou retardar o início ou desenvolvimento ou progressão da doença ou distúrbio. O termo “tratar” ou “tratamento” também se refere a uma redução na gravidade de um ou mais sintomas em cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90% ou cerca de 100%.

[0091] Conforme usado neste documento, o termo “administração tópica” refere-se à dispensação a um indivíduo pelo contato da formulação diretamente a uma superfície ou região localizada do indivíduo. A forma mais comum de dispensação tópica é na pele, mas uma composição aqui descrita também pode ser aplicada diretamente a outras superfícies do corpo, por exemplo, ao olho, uma membrana mucosa, às superfícies de uma cavidade corporal ou a uma superfície interna. Conforme mencionado acima, a dispensação tópica mais comum é na pele. O termo abrange várias vias de administração, incluindo, mas não se limitando a, tópica e transdérmica. Esses modos de administração incluem tipicamente a penetração da barreira de permeabilidade da pele e a dispensação eficiente ao tecido ou estrato alvo. A administração tópica pode ser usada como um meio para penetrar na epiderme e derme e, finalmente, alcançar a dispensação sistêmica da composição.

[0092] Conforme usado neste documento, o termo “formulação tópica” (como sinônimo, “composição tópica”) é usado aqui para se referir a uma preparação farmacêutica destinada a aplicação tópica ou local a uma região afetada de um indivíduo em necessidade, e inclui formas de dosagem como gel, creme, pomada, emulsão, suspensão, solução, gotas, loção, tinta, pessário, ducha, supositório, trocisco, spray, esponja, filme ou espuma. Preferivelmente,

28 / 93 a formulação tópica está na forma de um creme, um gel ou uma pomada.

[0093] “Variante” dos polipeptídeos de acordo com a presente invenção pode ser (i) aquela em que um ou mais dos resíduos de aminoácidos são substituídos por um resíduo de aminoácido conservado ou não conservado (preferivelmente um resíduo de aminoácido conservado) e tal resíduo de aminoácido pode ou não ser um codificado pelo código genético, (ii) aquela em que há um ou mais resíduos de aminoácidos modificados, por exemplo, resíduos que são modificados pela ligação de grupos substituintes, (iii) aquela em que o polipeptídeo é uma variante de splice alternativa do polipeptídeo da presente invenção, (iv) fragmentos dos polipeptídeos e/ou (v) aquela em que o polipeptídeo é fundido com outro polipeptídeo, tal como uma sequência líder ou secretora ou uma sequência que é utilizada para purificação (por exemplo, His-tag) ou para detecção (por exemplo, epítopo Tag Sv5). Os fragmentos incluem polipeptídeos gerados por meio de clivagem proteolítica (incluindo proteólise de múltiplos locais) de uma sequência original. As variantes podem ser pós-tradução ou quimicamente modificadas. Tais variantes são consideradas como compreendidas no escopo dos versados na técnica a partir dos ensinamentos deste documento.

[0094] Intervalos: ao longo desta descrição, vários aspectos da invenção podem ser apresentados em um formato de intervalo. Deve ser entendido que a descrição em formato de intervalo é meramente por conveniência e brevidade e não deve ser interpretada como uma limitação inflexível no escopo da invenção. Por conseguinte, a descrição de um intervalo deve ser considerada como tendo descrito especificamente todos os possíveis subintervalos, bem como valores numéricos individuais dentro desse intervalo. Por exemplo, a descrição de um intervalo de 1 a 6 deve ser considerada como tendo subintervalos especificamente descritos, como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, a de 3 a 6 etc., bem como números individuais dentro desse intervalo, por exemplo, 1, 2, 2,7, 3, 4, 5, 5,3 e 6. Isso se aplica

29 / 93 independentemente da amplitude do intervalo. Descrição

[0095] A presente invenção se baseia, em parte, na identificação de um novo alvo terapêutico que permite o tratamento de bactérias produtoras de biofilme usando um anticorpo monoclonal humano que pode combater uma diversidade de biofilmes bacterianos gram positivos e gram negativos, e até mesmo remover um biofilme de um dispositivo médico interno. Esta invenção permite novos fármacos mAb que têm como alvo um novo antígeno e (1) mudarão o paradigma para o tratamento de infecções profundas e associadas a corpo estranho/biofilme, (2) melhorarão o tratamento de bactérias resistentes a múltiplos fármacos ao alvejar um antígeno que não apresenta resistência cruzada com os fenótipos de resistência aos fármacos existentes e (3) serão eficazes contra uma ampla variedade de bactérias.

[0096] A presente invenção fornece uma composição com eficácia antimicrobiana intensificada e eficaz para inibir, reduzir ou tratar infecções microbianas, como infecções bacterianas, e/ou para descolonizar um organismo microbiano e/ou para destruir, romper, inibir ou reduzir a formação de biofilme bacteriano. É aqui descrita a verificação surpreendente e inesperada de que anticorpos com atividade de ligação a pan-amiloide rompem biofilmes de múltiplas espécies microbianas. Além disso, uma combinação de um anticorpo antiamiloide da invenção e um tratamento antibiótico, quando usado para tratar um organismo microbiano, demonstra efeito sinérgico contra um micróbio, colonização ou infecção ou formação de biofilme. Conforme usado neste documento, o termo “sinérgico” se refere ao efeito obtido pela combinação de compostos e/ou agentes que é maior do que o efeito obtido pela adição separada de cada composto. O tratamento de combinação da presente invenção mostrou um efeito sinérgico medido, por exemplo, pela extensão da resposta, pela duração da resposta, pela taxa de resposta, pela taxa de estabilização, pela duração da estabilização, pelo tempo para reduzir ou eliminar as infecções, pelo

30 / 93 tempo para erradicar os microrganismos, ao possível com a dosagem de um ou outro dos componentes do tratamento de combinação em sua dose convencional. Por exemplo, o efeito do tratamento de combinação da presente invenção é sinérgico porque o tratamento de combinação é terapeuticamente superior ao efeito alcançável com um componente isolado ou o efeito aditivo dos componentes de combinação agindo separadamente. O efeito superior pode ser a redução aprimorada na resistência aos fármacos dos organismos microbianos, na medida em que os organismos microbianos são erradicados e se tornam não detectáveis pelo tratamento de combinação. Também por exemplo, o efeito do tratamento de combinação da presente invenção é sinérgico porque leva menos tempo para matar os microrganismos e eliminar as infecções. Também, por exemplo, o efeito do tratamento de combinação da presente invenção é sinérgico porque o tratamento de combinação oferece um espectro mais amplo de atividades antimicrobianas do que aqueles com um único componente. Também, por exemplo, o efeito do tratamento de combinação da presente invenção é sinérgico porque um dos componentes na composição descrita nesta invenção é dosado em sua dose convencional e o(s) outro(s) componente(s) é/são dosado(s) em uma dose reduzida e o efeito terapêutico, conforme medido, por exemplo, pela extensão da eliminação e/ou inibição do crescimento dos microrganismos, como bactérias, pelo tempo para matar e/ou inibir o crescimento dos microrganismos, como bactérias, ou pelo tempo para destruir ou inibir colônias microbianas, ou pelo tempo para romper ou inibir ou reduzir a formação ou crescimento de biofilme, é equivalente ao que pode ser obtido na dosagem de quantidades convencionais dos componentes do tratamento de combinação. Composições

[0097] A composição da invenção pode tratar, prevenir e/ou proteger contra qualquer doença, distúrbio ou condição associada a uma atividade bacteriana. Em certas modalidades, a composição pode tratar, prevenir e/ou

31 / 93 proteger contra infecção bacteriana. Em certas modalidades, a composição pode tratar, prevenir e/ou proteger contra formação de biofilme bacteriano. Em certas modalidades, a invenção fornece um novo alvo terapêutico que permite o tratamento de bactérias produtoras de biofilme usando um anticorpo monoclonal humano que pode combater uma diversidade de biofilmes bacterianos gram positivos e gram negativos.

[0098] Em certas modalidades, a composição pode tratar, prevenir e/ou proteger contra infecção por Enterobacteriaceae, Bacteroidetes, Proteobacteria, Firmicutes ou Thermodesulfobacteria. Em certas modalidades, a composição pode tratar, prevenir e/ou proteger contra formação de biofilme por Enterobacteriaceae, Bacteroidetes, Proteobacteria, Firmicutes ou Thermodesulfobacteria. Em certas modalidades, a composição pode tratar, prevenir e/ou proteger contra infecção por Salmonella typhimurium (S Typhimurium). Em certas modalidades, a composição pode tratar, prevenir e/ou proteger contra formação de biofilme por S Typhimurium. Em certas modalidades, a composição pode tratar, prevenir e/ou proteger contra infecção por Escherichia coli (E coli). Em certas modalidades, a composição pode tratar, prevenir e/ou proteger contra formação de biofilme por E coli. Em certas modalidades, a composição pode tratar, prevenir e/ou proteger contra infecção por Yersinia pestis (Y. pestis). Em certas modalidades, a composição pode tratar, prevenir e/ou proteger contra formação de biofilme por Y. pestis. Em certas modalidades, a composição pode tratar, prevenir e/ou proteger contra uma doença incluindo, mas não se limitando a, meningite, enterite, peste e sepse.

[0099] Em várias modalidades, a presente invenção inclui composições de inibidor de amiloide. Em várias modalidades, as composições de inibidor de amiloide da invenção diminuem ou inibem a fibrilização de amiloide. Em uma modalidade, o inibidor de amiloide tem como alvo o principal constituinte de biofilmes entéricos, curli amiloide. Em uma modalidade, a invenção fornece

32 / 93 um inibidor de amiloide que alveja curli dentro de biofilmes que resulta em alterações na arquitetura do biofilme, estabilidade e resultado geral na redução do biofilme.

[00100] Em uma modalidade, a invenção fornece inibidores de amiloide que se ligam e inibem a fibrilização de curli amiloide bacteriano implicada na formação de biofilme. Em uma modalidade, os inibidores de amiloide são anticorpos monoclonais humanos que apresentam reatividade contra β- amiloide, bem como apresentam propriedades anti-curli dentro do contexto de biofilmes bacterianos.

[00101] Será entendido por um versado na técnica, com base na descrição fornecida neste documento, que uma diminuição na fibrilização de amiloide engloba uma diminuição na expressão de amiloide, incluindo transcrição, tradução ou ambas, e também abrange a promoção da degradação de amiloide, incluindo ao nível de RNA (por exemplo, RNAi, shRNA, etc.) e ao nível da proteína (por exemplo, degradação, etc.) O versado também reconhecerá, uma vez armado com os ensinamentos da presente invenção, que uma diminuição na fibrilização de amiloide inclui uma diminuição na atividade de amiloide (por exemplo, atividade enzimática, atividade de ligação ao substrato, atividade de ligação ao receptor, etc.). Assim, a redução da fibrilização de amiloide inclui, mas não está limitada a, diminuição da transcrição, tradução, ou ambas, de um ácido nucleico que codifica a amiloide; e também inclui a diminuição de qualquer atividade de um polipeptídeo amiloide, ou fragmento de peptídeo do mesmo, também. As composições e métodos do inibidor de amiloide da invenção podem inibir seletivamente a amiloide ou podem inibir a amiloide e outra molécula.

[00102] A inibição da fibrilização de amiloide pode ser avaliada usando uma ampla variedade de métodos, incluindo aqueles descritos neste documento, bem como métodos conhecidos na técnica ou a serem desenvolvidos no futuro. Ou seja, um versado na técnica reconheceria, com

33 / 93 base na descrição fornecida neste documento, que a diminuição do nível ou atividade de amiloide pode ser prontamente avaliada usando métodos que avaliam o nível de um ácido nucleico que codifica amiloide (por exemplo, mRNA), o nível de um polipeptídeo amiloide, ou fragmento de peptídeo do mesmo, presente em uma amostra biológica, o nível de atividade de amiloide (por exemplo, atividade enzimática, atividade de ligação ao substrato, atividade de ligação ao receptor, etc.) ou combinações dos mesmos.

[00103] Um versado na técnica, com base na descrição fornecida neste documento, entenderia que a invenção é útil no tratamento ou prevenção de uma doença ou distúrbio em um indivíduo em necessidade, esteja o indivíduo ou não também sendo tratado com outro medicamento ou terapia. Além disso, o versado na técnica reconheceria ainda, com base nos ensinamentos fornecidos neste documento, que a doença ou distúrbios tratáveis pelas composições e métodos descritos neste documento abrangem qualquer doença ou distúrbio em que a amiloide desempenha um papel e onde a fibrilização de amiloide diminuída promoverá um resultado terapêutico positivo. As composições de inibidor de amiloide e métodos da invenção que diminuem o nível ou atividade (por exemplo, fibrilização de amiloide, etc.) de amiloide, ou um fragmento de amiloide, incluem, mas não devem ser interpretados como sendo limitados a um composto químico, uma proteína, um peptídeo, um peptidomimético, um anticorpo, um fragmento de anticorpo, um mimético de anticorpo, uma ribozima, um composto químico de molécula pequena, um RNA de grampo curto, RNAi, uma molécula de ácido nucleico antissentido (por exemplo, siRNA, miRNA, etc.), um ácido nucleico que codifica uma molécula de ácido nucleico antissentido, uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína ou combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, o inibidor é um inibidor alostérico. Um versado na técnica reconheceria prontamente, com base na descrição fornecida neste documento, que uma composição de inibidor de amiloide engloba qualquer composto químico que diminui a fibrilização de

34 / 93 amiloide. Além disso, uma composição de inibidor de amiloide abrange um composto quimicamente modificado e derivados, como é bem conhecido por aqueles versados nas técnicas químicas.

[00104] Além disso, um versado na técnica, quando equipado com esta descrição e os métodos aqui exemplificados, reconheceria que uma composição de inibidor de amiloide inclui tais inibidores como descobertos no futuro, como podem ser identificados por critérios bem conhecidos na técnica de farmacologia, tal como os resultados fisiológicos de inibição de amiloide conforme descrito em detalhes neste documento e/ou conforme conhecido na técnica. Portanto, a presente invenção não está limitada de forma alguma a qualquer composição de inibidor de amiloide particular como exemplificado ou descrito aqui; em vez disso, a invenção abrange aquelas composições de inibidor que seriam entendidas por um versado na técnica como sendo úteis como são conhecidas na técnica e como serão descobertas no futuro.

[00105] Outros métodos de identificação e produção de composições de inibidor de amiloide são bem conhecidos por aqueles versados na técnica, incluindo, mas não se limitando, a obtenção de um inibidor de uma fonte de ocorrência natural (por exemplo, Streptomyces sp., Pseudomonas sp., Stylotella aurantium, etc.). Alternativamente, um inibidor de amiloide pode ser sintetizado quimicamente. Além disso, o rotineiro reconheceria, com base nos ensinamentos fornecidos neste documento, que uma composição de inibidor de amiloide pode ser obtida a partir de um organismo recombinante. As composições e métodos para sintetizar quimicamente inibidores de amiloide e para obtê-los de fontes naturais são bem conhecidos na técnica e são descritos na técnica.

[00106] Um versado na técnica reconhecerá que um inibidor pode ser administrado como um composto químico, uma proteína, um peptídeo, um peptidomimético, um anticorpo, um fragmento de anticorpo, um mimético de anticorpo, uma ribozima, um composto químico de molécula pequena, um

35 / 93 RNA em forma de grampo curto, RNAi, uma molécula de ácido nucleico antissentido (por exemplo, siRNA, miRNA, etc.), um ácido nucleico que codifica uma molécula de ácido nucleico antissentido, uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína, um receptor de amiloide, um fragmento de receptor de amiloide ou combinações dos mesmos. Inúmeros vetores e outras composições e métodos são bem conhecidos para administrar uma proteína ou uma construção de ácido nucleico que codifica uma proteína para células ou tecidos. Portanto, a invenção inclui um método de administração de uma proteína ou um ácido nucleico que codifica uma proteína que é um inibidor de amiloide. (Sambrook et al., 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York; Ausubel et al., 1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York).

[00107] Um versado na técnica perceberá que diminuir a quantidade ou atividade de uma molécula que por si só aumenta o nível ou atividade de amiloide pode servir nas composições e métodos da presente invenção para diminuir o nível ou atividade de amiloide.

[00108] Os oligonucleotídeos antissentido são moléculas de DNA ou RNA que são complementares a alguma porção de uma molécula de RNA. Quando presentes em uma célula, os oligonucleotídeos antissentido hibridizam com uma molécula de RNA existente e inibem a tradução em um produto gênico. A inibição da expressão de um gene usando um oligonucleotídeo antissentido é bem conhecida na técnica (Marcus-Sekura, 1988, Anal. Biochem. 172:289), assim como os métodos de expressão de um oligonucleotídeo antissentido em uma célula (Inoue, Pat. U.S. nº 5.190.931). Os métodos da invenção incluem o uso de um oligonucleotídeo antissentido para diminuir a quantidade de amiloide, ou para diminuir a quantidade de uma molécula que causa um aumento na quantidade ou atividade de amiloide, diminuindo assim a quantidade ou atividade de amiloide.

