KR20050010176A

KR20050010176A - 식물체에서 발현된 한탄 바이러스의 뉴클레오캡시드단백질을 포함하는 신증후출혈열 진단 키트

Info

Publication number: KR20050010176A
Application number: KR1020030049088A
Authority: KR
Inventors: 이선교; 주용규; 정남준; 이인희; 박선희; 유제근; 짐 맥펄슨; 코렛트 제이코
Original assignee: (주)넥스젠
Priority date: 2003-07-18
Filing date: 2003-07-18
Publication date: 2005-01-27
Also published as: KR100508499B1

Abstract

본 발명은 한탄 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 신규한 폴리뉴클레오타이드 및 그를 포함하는 식물발현용 벡터를 제공한다. 또한, 본 발명은 한탄 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 발현하는 형질전환 식물체의 제조방법 및 식물 형질전환체를 제공한다. 본 발명은 한탄 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질의 제조방법 및 한탄 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 제공한다. 한편, 본 발명은 신증후출혈열의 항체 진단용 키트 및 신증후출혈열의 항체 측정 방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, 저비용으로 우수한 항원성을 나타내는 한탄 바이러스의 재조합 뉴클레오캡시드 단백질을 얻을 수 있고, 이를 이용하는 경우에는 우수한 민감도 및 특이성으로 신증후출혈열을 진단할 수 있다.

Description

식물체에서 발현된 한탄 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 포함하는 신증후출혈열 진단 키트{Diagnosis Kits for Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome Comprising Nucleocapsid Protein from Hantann virus Expressed in Plants}

본 발명은 식물체에서 발현된 한탄 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 포함하는 신증후출혈열 진단 키트에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 한탄 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 신규 폴리뉴클레오타이드, 그를 포함하는 식물발현용 벡터, 상기 벡터에 의해 형질전환된 식물체, 신증후출혈열의 항체 진단용 키트 및 신증후출혈열의 항체 측정 방법에 관한 것이다.

분야비리대과의 한타바이러스 (Hantavirus) 속에 속하는 한탄 바이러스의 유전자는 3분절로 이루어진 단선 구조로 대 (L, large) 분절, 중 (M, middle) 분절,소 (S, small) 분절로 구성되었으며, 크기는 약 100 nm 정도의 소형 negative-sense RNA 바이러스이다. 이 RNA는 각기 자신의 뉴클레오캡시드 구조를 가지며 G1과 G2라는 당단백질로 만들어진 하나의 지질막에 감싸여 있다 (Schmaljohn et al., Characterization of Hantaan virions, the prototype virus of hemorrhagic fever with renal syndrome. J Infect Dis 148: 1005-1011, 1983). 한탄바이러스의 구조 단백질 중에서 면역반응에 관여하는 것은 뉴클레오캡시드 단백질과 G1, G2 막단백질이다. L 분절 RNA는 RNA 의존형 RNA 중합효소를 코딩하고, M 분절 RNA는 G1 과 G2 당단백질을 코딩하며, S 분절 RNA는 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩한다.

한타바이러스는 유라시아 대륙의 신증후출혈열과 미주 대륙의 한탄바이러스 폐 증후군을 유발하는 병원체로 잘 알려져 있다. 현재까지 많은 수의 한타바이러스 균주들이 신증후출혈열 환자 및 한타바이러스 폐 증후군 환자의 혈액 과 조직, 그리고 이 바이러스의 자연계 숙주동물인 비단털쥐과(Family Cricertidae)와 쥐과 (Family Muridae)에 속하는 많은 종의 설치류의 폐장조직에서 분리된 바 있다 (Chu et al., Serological relationships among viruses in the Hantavirus genus, family Bunyaviridae. Virology 198: 196-204, 1994).

현재까지 사람에게 질병을 유발하는 것이 확인된 바이러스로는 신 놈브레 바이러스 (Sin Nombre virus) 혈청형, 한탄바이러스 (Hantaan virus) 혈청형, 서울바이러스 (Seoul virus) 혈청형, 벨그레이드바이러스 (Belgrade virus) 혈청형, 푸말라바이러스 (Puumala virus) 혈청형 및 블랙크릭카날바이러스 (Black Creek Canal virus) 혈청형이 있으며, 병원성이 아직 밝혀지지 않은 바이러스로는 프로스펙트힐바이러스 (Prospect Hill virus) 혈청형, 타이바이러스 (Thailand virus) 혈청형 및 소타팔리얌바이러스 (Thottapalayam virus) 혈청형 등이 있다 (Xiao et al., Phylogenetic analyses of virus isolates in the genus Hantavirus, family Bunyaviridae. Virology 198: 205-217, 1994). 이들 9개의 바이러스 혈청형은 각각의 혈청형에 속하는 바이러스에 따라 숙주동물을 달리한다.

