DE69223952T2 - Entwurf, Konstruktion und Expression von chimärischen Proteinen zur Entwicklung von Impfstoffen und diagnostischen Reagenzien - Google Patents

Entwurf, Konstruktion und Expression von chimärischen Proteinen zur Entwicklung von Impfstoffen und diagnostischen Reagenzien

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Description

    Hintergrund der Erfindung 1. Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Konstruktion von chimären Proteinen, die sich als AIDS-Vaccine und für die Entwicklung von diagnostischen Mitteln eignen, sowie ein Verfahren zu deren Herstellung. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung chimäres gag-Protein von HIV, das in mit rekombinantem Baculovirus infizierten Insektenzellen exprimiert wird, und ein Verfahren zu dessen Herstellung.
    • 2. Stand der Technik
  • Humane Immunschwächeviren (HIV) Typ 1 und 2 werden als die ätiologischen Agenzien für das erworbene Immunschwächesyndrom (AIDS) angesehen. Ein Vaccin gegen die Viren ist ein idealer Weg, um das Syndrom aufgrund einer Infektion mit HIV zu vermeiden; daher haben sich viele Forschungsanstrengungen auf molekularbiologische Analysen von Struktur und Funktion von HIV konzentriert. Die hauptsächlichen Virion-Strukturproteine von HIV sind von den drei Strukturgenen abgeleitet, die als gag, pol und env bekannt sind. Das Genom vieler verschiedener Isolierungen von HIV ist vollständig sequenziert worden, und Aminosäuresequenzen sind aus den klonierten proviralen DNA-Sequenzen abgeleitet worden. Das Hüllgen von HIV codiert für eine Glycoprotein-Vorstufe mit einem Molekulargewicht von 160000 (gp160). Die Vorstufe gp160 in mit dem Virus infizierten Zellen wird prozessiert (oder gespalten), wobei die Hüllglycoproteine gp120 und gp41 gebildet werden. Das Hüllglycoprotein gp120 von HIV ist das hauptsächliche Ziel für die Entwicklung eines moglichen Vaccins gegen AIDS. gp120 erkennt den zellulären Rezeptor (CD4) auf Helfer-T-Lymphozyten und trägt die V3-Schleifendomäne, die neutralisierende Antikorper induziert (Science, 234, 1392-1395, 1986; Proc. Natl. Acad. Science, USA, 83, 7023-7027).
  • Die V3-Schleife repräsentiert die dritte hypervariable Regionvon gp120 von HIV-1 (Aminosäurereste 308-331), die nicht nur ein hauptsächliches immunodominantes neutralisierendes Epitop enthält, sondern auch Epitope für die antigenabhängige zelluläre Cytotoxizität (ADCC) und die Erkennung durch cytotoxische T-Lymphozyten (CTL). Der größte Teil der Aminosäuren in der V3-Schleife ist zwar unter den verschiedenen Stämmen von HIV variabel; ein Motiv G-P-G-R an der Spitze der Schleife ist jedoch konserviert (Science 249, 932-935, 1990).
  • Kürzlich haben Huang et al. und Biörling et al. gezeigt, daß die hauptsächliche Neutralisationsdomäne des Hüllglycoproteins von HIV-2 sich ebenfalls in der Region befindet, die dem hypervariablen Motiv in der V3-Schleife von gp120 von HIV-1 entspricht. Die CD4-bindende Region, die sich innerhalb des C-terminalen Drittels von gp120 von HIV-1 (Aminosäurereste 397-439) befindet, spielt eine wesentliche Rolle bei der infektiösen Beschaffenheit von HIV. Diese Region scheint auch schwach immunogen zu sein, da sie eine Tasche bildet, die für das Immunsystem nicht zugänglich ist, so daß ein neutralisierender Antikörper mit hohem Titer gegen diese Region gegenwärtig nicht verfügbar ist.
  • Chem. Abs. 113 (1990) Nr. 127642 beschreibt die Synthese eines chimären Gens durch Kupplung von RSV gag an Cytochrom und die Expression.
  • Abstract M.A. 68 der VII. International Conference on AIDS, Florenz 1991 beschreibt, wie chimäre Oligopeptide durch Verknüpfen eines gp20- oder eines gp41-B-Zell-Epitops mit dem N- oder C-Terminus eines p24-T-Zellepitops&sub1; nämlich p24E, hergestellt wurden. Die immunogene Beschaffenheit der chimären Oligopeptide wurde dann verglichen. Die Autoren stellten fest, daß die immunogene Beschaffenheit des hauptsächlichen neutralisierenden Epitops (V3-Schleife, Reste 311-327) höher war, wenn das Peptid an den C-Terminus anstelle des N-Terminus von p24E gebunden wurde, während die des B-Zellepitops (V3-Schleife, Reste 311-327) höher war, wenn die Verknüpfung mit dem C-Terminus des T-Zellepitops erfolgte, um eine anti- BE3-Antikörperreaktion hervorzurufen.
    • Zusammenfassende DarBtellung der Erfindung
  • Chimäre gag-env-Proteine können durch Verknüpfen von gag von HIV mit env unter Bildung des chimären Gens, Insertion des erhaltenen chimären Gens in die DNA von Baculovirus, Infektion von Insektenzellen oder Insekten mit dem resultierenden rekombinanten Virus, Kultivieren und Reinigen des erhaltenen chimären Proteins erhalten werden. Derartige chimäre Proteine eignen sich als ein AIDS-Vaccin.
  • Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird ein rekombinantes chimäres gag-env-Polypeptidpartikel von HIV bereitgestellt, das ein HIV-2-gag-Polypeptid, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus HIV-2-gag-Polypeptiden besteht, die sich von der N-terminalen Aminosäure von gag bis mindestens Aminosäure 376 und höchsten bis Aminosäure 425 erstrecken, wobei die gag-Polypeptide ein Prolin an Aminosäureposition 373 aufweisen; und ein env-Polypeptid von HIV, das die V3-Schleifendomäne von gp120 umfaßt; wobei das env-Polypeptid mit dem C-Terminus des gag-Polypeptids verknüpft ist, umfaßt.
    • Kurze der Beschreibung der Zeichnungen
  • Die Erfindung wird ausführlicher mit Bezug auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben:
  • Fig. 1 zeigt Deletionsmutanten des HIV-2-gag-Gens und die Partikelbildung. Eine Reihe von Deletionsmutanten des gag-Gens von HIV-2 wurde durch PCR mit spezifischen Primern konstruiert, und die Größe der Deletionsmutanten ist durch die Aminosäurezahl, die erhalten blieb, angegeben. Die Deletionsmutanten HIV-2-gag&sub4;&sub2;&sub5;, -gag&sub3;&sub8;&sub8;, -gag&sub3;&sub8;&sub0; und -gag&sub3;&sub7;&sub6; bildeten virusartige Partikel, die in das Kulturmedium freigesetzt wurden, während dies bei den Deletionsrnutanten HIV-1- gag&sub3;&sub7;&sub2;, -gag&sub3;&sub6;&sub6;, -gag&sub3;&sub4;&sub4; und -gag&sub3;&sub2;&sub2; nicht der Fall war. Polypeptiddomänen des HIV-2-gag-Proteins, von p16 MA (Matrixprotein), von p26 CA (Capsidprotein) und p12 NC (Nucleinsäure-bindendes Protein) sind oben im Diagramm gezeigt. C bei HIV-gag&sub4;&sub2;&sub5; bezeichnet Cystein, das die Zink-Finger-Domäne repräsentiert.
  • Fig. 2 zeigt spezifische Mutanten des HIV-2-gag380-W- Gens mit Partikelbildung. Drei Prolinreste, die sich in den Aminosäurepositionen 373, 375 und 377 am C-Terminus der gag- Mutante HIV-2-gag380-W befanden, wurden durch gerichtete Mutagenese unter Anwendung der PCR durch 1, 2 oder 3 Leucinreste substituiert und SF9-Zellen exprimimiert. Die Substitution von bis zu zwei Prolinresten beeinträchtigte die gag- Partikelbildung nicht, während die Änderung aller drei Prolinreste zu einem Fehlen der Partikelbildung führte, was durch Elektronenmikroskopie untersucht wurde.
  • Fig. 3 zeigt die Konstruktion von chimären gag-env-Genen. BglII-Fragmente von gp120 von HIV-2, die V3 (Aminosäurepositionen 273-363) oder V3+CD4BD (Aminosäurepositionen 294- 491) enthielten, wurden durch PCR amplifiziert. Die V3+CD4BD- Sequenzen von HIV-1 wurden direkt aus pUC-gp120-NSS durch BglII-Verdau isoliert. Um diese BglII-Fragmente am 3'-Terminus des HIV-2-gag-Gens ohne die Proteasesequenzen zu inserieren, wurden zwei BglII-Stellen durch Crossover-Linker-Mutagenese erzeugt, und zwar eine stromabwärts von der PstI-Stelle und die andere am C-Terminus unmittelbar stromaufwärts vom Stopcodon. BglII-Fragmente, die V3 oder V3+CD4BD aus HIV-1 oder HIV-2 trugen, wurden in die Mitte der 3'-terminalen BglII-Stelle inseriert. So wurden insgesamt 6 Konstrukte hergestellt. Der gepunktete Kasten und der ausgefüllte Kasten stellen V3 bzw. CD4BD von gp120 von HIV-1 dar. Der mit einem Karomuster versehene Kasten und der Kasten mit vertikalen Linien stellen V3 bzw. V3+CD4BD von gp120 von HIV-2 dar. Die Anzahl der in den einzelnen Fragmenten enthaltenen Aminosäuren ist angegeben.
  • Fig. 4 zeigt die Expression von chimären gag-env-Proteinen in SF9-Zellen, die mit rekombinanten Baculoviren infiziert wurden. Lysate von mit rekombinanten Baculoviren infizierten SF9-Zellen wurden durch SDS-PAGE analysiert, und die Proteine wurden mit Coomassie-Blau (A) angefärbt oder durch Western-Blots mit vereinigten Seren von AIDS-Patienten (B) nachgewiesen. Spuren 1-4: rekombinante Viren AcNPV-HIV-2gag, Ac-gagM-1V3, Ac-gagC-1V3 und Ac-gagC-1V3 + 1CD4. Die in den Kulturüberstand freigesetzten chimären gag-env-Partikel wurden durch Zentrifugation in 20-60%igen diskontinuierlichen Saccharosedichtegradienten gereinigt, einer SDS-PAGE unterzogen und durch Coomassie-Blau-Anfärbung (C) und Wester-Blot (D) nachgewiesen. Spur 1: gereinigte gag-Partikel; Spuren 2- 4: gereinigte chimäre gagC-1V3-, gagC-2V3- und gagC-2V3+2CD4- Partikel; M: Markerproteine; C: nicht-infizierte Zellkontrolle; Wt: Wildtyp-AcNPV-infizierte Zellen. Die hauptsächlichen Fusionsproteine P55 und P66 sind durch Pfeile bezeichnet, und mögliche Spaltprodukte sind durch offene Pfeile bezeichnet
  • Fig. 5 zeigt elektronenmikroskopische Aufnahmen von Saccharosegradienten-gereinigten chimären gag-env-Partikeln. (A) HIV-2-gag-Partikel, die von SF9-Zellen gebildet wurden, die mit rekombinantem AcNPV-HIV-2-gag infiziert waren; (B) chimäre gag-env-Partikel, die mit rekombinantem Ac-gagC-1V3 gebildet wurden; (C) chimäre gag-Partikel, die mit rekombinantem Ac-gagC-2V3 gebildet wurden; und (D) chimäre gag-Partikel, die mit rekombinantem Ac-gagC-2V3+2CD4 gebildet wurden. Die Proben wurden mit Uranylacetat angefärbt. Der Balken stellt 100 nm dar.