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[00109] Estão contemplados na presente invenção os oligonucleotídeos antissentido que são sintetizados e fornecidos à célula por meio de métodos bem conhecidos pelos versados na técnica. Como um exemplo, um oligonucleotídeo antissentido pode ser sintetizado para ter entre cerca de 10 e cerca de 100, mais preferivelmente entre cerca de 15 e cerca de 50 nucleotídeos de comprimento. A síntese de moléculas de ácido nucleico é bem conhecida na técnica, assim como a síntese de oligonucleotídeos antissentido modificados para melhorar a atividade biológica em comparação com oligonucleotídeos antissentido não modificados (Tullis, 1991, Pat. U.S. nº 5.023.243).

[00110] De forma similar, a expressão de um gene pode ser inibida pela hibridização de uma molécula antissentido com um promotor ou outro elemento regulador de um gene, afetando assim a transcrição do gene. Métodos para a identificação de um promotor ou outro elemento regulador que interage com um gene de interesse são bem conhecidos na técnica e incluem métodos como o sistema de duplo-híbrido de levedura (Bartel and Fields, eds., In: The Yeast Two Hybrid System, Oxford University Press, Cary, N.C.).

[00111] Alternativamente, a inibição de um gene que expressa amiloide, ou de um gene que expressa uma proteína que aumenta o nível ou atividade de amiloide, pode ser realizada através do uso de uma ribozima. O uso de ribozimas para inibir a expressão gênica é bem conhecido pelos versados na técnica (ver, por exemplo, Cech et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:17479; Hampel et al., 1989, Biochemistry 28: 4929; Altman et al., Pat. U.S. nº 5.168.053). Ribozimas são moléculas de RNA catalíticas com a capacidade de clivar outras moléculas de RNA de fita simples. Ribozimas são conhecidas por serem específicas de sequência e, portanto, podem ser modificadas para reconhecer uma sequência de nucleotídeos específica (Cech, 1988, J. Amer. Med. Assn. 260:3030), permitindo a clivagem seletiva de moléculas de mRNA específicas. Dada a sequência de nucleotídeos da molécula, um versado na técnica poderia

37 / 93 sintetizar um oligonucleotídeo antissentido ou ribozima sem experimentação indevida, fornecido com a descrição e referências aqui incorporadas.

[00112] Alternativamente, a inibição de um gene que expressa amiloide, ou de um gene que expressa uma proteína que aumenta o nível ou atividade de amiloide, pode ser realizada através do uso de um RNA em forma de grampo curto ou RNA antissentido, incluindo siRNA, miRNA e RNAi. Dada a sequência de nucleotídeos da molécula, um versado na técnica poderia sintetizar esse RNA em forma de grampo curto ou RNA antissentido sem experimentação indevida, fornecido com a descrição e referências aqui incorporadas.

[00113] Será reconhecido por um versado na técnica, quando armado com a presente descrição incluindo os métodos aqui detalhados, que a invenção não está limitada ao tratamento de uma doença ou distúrbio que já está estabelecido. Particularmente, a doença ou distúrbio não precisa ter se manifestado a ponto de prejudicar o indivíduo; de fato, a doença ou distúrbio não precisa ser detectado em um indivíduo antes que o tratamento seja administrado. Isto é, uma doença ou distúrbio significativo não precisa ocorrer antes que a presente invenção possa fornecer benefícios. Portanto, a presente invenção inclui um método para prevenir uma doença ou distúrbio em um indivíduo, em que uma composição de inibidor de amiloide, como discutido em outro lugar neste documento, pode ser administrada a um indivíduo antes do início da doença ou distúrbio, evitando assim que a doença ou desordem se desenvolva.

[00114] A invenção fornece composições que se ligam à amiloide. Em uma modalidade, o agente de ligação à amiloide inibe os níveis ou atividade de amiloide. Assim, em doenças e condições em que uma redução da atividade de amiloide seria benéfica, tais agentes de ligação à amiloide inibitórios podem potencialmente atuar como terapêuticos.

38 / 93 Anticorpos antiamiloides

[00115] Os anticorpos, incluindo seus fragmentos de ligação à amiloide, da presente invenção incluem, em certas modalidades, sequências de aminoácidos de anticorpos descritas neste documento codificadas por qualquer polinucleotídeo adequado ou qualquer anticorpo isolado ou formulado. Além disso, os anticorpos da presente descrição compreendem anticorpos com as características estruturais e/ou funcionais dos anticorpos antiamiloides aqui descritos. Em uma modalidade, o anticorpo antiamiloide se liga à amiloide e, desse modo, altera parcialmente ou substancialmente pelo menos uma atividade biológica de amiloide (por exemplo, fibrilização de amiloide). Em algumas modalidades, a amiloide é uma amiloide microbiana.

[00116] Em uma modalidade, os anticorpos antiamiloide da invenção se ligam imunoespecificamente a pelo menos um epítopo específico para a proteína amiloide, peptídeo, subunidade, fragmento, porção ou qualquer combinação dos mesmos e não se ligam especificamente a outros polipeptídeos, exceto amiloide de outras espécies. O pelo menos um epítopo pode compreender pelo menos uma região de ligação do anticorpo que compreende pelo menos uma porção da proteína amiloide. O termo “epítopo”, como aqui usado, refere-se a um determinante de proteína capaz de se ligar a um anticorpo. Os epítopos geralmente consistem em agrupamentos de superfície quimicamente ativos de moléculas, como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar e geralmente têm características estruturais tridimensionais específicas, bem como características de carga específicas. Os epítopos conformacionais e não conformacionais distinguem-se pelo fato de a ligação ao primeiro, mas não ao último, se perder na presença de solventes desnaturantes.

[00117] A invenção fornece uma composição imunológica compreendendo pelo menos um anticorpo possuindo atividade de ligação a pan-amiloide. Por exemplo, em uma modalidade, a composição compreende

39 / 93 um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga especificamente a uma estrutura de folha beta de uma proteína amiloide. Anticorpos antiamiloides exemplificativos incluem, mas não estão limitados a ALZ.3H3, ALZ.2C10, ALZ.4G1 e ALZ.4A6.

[00118] No entanto, a invenção não deve ser interpretada como sendo limitada apenas a métodos e composições incluindo esses anticorpos ou a essas porções dos antígenos. Em vez disso, a invenção deve ser interpretada para incluir outros anticorpos, como esse termo é definido em outro lugar aqui, para antígenos, ou porções dos mesmos. Além disso, a presente invenção deve ser interpretada para abranger anticorpos, inter alia, ligando-se aos antígenos específicos de interesse, e eles são capazes de se ligar ao antígeno presente em Western blots, em solução em imunoensaios ligados a enzimas, em ensaios de separação de células ativada por fluorescência (FACS), em ensaios de separação de células ativada por magnética (MACS) e em microscopia de imunofluorescência de uma célula transfectada transitoriamente com um ácido nucleico que codifica pelo menos uma porção da proteína antigênica, por exemplo.

[00119] Um versado na técnica reconheceria, com base na descrição fornecida neste documento, que o anticorpo pode se ligar especificamente a qualquer porção do antígeno e a proteína de comprimento total pode ser usada para gerar anticorpos específicos para esse fim. No entanto, a presente invenção não está limitada ao uso da proteína de comprimento total como um imunógeno. Em vez disso, a presente invenção inclui o uso de uma porção imunogênica da proteína para produzir um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno específico. Ou seja, a invenção inclui imunizar um animal usando uma porção imunogênica, ou determinante antigênico, do antígeno.

[00120] Uma vez armado com a sequência de um antígeno específico de interesse e a análise detalhada localizando os vários domínios conservados e não conservados da proteína, o versado na técnica entenderia, com base na

40 / 93 descrição aqui fornecida, como obter anticorpos específicos para as várias porções do antígeno usando métodos bem conhecidos na técnica ou a serem desenvolvidos.

[00121] O versado na técnica reconheceria, com base na descrição aqui fornecida, que a presente invenção inclui o uso de um único anticorpo que reconhece um único epítopo antigênico, mas que a invenção não está limitada ao uso de um único anticorpo. Em vez disso, a invenção abrange o uso de pelo menos um anticorpo em que os anticorpos podem ser direcionados para o mesmo ou diferentes epítopos de proteína antigênica.

[00122] Os métodos de produção e uso de anticorpos são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, anticorpos policlonais úteis na presente invenção podem ser gerados por imunização de coelhos de acordo com técnicas imunológicas padrão bem conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Harlow et al., 1988, In: Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY). Essas técnicas incluem a imunização de um animal com uma proteína quimérica compreendendo uma porção de outra proteína, tal como uma proteína de ligação à maltose ou porção polipeptídica tag glutationa (GSH), e/ou uma fração de modo que a proteína antigênica de interesse seja tornada imunogênica (por exemplo, um antígeno de interesse conjugado com hemocianina de lapa, KLH) e uma porção que compreende os respectivos resíduos de aminoácidos de proteína antigênica. As proteínas quiméricas são produzidas por clonagem dos ácidos nucleicos apropriados que codificam a proteína marcadora em um vetor plasmídeo adequado para esse propósito, tal como, mas não limitado a, pMAL-2 ou pCMX.

[00123] A geração de anticorpos policlonais é realizada inoculando o animal desejado com o antígeno e isolando anticorpos que se ligam especificamente ao antígeno usando métodos de produção de anticorpos padrão, tais como aqueles descritos em, por exemplo, Harlow et al. (1988, In: Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY).

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[00124] Os anticorpos monoclonais direcionados contra fragmentos de peptídeo ou comprimento total de uma proteína ou peptídeo podem ser preparados usando quaisquer procedimentos de preparação de anticorpos monoclonais bem conhecidos, tais como os descritos, por exemplo, em Harlow et al. (1988, In: Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY) e em Tuszynski et al. (1988, Blood, 72:109-115). Quantidades do peptídeo desejado também podem ser sintetizadas usando tecnologia de síntese química. Alternativamente, o DNA que codifica o peptídeo desejado pode ser clonado e expresso a partir de uma sequência promotora apropriada em células adequadas para a geração de grandes quantidades de peptídeo. Os anticorpos monoclonais direcionados contra o peptídeo são gerados a partir de camundongos imunizados com o peptídeo usando procedimentos padrão como aqui referenciado.

[00125] O ácido nucleico que codifica o anticorpo monoclonal obtido usando os procedimentos aqui descritos pode ser clonado e sequenciado usando tecnologia que está disponível na técnica e é descrito, por exemplo, em Wright et al. (1992, Critical Rev. Immunol. 12:125-168), e as referências citadas no mesmo. Além disso, o anticorpo da invenção pode ser “humanizado” usando a tecnologia descrita em, por exemplo, Wright et al., e nas referências citadas no mesmo, e em Gu et al. (1997, Thrombosis and Hematocyst 77:755-759), e outros métodos de humanização de anticorpos bem conhecidos na técnica ou a serem desenvolvidos.

[00126] A presente invenção também inclui o uso de anticorpos humanizados especificamente reativos com epítopos de um antígeno de interesse. Os anticorpos humanizados da invenção têm uma estrutura humana e têm uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de um anticorpo, tipicamente um anticorpo de camundongo, especificamente reativo com um antígeno de interesse. Quando o anticorpo usado na invenção é humanizado, o anticorpo pode ser gerado como descrito em Queen, et al.

42 / 93 (Patente U.S. nº 6.180.370), Wright et al., (supra) e nas referências citadas no mesmo, ou in Gu et al. (1997, Thrombosis and Hematocyst 77(4):755-759). O método descrito em Queen et al. é direcionado em parte ao projeto de imunoglobulinas humanizadas que são produzidas pela expressão de segmentos de DNA recombinante que codificam as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) da cadeia pesada e leve de uma imunoglobulina doadora capaz de se ligar a um antígeno desejado, como um epítopo em um antígeno de interesse, ligado a segmentos de DNA que codificam regiões estruturais humanas aceitadoras. De um modo geral, a invenção na patente de Queen tem aplicabilidade para o projeto de substancialmente qualquer imunoglobulina humanizada. Queen explica que os segmentos de DNA incluirão tipicamente uma sequência de DNA de controle de expressão operacionalmente ligada às sequências de codificação da imunoglobulina humanizada, incluindo regiões promotoras heterólogas ou naturalmente associadas. As sequências de controle de expressão podem ser sistemas promotores eucarióticos em vetores capazes de transformar ou transfectar células hospedeiras eucarióticas ou as sequências de controle de expressão podem ser sistemas promotores procarióticos em vetores capazes de transformar ou transfectar células hospedeiras procarióticas. Uma vez que o vetor tenha sido incorporado no hospedeiro apropriado, o hospedeiro é mantido sob condições adequadas para expressão de alto nível das sequências de nucleotídeos introduzidas e conforme desejado, pode-se seguir a coleta e purificação das cadeias leves humanizadas, cadeias pesadas, dímeros de cadeia leve/pesada ou anticorpos intactos, fragmentos de ligação ou outras formas de imunoglobulina (Beychok, Cells of Immunoglobulin Synthesis, Academic Press, New York, (1979), que é aqui incorporado por referência).

[00127] A invenção também inclui equivalentes funcionais dos anticorpos aqui descritos. Equivalentes funcionais têm características de ligação comparáveis àquelas dos anticorpos e incluem, por exemplo, anticorpos

43 / 93 hibridizados e de cadeia simples, bem como fragmentos dos mesmos. Os métodos de produção de tais equivalentes funcionais são descritos no Pedido PCT WO 93/21319 e no Pedido PCT WO 89/09622.

[00128] Equivalentes funcionais incluem polipeptídeos com sequências de aminoácidos substancialmente iguais à sequência de aminoácidos das regiões variáveis ou hipervariáveis dos anticorpos. “Substancialmente a mesma” sequência de aminoácidos é definida aqui como uma sequência com pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos cerca de 80%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 90%, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 95% e mais preferivelmente pelo menos 99 % de homologia com outra sequência de aminoácidos (ou qualquer número inteiro entre 70 e 99), conforme determinado pelo método de pesquisa FASTA de acordo com Pearson e Lipman, 1988 Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85: 2444-2448. Os anticorpos quiméricos ou outros anticorpos híbridos têm regiões constantes derivadas substancialmente ou exclusivamente de regiões constantes de anticorpos humanos e regiões variáveis derivadas substancialmente ou exclusivamente da sequência da região variável de um anticorpo monoclonal de cada hibridoma estável.

[00129] Os anticorpos de cadeia única (scFv) ou fragmentos Fv são polipeptídeos que consistem na região variável da cadeia pesada do anticorpo ligada à região variável da cadeia leve, com ou sem um ligante de interconexão. Assim, o Fv compreende um local de combinação de anticorpo.

[00130] Equivalentes funcionais dos anticorpos da invenção incluem adicionalmente fragmentos de anticorpos que têm as mesmas, ou substancialmente as mesmas, características de ligação às do anticorpo inteiro. Esses fragmentos podem conter um ou ambos os fragmentos Fab ou o fragmento F(ab’)2. Os fragmentos de anticorpo contêm todas as seis regiões determinantes de complementaridade de todo o anticorpo, embora os fragmentos contendo menos do que todas essas regiões, tais como três, quatro

44 / 93 ou cinco regiões determinantes de complementaridade, também sejam funcionais. Os equivalentes funcionais são membros da classe de imunoglobulina IgG e suas subclasses, mas podem ser ou podem se combinar com qualquer uma das seguintes classes de imunoglobulina: IgM, IgA, IgD ou IgE e suas subclasses. As cadeias pesadas de várias subclasses, como as subclasses de IgG, são responsáveis por diferentes funções efetoras e, portanto, ao escolher a região constante da cadeia pesada desejada, anticorpos híbridos com a função efetora desejada são produzidos. As regiões constantes exemplificativas são gama 1 (IgG1), gama 2 (IgG2), gama 3 (IgG3) e gama 4 (IgG4). A região constante da cadeia leve pode ser do tipo kappa ou lambda.

[00131] As imunoglobulinas da presente invenção podem ser monovalentes, divalentes ou polivalentes. As imunoglobulinas monovalentes são dímeros (HL) formados por uma cadeia pesada híbrida associada através de pontes dissulfeto com uma cadeia leve híbrida. As imunoglobulinas divalentes são tetrâmeros (H2L2) formados por dois dímeros associados por pelo menos uma ponte dissulfeto.

[00132] O anticorpo pode compreender um conjunto de regiões determinantes de complementaridade (“CDR”) de cadeia pesada e de cadeia leve, respectivamente interpostas entre um conjunto estrutural (“FR”) de cadeia pesada e de cadeia leve que fornece suporte para as CDRs e define a relação espacial das CDRs em relação umas às outras. O conjunto de CDR pode conter três regiões hipervariáveis de uma região V de cadeia pesada ou leve. Procedendo do terminal N de uma cadeia pesada ou leve, essas regiões são denotadas como “CDR1”, “CDR2” e “CDR3”, respectivamente. Um local de ligação ao antígeno, portanto, pode incluir seis CDRs, compreendendo o conjunto de CDR de cada uma de uma região V de cadeia pesada e leve.