한국형 출혈열 및 극동아시아에서 발생하는 신증후출혈열의 병원체인 한탄바이러스는 등줄쥐 (Apodemus agrarius)의 폐장조직 및 환자의 혈액과 조직에서 분리되었으며 (Lee at al., Isolation of the epilogic agent of Korean hemorrhagic fever. J Infect Dis 137: 298-308, 1978), 전세계의 동물실험실 및 도시지역의 집쥐와 접촉하여 발생하는 신증후출혈열의 병원체인 서울바이러스는 집쥐 및 실험용 흰쥐의 페장조직으로부터 분리되었고 (Lee et al., Isolation of Hantaan virus, the etiologic agent of Korean hemorrhagic fever from wild urban rats. J Infect Dis 146: 638-644, 1982), 유럽의 발칸반도 유역의 국가들에서 발생하는 중증의 신증후출혈열의 병원체인 벨그레이드 바이러스는 노란목들쥐 (Apodemus flavicolis) 및 환자의 혈액에서 분리되었다 (Avsic-xupanc et al., Characterization of Dovrava virus: a hantavirus from Slovenia, Yugoslavia. J Med Virol 38: 132-137, 1992).

전세계적으로 매년 20 만명 이상의 신증후출혈열 환자가 발생하는 것으로 알려져 있으며, 우리 나라의 경우 매년 약 1,000 명 가량의 신증후출혈열 환자 발생이 보고되었고, 이는 한탄혈청형 바이러스와 서울혈청형 바이러스에 의한 것으로알려져 있다.

현재는 백신개발에 의해 신증후출혈열 환자의 발생건수는 많이 줄었으나, 전세계적으로는 여전히 발생이 되며, 특히 미국의 경우 해외에 주둔하고 있는 미군 부대가 산림에 인접한 관계로 신증후출혈열 환자가 계속 발생하여 이를 막기 위한 방법을 지속적으로 시도하고 있다. 이에 따라 항원을 이용하여 신증후출혈열 환자를 진단할 수 있는 진단키트 및 진단시약의 개발에 관한 연구가 활발하게 진행되고 있다.

현재, 신증후출혈열의 진단을 위한 진단키트 및 백신개발에 사용되는 바이러스 항원 단백질은 한탄바이러스를 생후 1일된 마우스의 뇌에 접종하여 대량으로 증식시켜 얻은 한탄바이러스를 포르말린으로 불활성화하여 얻은 항원이다. 이와 같은 항원을 사용하는 것은 동물의 뇌조직을 이용하여 바이러스를 증식시키는 과정에서 감염된 동물로부터 다량의 바이러스가 배설되어 동물사육자 및 바이러스 항원을 정제하는 과정에 종사하는 사람들을 감염시켜 신증후출혈열을 발생시킬 우려가 있다. 또한 진단키트에 사용하는 한탄바이러스 항원 중에 남아있을 동물 뇌조직 유래 단백질 성분으로 인해 검사 혈청이 위양성 (pseudo-positive)으로 오진되는 경우가 있어 정확한 진단을 저해하는 문제점이 야기된다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 인용문헌 및 특허 문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 문헌 및 특허의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 한탄 바이러스의 전체 유전자 중에서 항원성이 가장 우수한 뉴클레오캡시드 단백질 유전자를 식물체에 형질전환하여 식물 형질전환체를 얻은 다음, 이로부터 분리·정제된 한탄 바이러스 뉴클레오캡시드 항원 단백질이 바이러스와 동일한 면역학적 항원성을 나타내는 것을 확인하고, 이를 한탄 바이러스에 의한 신증후출혈열을 진단하는 데 이용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 한탄 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 신규한 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 한탄 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 신규한 폴리뉴클레오타이드를을 포함하는 식물발현용 벡터를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 한탄 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 발현하는 형질전환 식물체의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 한탄 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 발현하는 식물 형질전환체를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 한탄 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 한탄 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 한탄 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 항원으로 포함하는 신증후출혈열의 항체 진단용 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 신증후출혈열의 항체 측정 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

도 1은 한탄 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질 유전자를 포함하는 식물형질전환용 벡터의 제조과정 및 유전자 지도를 나타내는 모식도.