  • Fig. 6 zeigt eine Immunoblotanalyse von chimären gagenv-Proteinen. Die chimären gag-env-Proteine und gp120 von HIV-1 und HIV-2 wurden einer SDS-PAGE unterzogen und elektrisch auf Nitrozellulosefilter übertragen. Die Filter wurden mit Kaninchenantiseren, die spezifisch für gp120 von HIV-1 (A) und HIV-2 (B) waren, und mit ¹²&sup5;-I-markiertem Protein A inkubiert. Spur 1: HIV-2-gag-Protein; Spur 2: gp120-Protein; Spur 3: chimäres gagC-1V3-Protein; Spur 4: chimäres gagC- 1V3+1CD4-Protein; C: Zellkontrolle; W: Wildtyp-AcNPV-infizierte Zellkontrolle. Die Kaninchenantiseren gegen HIV-1- und HIV-2-gp120 wurden an anderer Stelle beschrieben.
  • Fig. 7; Western-Blot-Analyse unter Verwendung von Kaninchenantiseren, die gegen chimäre gag-env-Partikel erzeugt wurden. (A) Das anti-gagC-1V3-Serum erkannte nicht-glycosyliertes gp120-Protein von HIV-1. Spur 1: HIV-2-gag-Protein; Spur 2: nicht-glycosyliertes gp120-Protein von HIV-1. (B) Das anti-gagC-2V3-Serum erkannte nicht-glycosyliertes gp120-Protein von HIV-2. Spur 1: HIV-2-gag-Protein; Spur 2: nicht-glycosyliertes. gp120-Protein von HIV-2. Wt: Wildtyp-AcNPV-infizierte Zellen am Tag 3 nach der Infektion (p.i.); C: Zellkontrolle. Die Seren wurden 1:200 verdünnt, und das »Immuno-Blot AK«-Nachweissystem von Bio-Rad wurde verwendet.
  • Fig. 8 zeigt die Neutralisation von HIV-1IIIB und HIV- 2ROD-Infektion mit Kaninchenimmunseren. Antiseren gegen die chimären gagC-1V3- und gagC-2V3(HIV-2)-Partikel wurden verdünnt und auf die Neutralisation des Virus unter Verwendung von reverser Transcriptase und viralen p24- oder p26-Assays untersucht. a und b: HIV-1; c und d: HIV-2. Pre-Immunserum ( ); V3-spezifisches Immunserum ( ) aus mit chimären gag-V3- Partikeln von HIV-1 oder HIV-2 immunisierten Kaninchen; antigp120-Seren ( ), die spezifisch für gp120 von HIV-1 oder HIV- 2 sind. Die neutralisierende Aktivität von anti-gagC-1V3- und anti-gagC-2V3-Seren wurde durch Inkubation der Seren (1:5- Verdünnung) mit Virusstammpräparaten von HIV-1IIIB (5000 TCID&sub5;&sub0;) oder HIV-2ROD (8000 TCID&sub5;&sub0;) bei 37ºC für 1 Stunde vor der Infektion von H9-Zellen bestimmt. Die virale Infektion wurde durch die Aktivität an reverser Transcriptase (a und c) und die Bildung der gag-Proteine HIV-1-p24 (b) oder HIV-2-p26 (d) an den Tagen 1-16 p.i. überwacht.
  • Weitere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der Erfindung sind aus der nachstehenden Beschreibung ersichtlich.
    • Ausführliche Darstellung der bevorzugten Ausführungsformen
  • Die vorliegende Erfindung stellt das chimäre gag-Protein von HIV, das sowohl antigene als auch immunogene Eigenschaften von gag und einem Anteil von env-Proteinen behält, bereit.
  • Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben bereits berichtet, daß die Expression von gag codierenden Sequenzen von HIV-2, denen das Proteasegen fehlt, in Insektenzellen virusartige partikel bildet (Virology 179, 874-880, 1990).
  • Der C-Terminus des gag-Proteins unter Einschluß der Zink-Finger-Domäne ist für die Partikelbildung nicht erforderlich (Fig. 1). Daher ist es möglich, den C-Terminus des gag-Vorstufenproteins durch andere Sequenzen zu ersetzen, ohne daß man die Fähigkeit des gag-Proteins zur Bildung virusartiger Partikel einbüßt. Das gag-Protein weist die einzigartige Fähigkeit zur Bildung von Partikeln in Abwesenheit aller anderen Komponenten des Virus auf, und den chimären gag-Partikeln fehlt die genomische RNA. Die Bildung von chimären gag-Partikeln, die das hauptsächliche neutralisierende Epitop (V3) und/oder die CD4-bindende Domäne (CD4BD) von gp120 enthalten, erlaubt möglicherweise die wirksame Erzeugung von HIV-neutralisierenden Antikörpern; Antigene, die in einer Partikelform präsentiert werden, verstärken möglicherweise die immunogenen Beschaffenheit der Epitope, und mehrfache Kopien von spezifischen Epitopen können präsentiert werden. Ferner können sekretierte chimäre Partikel in sicherer und einfacher Weise gesammelt und aus Zellkulturmedien durch Zentrifugation gereinigt werden.