[00133] O anticorpo pode ter meia-vida dentro do indivíduo. Em algumas modalidades, o anticorpo pode ser modificado para estender ou encurtar sua meia-vida dentro do indivíduo. A modificação pode estar presente

45 / 93 em uma região constante do anticorpo. A modificação pode ser uma ou mais substituições de aminoácidos em uma região constante do anticorpo que estendem a meia-vida do anticorpo em comparação com a meia-vida de um anticorpo que não contém uma ou mais substituições de aminoácidos. A modificação pode ser uma ou mais substituições de aminoácidos no domínio CH2 do anticorpo que estendem a meia-vida do anticorpo em comparação com a meia-vida de um anticorpo que não contém uma ou mais substituições de aminoácidos.

[00134] Em algumas modalidades, uma ou mais substituições de aminoácidos na região constante podem incluir a substituição de um resíduo de metionina na região constante com um resíduo de tirosina, um resíduo de serina na região constante com um resíduo de treonina, um resíduo de treonina na região constante com um resíduo de glutamato, ou qualquer combinação dos mesmos, estendendo assim a meia-vida do anticorpo.

[00135] Em outras modalidades, uma ou mais substituições de aminoácidos na região constante podem incluir a substituição de um resíduo de metionina no domínio CH2 com um resíduo de tirosina, um resíduo de serina no domínio CH2 com um resíduo de treonina, um resíduo de treonina no domínio CH2 com um resíduo de glutamato, ou qualquer combinação dos mesmos, estendendo assim a meia-vida do anticorpo.

[00136] O anticorpo pode ser defucosilado. A fucosilação inclui a adição do açúcar fucose a uma molécula, por exemplo, a ligação da fucose a N- glicanos, O-glicanos e glicolipídeos. Consequentemente, em um anticorpo defucosilado, a fucose não está ligada às cadeias de carboidratos da região constante. O anticorpo pode ser modificado de modo a prevenir ou inibir a fucosilação do anticorpo. A modificação pode ser na cadeia pesada, cadeia leve ou uma combinação das mesmas. A modificação pode ser uma ou mais substituições de aminoácidos na cadeia pesada, uma ou mais substituições de aminoácidos na cadeia leve ou uma combinação das mesmas.

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[00137] O anticorpo antiamiloide pode tratar, prevenir e/ou proteger contra doenças no indivíduo a quem se administrou a composição. O anticorpo antiamiloide pode promover a sobrevida da doença no indivíduo a quem se administrou a composição. Em uma modalidade, o anticorpo antiamiloide pode fornecer maior sobrevida da doença no indivíduo em relação à sobrevida esperada de um indivíduo com a doença a quem não foi administrado o anticorpo antiamiloide. Em várias modalidades, o anticorpo antiamiloide pode fornecer pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% de aumento na sobrevivência da doença em indivíduos aos quais foi administrada a composição em relação à sobrevida esperada na ausência da composição.

[00138] Em uma modalidade, o anticorpo antiamiloide pode fornecer proteção aumentada contra a doença no indivíduo em relação à proteção esperada de um indivíduo que não recebeu o anticorpo antiamiloide. Em várias modalidades, o anticorpo antiamiloide pode proteger contra a doença em pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% de indivíduos aos quais foi administrada a composição sobre a proteção esperada na ausência da composição. Combinação com tratamento com antibióticos

[00139] Em um aspecto, a presente invenção fornece uma composição que compreende um anticorpo antiamiloide da invenção em combinação com pelo menos um agente adicional. Em uma modalidade, o agente adicional é um antibiótico. Em um aspecto, a presente invenção fornece uma composição que compreende um anticorpo antiamiloide da invenção e um tratamento com antibiótico. Em uma modalidade, a razão em peso entre um anticorpo antiamiloide da invenção e um tratamento com antibiótico é de cerca de 10:1 a cerca de 1:10. Em uma modalidade, a razão em peso entre um anticorpo

47 / 93 antiamiloide da invenção e um tratamento com antibiótico é de cerca de 4:1 a cerca de 1:4. Em uma modalidade, a razão em peso entre um anticorpo antiamiloide da invenção e um tratamento com antibiótico é de cerca de 2:1 a cerca de 1:2. Em uma modalidade, a razão em peso entre um anticorpo antiamiloide da invenção e um tratamento com antibiótico é cerca de 1:1 a cerca de 1: 2, cerca de 1:3, cerca de 1:4, cerca de 1:5, cerca de 2:1, cerca de 3:1, cerca de 4:1, ou cerca de 5:1. Em uma modalidade, a concentração total de um anticorpo antiamiloide da invenção e um tratamento com antibiótico na composição da presente invenção é de cerca de 1% em peso a cerca de 50% em peso. Em uma modalidade, a concentração total de um anticorpo antiamiloide da invenção e um tratamento com antibiótico na composição da presente invenção é de cerca de 50% em peso (% em peso), cerca de 40% em peso, cerca de 30% em peso, cerca de 25% em peso, cerca de 20% em peso, cerca de 15% em peso, cerca de 10% em peso, cerca de 5% em peso, cerca de 3% em peso, cerca de 2% em peso, cerca de 1% em peso por unidade da composição. Formulações e composições farmacêuticas

[00140] A invenção também abrange uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo com atividade pan-amiloide. Em uma modalidade, a composição farmacêutica é útil para inibir infecções bacterianas. Em uma modalidade, a composição farmacêutica é útil para superar resistência antibacteriana. Tal composição farmacêutica pode consistir em um anticorpo com atividade pan-amiloide em uma forma adequada para administração a um indivíduo. Em uma modalidade, a composição da invenção pode compreender uma molécula de ácido nucleico que codifica um anticorpo com atividade pan- amiloide.

[00141] Em uma modalidade, as composições farmacêuticas úteis para a prática do método da invenção podem ser administradas para dispensar uma dose entre 1 ng/kg/dia e 100 mg/kg/dia. Em uma outra modalidade, as composições farmacêuticas úteis para a prática da invenção podem ser

48 / 93 administradas para administrar uma dose entre 1 ng/kg/dia e 500 mg/kg/dia.

[00142] As quantidades relativas do ingrediente ativo, o carreador farmaceuticamente aceitável e quaisquer ingredientes adicionais em uma composição farmacêutica da invenção irão variar, dependendo da identidade, tamanho e condição do indivíduo tratado e ainda dependendo da via pela qual a composição deve ser administrada. A título de exemplo, a composição pode compreender entre 0,1% e 100% (p/p) de ingrediente ativo.

[00143] As composições farmacêuticas que são úteis nos métodos da invenção podem ser adequadamente desenvolvidas para administração oral, retal, vaginal, tópica, transdérmica, oftálmica, intratecal ou outra via de administração. A(s) via(s) de administração serão prontamente aparentes para o versado na técnica e dependerão de qualquer número de fatores, incluindo o tipo e a gravidade da doença a ser tratada, o tipo e a idade do paciente veterinário ou humano a ser tratado e similares.

[00144] As formulações das composições farmacêuticas aqui descritas podem ser preparadas por qualquer método conhecido ou a seguir desenvolvido na técnica da farmacologia. Em geral, tais métodos preparatórios incluem colocar o ingrediente ativo em associação com um carreador ou um ou mais outros ingredientes acessórios, e então, se necessário ou desejável, conformar ou acondicionar o produto em uma unidade de dose única ou múltipla desejada.

[00145] Conforme usado neste documento, uma “dose unitária” é uma quantidade discreta da composição farmacêutica que compreende uma quantidade predeterminada do ingrediente ativo. A quantidade do ingrediente ativo é geralmente igual à dosagem do ingrediente ativo que seria administrada a um indivíduo ou uma fração conveniente de tal dosagem, tal como, por exemplo, metade ou um terço de tal dosagem. A forma de dosagem unitária pode ser para uma única dose diária ou uma de múltiplas doses diárias (por exemplo, cerca de 1 a 4 ou mais vezes por dia). Quando múltiplas doses diárias são usadas, a forma de dosagem unitária pode ser a mesma ou diferente para

49 / 93 cada dose.

[00146] Embora as descrições de composições farmacêuticas fornecidas neste documento sejam principalmente direcionadas a composições farmacêuticas que são adequadas para administração ética a humanos, será entendido pelo versado na técnica que tais composições são geralmente adequadas para administração a animais de todos os tipos. A modificação de composições farmacêuticas adequadas para administração a humanos, a fim de tornar as composições adequadas para administração a vários animais, é bem compreendida, e o farmacologista veterinário habilitado pode projetar e realizar tal modificação com experimentação meramente comum, se houver. Os indivíduos para os quais a administração das composições farmacêuticas da invenção é contemplada incluem, mas não estão limitados a humanos e outros primatas, mamíferos incluindo mamíferos comercialmente relevantes, como gado, porcos, cavalos, ovelhas, gatos e cães.

[00147] Em uma modalidade, as composições da invenção são formuladas usando um ou mais excipientes ou carreadores farmaceuticamente aceitáveis. Em uma modalidade, as composições farmacêuticas da invenção compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo com atividade pan-amiloide e um carreador farmaceuticamente aceitável. Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis, que são úteis, incluem, mas não estão limitados a glicerol, água, solução salina, etanol e outras soluções de sal farmaceuticamente aceitáveis, tais como fosfatos e sais de ácidos orgânicos. Exemplos destes e de outros carreadores farmaceuticamente aceitáveis são descritos em Remington’s Pharmaceutical Sciences (1991, Mack Publication Co., New Jersey).

[00148] O carreador pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol e polietilenoglicol líquido, e similares), misturas adequadas dos mesmos e óleos vegetais. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso

50 / 93 de um revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. A prevenção ou redução da ação de microrganismos pode ser conseguida por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal e similares. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, cloreto de sódio, ou poliálcoois tais como manitol e sorbitol na composição. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser realizada pela inclusão na composição de um agente que retarda a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio ou gelatina.

[00149] As formulações podem ser utilizadas em misturas com excipientes convencionais. As preparações farmacêuticas podem ser esterilizadas e, se desejado, misturadas com agentes auxiliares, por exemplo, lubrificantes, conservantes, estabilizantes, agentes umectantes, emulsificantes, sais para influenciar tampões de pressão osmótica, corantes, aromatizantes e/ou substâncias aromáticas e similares. Elas também podem ser combinadas, quando desejado, com outros agentes ativos, por exemplo, outros agentes analgésicos.

[00150] Conforme usado neste documento, “ingredientes adicionais” incluem, mas não estão limitados a um ou mais dos seguintes: excipientes; agentes tensoativos; agentes dispersantes; diluentes inertes; agentes de granulação e desintegração; agentes de ligação; agentes lubrificantes; agentes adoçantes; agentes aromatizantes; agentes corantes; conservantes; composições fisiologicamente degradáveis, tais como gelatina; veículos aquosos e solventes; veículos oleosos e solventes; agentes de suspensão; agentes dispersantes ou umectantes; agentes emulsificantes, demulcentes; tampões; sais; agentes espessantes; cargas; agentes emulsificantes; antioxidantes; antibióticos; agentes antifúngicos; antissépticos; agentes antivirais; anticoagulantes; agentes estabilizadores; e materiais poliméricos ou

51 / 93 hidrofóbicos farmaceuticamente aceitáveis. Outros “ingredientes adicionais” que podem ser incluídos nas composições farmacêuticas da invenção são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em Genaro, ed. (1985, Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA), que é aqui incorporado por referência.

[00151] A composição da invenção pode compreender um conservante de cerca de 0,005% a 2,0% em peso total da composição. O conservante é usado para prevenir a deterioração em caso de exposição a contaminantes do meio ambiente. Exemplos de conservantes úteis de acordo com a invenção incluem, mas não estão limitados àqueles selecionados do grupo que consiste em álcool benzílico, ácido sórbico, parabenos, imidureia e combinações dos mesmos. Um conservante particularmente preferido é uma combinação de cerca de 0,5% a 2,0% de álcool benzílico e 0,05% a 0,5% de ácido sórbico.

[00152] A composição inclui preferivelmente um antioxidante e um agente quelante que inibe a degradação do composto. Os antioxidantes preferidos para alguns compostos são BHT, BHA, alfa-tocoferol e ácido ascórbico no intervalo preferido de cerca de 0,01% a 0,3% e mais preferivelmente BHT no intervalo de 0,03% a 0,1% em peso por peso total da composição. Preferivelmente, o agente quelante está presente em uma quantidade de 0,01% a 0,5% em peso por peso total da composição. Os agentes quelantes particularmente preferidos incluem sais de edetato (por exemplo, edetato dissódico) e ácido cítrico no intervalo de peso de cerca de 0,01% a 0,20% e mais preferivelmente no intervalo de 0,02% a 0,10% em peso por peso total da composição. O agente quelante é útil para quelar íons metálicos na composição, o que pode ser prejudicial ao prazo de validade da formulação. Embora o BHT e o edetato dissódico sejam o antioxidante e o agente quelante particularmente preferidos, respectivamente, para alguns compostos, outros antioxidantes e agentes quelantes adequados e equivalentes podem ser substituídos, como seria do conhecimento dos versados na técnica.

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[00153] As suspensões líquidas podem ser preparadas usando métodos convencionais para conseguir a suspensão do ingrediente ativo em um veículo aquoso ou oleoso. Os veículos aquosos incluem, por exemplo, água e solução salina isotônica. Os veículos oleosos incluem, por exemplo, óleo de amêndoa, ésteres oleosos, álcool etílico, óleos vegetais, como óleo de amendoim, azeite, gergelim ou coco, óleos vegetais fracionados e óleos minerais, como parafina líquida. As suspensões líquidas podem compreender adicionalmente um ou mais ingredientes adicionais, incluindo, mas não se limitando a agentes de suspensão, agentes dispersantes ou umectantes, agentes emulsificantes, demulcentes, conservantes, tampões, sais, aromatizantes, agentes corantes e agentes adoçantes. As suspensões oleosas podem compreender adicionalmente um agente espessante. Os agentes de suspensão conhecidos incluem, mas não estão limitados a xarope de sorbitol, gorduras comestíveis hidrogenadas, alginato de sódio, polivinilpirrolidona, goma tragacanto, goma acácia e derivados de celulose, tais como carboximetilcelulose de sódio, metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose. Os agentes dispersantes ou umectantes conhecidos incluem, mas não estão limitados a fosfatídeos de ocorrência natural, como lecitina, produtos de condensação de um óxido de alquileno com um ácido graxo, com um álcool alifático de cadeia longa, com um éster parcial derivado de um ácido graxo e um hexitol, ou com um éster parcial derivado de um ácido graxo e um anidrido hexitol (por exemplo, estearato de polioxietileno, heptadecaetilenoxicetanol, mono-oleato de polioxietileno sorbitol e mono- oleato de polioxietileno sorbitano, respectivamente). Os agentes emulsificantes conhecidos incluem, mas não estão limitados a lecitina e acácia. Os conservantes conhecidos incluem, mas não estão limitados a metil, etil ou n- propil para hidroxibenzoatos, ácido ascórbico e ácido sórbico. Os agentes adoçantes conhecidos incluem, por exemplo, glicerol, propilenoglicol, sorbitol, sacarose e sacarina. Os agentes espessantes conhecidos para suspensões oleosas incluem, por exemplo, cera de abelha, parafina dura e álcool cetílico.

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[00154] As soluções líquidas do ingrediente ativo em solventes aquosos ou oleosos podem ser preparadas substancialmente da mesma maneira que as suspensões líquidas, a principal diferença sendo que o ingrediente ativo é dissolvido, em vez de suspenso no solvente. Conforme usado neste documento, um líquido “oleoso” é aquele que compreende uma molécula líquida contendo carbono e que apresenta um caráter menos polar do que a água. As soluções líquidas da composição farmacêutica da invenção podem compreender cada um dos componentes descritos em relação às suspensões líquidas, sendo entendido que os agentes de suspensão não ajudarão necessariamente na dissolução do ingrediente ativo no solvente. Os solventes aquosos incluem, por exemplo, água e solução salina isotônica. Os solventes oleosos incluem, por exemplo, óleo de amêndoa, ésteres oleosos, álcool etílico, óleos vegetais, como óleo de amendoim, azeite, gergelim ou coco, óleos vegetais fracionados e óleos minerais, como parafina líquida.

[00155] As composições da invenção podem ser usadas em emulsões aquosas, tais como látex, tintas e revestimentos à base de água, calafetagens e adesivos, compostos de junta de fita, pastas fluidas minerais, sistemas de refrigeração de água, produtos de higiene pessoal, sabões e detergentes, desinfetantes, produtos de limpeza, e sanitizantes, produtos pesticidas, água de campo petrolífero e fluidos à base de água usados em aplicações de campo petrolífero, incluindo lamas de perfuração, fluidos de fraturamento e fluidos hidrotestes e similares. Em uma modalidade, a composição é uma composição antimicrobiana. Em uma modalidade, a composição é um antisséptico.