도 2는 한탄 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질 유전자가 클로닝된 pHS737 벡터를 제한효소XbaI과BamHI로 절단하여 전기영동한 결과를 나타내는 사진. M, 1 kb DNA 래더; 레인 1,XbaI과BamHI로 절단한 pHS737 벡터; 레인 2, 삽입 서열의 PCR 산물; 및 레인 3,XbaI과BamHI로 절단한 뉴클레오캡시드 유전자를 포함하는 pHS737 벡터 (pHS737/HTNV).

도 3은 형질전환 식물체에서 한탄 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질 유전자의 PCR 분석 결과를 나타내는 사진. M, 1 kb DNA 래더; 레인 1, 한탄 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질 유전자를 포함하는 양성 표준 플라스미드의 PCR 산물; 레인 2, 야생종 담배의 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR 산물; 및 레인 3-10, 선발된 담배 형질전환체의 DNA를 주형으로 한 PCR 산물.

도 4는 형질전환 식물체에서 발현된 한탄 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질을SDS-폴리아크릴아마이드 겔에서 전기영동한 결과 사진. M, 분자량 마커; 레인 1, 야생종 담배의 단백질; 및 레인 2, 형질전환 식물체 내 발현된 한탄 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질.

도 5는 형질전환 식물체에서 발현된 한탄 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질의 웨스턴 블롯 분석 결과를 보여주는 사진. M, 분자량 마커; 레인 1, 1 구간 용출액; 레인 2, 2 구간 용출액; 레인 3, 3 구간 용출액; 및 레인 4, 야생형 담배

도 6은 형질전환 식물체에서 발현된 한탄 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질의 항원성을 보여주는 그래프.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제 1 서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열 또는 그 일부를 포함하는 한탄 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

본 발명의 신규한 폴리뉴클레오타이드는 항원으로 작용할 수 있는 한탄 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 것으로서, 식물체내에서의 발현을 최적화 하기 위하여 변형된 서열을 갖는다.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 디자인은 다음과 같은 기준에 의해 실시된다: (ⅰ) GC 함량을 50% 이상으로 하고, (ⅱ) 식물이 선호하는 코돈을 갖도록 하며, (ⅲ) 인트론 유사 서열을 제거하는 것이다.

본 발명의 신규한 폴리뉴클레오타이드는 서열목록 제 1 서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열뿐만 아니라 일부의 서열도 포함한다. 즉, 상기 일부 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열이 항원성을 나타내는 경우에는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 포함된다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (ⅰ) 서열목록 제 1 서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열 또는 그 일부; (ⅱ) 상기 (ⅰ)의 폴리뉴클레오타이드에 작동적으로 연결되며 식물세포에서 작용하여 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 및 (ⅲ) 식물세포에서 작용하여 상기 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-비-해독화 부위를 포함하는 식물발현용 벡터를 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 적합한 프로모터는, 식물체의 형질전환을 위해 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 것도 이용될 수 있으며, 예를 들어, 콜리플라우어 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터, 노팔린 씬타아제 (nos) 프로모터, 피그워트 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 수가크레인 바실리폼 바이러스 프로모터, 콤멜리나 엘로우 모틀 바이러러스 프로모터, 리불로오스-1,5-비스-포스페이트 카르복실라아제 스몰 서브유티트 (ssRUBISCO)의 광유도성 프로모터, 쌀 사이토졸 트리오스포스페이트 이소머라아제 (TPI) 프로모터, 아라비돕시스의 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제 (APRT) 프로모터 및 옥토파인 신타아제 프로모터를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 적합한 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-비-해독화 부위는 아그로박테리움 튜머페이션스의 노팔린 신타아제 유전자로부터 유래된 것 (nos 3' end) (Bevan et al.,Nucleic Acids Research,11(2):369-385(1983)), 아그로박테리움 튜머페이션스의 옥토파인 신타아제 유전자로부터 유래된 것, 토마토 또는 감자의 프로테아제 억제자 I 또는 Ⅱ 유전자의 3' 말단 부분 및 CaMV 35S 터미네이터를 포함한다.