  • In der vorliegenden Anmeldung zeigen wir die Kartierung von essentiellen Domänen des gag-Proteins für die Partikelbildung und die Konstruktion von sechs verschiedenen chimären gag-Genen&sub1; die die V3-Schleife (V3) oder die V3-Schleife plus die CD4-Bindungsdomäne (V3+CD4BD) von gp120 aus HIV-1 oder HIV-2 enthalten. Diese Konstrukte wurden in Insektenzellen unter Verwendung eines Baculovirus-Expressionsvektors exprimiert. Die minimale Länge von HIV-2-gag zur Bildung von Partikeln beträgt 376 Aminosäuren, und das Prolin an der 373sten Position ist für die Partikelbildung essentiel. Die chimäre Genkonstruktion zeigt, daß nur bestimmte Kombinationen von Fusionsproteinen exprimiert werden, als virusartige Partikel zusammengesetzt werden und antigene und immunogene Beschaffenheit von sowohl gag- als auch env-Epitopen behalten.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Karte der minimalen Länge von HIV-2-gag-Gensequenzen bereit, die für die gag- Partikelbildung erforderlich sind, und zwar unter Anwendung der Deletionsmutagenese.
  • Die Aminosäuresequenz, die bis zu 143 Aminosäuren am C- Terminus der 519 Aminosäuren umfassenden Sequenz deletiert ist und 376 Aminosäuren am N-Terminus behält, ist das minimale Protein für die gag-Partikelbildung von HIV-2. Im Gegensatz dazu beendet die Deletion von vier weiteren Aminosäuren, wobei 372 Aminosäuren am N-Terminus erhalten bleiben, die Partikelbildung.
  • Die gerichtete Mutagenese zeigte, daß Prolin an der Aminosäureposition 3731 nicht jedoch an den Aminosäurepositionen 375 und 377, für die Partikelbildung essentiel ist.
  • Um die gag-Proteindomäne(n), die für die Partikelbildung essentiel ist/sind, zu kartieren, wurden sowohl Deletionsals auch gerichtete Mutagenese durchgeführt. Fig. 1 zeigt klar, daß 376 Aminosäuren am N-Terminus für die Partikelbildung erforderlich sind. Im Gegensatz zu bisherigen Berichten ist die Zink-Finger-Domäne am C-Terminus für die gag-Partikelbildung nicht erforderlich. Ferner zeigten die vorliegenden gerichteten Mutanten, daß das Prolin in der Position 373 für die Partikelbildung essentiel ist, wie es in Fig. 2 gezeigt ist. Die Ergebnisse von Fig. 1 und Fig. 2 weisen darauf hin, daß man ohne Unterbrechnung 1128 Basenpaare des HIV-2- gag-Leserahmens als essentiel für das Packen fremder Epitope in gag-Partikel erhalten muß.
  • Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben sechs verschiedene Kombinationen von chimären Genen durch Kupplung des verkürzten HIV-2-gag-Gens&sub1; das für 425 Aminosäuren codiert, mit der neutralisierenden Domäne (V3) oder den neutralisierenden und CD4-bindenden Domänen (V3+CD4BD) von gp120-env- Gensequenzen aus HIV-1 oder HIV-2 konstruiert. Diese Herstellung hat zum Abschluß der vorliegenden Erfindung geführt.
  • Die env-Gen-Sequenzen wurden entweder in die Mitte des gag-Gens oder am 3'-Terminus des gag-Gens inseriert. Virusartige Partikel wurden durch chimäre Genprodukte nur gebildet, wenn die env-Gensequenzen mit dem 3'-Terminus des gag-Gens verknüpft waren. Die Insertion der env-Gensequenz in der Mitte des gag-Gens führte zu einem hohen Expressionsgrad des chimären Gens, jedoch ohne Bildung virusartiger Partikel.
  • Insbesondere bildeten drei verschiedene chimäre Proteine, nämlich (1) gag (425 Aminosäuren) mit HIV-1-V3 (91 Aminosäuren); (2) gag mit HIV-2-V3 (90 Aminosäuren); und (3) gag mit HIV-2-V3+CD4BD (198 Aminosäuren) virusartige Partikel, die in das Zellkulturmedium sekretiert wurden (vergleiche Tabelle 1). Tabelle 1: Vergleich von Partikelbildung und Ausbeute an chimären Fusionsproteinen
  • Anmerkungen:
  • * Das Pluszeichen gibt an, daß virusartige Partikel aus dem Zellkulturmedium gewonnen wurden.
  • ** Virusartige Partikel befanden sich als Bande oben auf diesen Saccharoselösungen nach der Ultrazentrifugation.
  • Die vorliegende Erfindung stellt also ein rekombinantes Baculovirus bereit, das ein chimäres Gen enthält.
  • Das erfindungsgemäße rekombinante Baculovirus kann unter Verwendung von Autographa Californica-Kernpolyhedrose-Virus (AcNPV) oder Bombyx iridexcent-Virus hergestellt werden.
  • Das rekombinante Virus wird erhalten, indem das chimäre Gen in das AcNPV-Genom inseriert und durch aufeinanderfolgende Plaqueassays zur Selektion von Polyhedrin-negativen rekombinanten Viren gereinigt wird. AcNPV mit inseriertem gag aus HIV-2 wurde bei der ATCC unter der Zugangsnummer VR2314, AcNPV mit inseriertem gag von HIV-2 und V3 von HIV-1 unter der Zugangsnummer VR2316 und AcNPV mit inseriertem gag von HIV-2 und V3 von HIV-2 unter der Zugangsnummer VR2317 am 26. Februar 1991 hinterlegt. Es ist garantiert, daß diese für Forschungszwecke zur Verfügung stehen.