[00156] As composições úteis na invenção podem compreender adicionalmente pelo menos um agente antimicrobiano adicional. Exemplos não limitativos de pelo menos um agente antimicrobiano adicional são levofloxacina, doxiciclina, neomicina, clindamicina, minociclina, gentamicina, rifampicina, clorexidina, cloroxilenol, metilisotizolona, timol, α-terpineol, cloreto de cetilpiridínio, hexaclorofeno, triclosan, nitrofurantoína, eritromicina,

54 / 93 nafcilina, cefazolina, imipenem, astreonam, gentamicina, sulfametoxazol, vancomicina, ciprofloxacina, trimetoprima, rifampicina, metronidazol, clindamicina, teicoplanina, mupirocina, azitromicina, claritromicina, ofloxacina, lomefloxacina, norfloxacina, ácido nalidíxico, sparfloxacina, pefloxacina, amifloxacina, gatifloxacina, moxifloxacina, gemifloxacina, enoxacina, fleroxacina, minociclina, linexolida, temafloxacina, tosufloxacina, clinafloxacina, sulbactam, ácido clavulânico, anfotericina B, fluconazol, itraconazol, cetoconazol, nistatina, penicilinas, cefalosporinas, carbepenemas, antibióticos de beta-lactamas, aminoglicosídeos, macrolídeos, lincosamidas, glicopeptídeos, tetracilinas, cloranfenicol, quinolonas, fucidinas, sulfonamidas, trimetoprimas, rifamicinas, oxalinas, estreptograminas, lipopeptídeos, cetolídeos, polienos, azóis, equinocandinas e qualquer combinação dos mesmos.

[00157] Em uma modalidade, o composto da invenção e o pelo menos um agente antimicrobiano adicional agem sinergicamente na prevenção, redução ou tratamento de infecções bacterianas. Um efeito sinérgico pode ser calculado, por exemplo, usando métodos adequados, como, por exemplo, a equação Sigmoid-Emax (Holford & Scheiner, 19981, Clin. Pharmacokinet. 6: 429-453), a equação da aditividade Loewe (Loewe & Muischnek, 1926, Arch. Exp. Pathol Pharmacol. 114: 313-326) e a equação do efeito mediano (Chou & Talalay, 1984, Adv. Enzyme Regul. 22: 27-55). Cada equação referida acima pode ser aplicada a dados experimentais para gerar um gráfico correspondente para auxiliar na avaliação dos efeitos da combinação de fármacos. Os gráficos correspondentes associados às equações referidas acima são a curva de concentração-efeito, a curva de isobolograma e a curva de índice de combinação, respectivamente.

[00158] As composições da invenção podem ser formuladas conforme apropriado para administração tópica. Consequentemente, a presente invenção fornece o uso de uma formulação tópica para tratar uma infecção microbiana,

55 / 93 ou para descolonizar um organismo microbiano, ou para destruir ou romper ou inibir ou reduzir a formação de biofilme de um organismo microbiano, a dita formulação tópica compreende um anticorpo antiamiloide da invenção.

[00159] Em uma modalidade, a formulação tópica da presente invenção pode assumir a forma de um creme, uma loção, uma pomada, um hidrogel, um coloide, um gel, uma espuma, um óleo, um leite, uma suspensão, um lenço, uma esponja, uma solução, uma emulsão, uma pasta, um emplastro, uma compressa, um suabe, um curativo, um spray ou uma atadura.

[00160] A formulação tópica da presente invenção compreende um ou mais carreadores farmaceuticamente aceitáveis. Exemplos de carreadores farmaceuticamente aceitáveis que são úteis no contexto da presente invenção incluem materiais carreadores, tais como um solvente, um estabilizador, um solubilizante, uma carga, um agente de intensificação de tonicidade, um agente formador de estrutura, um agente de suspensão, um agente de dispersão, um agente quelante, um agente emulsificante, um agente antiespuma, uma base de pomada, um emoliente, um agente protetor da pele, um agente formador de gel, um agente espessante, um agente de ajuste de pH, um conservante, um intensificador de penetração, um agente complexante, um lubrificante, um demulcente, um intensificador de viscosidade, um polímero bioadesivo ou uma combinação dos mesmos.

[00161] Exemplos de solventes são água ou água purificada, álcoois (por exemplo, etanol, álcool benzílico), óleos vegetais, marinhos e minerais, polietilenoglicóis, propilenoglicóis, glicerol e polialquilsiloxanos líquidos.

[00162] Os diluentes ou cargas inertes podem ser sacarose, sorbitol, açúcar, manitol, celulose microcristalina, amidos, carbonato de cálcio, cloreto de sódio, lactose, fosfato de cálcio, sulfato de cálcio ou fosfato de sódio.

[00163] Exemplos de agentes tamponantes incluem ácido cítrico, ácido acético, ácido lático, ácido hidrogenofosfórico, dietilamina, hidróxido de sódio e trometano (por exemplo, cloridrato de tris(hidroximetil)aminometano).

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[00164] Os agentes de suspensão adequados são, por exemplo, gomas de ocorrência natural (por exemplo, goma acácia, arábica, xantana e tragacanto), celuloses (por exemplo, carboximetil-, hidroxietil-, hidroxipropil- e hidroxipropilmetil-celulose), alginatos e quitosanos.

[00165] Exemplos de agentes dispersantes ou umectantes são fosfatídeos de ocorrência natural (por exemplo, lecitina ou lecitina de soja), produtos de condensação de óxido de etileno com ácidos graxos ou com álcoois alifáticos de cadeia longa (por exemplo, estearato de polioxietileno, mono- oleato de polioxietileno sorbitol e mono-oleato de polioxietileno sorbitano).

[00166] Os conservantes podem ser adicionados a uma composição tópica da invenção para prevenir a contaminação microbiana que pode afetar a estabilidade da formulação e/ou causar infecção no paciente. Exemplos adequados de conservantes incluem parabenos (tais como metila, etila, propila, /p-hidroxibenzoato, butila, isobutila e isopropilparabeno), sorbato de potássio, ácido sórbico, ácido benzoico, benzoato de metila, fenoxietanol, bronopol, bronidox, hidantoína MDM, butilcarbamato de iodopropinila, cloreto de benzalcônio, cetrimida e álcool benzílico.

[00167] Exemplos de agentes quelantes incluem EDTA sódico e ácido cítrico.

[00168] Exemplos de bases de gel ou agentes de aumento de viscosidade são parafina líquida, polietileno, óleos graxos, sílica coloidal ou alumínio, glicerol, propilenoglicol, carbonato de propileno, polímeros de carboxivinila, silicatos de magnésio-alumínio, polímeros hidrofílicos (como, por exemplo, amido ou derivados de celulose), hidrocoloides dilatáveis em água, carragenanos, hialuronatos, alginatos e acrilatos.

[00169] As bases de pomadas adequadas para uso nas composições da presente invenção podem ser hidrofóbicas ou hidrofílicas. As bases de pomada incluem, mas não estão limitadas a parafina, lanolina, polialquilsiloxanos líquidos, cetanol, palmitato de cetila, óleos vegetais, ésteres de sorbitano de

57 / 93 ácidos graxos, polietilenoglicóis e produtos de condensação entre ésteres de sorbitano de ácidos graxos, óxido de etileno (por exemplo, mono-oleato de polioxietileno sorbitano), polissorbatos, vaselina branca e cera branca.

[00170] Exemplos de umectantes incluem, mas não estão limitados a etanol, isopropanol, glicerina, propilenoglicol, sorbitol, ácido lático e ureia. Emolientes adequados incluem colesterol e glicerol.

[00171] Exemplos de protetores de pele incluem, mas não estão limitados a vitamina E, alatoína, glicerina, óxido de zinco, vitaminas e agentes de proteção solar.

[00172] Os agentes espessantes são geralmente usados para aumentar a viscosidade e melhorar as propriedades bioadesivas de composições farmacêuticas ou cosméticas. Exemplos de agentes espessantes incluem, mas não estão limitados a celuloses, polietilenoglicol, óxido de polietileno, gomas de ocorrência natural, gelatina, karaya, pectina, ácido algínico, povidona e polímeros Carbopol®. Particularmente interessantes são os agentes espessantes com propriedades tixotrópicas (isto é, agentes cuja viscosidade é diminuída por balanço ou agitação). A presença de tal agente em uma composição permite que a viscosidade da composição seja reduzida no momento da administração para facilitar a sua aplicação na pele e, para aumentar após a aplicação, de modo que a composição permaneça no local de administração.

[00173] Os polímeros bioadesivos são úteis para hidratar a pele e intensificar sua permeabilidade. Os polímeros bioadesivos também podem funcionar como agentes espessantes. Exemplos de polímeros bioadesivos incluem, mas não estão limitados a pectina, ácido algínico, quitosano, polissorbatos, poli(etilenoglicol), oligossacarídeos e polissacarídeos, ésteres de celulose e éteres de celulose e polímeros de celulose modificados.

[00174] Os agentes de intensificação de permeação são veículos contendo agentes específicos que afetam a distribuição de componentes ativos através da pele. Os agentes de intensificação de permeação são geralmente

58 / 93 divididos em duas classes: solventes e compostos tensoativos (moléculas anfifílicas). Exemplos de agentes de intensificação de permeação de solvente incluem, mas não estão limitados a, álcoois (por exemplo, álcool etílico, álcool isopropílico), dimetilformamida, dimetilacetamida, dimetilsulfóxido, l- dodecilazocilo-heptan-2-ona, N-decil-metilsulfóxido, ácido lático, N,N-dietil- m-toluamida, N-metil pirrolidona, nonano, ácido oleico, petrolato, polietilenoglicol, propilenoglicol, ácido salicílico, ureia, terpenos e tricloroetanol. Os agentes de intensificação de permeação do tensoativo podem ser não iônicos, anfotéricos, catiônicos ou zwitteriônicos. Os tensoativos não iônicos adequados incluem, mas não estão limitados a, copolímeros de bloco de poli(oxietileno)-poli(oxipropileno), comercialmente conhecidos como poloxâmeros; óleos de rícino hidrogenados etoxilados; polissorbatos, como Tween 20 ou Tween 80. Os tensoativos anfotéricos incluem derivados de imidazol quaternizados, os tensoativos catiônicos incluem cloreto de cetipiridínio e os tensoativos zwitteriônicos incluem as betaínas e sulfobetaínas. Outros exemplos de intensificadores de permeação adequados incluem pentadecalactona, 2-pirrolidina, l-dodecal-azaciclo-heptano-2-ona, tioglicolato de cálcio, hexanol, derivados de 1,3-dioxanos (ou seja, 1,3-dioxaciclo-hexanos) e 1,3-dioxalanos (isto é, 1,3-dioxaciclopentanos), ácido l-N-dodecil-2- pirrolidona-5-carboxílico, ácido 2-pentil-2-oxo-pirrolidinoacético, ácido 2- dodecil-2-oxo-1-pirrolidinoacético e ácido l-azaciclo-heptan-2-ona-2- dodecilacético entre outros. Dispositivos médicos

[00175] A invenção contempla a aplicação ou revestimento de dispositivos médicos com as composições úteis na invenção. Exemplos não limitativos de dispositivos médicos incluem cateteres descartáveis ou permanentes, (por exemplo, cateteres venosos centrais, cateteres de diálise, cateteres venosos centrais de longa permanência, cateteres venosos centrais de curta permanência, cateteres arteriais, cateteres centrais de inserção periférica,

59 / 93 cateteres venosos periféricos, cateteres de artéria pulmonar Swan-Ganz, cateteres urinários e cateteres peritoneais, cateteres de drenagem), dispositivos urinários de longo prazo, dispositivos urinários de ligação de tecidos, enxertos vasculares, portas de cateter vascular, tubos de drenagem de feridas, cateteres ventriculares, derivações de hidrocefalia, válvulas cardíacas, dispositivos de assistência cardíaca (por exemplo, dispositivos de assistência ventricular esquerda), cápsulas de marca-passo, dispositivos de incontinência, implantes penianos, substituições de articulações pequenas ou temporárias, dilatador urinário, cânulas, elastômeros, hidrogéis, instrumentos cirúrgicos, instrumentos dentários, tubos (por exemplo, tubos intravenosos, tubos respiratórios, linhas de água de equipamentos odontológicos, tubos de drenagem odontológicos e tubos de alimentação), tecidos, papel, tiras indicadoras (por exemplo, tiras indicadoras de papel ou tiras indicadoras de plástico), adesivos (por exemplo, adesivos de hidrogel, adesivos termofusíveis ou adesivos à base de solvente), bandagens, implantes ortopédicos e qualquer outro dispositivo usado no campo médico.

[00176] Os dispositivos médicos também incluem qualquer dispositivo que pode ser inserido ou implantado em um ser humano ou outro animal, ou colocado no local de inserção ou implantação, como a pele próxima ao local de inserção ou implantação, e que inclui pelo menos uma superfície que é suscetível à colonização por microrganismos e/ou microrganismos embutidos em biofilme. Também contemplado na invenção está qualquer outra superfície que possa ser desejada ou necessária para evitar que microrganismos e/ou microrganismos embutidos em biofilme cresçam ou proliferem em pelo menos uma superfície do dispositivo médico, ou para remover ou limpar microrganismos e/ou microrganismos embutidos em biofilme de pelo menos uma superfície do dispositivo médico, como as superfícies de equipamentos em salas de cirurgia, salas de emergência, quartos de hospital, clínicas e banheiros. Em uma modalidade específica, a composição é integrada em um adesivo, tal

60 / 93 como fita, fornecendo assim um adesivo que pode prevenir ou reduzir o crescimento ou proliferação de microrganismos e/ou microrganismos embutidos em biofilme em pelo menos uma superfície do adesivo.

[00177] Dispositivos médicos implantáveis incluem implantes ortopédicos que podem ser inspecionados quanto à contaminação ou infecção por microrganismos e/ou microrganismos embutidos em biofilme usando endoscopia. Os dispositivos médicos inseríveis incluem cateteres e derivações que podem ser inspecionados sem técnicas invasivas, como a endoscopia. Os dispositivos médicos podem ser formados de quaisquer materiais metálicos adequados ou materiais não metálicos conhecidos pelos versados na técnica. Exemplos de materiais metálicos incluem, mas não estão limitados a tivânio, titânio e aço inoxidável e derivados ou combinações dos mesmos. Exemplos de materiais não metálicos incluem, mas não estão limitados a materiais termoplásticos ou poliméricos, como borracha, plástico, poliésteres, polietileno, poliuretano, silicone, Gortex® (politetrafluoroetileno), Dacron® (tetraftalato de polietileno), Teflon® (politetrafluoroetileno), látex, elastômeros e Dacron® vedados com gelatina, colágeno ou albumina e derivados ou combinações dos mesmos. Os dispositivos médicos incluem pelo menos uma superfície para aplicação da composição de penetração de biofilme. Em uma modalidade, a composição de penetração de biofilme é aplicada a todo o dispositivo médico. Administração

[00178] A presente invenção fornece o uso de um anticorpo antiamiloide da invenção para tratar uma infecção microbiana, ou para descolonizar um organismo microbiano, ou para destruir ou romper ou inibir ou reduzir a formação de biofilme de um organismo microbiano.

[00179] Em uma modalidade, a composição aqui descrita é para administração a um indivíduo. Em uma modalidade, o indivíduo tem infecção microbiana ou colonização por micróbios. Preferivelmente, a infecção

61 / 93 microbiana ou local de colonização é caracterizado com colônias microbianas ou biofilme ou formação de biofilme.

Preferivelmente, a infecção microbiana é uma infecção bacteriana.

Em uma modalidade, a infecção bacteriana é de bactérias Gram-positivas ou Gram-negativas.

Em uma modalidade, a infecção bacteriana é de uma selecionada de Staphylococcus spp., por exemplo Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis; Enterococcus spp., por exemplo Enterococcus faecalis; Klebsiella spp., por exemplo Klebsiella pneumoniae; Acinetobacter spp., por exemplo Acinetobacter baumannii; Pseudomonas spp., por exemplo Pseudomonas aeruginosa; Enterobacter spp.; Streptococcus pyogenes; Listeria spp.; Pseudomonas spp.; Mycobacterium spp., por exemplo Mycobacterium tuberculosis; Enterobacter spp.; Campylobacter spp.; Salmonella spp.; Streptococcus spp., por exemplo Streptococcus Group A or B, Streptoccocus pneumoniae; Helicobacter spp., por exemplo Helicobacter pylori; Neisseria spp., por exemplo Neisseria gonorrhea, Neisseria meningitidis; Borrelia burgdorferi; Shigella spp., por exemplo Shigella flexneri; Escherichia coli; Haemophilus spp., por exemplo Haemophilus influenzae; Chlamydia spp., por exemplo Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci; Francisella fularensis; Bacillus spp., por exemplo Bacillus anthracis; Clostridia spp., por exemplo Clostridium botulinum; Yersinia spp., por exemplo Yersinia pestis; Treponema spp.; Burkholderia spp.; por exemplo Burkholderia mallei e B pseudomallei, ou a combinação das mesmas.