선택적으로, 상기 벡터는 리포터 분자 (예: 루시퍼라아제 및 β-글루쿠로니다아제)를 코딩하는 유전자를 추가적으로 운반한다. 또한, 본 발명의 벡터는 선택 표지로서 항생제 (예: 네오마이신, 카베니실린, 카나마이신, 스펙티노마이신, 하이그로마이신 등) 내성 유전자 (예: 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 (nptⅡ), 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 (hpt), 등)를 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 식물 세포를 상기 제 2 항의 식물발현용 벡터로 형질전환하는 단계; (b) 형질전환된 식물세포를 선별하는 단계; 및 (c) 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물체를 재분화시켜 형질전환 식물체를 수득하는 단계를 포함하는 한탄 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 발현하는 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기한 본 발명의 방법에 의해 제조된 식물 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 방법에 있어서, 식물세포의 형질전환은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있으며, 이는 전기천공 (Neumann, E. et al.,EMBO J., 1:841(1982)), 입자 밤바드먼트 (Yang et al.,Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 및 아그로박테리움-매개 형질전환 (미합중국 특허 제 5,004,863,5,349,124 및 5,416,011 호)을 포함한다. 이 중에서, 아그로박테리움-매개 형질전환이 가장 바람직하다. 아그로박테리움-매개 형질전환은 일반적으로 잎 디스크, 그리고 다른 조직 (자엽 및 배축)을 가지고 실시된다. 아그로박테리움-매개 형질전환은 쌍자엽 식물에서 가장 효율적이다.

형질전환된 식물세포의 선별은 형질전환 배양물을 선택제 (예: 대사 억제제, 항생제 및 제초제)에 노출시켜 실시될 수 있다. 형질전환되고 선택제 내성을 부여하는 표지 유전자를 안정되게 포함하고 있는 식물 세포는 상기한 배양물에서 성장하고 분할한다.

식물 원형질 또는 다양한 익스플랜트로부터 식물체의 발달 또는 재분화시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 형성된 형질전환 발근 신초는 적합한 식물 성장 배지에 치상된다. 아그로박테리움에 의해 도입된 외래 유전자를 포함하는 식물체의 발달 또는 재분화는 당업계에 공지된 방법에 따라 달성될 수 있다 (미합중국 특허 제 5,004,863, 5,349,124 및 5,416,011 호).

한편, 본 발명자들은 신규한 형질전환 식물체 (예: 담배, 참외, 오이, 수박 및 유채)를 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였고, 그 결과 특정 식물체의 형질전환을 위한 가장 효율적인 방법을 구축하였다. 이러한 방법은 PCT/KR02/01461, PCT/KR02/01462 및 PCT/KR02/01463에 개시되어 있으며, 상기 특허문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명의 방법은 다양한 식물체에 적용되지만, 바람직하게는 담배, 참외, 오이, 수박 및 유채에 적용된다.

본 발명에 있어서, 바람직한 형질전환 방법은 아그로박테리움 시스템을 이용하여 실시되며, 보다 바람직하게는 아그로박테리움 튜머페이션스 (Agrobacterium tumefaciens)-바이너리 벡터 시스템을 이용하여 실시된다.

아그로박테리움 시스템을 이용하는 방법에 있어서, 구체적인 일 실시예는 다음의 단계를 포함한다: (a') 식물 세포의 지놈 DNA에 삽입될 수 있고 다음의 서열을 갖는 벡터가 내재되어 있는 아그로박테리움 튜머페이션스 (Agrobacterium tumefaciens)로 식물체의 익스플랜트를 감염시키는 단계: 서열목록 제 1 서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열 또는 그 일부; (ⅱ) 상기 (ⅰ)의 폴리뉴클레오타이드에 작동적으로 연결되며 식물세포에서 작용하여 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 및 (ⅲ) 식물세포에서 작용하여 상기 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-비-해독화 부위; (b') 상기 감염된 익스플랜트를 재분화 배지에서 재분화하여 재분화 신초를 얻는 단계; 및 (c') 상기 재분화 신초를 발근 배지에서 배양하여 형질전환 식물체를 얻는 단계.

상기한 구체적인 일 실시예에서, 형질전환에 적합한 익스플랜트는 발아된 종자로부터 유래된 어떠한 조직도 포함하며, 바람직하게는 자엽 및 배축이고, 가장 바람직하게는 자엽이다. 종자의 발아는 적합한 배지를 이용하여 적합한 암/광조건 하에서 실시된다. 식물 세포의 형질전환은 Ti 플라스미드를 포함하는 아그로박테리움 튜머페이션스를 가지고 실시된다 (Depicker, A. et al., Plant cell transformation byAgrobacteriumplasmids. In Genetic Engineering of Plants, Plenum Press, New York (1983)).