  • Insektenzellen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Spodoptera frugiperda-Zellen, Mamestra brassica-Zellen, Trichoplusia ni-Zellen, Bombyx mon-Zellen und Bombyx mon- Seidenraupenzellen besteht, wurden mit dem vorstehend erhaltenen rekombinanten Baculovirus infiziert, um eine Expression des chimären gag-Proteins durchzuführen.
  • Die erfindungsgemäßen chimären gag-Partikel rufen neutralisierende Antikörper in Kaninchen hervor, die eine HIV- Infektion vollständig blockieren.
  • Die erfindungsgemäßen chimären gag-Partikel können als Antigen eines AIDS-Vaccins oder eines diagnostischen Reagenzes verwendet werden. Das erfindungsgemäße AIDS-Vaccin zeigt eine spezifische Immunreaktion gegen ein Immunogen, und zwar unter Einschluß eines Vaccins&sub1; das vor oder nach der Exposition zur Verhinderung einer Infektion mit HIV oder für eine immuntherapeutische Behandlung verwendet wird.
  • Das erfindungsgemäße Vaccin kann herkömmliche Absorbentien, Stabilisatoren, Adjuvantien, Träger und dergleichen enthalten, und es kann auf herkömmuchem Weg verabreicht werden.
  • Weitere Merkmale der Erfindung sind im Verlauf der folgenden Beschreibung von beispielhaften Ausführungsformen ersichtlich, die zur Erläuterung der Erfindung vorgelegt werden, die sie aber nicht beschränken sollen.
    • Beispiele Beispiel 1: Herstellung von Plasmiden
  • Autographa californica-Kernpolyhedrose-Virus (AcNPV) und rekombinantes AcNPV wurden gezüchtet und in Spodoptera frugiperda (SF9) -Zellmonoschichten unter Verwendung von vollständigem TNM-FH-Medium mit einem Gehalt an 10% fötalem Rinderserum bei 27ºC nachgewiesen, wie es in Adv. Virus Res. 35, 177- 192, 1988 beschrieben ist. Wildtyp-AcNPV-DNA wurde nach dem Verfahren von Smith and Summers (Virology 89, 517-527, 1978) gereinigt.
  • Die Plasmide pHXB-2D und p1BM, die das vollständige HIV-1HXB2D- bzw. HIV-2NIHZ-Genom enthielten, wurden von Dr. R. Gallo (National Institutes of Health, Bethesda, MD) erhalten. Die rekombinanten Plasmide pUC19-gp120-NSS, PUC18-gp120 und pUC19-GAG, die Vollängen-cDNA-Kopien von HIV-1-env, HIV- 2-env und ein verkürztes gag-Gen von HIV-2 (das 425 Aminosäuren codiert) enthielten, wurden aus pHXB-2D bzw. p1BM subkloniert, wie es von den Erfindern in Virology 179, 874-880, 1990 beschrieben wurde.
    • Beispiel 2: Herstellung von chimären Genen
  • Um V3 und V3+CD4BD der HIV-1- und HIV-2-env-Gene in pUC19-GAG zu subklonieren, wurden die rekombinanten Plasmide pUC19-gp120-NSS und pUC19-gp120 als Matrizen verwendet, und die spezifischen Regionen wurden mit geeigneten Oligonucleotidprimern amplifiziert. Genauer gesagt wurden die Plasmide pUC19-gp120-NSS (HIV-1) und pUC18-gp120 (HIV-2) als Matrizen für die Amplifikation durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) eines HIV-1-DNA-Fragments, das der V3-Domäne entsprach (91 Aminosäuren, Positionen 273-363), und von HIV-2-DNA-Fragmenten; die der V3-äquivalenten Domäne (90 Aminosäuren, Positionen 294-383) und V3+CD4BD (198 Aminosäuren, Positionen 294-491) entsprachen, verwendet. Alle Primer waren so ausgelegt, daß eine BglII-Restrictionsstelle am 5'-Ende erzeugt wurde, so daß gp120-DNA-Fragmente in die BglII-Stelle von pUC19-GAG inseriert werden konnten.
  • Das HIV-1-V3-DNA-Fragment wurde unter Verwendung von L-1 (5'-CGAAGATCTGTCAATTTCACGG-3') und L-2 (5'-GCAGATCTTTGCTTAAAGATTA-3') als Primer, die komplementär zu den Nudeotiden 816 bis 836 bzw. 1075 bis 1089 sind, amplifiziert. Das V3+CD4BD-DNA-Fragment von HIV-1 wurde aus pUC19-gp120-NSS durch BglII-Verdau an den Nucleotidpositionen 816 und 1398 von gp120 erzeugt. Die Primer L-3 (5'-CGAGATCTCATTGTTAAGAGGCC-3') und L-4 (5'-GCAGATCTTCTGCAGTTAGTCC-3'), die komplementär zu den Nucleotidpositionen 879 bis 893 bzw. 1135 bis 1149 von HIV-2- gp120 sind, wurden zur Synthese des HIV-2-V3-DNA-Fragments verwendet. Die Primer L-3 und L-5 (5'-GCAGATCTCTTTACTGATGTAG-3'), der komplementär zu den Nucleotiden 1459 bis 1473 von HIV-2-gp120 ist, wurden zur Synthese des HIV-2-V3+CD4BD-DNA-Fragments verwendet. Die PCR wurde entsprechend den Verfahren durchgeführt&sub1; die mit dem Geneamp-Kit (Norwalk, CT) zur Verfügung gestellt werden. Kurz gesagt wurden 20 ng linearisierte gp120-DNA zu 100 ul PCR- Reaktionsgemisch (10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl&sub2; und 0,01% Gelatine) mit einem Gehalt an 20 uM der einzelen dNTP, 2,5 Einheiten Taq-Polymerase und 20 uM der einzelnen Oligonucleotidprimer gegeben.