Também em uma modalidade, as bactérias são selecionadas de Acidothermus cellulyticus, Actinomyces odontolyticus, Alkaliphilus metalliredigens, Alkaliphilus oremlandii, Arthrobacter aurescens, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus clausii, Bacillus halodurans, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus, Bacillus subtilis, Bifidobacterium adolescentis, Bifidiobacterium longum, Caldicellulosiruptor saccharolyticus, Carboxydothermus hydrogenoformans, Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Clostridium botulinum, Clostridium

62 / 93 cellulolyticum, Clostridium difficile, Clostridium kluyveri, Clostridium leptum, Clostridium novyi, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Clostridium thermocellum, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium jeikeium, Corynebacterium urealyticum, Desulfitobacterium hafniense, Desulfotomaculum reducens, Eubacterium ventriosum, Exiguobacterium sibiricum, Finegoldia magna, Geobacillus kaustophilus, Geobacillus thermodenitrificans, Janibacter sp., Kineococcus radiotolerans, Lactobacillus fermentum, Listeria monocytogenes, Listeria innocua, Listeria welshimeri, Moorella thermoacetica, Mycobacterium avium, Mycobacterium bovis, Mycobacterium gilvum, Mycobacterium leprae, Mycobacterium paratuberculosis, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium vanbaalenii, Nocardioides sp., Nocardia farcinica, Oceanobacillus iheyensis, Pelotomaculum the rmopropionicum, Rhodococcus sp., Saccharopolyspora erythraea, coagulase-negative Staphylococcus species, Staphylococcus aureus, Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA), Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus epidermidis resistente à meticilina, (MRSE), Staphylococcus pseudintermedius, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus delphini, Streptococcus agalactiae, Streptococcus gordonii, Streptococcus mitis, Streptococcus oralis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus sanguinis, Streptococcus suis, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Thermoanaerobacter ethanolicus, Thermoanaerobacter tengcongensis, ou a combinação das mesmas.

[00180] Em uma modalidade, a formação de biofilme é sobre uma superfície de um dispositivo. Em uma modalidade, o dispositivo é um dispositivo médico. Em uma modalidade, a formação de biofilme é sobre uma superfície de ou em um tecido de um indivíduo. Em uma modalidade, a formação de biofilme é sobre uma pele, olho, membrana mucosa, superfície da cavidade, etc.

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[00181] Consequentemente, a presente invenção fornece o uso de uma composição compreendendo um anticorpo antiamiloide da invenção para tratar uma infecção microbiana, ou para descolonizar um organismo microbiano, ou para destruir ou romper ou inibir ou reduzir a formação de biofilme de um organismo microbiano. Em uma modalidade, o uso é para descolonizar um organismo microbiano, ou para romper ou inibir ou reduzir a formação de biofilme na superfície de um dispositivo médico.

[00182] O regime de administração pode afetar o que constitui uma quantidade eficaz. As formulações terapêuticas podem ser administradas ao paciente antes ou após o início da colonização patogênica, formação de biofilme e/ou infecção em um paciente. Além disso, várias dosagens divididas, bem como dosagens escalonadas, podem ser administradas diariamente ou sequencialmente, ou a dose pode ser infundida continuamente ou pode ser uma injeção em bolus. Além disso, as dosagens das formulações terapêuticas podem ser aumentadas ou diminuídas proporcionalmente, conforme indicado pelas exigências da situação terapêutica ou profilática.

[00183] A administração das composições da presente invenção a um paciente, preferivelmente um mamífero, mais preferivelmente um humano, pode ser realizada usando procedimentos conhecidos, em dosagens e por períodos de tempo eficazes para prevenir, reduzir ou romper a colonização patogênica, formação de biofilme e/ou infecção no paciente. Uma quantidade eficaz do composto terapêutico necessária para atingir um efeito terapêutico pode variar de acordo com fatores tais como a atividade do composto particular utilizado; o tempo de administração; a taxa de excreção do composto; a duração do tratamento; outros fármacos, compostos ou materiais usados em combinação com o composto; o estado da doença ou distúrbio, idade, sexo, peso, condição, saúde geral e histórico médico anterior do paciente a ser tratado e fatores semelhantes bem conhecidos nas técnicas médicas. Os regimes de dosagem podem ser ajustados para fornecer a resposta terapêutica ideal. Por exemplo,

64 / 93 várias doses divididas podem ser administradas diariamente ou a dose pode ser reduzida proporcionalmente conforme indicado pelas exigências da situação terapêutica. Um exemplo não limitativo de um intervalo de dose eficaz para um composto terapêutico da invenção é de cerca de 0,01 e 50 mg/kg de peso corporal/por dia. Um versado na técnica seria capaz de estudar os fatores relevantes e fazer a determinação em relação à quantidade eficaz do composto terapêutico sem experimentação indevida.

[00184] O composto pode ser administrado a um animal tão frequentemente quanto várias vezes ao dia, ou pode ser administrado com menos frequência, como uma vez por dia, uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez por mês, ou ainda menos frequentemente, como uma vez a cada vários meses ou mesmo uma vez por ano ou menos. Entende-se que a quantidade de composto dosado por dia pode ser administrada, em exemplos não limitativos, todos os dias, a cada dois dias, a cada 2 dias, a cada 3 dias, a cada 4 dias ou a cada 5 dias. Por exemplo, com a administração em dias alternados, uma dose de 5 mg por dia pode ser iniciada na segunda-feira com uma primeira dose subsequente de 5 mg por dia administrada na quarta-feira, uma segunda dose subsequente de 5 mg por dia administrada na sexta-feira e assim por diante. A frequência da dose será prontamente aparente para o versado na técnica e dependerá de qualquer número de fatores, tais como, mas não se limitando ao tipo e à gravidade da doença a ser tratada, ao tipo e à idade do animal, etc.

[00185] Os níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas desta invenção podem ser variados de modo a obter uma quantidade do ingrediente ativo que seja eficaz para atingir a resposta terapêutica desejada para um determinado paciente, composição e modo de administração, sem ser tóxico para o paciente.

[00186] Um médico ou veterinário com habilidade na técnica pode determinar e prescrever prontamente a quantidade eficaz da composição

65 / 93 farmacêutica necessária. Por exemplo, o médico ou o veterinário poderia iniciar doses dos compostos da invenção utilizado na composição farmacêutica em níveis inferiores aos necessários para alcançar o efeito terapêutico desejado e aumentar gradualmente a dosagem até que o efeito desejado seja alcançado.

[00187] Em modalidades particulares, é especialmente vantajoso formular o composto na forma unitária de dosagem para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. A forma unitária de dosagem tal como aqui usada refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para os pacientes a serem tratados; cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de composto terapêutico calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veículo farmacêutico necessário. As formas unitárias de dosagem da invenção são ditadas por e diretamente dependentes (a) das características únicas do composto terapêutico e do efeito terapêutico particular a ser alcançado, e (b) das limitações inerentes à técnica de composição/formulação de tal composto terapêutico para o tratamento de distúrbios de controle de hálito em um paciente.

[00188] Em uma modalidade, as composições da invenção são formuladas usando um ou mais excipientes ou carreadores farmaceuticamente aceitáveis. Em uma modalidade, as composições farmacêuticas da invenção compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da invenção e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[00189] O carreador pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol e polietilenoglicol líquido, e similares), óleos vegetais e misturas adequadas dos mesmos. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. A prevenção da ação de microrganismos pode ser conseguida por vários agentes

66 / 93 antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal e similares. Em algumas modalidades, é útil incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, cloreto de sódio, ou poliálcoois tais como manitol e sorbitol na composição. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser alcançada pela inclusão na composição de um agente que retarda a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio ou gelatina. Em uma modalidade, o carreador farmaceuticamente aceitável é DMSO, isolado ou em combinação com outros carreadores.

[00190] A quantidade ou dose terapeuticamente eficaz de um composto da presente invenção depende da idade, sexo e peso do paciente, da condição médica atual do paciente e da gravidade da doença ou infecção no paciente a ser tratado. O versado na técnica é capaz de determinar as doses apropriadas dependendo destes e de outros fatores.

[00191] A dose pode ser administrada em uma dose única ou em doses múltiplas, por exemplo de 1 a 4 ou mais vezes por dia. Quando múltiplas dosagens são usadas, a quantidade de cada dosagem pode ser a mesma ou diferente. Por exemplo, uma dose de 1 mg por dia pode ser administrada como duas doses de 0,5 mg, com cerca de um intervalo de 12 horas entre as doses.

[00192] As doses da composição da invenção para administração podem estar no intervalo de cerca de 1 µg a cerca de 10.000 mg, de cerca de 20 µg a cerca de 9,500 mg, de cerca de 40 µg a cerca de 9.000 mg, de cerca de 75 µg a cerca de 8,500 mg, de cerca de 150 µg a cerca de 7,500 mg, de cerca de 200 µg a cerca de 7.000 mg, de cerca de 3050 µg a cerca de 6.000 mg, de cerca de 500 µg a cerca de 5.000 mg, de cerca de 750 µg a cerca de 4.000 mg, de cerca de 1 mg a cerca de 3.000 mg, de cerca de 10 mg a cerca de 2,500 mg, de cerca de 20 mg a cerca de 2.000 mg, de cerca de 25 mg a cerca de 1,500 mg, de cerca de 30 mg a cerca de 1.000 mg, de cerca de 40 mg a cerca de 900 mg, de cerca de 50 mg a cerca de 800 mg, de cerca de 60 mg a cerca de 750 mg, de cerca de 70 mg a cerca de 600 mg, de cerca de 80 mg a cerca de 500 mg, e todo e

67 / 93 qualquer incremento total ou parcial entre os mesmos.

[00193] Em algumas modalidades, a dose de uma composição da invenção é de cerca de 1 mg a cerca de 2.500 mg.Em algumas modalidades, uma dose de uma composição da invenção usada nas composições aqui descritas é menos de cerca de 10.000 mg, ou menos de cerca de 8.000 mg, ou menos de cerca de 6.000 mg, ou menos de cerca de 5.000 mg, ou menos de cerca de 3.000 mg, ou menos de cerca de 2.000 mg, ou menos de cerca de 1.000 mg, ou menos de cerca de 500 mg, ou menos de cerca de 200 mg, ou menos de cerca de 50 mg. De forma similar, em algumas modalidades, a dosagem de uma segunda composição conforme descrita em outro lugar neste documento é menos de cerca de 1.000 mg, ou menos de cerca de 800 mg, ou menos de cerca de 600 mg, ou menos de cerca de 500 mg, ou menos de cerca de 400 mg, ou menos de cerca de 300 mg, ou menos de cerca de 200 mg, ou menos de cerca de 100 mg, ou menos de cerca de 50 mg, ou menos de cerca de 40 mg, ou menos de cerca de 30 mg, ou menos de cerca de 25 mg, ou menos de cerca de 20 mg, ou menos de cerca de 15 mg, ou menos de cerca de 10 mg, ou menos de cerca de 5 mg, ou menos de cerca de 2 mg, ou menos de cerca de 1 mg, ou menos de cerca de 0,5 mg, e todo e qualquer incremento total ou parcial.

[00194] As composições para uso no método da invenção podem ser formuladas em forma de dosagem unitária. A forma de dosagem unitária refere- se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagem unitária para o indivíduo em tratamento, cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de material ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado, opcionalmente em associação com um carreador farmacêutico necessário. A forma de dosagem unitária pode ser para uma única dose diária ou uma de múltiplas doses diárias (por exemplo, cerca de 1 a 4 ou mais vezes por dia). Quando múltiplas doses diárias são usadas, a forma de dosagem unitária pode ser a mesma ou diferente para cada dose.

[00195] Em uma modalidade, as composições da invenção são

68 / 93 administradas ao paciente de cerca de uma a cerca de cinco vezes por dia ou mais. Em várias modalidades, as composições da invenção são administradas ao paciente, 1 a 7 vezes por dia, 1 a 7 vezes a cada dois dias, 1 a 7 vezes a cada 3 dias, 1 a 7 vezes a cada semana, 1 a 7 vezes a cada duas semanas e 1 a 7 vezes por mês. É prontamente aparente para um versado na técnica que a frequência de administração das várias composições de combinação da invenção irá variar de indivíduo para indivíduo, dependendo de muitos fatores, incluindo, mas não se limitando a idade, doença ou distúrbio a ser tratado, a gravidade da doença ou distúrbio a ser tratado, sexo, saúde geral e outros fatores. Assim, a invenção não deve ser interpretada como limitada a qualquer regime de dosagem particular e a dosagem e composição precisas a serem administradas a qualquer paciente são determinadas pelo profissional médico levando em consideração todos os outros fatores sobre o paciente.

[00196] No caso em que o estado do paciente melhora, a critério do médico, a administração do inibidor da invenção é opcionalmente dada continuamente; alternativamente, a dose de fármaco a ser administrada é temporariamente reduzida ou temporariamente suspensa por um certo período de tempo (isto é, “folga do fármaco”). A duração da folga do fármaco opcionalmente varia entre 2 dias e 1 ano, incluindo apenas a título de exemplo, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 10 dias, 12 dias, 15 dias, 20 dias, 28 dias, 35 dias, 50 dias, 70 dias, 100 dias, 120 dias, 150 dias, 180 dias, 200 dias, 250 dias, 280 dias, 300 dias, 320 dias, 350 dias ou 365 dias. A redução da dose durante uma folga do fármaco inclui de 10% a 100%, incluindo, apenas a título de exemplo, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100%.

[00197] Uma vez que a melhora da condição do paciente ocorreu, uma dose de manutenção é administrada se necessário. Subsequentemente, a dosagem ou a frequência de administração, ou ambas, podem ser reduzidas a um nível em que a doença melhorada seja retida. Em algumas modalidades, um

69 / 93 paciente pode requerer tratamento intermitente a longo prazo ou mediante qualquer recorrência da doença ou distúrbio.

[00198] A toxicidade e a eficácia terapêutica de tais regimes terapêuticos são determinadas opcionalmente em culturas de células ou animais experimentais, incluindo, mas não se limitando à determinação da LD50 (a dose letal para 50% da população) e da ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população). A razão da dose entre os efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico, que é expresso como a razão entre a LD50 e a ED50. Os dados obtidos a partir de ensaios de cultura de células e estudos em animais são opcionalmente usados na formulação de um intervalo de dosagem para uso em seres humanos. A dosagem de tais composições encontra-se preferivelmente dentro de um intervalo de concentrações circulantes que incluem a ED50 com toxicidade mínima. A dosagem opcionalmente varia dentro desse intervalo dependendo da forma de dosagem utilizada e da via de administração utilizada.

[00199] Em uma modalidade, a presente invenção é direcionada a uma composição farmacêutica acondicionada que compreende um recipiente contendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição da invenção, isolada ou em combinação com um segundo agente farmacêutico; e instruções para usar a composição para tratar ou prevenir uma doença ou infecção em um paciente.

[00200] As formulações podem ser utilizadas em misturas com excipientes convencionais, isto é, substâncias carreadoras orgânicas ou inorgânicas farmaceuticamente aceitáveis adequadas para administração oral, parenteral, nasal, intravenosa, subcutânea, enteral ou qualquer outro modo de administração adequado, conhecido na técnica. As preparações farmacêuticas podem ser esterilizadas e, se desejado, misturadas com agentes auxiliares, por exemplo, lubrificantes, conservantes, estabilizantes, agentes umectantes, emulsificantes, sais para influenciar tampões de pressão osmótica, corantes, aromatizantes e/ou substâncias aromáticas e similares. Elas também podem ser

70 / 93 combinadas, quando desejado, com outros agentes ativos, por exemplo, outros agentes analgésicos.

[00201] As vias de administração de qualquer uma das composições da invenção incluem oral, nasal, retal, intravaginal, parenteral, bucal, sublingual ou tópica. As composições para uso na invenção podem ser formuladas para administração por qualquer via adequada, como por via oral ou parenteral, por exemplo, transdérmica, transmucosa (por exemplo, sublingual, lingual, (trans)bucal, (trans)uretral, vaginal (por exemplo, trans- e perivaginalmente), (intra)nasal e (trans)retal), intravesical, intrapulmonar, intraduodenal, intragástrico, intratecal, subcutânea, intramuscular, intradérmica, intra-arterial, intravenosa, intrabrônquica, inalação e administração tópica.