보다 바람직하게는, pBin19, pRD400, pRD320 및 pHS737과 같은 바이너리 벡터 시스템이 이용된다 (An, G. et al., "Binary vectors" In Plant Gene Res. Manual, Martinus Nijhoff Publisher, New York(1986); R. K. Jain, et al.,Biochem. Soc. Trans.28:958-961(2000)).

아그로박테리움 튜머페이션스에 의한 익스플랜트의 감염은 당업계에 공지된 방법을 포함한다. 가장 바람직하게는, 상기 감염 과정은 아그로박테리움 튜머페이션스의 배양물에 자엽을 함침시켜 공동배양하는 과정을 포함한다. 이에 의해 아그로박테리움 튜머페이션스는 식물내로 감염된다. 공동배양액에는 바람직하게는 아세토시링곤이 포함되는데, 이는 아그로박테리움의 식물로의 형질전환을 돕기 위한 것이다.

아그로박테리움 튜머페이션스에 의해 형질전환된 익스플랜트는 재분화 배지에서 재분화되며, 이는 신초의 재분화를 성공적으로 야기한다. 본 발명에 따르면, 재분화 배지는 MS, B5, LS, N6 및 화이트'스 등과 같은 영양 기본 배지, 에너지원 그리고 식물 성장 조절제를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 에너지원은 보다 바람직하게는 당류이고, 가장 바람직하게는 수크로스이다. 한편, 본 발명의 재분화 배지는 pH 완충 역할을 하는 MES를 추가적으로 포함할 수 있고, 고체 지지체로서 아가를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 재분화 배지에는 식물 성장 조절제가 포함된다. 식물 성장 조절제 중 함유되는 시토키닌은 6-벤질아미노퓨린 (BAP), 키네틴, 제아틴, 이소펜틸아데노신 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 가장 바람직하게는 6-벤질아미노퓨린이 이용된다. 한편, 옥신계 성장 조절제 (예: 1- 나프탈렌아세트산, 인돌아세트산, (2,4-디클로로페녹시) 아세트산)도 재분화배지에 포함될 수 있다.

재분화된 조직은 발근 배지에서 발근되어 형질전환 식물이 생산된다.

본 발명에 따라 형질전환된 식물은 당업계에 공지된 방법에 의해 형질전환 여부가 확인된다. 예를 들어, 형질전환된 식물의 조직으로부터 얻은 DNA 시료를 이용하여, PCR을 실시하면 형질전환 식물의 지놈에 삽입된 외래 유전자가 규명될 수 있다. 택일적으로, 노던 또는 서던 블롯팅을 실시하여 형질전환 여부를 확인할 수 있다 (Maniatis et al.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)). 한편, 형질전환 시 이용되는 벡터에 β-글루쿠로니다아제 유전자가 있는 경우에는 재분화된 자엽 조직의 일부를 X-gluc (5-Bromo-4-Chloro-3-Indole-β-D-Glucuronic Acid) 등의 기질 용액에 침지시켜 발색되는 양상을 육안으로 관찰함으로써 형질전환 여부를 용이하게 확인할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 식물 세포를 상술한 본 발명의 벡터로 형질전환하는 단계; (b) 형질전환된 식물세포를 선별하는 단계; (c) 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물체를 재분화시켜 형질전환 식물체를 수득하는 단계; 및 (d) 상기 형질전환 식물체로부터 한탄 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 한탄 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 방법에 의해 제조된 한탄 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 제공한다.

본 발명의 식물 형질전환체의 다양한 기관 (예: 줄기, 잎, 뿌리, 열매, 종자 등)으로부터 유래된 조직으로부터 한탄 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 얻을 수 있으며, 상기 조직으로부터 얻은 추출액을 통상적인 정제과정을 거쳐 얻을 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 정제 단계는 당업계에서 통상적으로 이용되는 정제방법을 채용하여 실시할 수 있다. 예컨대, 암모늄 설페이트 또는 PEG 등을 이용한 용해도에 따른 분리 (solubility fractionation), 분자량에 따른 한외여과 분리, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 다양한 방법이 이용될 수 있고, 통상적으로는 상기한 방법의 조합을 이용하여 정제하게 된다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명의 한탄 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질의 N-말단에 6 x His이 있는 경우에는, Ni-NTA His-결합 레진 컬럼 을 이용하여 소망하는 한탄 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 신속하고 용이하게 분리 및 정제할 수 있다.