  • Die V3- und V3+CD4BD-Gene wurden für 30 PCR-Zyklen (94ºC für 1 Minute, 45ºC für 3 Minuten) amplifiziert. Die chimären gag-Genkonstrukte, die die V3- und V3+CD4BD-Fragmente enthielten, wurden durch Didesoxy-DNA-Sequenzierung der doppelsträngigen DNA unter Verwendung des Sequence-Kit (Marke der United States Biochemical Corporation) überprüft.
  • Die chimären gagM-1V3-, gagC-1V3-, gagC-1V3+LCD4BD-, gagM-2V3-, gagC-2V3- und gagC-2V3+2CD4BD-Gene wurden nach dem vorstehenden Verfahren hergestellt. Die Zahlen 1 und 2 vor V3 und CD4BD bezeichnen Gene aus HIV-1 bzw. HIV-2; gagm bezeichnet das chimäre Gen, das in die Mitte des gag-Gens inseriert wurde, und gagC bezeichnet das chimäre Gen, das am Terminus des gag-Gens inseriert wurde. Das Verfahren zur Erzeugung des vorliegenden chimären Gens ist kurz in Fig. 3 gezeigt.
    • Beispiel 3: Herstellung eines rekombinanten Baculovirus
  • Die aus Beispiel 3 erhaltenen chimären Gene wurden nach Verdau mit BamHI isoliert und in den Baculovirus-Transfervektor pAcYM1 inseriert. SF9-Zellen wurden mit Gemischen aus infektiöser Wildtyp-AcNPV-DNA (1 ug) und rekombinanten Plasmid- DNAs (4 ug) unter Anwendung des Standardverfahrens (Adv. Virus Res., 35, 177-192, 1988) cotransfiziert.
  • Von den nach dem vorstehenden Verfahren erhaltenen rekombinanten Baculoviren wurden AcNPV, das gag von HIV-2 trägt (nachstehend als »AcHIV2GAGYK« bezeichnet) unter der Zugangsnummer VR2314, AcNPV, das gag von HIV-2 und V3 von HIV-1 trägt (nachstehend als»AcHIV2GAG+1V3YK« bezeichnet) unter der Zugangsnummer VR2316 und AcNPV, das gag von HIV-2 und V3 von HIV-2 trägt (nachstehend als »AcHIV2GAG+2V3YK« bezeichnet) unter der Zugangsnummer VR2317 bei der American Type Culture Collection (ATCC) am 26. Februar 1991 hinterlegt, und es ist garantiert, daß Proben für Forschungszwecke zur Verfügung gestellt werden.
  • Nach Inkubation des rekombinanten Baculovirus bei 27ºC für 4 Tage wurden die Kulturüberstände geerntet und auf 80% konfluente Monoschichten von SF9-Zellen titriert. Um Polyhedrin-negatives rekombinantes AcNPV zu erhalten, wurden Plaques, denen Polyeder fehlten, aufgenommen, durch drei aufeinanderfolgende Plaqueassays gereinigt und zur Herstellung von Virusstammlösungen mit 2x10&sup8; PFU/ml verwendet.
    • Beispiel 4: Expression von chimären Partikeln
  • SF9-Zellen wurden mit Wildtyp-AcNPV oder rekombinantem AcNPV, das chimäre Gene trug, mit Multiplizitäten der Infektion von 5 PFU/Zelle infiziert und bei 27ºC inkubiert. Nach geeigneten Inkubationszeiten (üblicherweise 3 bis 4 Tage) wurden Zellen geerntet und zweimal mit PBS gewaschen. Lysate ganzer Zellen wurden durch Resuspendieren des Zellpellets in Wasser und Zugabe eines gleichen Volumens an 2x Dissoziationspuffer (10% β-Mercaptoethanol, 10% SDS, 25% Glycerin, 100 mM Tris-HCl, pH-Wert: 7,0, 0,04% Bromphenolblau) hergestellt. Zell-Lysate wurden durch Elektrophorese in 12% Polyacrylamidgel mit einem Gehalt an SDS (SDS-PAGE) analysiert, und die Proteinbanden wurden durch Anfärben mit Coomassie-Blau (Nature 227, 283-303, 1987) sichtbar gemacht.
  • Western-Blot-Analysen wurden dann unter Verwendung von Seren von AIDS-Patienten und des Bio-Rad Immune Blot AK-Systems durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 gezeigt.
  • Fig. 4A zeigt die Proteine, die durch die rekombinanten Baculoviren Ac-gagM-1V3, Ac-gagC-1V3 und Ac-gagC-1V3+1CD4BD gebildet wurden. Da vom ursprünglichen HIV-2-gag-Protein 93 Aminosäuren vom C-Terminus deletiert sind, ist zu erwarten, daß eine Insertion von V3 (91 Aminosäuren) oder V3+CD4BD (194 Aminosäuren) von gp120 aus HIV-1 in das gag-Gen Proteine von 55 kDa bzw. 66 kDa ergibt.
  • Wie in Fig. 4A gezeigt ist, wurden stark angefärbte Proteinbanden, die als 55 kDa- oder 66 kDa-Banden wanderten, in den Lysaten von SF9-Zellen, die mit Ac-gagM-1V3 (Spur 2), AcgagC-1V3 (Spur 3) und Ac-gagC-1V3+1CD4BD (Spur 4) infiziert waren, beobachtet; sie waren jedoch in Lysaten von pseudoinfizierten oder Wildtyp-Baculovirus-infizierten Zellen nicht vorhanden.