[00202] As composições e formas de dosagem adequadas incluem, por exemplo, comprimidos, cápsulas, comprimidos oblongos, pílulas, cápsulas de gel, trociscos, dispersões, suspensões, soluções, xaropes, grânulos, esferas, adesivos transdérmicos, géis, pós, glóbulos, magmas, pastilhas, cremes, pastas, emplastros, loções, discos, supositórios, sprays líquidos para administração nasal ou oral, pó seco ou formulações em aerossol para inalação, composições e formulações para administração intravesical e similares. Deve ser entendido que as formulações e composições que seriam úteis na presente invenção não estão limitadas às formulações e composições particulares que são aqui descritas. Vias de administração

[00203] As vias de administração de qualquer uma das composições da invenção incluem administração oral, retal, transdérmica, transmucosa (por exemplo, sublingual, lingual, (trans)bucal, (trans)uretral, vaginal (por exemplo, trans- e perivaginalmente), (trans)retal, intravesical e tópica.

[00204] Um obstáculo para a administração tópica de produtos farmacêuticos é a camada do estrato córneo da epiderme. O estrato córneo é uma camada altamente resistente composta por proteínas, colesterol,

71 / 93 esfingolipídios, ácidos graxos livres e vários outros lipídios e inclui células cornificadas e vivas. Um dos fatores que limitam a taxa de penetração (fluxo) de uma composição através do estrato córneo é a quantidade da substância ativa que pode ser carregada ou aplicada na superfície da pele. Quanto maior a quantidade de substância ativa aplicada por unidade de área da pele, maior será o gradiente de concentração entre a superfície da pele e as camadas inferiores da pele e, por sua vez, maior será a força de difusão da substância ativa através da pele. Portanto, uma formulação contendo uma concentração maior da substância ativa tem mais probabilidade de resultar na penetração da substância ativa através da pele, e mais dela, e a uma taxa mais consistente, do que uma formulação com uma concentração menor, todas as outras coisas sendo iguais.

[00205] As formulações adequadas para administração tópica incluem, mas não estão limitadas a preparações líquidas ou semilíquidas, como linimentos, géis, loções, emulsões óleo-em-água ou água-em-óleo, como cremes, pomadas ou pastas e soluções ou suspensões. As formulações para administração tópica podem, por exemplo, compreender de cerca de 1% a cerca de 10% (p/v) de ingrediente ativo em um solvente, embora a concentração do ingrediente ativo possa ser tão alta quanto o limite de solubilidade do ingrediente ativo no solvente. As formulações para administração tópica podem compreender adicionalmente um ou mais dos ingredientes adicionais aqui descritos.

[00206] Podem ser usados intensificadores de permeação. Esses materiais aumentam a taxa de penetração dos fármacos na pele. Intensificadores típicos na técnica incluem etanol, monolaurato de glicerol, PGML (monolaurato de polietilenoglicol), dimetilsulfóxido (DMSO) e similares. Outros intensificadores incluem ácido oleico, álcool oleílico, etoxidiglicol, laurocapram, ácidos alcanocarboxílicos, dimetilsulfóxido, lipídeos polares ou N-metil-2-pirrolidona.

[00207] Um veículo aceitável para dispensação tópica de algumas das

72 / 93 composições da invenção pode conter lipossomas. A composição dos lipossomas e seu uso são conhecidos na técnica (por exemplo, ver Constanza, Patente U.S. nº 6.323.219).

[00208] Em modalidades alternativas, a composição farmacêutica topicamente ativa pode ser opcionalmente combinada com outros ingredientes, tais como adjuvantes, antioxidantes, agentes quelantes, tensoativos, agentes espumantes, agentes umectantes, agentes emulsificantes, viscosificantes, agentes tamponantes, conservantes e similares. Em uma outra modalidade, um intensificador de permeação ou penetração é incluído na composição e é eficaz para melhorar a penetração percutânea do ingrediente ativo no e através do estrato córneo em relação a uma composição sem o intensificador de permeação. Vários intensificadores de permeação, incluindo ácido oleico, álcool oleílico, etoxidiglicol, laurocapram, ácidos alcanocarboxílicos, dimetilsulfóxido, lipídeos polares ou N-metil-2-pirrolidona, são conhecidos dos versados na técnica. Em um outro aspecto, a composição pode compreender adicionalmente um agente hidrotrópico, que funciona para aumentar o distúrbio na estrutura do estrato córneo e, assim, permite um transporte aumentado através do estrato córneo. Vários agentes hidrotrópicos, tais como álcool isopropílico, propilenoglicol ou xilenossulfonato de sódio, são conhecidos pelos versados na técnica.

[00209] A composição farmacêutica topicamente ativa deve ser aplicada em uma quantidade eficaz para afetar as alterações desejadas. Como usado aqui, “quantidade eficaz” deve significar uma quantidade suficiente para cobrir a região da superfície da pele onde uma mudança é desejada. Uma composição ativa deve estar presente na quantidade de cerca de 0,0001% a cerca de 15% em peso do volume da composição. Mais preferivelmente, deve estar presente em uma quantidade de cerca de 0,0005% a cerca de 5% da composição; mais preferivelmente, deve estar presente em uma quantidade de cerca de 0,001% a cerca de 1% da composição. Essas composições podem ser derivadas

73 / 93 sinteticamente ou naturalmente.

[00210] Para administração oral, as formas adequadas incluem comprimidos, drágeas, líquidos, gotas, supositórios ou cápsulas, comprimidos oblongos e cápsulas de gel. As composições formuladas para uso oral podem ser preparadas de acordo com qualquer método conhecido na técnica e tais composições podem conter um ou mais agentes selecionados do grupo que consiste em excipientes inertes, não tóxicos farmaceuticamente que são adequados para a fabricação de comprimidos. Esses excipientes incluem, por exemplo, um diluente inerte como a lactose; agentes de granulação e desintegração tais como amido de milho; agentes de ligação, tais como amido; e agentes lubrificantes, tais como estearato de magnésio. Os comprimidos podem ser não revestidos ou podem ser revestidos por técnicas conhecidas para fins de elegância ou para retardar a liberação dos ingredientes ativos. As formulações para uso oral também podem ser apresentadas como cápsulas de gelatina dura em que o ingrediente ativo é misturado com um diluente inerte.

[00211] Para administração oral, as composições da invenção podem estar na forma de comprimidos ou cápsulas preparadas por meios convencionais com excipientes farmaceuticamente aceitáveis, tais como agentes de ligação (por exemplo, polivinilpirrolidona, hidroxipropilcelulose ou hidroxipropilmetilcelulose); cargas (por exemplo, amido de milho, lactose, celulose microcristalina ou fosfato de cálcio); lubrificantes (por exemplo, estearato de magnésio, talco ou sílica); desintegrantes (por exemplo, glicolato de amido sódico); ou agentes umectantes (por exemplo, lauril sulfato de sódio). Se desejado, os comprimidos podem ser revestidos usando métodos adequados e materiais de revestimento, tais como sistemas de revestimento de película OPADRY™ disponíveis em Colorcon, West Point, Pa. (por exemplo, tipo OPADRY™ OY, tipo OYC, tipo orgânico entérico OY-P, tipo aquoso entérico OY-A, tipo OY-PM e branco OPADRY™, 32K18400). A preparação líquida para administração oral pode estar na forma de soluções, xaropes ou

74 / 93 suspensões. As preparações líquidas podem ser preparadas por meios convencionais com aditivos farmaceuticamente aceitáveis, tais como agentes de suspensão (por exemplo, xarope de sorbitol, metilcelulose ou gorduras comestíveis hidrogenadas); agente emulsificante (por exemplo, lecitina ou acácia); veículos não aquosos (por exemplo, óleo de amêndoa, ésteres oleosos ou álcool etílico); e conservantes (por exemplo, metil ou propil p- hidroxibenzoatos ou ácido sórbico).

[00212] As técnicas de granulação são bem conhecidas na técnica farmacêutica para modificar pós de partida ou outros materiais particulados de um ingrediente ativo. Os pós são tipicamente misturados com um material aglutinante em aglomerados ou grânulos de fluxo livre permanentes maiores, chamados de “granulação”. Por exemplo, os processos de granulação a “úmido” usando solvente são geralmente distinguidos pelo fato de que os pós são combinados com um material aglutinante e umedecidos com água ou um solvente orgânico sob condições que resultam na formação de uma massa granulada úmida a partir da qual o solvente deve então ser evaporado.

[00213] A granulação por fusão envolve o uso de materiais que são sólidos ou semissólidos à temperatura ambiente (ou seja, com uma faixa de ponto de fusão ou amolecimento relativamente baixo) para promover a granulação de pó ou outros materiais, essencialmente na ausência de água adicionada ou outros solventes líquidos. Os sólidos de baixo ponto de fusão, quando aquecidos a uma temperatura na faixa do ponto de fusão, se liquefazem para atuar como um aglutinante ou meio de granulação. O sólido liquefeito espalha-se sobre a superfície dos materiais em pó com os quais está em contato e, ao resfriar, forma uma massa sólida granulada na qual os materiais iniciais são unidos. A granulação por fusão resultante pode então ser fornecida a uma prensa de comprimidos ou ser encapsulada para preparar a forma de dosagem oral. A granulação por fusão melhora a taxa de dissolução e a biodisponibilidade de um ativo (isto é, fármaco), formando uma dispersão

75 / 93 sólida ou solução sólida.

[00214] A Patente U.S. nº 5.169.645 descreve grânulos contendo cera compressíveis diretamente com propriedades de fluxo melhoradas. Os grânulos são obtidos quando as ceras são misturadas no fundido com certos aditivos que melhoram o fluxo, seguido por resfriamento e granulação da mistura. Em certas modalidades, apenas a própria cera derrete na combinação de fusão da(s) cera(s) e aditivo(s) e, em outros casos, a(s) cera(s) e aditivo(s) derretem.

[00215] A presente invenção também inclui um comprimido de múltiplas camadas que compreende uma camada que fornece a liberação retardada de uma ou mais composições da invenção e uma camada adicional que fornece a liberação imediata de um medicamento para o tratamento de doenças ou distúrbios relacionados ao receptor de proteína G. Usando uma mistura de polímero sensível ao pH/cera, pode ser obtida uma composição insolúvel gástrica na qual o ingrediente ativo é captado, garantindo sua liberação retardada.

[00216] Para administração parenteral, as composições da invenção podem ser formuladas para injeção ou infusão, por exemplo, injeção ou infusão intravenosa, intramuscular ou subcutânea, ou para administração em uma dose em bolus e/ou infusão contínua. Podem ser usadas suspensões, soluções ou emulsões em um veículo oleoso ou aquoso, contendo opcionalmente outros agentes de formulação, tais como agentes de suspensão, estabilização e/ou dispersão.

[00217] As formas de dosagem adicionais desta invenção incluem as formas de dosagem como descritas nas Patentes U.S. nº 6.340.475; 6.488.962;

6.451.808; 5.972.389; 5.582.837; e 5.007.790. As formas de dosagem adicionais desta invenção também incluem as formas de dosagem como descritas nos Pedidos de Patente U.S. nº20030147952; 20030104062; 20030104053; 20030044466; 20030039688; e 20020051820. As formas de dosagem adicionais desta invenção também incluem as formas de dosagem

76 / 93 descritas nos Pedidos PCT nº WO 03/35041; WO 03/35040; WO 03/35029; WO 03/35177; WO 03/35039; WO 02/96404; WO 02/32416; WO 01/97783; WO 01/56544; WO 01/32217; WO 98/55107; WO 98/11879; WO 97/47285; WO 93/18755; e WO 90/11757. Formulações de liberação controlada e sistemas de dispensação de fármaco

[00218] Em uma modalidade, as formulações da presente invenção podem ser, mas não estão limitadas a formulações de curto prazo, de deslocamento rápido, bem como controladas, por exemplo, liberação prolongada, liberação retardada e liberação pulsátil.

[00219] O termo liberação prolongada refere-se a uma formulação de fármaco que fornece a liberação gradual de um fármaco ao longo de um período de tempo estendido e que pode, embora não necessariamente, resultar em níveis sanguíneos substancialmente constantes de um fármaco ao longo de um período de tempo estendido. O período de tempo pode ser tão longo quanto um dia, uma semana ou um mês ou mais e deve ser uma liberação que seja mais longa do que a mesma quantidade de agente administrado em bolus. O termo liberação retardada é usado aqui no seu sentido convencional para se referir a uma formulação de fármaco que fornece uma liberação inicial do fármaco após algum atraso após a administração do fármaco e que, embora não necessariamente, inclui um atraso de cerca de 10 minutos até cerca de 12 horas.

[00220] Para liberação prolongada, as composições podem ser formuladas com um polímero adequado ou material hidrofóbico que fornece propriedades de liberação prolongada às composições. Como tal, as composições para usar o método da invenção podem ser administradas na forma de micropartículas, por exemplo, por injeção ou na forma de bolachas ou discos por implantação.

[00221] Em uma modalidade da invenção, as composições da invenção são administradas a um paciente, isoladas ou em combinação com outro agente farmacêutico, usando uma formulação de liberação prolongada.

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[00222] O termo liberação pulsátil refere-se a uma formulação de fármaco que fornece a liberação do fármaco de forma a produzir perfis de plasma pulsado do fármaco após a administração do fármaco.

[00223] O termo liberação imediata refere-se a uma formulação de fármaco que fornece a liberação do fármaco imediatamente após a administração do fármaco.

[00224] Como usado aqui, curto prazo refere-se a qualquer período de tempo até e incluindo cerca de 8 horas, cerca de 7 horas, cerca de 6 horas, cerca de 5 horas, cerca de 4 horas, cerca de 3 horas, cerca de 2 horas, cerca de 1 hora, cerca de 40 minutos, cerca de 20 minutos ou cerca de 10 minutos e todo e qualquer incremento total ou parcial após a administração do fármaco após a administração do fármaco.

[00225] Como usado aqui, deslocamento rápido se refere a qualquer período de tempo até e incluindo cerca de 8 horas, cerca de 7 horas, cerca de 6 horas, cerca de 5 horas, cerca de 4 horas, cerca de 3 horas, cerca de 2 horas, cerca de 1 hora, cerca de 40 minutos, cerca de 20 minutos ou cerca de 10 minutos, e todo e qualquer incremento total ou parcial após a administração do fármaco.

[00226] Os versados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de determinar usando apenas uma experimentação de rotina, inúmeros equivalentes a procedimentos, modalidades, reivindicações e exemplos específicos aqui descritos. Tais equivalentes foram considerados como estando dentro do escopo desta invenção e cobertos pelas reivindicações anexas. Por exemplo, deve ser entendido que as modificações nas condições de reação, incluindo, mas não se limitando a tempos de reação, tamanho/volume da reação e reagentes experimentais, tais como solventes, catalisadores, pressões, condições atmosféricas, por exemplo, atmosfera de nitrogênio e agentes redutores/oxidantes, com alternativas reconhecidas na técnica e usando não

78 / 93 mais do que experimentação de rotina, estão dentro do escopo do presente pedido.

[00227] Deve ser entendido que sempre que os valores e intervalos são fornecidos neste documento, todos os valores e intervalos abrangidos por esses valores e intervalos devem ser abrangidos pelo escopo da presente invenção. Além disso, todos os valores que estão dentro dessas faixas, bem como os limites superior ou inferior de um intervalo de valores, também são contemplados pelo presente pedido. Terapia de combinação

[00228] O anticorpo antiamiloide da presente invenção pode ser administrado isolado ou em conjunto com outra terapia. Por exemplo, a terapia de combinação da presente invenção pode ser usada em conjunto com um desinfetante, antisséptico, antibiótico ou biocida em uma superfície, como dispositivos médicos e dispositivos internos, incluindo stents, cateteres, tubos de diálise peritoneal, dispositivos de drenagem, próteses articulares, implantes dentários e similares.

[00229] Em uma modalidade, a presente invenção fornece uma terapia de combinação sinérgica compreendendo um anticorpo antiamiloide da invenção e um tratamento com antibiótico que pode ser administrado topicamente para o tratamento de uma superfície ou infecção colonizada por micróbios.

[00230] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método de tratamento de uma infecção microbiana em um indivíduo, compreendendo a administração ao indivíduo separadamente, simultaneamente ou sequencialmente, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo antiamiloide da invenção e um tratamento antibiótico. Em uma modalidade, o método compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição que compreende um anticorpo antiamiloide da invenção e um tratamento com antibiótico aqui descrito. Em

79 / 93 uma modalidade, o método compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma formulação tópica compreendendo um anticorpo antiamiloide da invenção e um tratamento antibiótico aqui descrito e um ou mais carreadores ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis, em que a formulação tópica e os carreadores ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis são definidos aqui ao longo do relatório descritivo. Em uma modalidade, a infecção é uma infecção tópica. A infecção tópica é uma infecção em uma superfície ou região localizada de um indivíduo incluindo pele, olho, uma membrana mucosa, uma superfície de cavidade, etc. Em uma modalidade, a infecção tópica é infecção da pele. Em uma modalidade, a infecção tópica é sob a forma de ferida, úlcera e lesão. Em uma modalidade, o organismo microbiano é uma bactéria.

[00231] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método de descolonização de um organismo microbiana contactar o organismo microbiano separadamente, simultaneamente ou sequencialmente com um anticorpo antiamiloide da invenção e um tratamento antibiótico. Em uma modalidade, o método compreende contactar o organismo microbiano com uma composição que compreende um anticorpo antiamiloide da invenção e um tratamento com antibiótico aqui descrito. Em uma modalidade, o método compreende contactar o organismo microbiano com uma formulação tópica compreendendo um anticorpo antiamiloide da invenção e um tratamento antibiótico aqui descrito e um ou mais carreadores ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis, em que a formulação tópica e os carreadores ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis são definidos aqui ao longo do relatório descritivo. De acordo com qualquer um dos métodos descritos neste documento, o organismo microbiano é uma bactéria.

[00232] Em uma modalidade, a formação de biofilme é sobre uma superfície de um dispositivo. Em uma modalidade, o dispositivo é implantado com cateteres, válvulas cardíacas protéticas, marca-passos cardíacos, lentes de

80 / 93 contato, derivações de líquido cefalorraquidiano, substituições de articulações ou linhas intravasculares. Em uma modalidade, a formação de biofilme é sobre uma superfície de ou em um tecido de um indivíduo. Em uma modalidade, a formação de biofilme é sobre uma pele, olho, membrana mucosa, superfície da cavidade, etc.

[00233] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para destruiu ou romper ou reduzir a formação de biofilme de um organismo microbiano compreendendo contactar o organismo microbiano separadamente, simultaneamente ou sequencialmente com uma composição compreendendo um anticorpo antiamiloide da invenção e uma composição compreendendo um antibiótico. Em uma modalidade, o método compreende contactar o organismo microbiano com uma composição que compreende um anticorpo antiamiloide da invenção e um antibiótico aqui descrito. Em uma modalidade, o método compreende contactar o organismo microbiano com uma formulação tópica compreendendo um anticorpo antiamiloide da invenção e um tratamento antibiótico aqui descrito e um ou mais carreadores ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis, em que os carreadores ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis são definidos aqui ao longo do relatório descritivo. Em uma modalidade, o organismo microbiano é uma bactéria.

[00234] Estes métodos aqui descritos não são de forma alguma inclusivos, e outros métodos para se adequar à aplicação específica serão evidentes para o versado na técnica. Além disso, a quantidade eficaz das composições pode ser adicionalmente aproximada por analogia com composições conhecidas por exercerem o efeito desejado.

EXEMPLOS EXPERIMENTAIS

[00235] A invenção é adicionalmente descrita em detalhe por referência aos seguintes exemplos experimentais. Esses exemplos são providos apenas para fins ilustrativos e não devem ser limitados, a menos que especificado de outra forma. Assim, a invenção não deve de modo algum ser interpretada como

81 / 93 estando limitada aos exemplos seguintes, mas deve ser interpretada de modo a abranger todas e quaisquer variações que se tornam evidentes como resultado dos ensinamentos aqui providos. Exemplo 1: Anticorpos monoclonais direcionados por antiamiloide reduzem a formação de biofilme de Salmonella Typhimurium ao alvejar o curli amiloide

[00236] Amiloides de origem procariótica e eucariótica não compartilham estrutura de sequência primária, no entanto amiloides de ambas as linhagens compartilham uma estrutura de folha beta conservada comum (Rapsinski et al., 2013, J Biol Chem, 17;288(20):14178-88). Além disso, as amiloides bacterianas e hospedeiras se ligam e ativam TLR2. Semelhante à ligação de curli a TLR2 em células imunes inatas (Tükel et al., 2010, Cell Microbiol, 12(10):1495-505), a ligação de beta amiloide associada à doença de Alzheimer (Liu et al., 2012, J Immunol, 188(3):1098-107; Udan et al., 2008, J Neurochem, 104(2):524-33) e amiloide sérica A na aterosclerose (Seidl et al., 2017, PLoS One, 12(3):e0171711). Foi testada a capacidade dos anticorpos monoclonais de se ligarem e inibirem a fibrilização de curli amiloide bacteriano implicado na formação de biofilme. Usando uma abordagem multidisciplinar, vários anticorpos monoclonais humanos foram identificados que apresentam reatividade contra amiloide-β que também apresenta propriedades anti-curli dentro do contexto de biofilmes de S. Typhimurium. A incubação de biofilmes de S. Typhimurium (STM) com o mAb alterou a arquitetura do biofilme, desestabilizou o biofilme e, por fim, reduziu a biomassa. As alterações resultantes na arquitetura e estabilidade do biofilme tornaram o biofilme mais sensível ao tratamento com antibióticos, DNase e captação de bactérias por macrófagos em comparação aos biofilmes que não receberam tratamento com mAb. No geral, um novo método terapêutico foi identificado pelo qual o alvejamento de curli dentro do biofilme de biofilmes de S. Typhimurium por meio do uso de mAbs antiamiloide resulta em alterações na arquitetura do biofilme, estabilidade e resultado geral na redução do biofilme.

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[00237] Os métodos experimentais e os resultados são agora descritos. O anticorpo monoclonal ALZ.3H3 rompe a arquitetura e integridade do biofilme de S. Typhimurium

[00238] Os biofilmes foram estabelecidos na presença de 0,5 mg/ml de ALZ.3H3 por 72 horas a 28°C. Após o crescimento, os biofilmes foram corados com Syto9 e fotografados usando CSLM. A arquitetura tridimensional foi examinada criando plotagens de superfície 3D usando ImageJ. A incubação do anticorpo monoclonal ALZ.3H3 alterou a arquitetura do biofilme formando uma topografia de biofilme disperso que se expandiu acima da espessura média (20 µM) de um biofilme de S. Typhimurium de tipo selvagem que apresentou uma arquitetura densa e compacta (Figura 1A). Essa matriz solta também foi observada no tratamento anti-csg, enquanto os biofilmes tratados com o controle A6 permaneceram intactos e sem ruptura (Figura 1A). Para quantificar o biofilme disperso criado pelo tratamento com ALZ.3H3, através do uso de ImageJ, todas as partículas acima da espessura de um S. Typhimurium de tipo selvagem (20 µM) foram usadas para definir o valor de limite, e esses parâmetros de limite foram aplicados a tratamentos (Figura 1B). Após a enumeração das partículas, houve um aumento significativo no número de partículas após o tratamento com ALZ.3H3 (Figura 1C). Para esse efeito, ao plaquear sobrenadantes recuperados dos biofilmes, significativamente mais bactérias foram recuperadas do sobrenadante do biofilme de ALZ.3H3. A bactéria recuperada dos sobrenadantes é representativa da matriz de biofilme dispersa solta que é facilmente dissociada da biomassa. No geral, esses dados sugerem que a incubação com ALZ.3H3 alterou a estrutura do biofilme, rompendo a estrutura geral da matriz do biofilme. O anticorpo monoclonal ALZ.3H3 altera a integridade do biofilme de biofilmes de S. Typhimurium pré-estabelecidos

[00239] Para determinar se ALZ.3H3 pode reduzir a formação de biofilme de biofilmes pré-estabelecidos de S. Typhimurium, 0,5 mg/ml de

83 / 93 ALZ.3H3 foi adicionado por mais 24 horas a um biofilme pré-estabelecido de 24 horas de S. Typhimurium, ou 0,5 mg/ml de ALZ.3H3 foi adicionado por 24 horas a um biofilme pré-estabelecido de 48 horas. Esses biofilmes foram então comparados, respectivamente, a um biofilme de S. Typhimurium de 48 e 72 horas que não foi exposto a ALZ.3H3 (Figura 2A). Os biofilmes foram corados com Syto9 e fotografados usando CSML. Os biofilmes não foram lavados extensivamente para determinar o impacto de ALZ.3H3 na arquitetura do biofilme. Em comparação com um biofilme de 48 horas de S. Typhimurium de tipo selvagem, embora ainda se estabelecendo e a matriz do biofilme estivesse incompleta, o biofilme pré-estabelecido de 24 horas que foi exposto a ALZ.3H3 por mais 24 horas começou a apresentar uma matriz mais dispersa em comparação com o biofilme de 48 horas, que era compacta (Figura 2B). Essa tendência continuou quando um biofilme pré-estabelecido de 48 horas foi incubado por mais 24 horas com 0,5 mg/ml de ALZ.3H3, onde a matriz do biofilme estava mais dispersa em comparação com o biofilme de S. Typhimurium totalmente formado de 72 horas que não recebeu tratamento com ALZ.3H3 (Figura 2B). Usando a técnica de limite descrita anteriormente, o número de partículas acima da espessura do S. Typhimurium tipo selvagem foi contado. Mesmo já em 24 horas, a incubação com ALZ.3H3 aumentou o número de partículas acima do S. Typhimurium tipo selvagem, e o número de partículas também aumentou quando um biofilme pré-estabelecido de 48 horas de S. Typhimurium foi incubado com ALZ.3H3 por 24 horas (Figura 2C). Esses dados sugerem que ALZ.3H3 impacta a estrutura de biofilmes pré- estabelecidos de S. Typhimurium tão cedo quanto 24 horas após a adição de ALZ.3H3. Resposta da dosagem de ALZ.3H3 na integridade do biofilme

[00240] Uma curva de dosagem de ensaio de violeta cristal de 3H3 (0,1 ug/ml, 1 ug/ml, 10 ug/ml, 25 ug/ml, 50 ug/ml, 250 ug/ml, 500 ug/ml e não tratado) adicionado durante o crescimento do biofilme de S. Typhimurium, E.

84 / 93 coli MC4100, S. enteritidis e E.coli UTI89 foi realizada e a biomassa determinada na absorbância a 570nm (Figura 3).

[00241] A análise confocal de biofilmes de S. Typhimurium cultivados na presença (10 ug/ml, 25 ug/ml, 50 ug/ml, 250 ug/ml, 500 ug/ml) ou ausência (não tratada) de 3H3 foi realizada. Os biofilmes foram corados com syto9 (coloração de ácido nucleico verde para bactérias) e corante amiloide vermelho do Congo (curli vermelho) e foram fotografados usando Leica TCS confocal a 63x. Reconstruções 3D de biofilme criadas usando o software visualizador 3D ImageJ (Figura 4A). A espessura do biofilme (um) de biofilmes de S. Typhimurium cultivados na presença (10 ug/ml, 25 ug/ml, 50 ug/ml, 250 ug/ml, 500 ug/ml) ou ausência (não tratada) de 3H3 foi medida usando software de microscopia confocal Leica TCS (Figura 4C). ALZ.3H3 reduz a fibrilação do curli.

[00242] A formação de monômeros em fibrilas curli maduras pode ser monitorada por incubação com Tioflavina T (ThT). A fluorescência de ThT aumenta à medida que se liga à fibrila amiloide, permitindo que o processo de formação de amiloide seja medido espectroscopicamente. A formação de fibras amiloides pode ser definida por uma curva sigmoidal de três estágios (Dueholm et al., 2011, Biochemistry, 50(39):8281-90; Wang et al., 2007, J Biol Chem, 282(6):3713-9). No primeiro estágio, as subunidades monoméricas demoram para se autoassociar e a fluorescência ThT é mínima (Naiki et al., 1991, Lab Invest, 65(1):104-10). A reação exponencial aumenta à medida que as sementes monoméricas oligomerizam e continuam a se alongar (Naiki et al., 1991, Lab Invest, 65(1):104-10). Esse processo é marcado por um rápido aumento na fluorescência ThT (Naiki et al., 1991, Lab Invest, 65(1):104-10). Os oligômeros se alongam em fibrilas maduras e picos de fluorescência Tht (Dueholm et al., 2011, Biochemistry, 50(39):8281-90; Wang et al., 2007, J Biol Chem, 282(6):3713-9). Essa reação atinge um patamar uma vez que todos os monômeros tenham sido consumidos e o alongamento da fibrila cessa (Naiki

85 / 93 et al., 1991, Lab Invest, 65(1):104-10). CsgA marcado com histadina (His- CsgA), que irá se autoassociar naturalmente e fibrilizar, foi incubado com 0,5 mg/ml de ALZ.3H3 e a reação de fibrilização foi monitorada usando ThT. Como controles, os peptídeos sintéticos CsgAR4-5 e CsgAR4-5N122A foram incubados com Tht e a reação de fibrilização foi monitorada em paralelo. CsgAR4-5 é a quarta e quinta repetição de CsgA, que demonstrou se autoassociar e formar fibrilas, enquanto CsgAR4-5N122A contém uma única mutação de aminoácido que evita a fibrilização (Tükel et al., 2009, Cell Host Microbe, 6(1):45-53). Após a fibrilização com His-CsgA e ALZ.3H3, foi observada uma redução significativa nas unidades de fluorescência relativas (Figura 5A). Além de determinar as unidades fluorescentes relativas máximas que são representativas da formação de fibrilas, o tempo de latência (t6) pode ser calculado usando a equação t0=t1/2-2te, onde t1/2 é o tempo necessário para atingir a metade da fluorescência máxima intensidade e te é o tempo de alongamento (Naiki et al., 1991, Lab Invest, 65(1):104-10). O tempo de latência pode ser definido como a quantidade de tempo necessária para os monômeros se autoassociarem e começarem a oligomerizar (Naiki et al., 1991, Lab Invest, 65(1):104-10). Em comparação com o tempo de latência calculado para o peptídeo sintético CsgAR4-5, houve um aumento significativo nos tempos de latência necessários para His-CsgA se autoassociar e oligomerizar quando incubado com ALZ.3H3 (Figura 5B). Com base nesses dados, propôs que ALZ.3H3 interage no nível monomérico para prevenir a fibrilização. Ao interagir com o monômero, ALZ.3H3 aumenta o tempo necessário para os monômeros se autoassociarem, evitando a formação de fibrilas. Ensaio de violeta cristal de S. Typhimurium (STM) ou E.coli UTI89

[00243] STM ou UTI89 foram cultivados na ausência ou presença de 3H3 (250 ug/ml, 125 ug/ml, 50 ug/ml, 25 ug/ml, 10 ug/ml, 1 ug/ml), bem como 0,5 mg/ml de controle A6 ou anticorpo anti-Dengue por 72 horas a 26°C em uma placa de 96 poços estéril. O mutante S. Typhimurium curli (csgBA) e o

86 / 93 mutante UTI89 curli (csgBA) também foram cultivados como controles negativos. Resultados mais consistentes com experimentos envolvendo STM e mais variabilidade envolvendo experimentos com UTI89 (Figura 6). O sinergismo entre ALZ.3H3 e o tratamento com antibióticos reduz a formação de biofilme de S. Typhimurium

[00244] Os biofilmes intensificam a recalcitrância das bactérias aos antibióticos (Keren et al., 2004, FEMS Microbiol Lett, 230(1):13-8, Brown et al., 1988, J Antimicrob Chemother, 22(6):777-80, Stewart, 2002, Int J Med Microbiol, 292(2):107-13). Para aumentar a eliminação de biofilmes bacterianos, a estrutura do biofilme foi alterada com a utilização de ALZ.3H3 e, em seguida, o biofilme foi submetido a antibióticos para matar as bactérias dentro do biofilme disperso. Para isso, biofilmes de S. Typhimurium foram estabelecidos na presença ou ausência de 0,5 mg/ml de ALZ.3H3, após o que os biofilmes foram expostos à ampicilina por mais 24 horas. Como a DNase é um componente integral adicional dos biofilmes de S. Typhimurium, os biofilmes incubados com tipo selvagem ou ALZ.3H3 foram expostos ao tratamento com X DNase por mais 24 horas. Os biofilmes foram então corados com Syto9 e visualizados usando CSML. Etapas de lavagem excessivas foram evitadas com o objetivo de examinar a arquitetura dos biofilmes. Como os tratamentos com antibióticos são relativamente ineficazes contra o crescimento do biofilme, nenhuma alteração na aparência geral do biofilme foi observada quando os biofilmes do tipo selvagem foram tratados com ampicilina ou DNase após o estabelecimento do biofilme. No entanto, quando os biofilmes de S. Typhimurium foram incubados na presença de ALZ.3H3 e tratamento com antibiótico, houve uma redução significativa na massa do biofilme para os níveis abaixo da detecção (Figura 7).