  • Die Western-Blot-Analyse zeigte, daß beide Fusionsproteine p55 und p66 von vereinigten HIV-1-positiven Humanseren erkannt wurden (Fig. 4B, Spuren 2, 3 und 4). Keine spezifische Reaktion wurde bei pseudoinfizierten Zellen und Wildtyp- AcNPV-infizierten Zellen beobachtet.
  • Die Ergebnisse zeigen klar, daß die Insertion von HIV-1- V3 oder V3+CD4BD in das gag-Protein zur Expression von Proteinen in Konzentrationen mindestens so hoch wie bei rekombinantem AcNPV-HIV-2gag allein führten (Fig. 4A, Spur 1).
  • Entsprechende Ergebnisse wurden erhalten, als drei weitere rekombinante Baculoviren, die V3- und V3+CD4BD-Gene aus HIV-2-gp120 enthielten, nämlich Ac-gagM-2V3, Ac-gagC-2V3 und Ac-gagC-2V3+2CD4BD, analysiert wurden.
    • Beispiel 5: Reinigung chimärer Partikel
  • Die aus Beispiel 5 erhaltenen Zellkulturflüssigkeiten wurden nach Zentrifugation bei 1000 x g für 20 min. aufgefangen. Chimäre Partikel im Kulturüberstand wurden durch Ultrazentrifugation in einem Beckman SW28-Rotor bei 80000 x g für 1 h gesammelt und in PBS mit einem Gehalt an 0,1% Tween 20, 10 ug/ml Aprotinin resuspendiert und bei 4ºC gelagert. Eine Bande, die gag-Partikel enthielt, wurde aus einem 20-60%igen diskontinuierlichen Saccharosegradienten gewonnen, mindestens 10fach mit PBS verdünnt und in einem SW28-Rotor bei 80000 x g für 1 h pelletiert. Das Pellet wurde vorsichtig in PBS suspendiert. gagC-1V3- und gagC-2V3-Partikel wurden aus der 50%- Saccharosefraktion gewonnen, während chimäre gagC-2V3+2CD4BD- Partikel sich oben auf der 60%-Saccharosefraktion als Bande befanden. Die Ergebnisse der Morphologie der im Saccharosegradienten gereinigten Partikel gemäß Transmissionselektronenmikroskopie unter Anwendung der Anfärbung mit Uranylacetat sind in Fig. 5 gezeigt.
  • HIV-2-gag-Partikel waren kugelförmig (Fig. 5A), wiesen Durchmesser von ungefähr 100 nm auf und waren ähnlich reifen HIV-1-Partikeln, die aus HIV-1-infizierten Zellen hervorgehen. Die chimären Partikel gagC-1V3 (Fig. 5B), gagC-2V3 (Fig. 5C) und gagC-2V3+2CD4BD (Fig. 5D) zeigten Morphologien ähnlich den gag-Partikeln. Das äußere körnige Material zeigte häufig eine Streifenbildung mit einer Periodizität, die auf eine helikale Anordnung hinweist. Es bildete eine schalenartige Schicht, wahrscheinlich innerhalb einer Lipidmembran, und war vermutlich starr. Der einzige Unterschied zwischen den gag-Partikeln und den chimären gag-Partikeln bestand darin, daß die chimären gag-Partikel geringfügig größer mit ungefähren Durchmessern von 130 nm waren, ähnlich dem Durchmesser von reifen HIV-1-Partikeln.
    • Experimentelles Beispiel 1: Antigene Beschaffenheit von chimiren gag-Partikeln
  • Die antigene Beschaffenheit von chimären gag-Partikeln wurde durch Immunoblot-Analyse untersucht. Gereinigte chimäre gag-Partikel wurden einer SDS-PAGE unterzogen und durch Western-Blot mit Kaninchenantiseren, die gegen HIV-1- und HIV- 2-gp120 gerichtet waren, und ¹²&sup5;I-markiertem Protein A analysiert. Die Ergebnisse sind in Fig. 6 gezeigt. In dieser Fig. 6 ist Spur 1 HIV-2-gag-Protein; Spur 2 ist gp120-Protein; Spur 3 ist chimäres gagC-1V3-Protein; Spur 4 ist chimäres gagC-1V3+LCD4-Protein; C ist eine Zellkontrolle; und W ist eine Wildtyp-AcNPV-infizierte Zellkontrolle.
  • Das HIV-2-gag-Protein wurde nicht durch anti-gp120-Seren erkannt (Fig. 6A und B, Spur 1), während die nicht-glycosylierten Formen von gp120 aus HIV-1 und HIV-2 eine starke Reaktivität mit ihren entsprechenden Antiseren zeigten (Fig. 6A und B, Spur 2). Die Fusionsproteine von 55 kDa und 66 kDa wurden spezifisch von Kaninchenantiseren gegen HIV-1- oder HIV-2-gp120 erkannt (Fig. 6A und B, Spuren 3 und 4). Die Ergebnisse zeigen klar, daß die chimären Proteine durch Antiserum, das spezifisch für gp120 ist, nachgewiesen werden können, und sie bestätigen erneut, daß die inserierten Sequenzen von V3 oder V3+CD4BD antigen sind.
    • Experimentelles Beispiel 2: Immunogene Beschaffenheit von chimären gag-V3-Partikeln
  • Um die Eignung von Partikeln zur Induktion von Antikörpern sowohl gegen gag- als auch gegen env-Proteine von HIV zu untersuchen, wurden Kaninchen 4 mal in Abständen von 4 Wochen mit gereinigten chimären gagC-1V3- und gagC-2V3-Partikeln immunisiert. Die Kaninchenimmunseren wurden 2 Wochen nach der letzten Immunisierung gewonnen und auf ihre Eignung zur Erkennung von gp120 von HIV-1 und HIV-2 untersucht.