[00245] Biofilmes de S. Typhimurium (STM) or E.coli UTI89 foram cultivados na ausência ou presença de 3H3 (250 ug/ml, 125 ug/ml, 50 ug/ml, 25 ug/ml, 10 ug/ml, 1 ug/ml), bem como cultivados com 0,5 mg/ml de anticorpo

87 / 93 controle A6 em cima de lamínulas de vidro esterilizadas por 72 horas a 26°C em uma placa de 24 poços estéril. O mutante S. Typhimurium curli (csgBA) e o mutante UTI89 curli (csgBA) também foram cultivados como controles negativos. Em condições selecionadas, os biofilmes foram incubados por mais 24 horas a 26°C com 30 ug/ml de Ampicilina (Amp). Para determinar o número de unidades formadoras de colônia por biofilme (UFC/biofilme), a lamínula de vidro estéril, que foi usada como uma superfície para o crescimento do biofilme, foi colocada em um tubo cônico estéril de 15 ml que continha 3 ml de PBS estéril. O biofilme foi sonicado por 10 segundos em uma configuração de 4 usando um ThermoFisher Sonic Dismembrator. Experimentos anteriores confirmaram que a sonicação nas configurações mencionadas anteriormente não matou as bactérias. As bactérias foram enumeradas por diluição em série 1:10 em PBS estéril e plaqueamento em placas de ágar. Uma redução de UFC/biofilme foi observada quando STM e UTI89 são cultivados com 3H3, e uma redução adicional em UFC/biofilme foi observada quando Ampicilina foi adicionada por mais 24 horas (embora essa redução possa ser aumentada com tempos de exposição mais longos à Ampicilina) (Figura 8).

[00246] Para investigar a capacidade do ALZ.3H3 de eliminar o crescimento do biofilme em um modelo fisiologicamente relevante, os biofilmes de S. Typhimurium foram cultivados em cateteres de grau médico na presença ou ausência de ALZ.3H3 e o impacto na arquitetura do biofilme associado ao cateter foi investigado. Biofilmes de Salmonella foram cultivados sozinhos ou na presença de anticorpo ALZ3H3 após cateteres i.v. estéreis. As bactérias foram marcadas como verdes usando GFP. O vermelho do Congo foi usado para corar fibrilas amiloides curli. Quando cultivado na presença de 0,5 mg/ml de mAbs ALZ3H3 por 72 horas, o biofilme foi disperso. Não houve coloração significativa com vermelho do Congo, sugerindo a falta de fibras curli no biofilme (Figura 9). Para investigar o efeito da combinação de ALZ3H3 e ampicilina no crescimento do biofilme, os camundongos receberam 1 mg/ml

88 / 93 de Ampicilina na água potável 24 horas antes da inserção do cateter. Os cateteres i.v. estéreis foram incubados por 24 horas com Salmonella typhimurium antes da inserção nos flancos posteriores de camundongos Balb/C. 24 e 28 horas após a inserção do cateter 100 ug de ALZ3H3 foram inseridos percutaneamente no lúmen do cateter. 72 horas após a inserção do cateter, os camundongos foram sacrificados e os cateteres foram removidos. As bactérias foram marcadas como verdes usando GFP. O vermelho do Congo foi usado para corar fibrilas amiloides curli. Cateteres com autofluorescência verde. Biofilmes de Salmonella typhimurium não tratados aderiram intimamente à parede do cateter com curli em toda a biomassa, enquanto biofilmes tratados com ALZ3H3 tinham uma morfologia dispersa com poucos curli. O tratamento combinado com ALZ3H3 e ampicilina reduziu significativamente o crescimento do biofilme no cateter, que apresentou pouca ou nenhuma incorporação de amiloide (Figura 10).

[00247] Os cateteres foram colonizados com biofilmes de S. Typhimurium (STM) e um cateter colonizado foi inserido em cada um dos 15 camundongos C67BL/6 (Coortes: 5 camundongos que receberam cateteres STM apenas, 5 camundongos que receberam cateteres STM e injeções percutâneas de 100 ug de 3H3 e 5 camundongos que receberam cateteres STM, injeções percutâneas de 100 ug de 3H3, e 1 mg/ml de ampicilina (Amp) ad libitum na água potável. (**Ampicilina foi adicionada à água potável 24 horas antes da inserção do cateter). Começando 24 horas após a inserção do cateter, em grupos apropriados 100 ug/ml de 3H3 foi inserido percutaneamente no lúmen dos cateteres a cada 24 horas após a inserção do cateter. Os camundongos foram monitorados diariamente quanto à sobrevivência (Figura 11). Exemplo 2: Desenvolvimento de anticorpos pan-amiloides

[00248] As bactérias formam comunidades multicelulares denominadas biofilmes na natureza e durante infecções para se protegerem contra insultos,

89 / 93 incluindo antimicrobianos e sistema imunológico. A matriz extracelular (ECM) de um biofilme é composta de polissacarídeos, DNA e proteínas, incluindo amiloides. Amiloides são proteínas fibrilares insolúveis de ocorrência natural definidas por uma estrutura secundária de folha beta cruzada. O vermelho do Congo é um corante específico que se liga aos amiloides e pode ser usado para identificar os amiloides bacterianos. As bactérias usam essas proteínas para decorar seus biofilmes. Um dos amiloides bacterianos mais bem estudados é o curli, produzido especificamente por Enterobacteriaceae. Um anticorpo monoclonal humano (mAb) que apresenta atividade de ligação pan-amiloide inibe a formação de biofilmes de E. coli e Salmonella typhimurium in vitro e in vivo.

[00249] Ligantes difusíveis derivados de beta amiloide (ADDLs), também conhecidos como globulômeros, produzidos a partir de Aβ42 (Figura 12). Esses ADDLs foram usados para rastrear mAbs humanos que se ligam a epítopos específicos de amiloide. Os hibridomas foram criados a partir de células B de um paciente com diagnóstico clínico de doença de Alzheimer leve a moderada, e três mAbs recém-clonados (4G1, 4A6 e 2C10) foram comparados com ALZ.3H3 (Figura 13). O Aβ42 monomérico aderente a uma placa ELISA pode adotar uma conformação reconhecida por mAbs específico para epítopos amiloides conformacionais (Levites et al., 2015, J Neurosci, 35(16): 6265-6276).

[00250] A ligação do MAb a conformadores Aβ42 foi medida por ressonância de plasma de superfície (SPR) (Tabela 1). As constantes de afinidade calculadas (KD) foram obtidas usando o software Qdat. Em comparação com o monômero biotinilado de terminal N, todos os mAbs apresentam ligação de afinidade inferior para alguns ou todos os oligômeros ou fibrilas Aβ42. Os dados de ligação de 3H3 são qualitativamente mais similares aos mAbs 4G1 e 6E10. 4A6 e 2C10 ligam preferivelmente fibrilas Aβ. Tabela 1: Ligação de MAb a conformadores Aβ42. Oligômeros

90 / 93 (ADDLs/globulômeros); oligo CTB (ADDLs/globulômeros biotinilados de terminal C); mono CTB (monômeros biotinilados de terminal C); mono NTB (monômeros biotinilados de terminal N). 6E10 (mAb de camundongo para aminoácidos Aβ 1-16; BioLegend, San Diego, CA). Anticorpo Oligômeros Fibrilas Oligo CTB Mono CTB Mono NTB nM nM nM nM nM 3H3 40 2,1 35 3,4 240 4G1 8,8 14 11,4 16 1700 4A6 1300 11 >2000 16 >2000 2C10 >2000 16 >2000 >2000 >2000 6E10 69 56 50 47 158

[00251] mAbs humanos foram testados para SPR para ligação ao peptídeo amiloide de ilhota agregado IAPP e filamentos helicoidais emparelhados com tau (TAU PHF) isolados de homogenatos de cérebro com AD (Figura 14). As concentrações de anticorpos usadas neste estudo foram 110 nM para o IAPP e 66,7 nM para o Tau-PHF. Os mAbs 3H3 e 4G1 são notáveis pela ligação a Tau PHF, consistente com o reconhecimento de um epítopo pan- amiloide.

[00252] A ligação dos mAbs 4G1 e 3H3 às linhagens de células tau40 HEK-293 e HEK-293 foi testada (Figura 15).

[00253] A fibrilização de Aβ42 de oligômeros de beta amiloide sozinhos ou na presença de mAbs anti-amiloide, 3H3, 4G1 e 4A6 foi testada (Figura 16). Exemplo 3: Uso de anticorpos pan-amiloides como anticorpos terapêuticos contra Y. pestis

[00254] Um membro da família Enterobacteriaceae, Yersinia pestis, é o agente causador da praga da doença. Y. pestis infecta principalmente roedores, mas que também podem infectar uma grande variedade de outros hospedeiros mamíferos, incluindo humanos. As pulgas são utilizadas pelo patógeno como vetores, e acredita-se que a maioria dos eventos de transmissão ocorra por meio de picadas de pulgas. Assim, o sucesso da bactéria depende, em parte, de sua capacidade de se adaptar e responder rapidamente aos ambientes de temperatura díspares encontrados nos hospedeiros mamíferos e pulgas. Y. pestis forma biofilmes no hospedeiro da pulga e essa característica foi associada

91 / 93 a infecções mortais em humanos. Além disso, biofilmes de Y. pestis também foram observados nos granulomas produzidos durante a infecção. No entanto, a natureza desses biofilmes ainda não foi explorada.

[00255] Vários genes de virulência codificados por plasmídeo e cromossomo foram identificados em Y. pestis, incluindo aqueles envolvidos na ligação ao vermelho do Congo (fenótipo Crb+), que forma a base da formação de biofilme. No entanto, esses estudos ainda não identificaram uma proteína amiloide que sirva como arcabouço para os biofilmes de Y. pestis.

[00256] Os experimentos são projetados para identificar e validar amiloides Yersinia que estão envolvidos na formação de biofilme durante a infecção usando uma abordagem proteômica e um software que foi estabelecido para identificar proteínas amiloides por meio de análise de sequência. As proteínas candidatas são então selecionadas e validadas. Proteínas recombinantes são geradas e testadas quanto à sua atividade amiloide usando ensaios funcionais, incluindo ensaio de ligação de Tioflavina T, Espectrometria do Vermelho do Congo e Microscopia Eletrônica.

[00257] Após a validação dos amiloides, anticorpos que alvejam essas proteínas serão gerados. Os mAbs gerados são testados quanto à sua capacidade de romper biofilmes, incluindo biofilmes de Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica e E. coli, e quanto à sua atividade antibiofilme in vitro usando ensaios de biofilme padrão. Os anticorpos que mostram uma forte atividade anti-panamiloide são ainda testados in vivo contra Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica e E. coli usando um modelo de biofilme de cateter. Os mAbs que mostram a atividade mais elevada tanto in vitro como in vivo são anticorpos terapêuticos potenciais contra Y. pestis. Exemplo 4: Sequências de anticorpos

[00258] SEQ ID NO:1: cadeia pesada de ALZ.3H3 (nucleotídeo) SEQ ID NO:2: cadeia pesada de ALZ.3H3 (aminoácido) SEQ ID NO:3: região variável da cadeia pesada de ALZ.3H3

92 / 93

(nucleotídeo) SEQ ID NO:4: região variável da cadeia pesada de ALZ.3H3 (aminoácido) SEQ ID NO:5: cadeia pesada de ALZ.3H3 (nucleotídeo) com 4nt antes de Met REGIÃO V-D-J: Nucleotídeos 62..448 da SEQ ID NO:5 REGIÃO V Nucleotídeos 62..357 da SEQ ID NO:5 FR1-IMGT (SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:7) CDR1-IMGT (SEQ ID NO:8; SEQ ID NO:9) FR2-IMGT (SEQ ID NO:10; SEQ ID NO:11) CDR2-IMGT (SEQ ID NO:12; SEQ ID NO:13) FR3-IMGT (SEQ ID NO:14; SEQ ID NO:15) CDR3-IMGT (SEQ ID NO:16; SEQ ID NO:17) JUNÇÃO (SEQ ID NO:18; SEQ ID NO:19) REGIÃO 3’V (SEQ ID NO:20; SEQ ID NO:21) REGIÃO N1 (SEQ ID NO:22; SEQ ID NO:23) REGIÃO D (SEQ ID NO:24; SEQ ID NO:25) REGIÃO N2 (SEQ ID NO:26; SEQ ID NO:27) REGIÃO 5’J (SEQ ID NO:28; SEQ ID NO:29) REGIÃO J (SEQ ID NO:30; SEQ ID NO:31) FR4-IMGT (SEQ ID NO:32; SEQ ID NO:33) SEQ ID NO:34: cadeia leve de ALZ.3H3 (nucleotídeo) SEQ ID NO:35: cadeia leve de ALZ.3H3 (aminoácido) REGIÃO V-J <Nucleotídeos 1..323 da SEQ ID NO:34 REGIÃO V <Nucleotídeos 1..288 da SEQ ID NO:34 FR1-IMGT (SEQ ID NO:36; SEQ ID NO:37) CDR1-IMGT (SEQ ID NO:38; SEQ ID NO:39) FR2-IMGT (SEQ ID NO:40; SEQ ID NO:41) CDR2-IMGT (SEQ ID NO:42; SEQ ID NO:43)

93 / 93 FR3-IMGT (SEQ ID NO:44; SEQ ID NO:45) CDR3-IMGT (SEQ ID NO:46; SEQ ID NO:47) JUNÇÃO (SEQ ID NO:48; SEQ ID NO:49) REGIÃO 3’V (SEQ ID NO:50; SEQ ID NO:51) REGIÃO N Nucleotídeos 289..290 da SEQ ID NO:34 REGIÃO 5’J <Nucleotídeos 291..295 da SEQ ID NO:34 REGIÃO J (SEQ ID NO:52; SEQ ID NO:53) FR4-IMGT (SEQ ID NO:54; SEQ ID NO:55) Cadeia pesada de ALZ.4A6 da SEQ ID NO:56 (nucleotídeo) Cadeia pesada de ALZ.4A6 da SEQ ID NO:57 (aminoácido) Cadeia leve de ALZ.4A6 da SEQ ID NO:58 (nucleotídeo) Cadeia leve de ALZ.4A6 da SEQ ID NO:59 (aminoácido) Cadeia pesada de ALZ.4G1 da SEQ ID NO:60 (nucleotídeo) Cadeia pesada de ALZ.4G1 da SEQ ID NO:61 (aminoácido) Cadeia leve de ALZ.4G1 da SEQ ID NO:62 (nucleotídeo) Cadeia leve de ALZ.4G1 da SEQ ID NO:63 (aminoácido).

[00259] As descrições de cada patente, pedido de patente e publicação aqui citada é aqui incorporada por referência na sua totalidade. Embora esta invenção tenha sido descrita com referência a modalidades específicas, é evidente que outras modalidades e variações desta invenção podem ser concebidas por outros versados na técnica sem se afastar do espírito e escopo verdadeiros da invenção. As reivindicações anexas se destinam a ser interpretadas para incluir todas essas modalidades e variações equivalentes.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo terapêutico, em que o anticorpo é específico para a ligação a um epítopo de curli e adicionalmente em que o epítopo de curli compreende uma sequência com homologia com um sítio de ligação de anticorpo de uma ou mais proteínas amiloides heterólogas.

2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o anticorpo inibe a fibrilização de uma ou mais proteínas amiloides heterólogas.

3. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o anticorpo impede a formação de biofilme ou altera a arquitetura do biofilme.

4. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o anticorpo é eficaz na redução da massa de biofilme.

5. Composição de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a massa de biofilme está associada a uma bactéria selecionada do grupo que consiste em gram-positivas, gram-negativas e uma combinação das mesmas.

6. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o anticorpo inibe a fibrilização de β-amiloide e impede a formação de biofilme ou altera a arquitetura do biofilme.

7. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal selecionado do grupo que consiste em: a) ALZ.3H3, compreendendo pelo menos um de uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada conforme estabelecido na SEQ ID NO:2 e uma sequência de aminoácidos da cadeia leve conforme estabelecido na SEQ ID NO:35;

b) ALZ.4G1, compreendendo pelo menos um de uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada conforme estabelecido na SEQ ID NO:61 e uma sequência de aminoácidos da cadeia leve conforme estabelecido na SEQ ID NO:63; e c) ALZ.4A6, compreendendo pelo menos um de uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada conforme estabelecido na SEQ ID NO:57 e uma sequência de aminoácidos da cadeia leve conforme estabelecido na SEQ ID NO:59.

8. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que a composição é para aplicação a uma superfície de um dispositivo médico.

9. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente um antibiótico.

10. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente um ou mais carreadores ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

11. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que a formulação é uma formulação tópica na forma de um creme, uma loção, uma pomada, um hidrogel, um coloide, um gel, uma espuma, um óleo, um leite, uma suspensão, um lenço, uma esponja, uma solução, uma emulsão, uma pasta, um emplastro, uma compressa, um suabe, um curativo, um spray ou uma atadura.

12. Método para descolonizar um organismo microbiano, caracterizado pelo fato de que compreende o contato do organismo microbiano com uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a

11.

13. Método para destruir ou interromper ou inibir ou reduzir a formação de biofilme de um organismo microbiano, caracterizado pelo fato de que compreende o contato do organismo microbiano com uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 12.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 13, caracterizado pelo fato de que o organismo microbiano é uma bactéria.

15. Método para tratar uma infecção microbiana em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 11.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a infecção microbiana é uma infecção bacteriana.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a infecção bacteriana é distinguida por colonização de uma bactéria.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a infecção bacteriana é distinguida por formação de biofilme.

19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 18, caracterizado pelo fato de que a infecção microbiana é uma infecção tópica.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a infecção tópica é selecionada de ferida, úlcera e lesão.