  • Wie in Fig. 7 gezeigt ist, erkannten die Antiseren, die sowohl gegen chimäre gagC-1V3- als auch gagC-2V3-Partikel hergestellt wurden, nicht nur Träger-HIV-2-gag-Protein (Fig. 7A, B, Spur 1), sondern auch nicht-glycosyliertes gp120 von HIV-1 (Fig. 7A, Spur 2) und HIV-2 (Fig. 7B, Spur 2).
  • Im Unterschied dazu enthalten weder Wildtyp-AcNPV-infizierte SF9-Zellen noch nicht-infizierte SF9-Zellen Proteine, die von den Antiseren erkannt wurden. Diese Ergebnisse zeigen klar, daß die V3-Schleifendomäne in den chimären gagC-1V3- und gagC-2V3-Partikeln sowohl antigene als auch immunogene Eigenschaften behält.
    • Experimentelles Beispiel 3: Immunseren gegen chimäre gag-V3-Partikel von HIV-1 oder HIV-2 neutralisieren die infektiöse Beschaffenheit des Virus in vitro
  • Gegen chimäre Partikel gerichtete Kaninchenantiseren wurden verwendet, um die infektiöse Beschaffenheit von HIV zu neutralisieren, was durch reverse Transcriptase (RT)-Aktivität und gag-p24-Bildung untersucht wurde. Kaninchen wurden 4 mal in Abständen von 1 Monat durch intramuskuläre Injektionen von 25 ug der durch Dichtegradienten gereinigten chimären gag-Partikel immunisiert. Kaninchen-anti-gagC-1V3- und anti- gagC-2V3-Seren (25 ul) wurden mit 100 ul Virus gemischt, das 5000 TCID&sub5;&sub0; von HIV-1IIIB oder 8000 TCID&sub5;&sub0; von HIV-2ROD darstellte, und die Gemische wurden zur Infektion von H9-Zellen verwendet. Die Menge an p24-gag-Protein und die reserve Transcriptase (RT)-Aktivität in den Kulturmedien wurden zur quantitativen Bestimmung der Virusbildung an verschiedenen Tagen nach der Infektion (Tage 1 bis 16) untersucht, und die Werte wurden mit denen von Kontrollproben verglichen, in denen das Virus mit Pre-Immunseren oder Kaninchen-anti-gp120- Serum inkubiert wurden.
  • Fig. 8 zeigt, daß sowohl Kaninchen-anti-gagC-1V3- als auch anti-gagC-2V3-Serum Antikörper enthielt, die zur Neutralisation der HIV-Infektion von H9-Zellen imstande waren. Am Tag 9 nach der Infektion blockierten Antiseren gegen chimäre gagC-1V3- und gagC-2V3-Partikel die Bildung von HIV-1 bzw. HIV-2 vollständig. Am Tag 12 nach der Infektion wurde jedoch eine kleine Menge an HIV-1 in Kulturen nachgewiesen&sub1; die mit anti-gagC-1V3-Serum behandelt worden waren (Fig. 8, a und b). Im Gegensatz dazu neutralisierten die chimären gagC-2V3-Partikel die infektiöse Beschaffenheit von HIV-2 vollständig (Fig. 8, c und d). Keine Verringerung von RT oder p24-gag- Proteinbildung wurde bei Pre-Immunseren beobachtet. Kaninchen-anti-gp120-Seren (HIV-2) zeigten eine stärkere neutralisierende Aktivität gegen HIV-2ROD als Kaninchen-anti-gp120- Seren von HIV-1 gegen HIV-1IIIB (Fig. 8).
  • Aus den vorstehenden Angaben ist ersichtlich, daß das erfindungsgemäße chimäre Protein eine hervorragende neutralisierende Aktivität gegen HIV-1 und HIV-2 zeigte.

Claims (6)

1. Rekombinantes chimäres gag-env-Polypeptidpartikel von menschlichem Immunschwächevirus, umfassend: ein HIV-2- gag-Polypeptid, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus HIV-2-gag-Polypeptiden besteht, die sich von der N-terminalen Aminosäure von gag mindestens bis Aminosäure 376 und höchstens bis Aminosäure 425 erstrecken, wobei die gag-Polypeptide ein Prolin an Aminosäureposition 373 aufweisen; und ein env-Polypeptid von HIV, das die V3-Schleifendomäne von gp 120 umfaßt; wobei das env-Polypeptid mit dem C-Terminus des gag- Polypeptids verknüpft ist.
2. Chimäres gag-env-Polypeptidpartikel nach Anspruch 1, wobei das env-Polypeptid die V3-Schleifendomäne von gp 120 und die CD4-Bindungsstelle umfaßt.
3. Chimäres gag-env-Polypeptidpartikel nach Anspruch 2, wobei das chimäre gag-env-Polypeptid in einer Insektenzelle durch ein rekombinantes Baculovirus, das ein chimäres HIV-gag-env-Gen, das für das chimäre gag-env-Polypeptid von Anspruch 1 kodiert, umfaßt, exprimiert wird.
4. Chimäres gag-env-Polypeptidpartikel nach Anspruch 4, wobei es sich bei dem rekombinanten Baculovirus um die ATCC-Hinterlegung Nr. VR2316 oder VR2317 handelt.
5. Vaccinzusammensetzung, die das rekombinante chimäre gag-env-Polypeptidpartikel von HIV nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger dafür umfaßt.
6. Vaccinzusammensetzung nach Anspruch 5, wobei das chimäre gag-env-Protein ein Protein ist, das von dem rekombinanten Baculovirus ATCC VR2316 oder ATCC VR2317 exprimiert wird.
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