본 발명의 방법에 따르면, 식물 형질전환체를 이용함으로써 저렴한 비용으로 한탄 바이러스 유래 뉴클레오캡시드 단백질을 대량 생산할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 시험 대상의 개체로부터 시험액 (testing fluid)을 수득하는 단계; (b) 상기 본 발명의 한탄 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 항원으로 이용하여 상기 시험액과 항원-항체 반응을 유도하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)에서 항원-항체 반응의 발생 (occurrence) 여부를 측정하는 단계를 포함하는 신증후출혈열의 항체 측정 방법을 제공한다.

본 발명에서는 다양한 생체액 (예: 혈액, 혈청, 오줌, 땀 등)에 적용될 수 있지만, 바람직하게는 혈액이고, 보다 바람직하게는 혈청이다.

본 발명의 방법은 항원-항체 결합을 원리로 하는 모든 분석방법이 사용될 수 있다. 가장 바람직하게는, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assy) 방법에 따라 실시하는 것이다. 보다 구체적으로는, (ⅰ) 웰 플레이트에 항-인간 항체를 흡착시키는 단계; (ⅱ) 상기 웰 플레이트에 검체의 혈청을 첨가하여 반응시키고 세척하는 단계; (ⅲ) 한탄 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질을 첨가하여 반응시키는 단계; (ⅳ) 한탄 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 단일클론 항체를 첨가하여 반응시키는 단계; (ⅴ) 상기 웰 플레이트를 세척한 후 발색효소 또는 형광물질이 결합된 2차 항체를 첨가하여 반응시키는 단계; 및 (ⅵ) 2차 항체의 결합여부를 측정하는 단계를 포함하는 방법으로 실시된다.

상기 발색 효소는 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 페록시다아제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 알칼린 포스파타아제를 이용하는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), ECF 기질 등이 이용되고, 호스 래디쉬 페록시다아제를 이용하는 경우에는 기질로서 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, 루미놀, ABTS (2,2´-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]) 등이 이용된다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 한탄 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 항원으로 포함하는 신증후출혈열의 항체 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 진단 키트가 포함하는 한탄 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질은 식물체에서 발현된 재조합 단백질로서, 인간 및 동물에는 감염성이 없으면서, 한탄 바이러스 항체에 대한 특이성 및 민감성이 매우 우수하며, 이러한 하기의 실시예에서 증명되어 있다.

본 발명의 진단 키트가 기본적으로 ELISA 용으로 개발되는 경우에는, 플레이트 (또는 한탄 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질로 표면 코팅된 플레이트), 완충용액, 발색효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 한탄 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질의 신규 유전자의 합성

천연의 한탄 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질 유전자와 동일하게 429개의 아미노산 (참조: 서열목록 제 2 서열)을 암호화하면서도, 기존의 한탄 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열과는 다르게, 식물체가 선호하는 최적의 뉴클레오타이드 서열을 디자인하였다. 신규 유전자의 디자인 기준은, 첫째, GC 함량을 50% 이상으로 하고, 식물이 선호하는 코돈을 갖도록 하였으며, 그리고 인트론 유사 서열을 제거하는 것이다. 이렇게 디자인된 뉴클레오타이드 서열은 Plant Biotechnology Institute (이하 "PBI"로 표시), National Research Centre (SK, 캐나다)에서 화학적으로 합성하였다. 합성된 한탄 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 DNA는 서열목록 제 1 서열에 기재되어 있다.

실시예 2: 한탄 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질 유전자의 식물 발현용 벡터의 제작

한탄 바이러스의 뉴클레오캡시드를 코딩하는 합성 유전자는 1287 bp로 구성되어 있으며, 5'-말단에XbaI과 3'-말단에BamHI의 인식부위를 가질 수 있도록 합성되어 있다.

식물 발현용 바이너리 벡터인 pHS737 (PBI, National Research Centre, 캐나다)을 제한효소XbaI과BamHI 효소로 함께 처리하여 절단한 후 분리·정제하였다. 상기 1284 bp 합성 유전자와 절단된 pHS737 벡터를 혼합하고, 이 혼합물에 라이게이션 완충액 (KOSCO, 한국) 및 T4 리가아제 (KOSCO, 한국)를 첨가한 후 1시간 이상 16℃에서 반응 시켰다. 그런 다음, 반응물을 CaCl₂로 처리된 컴피턴트 세포 (E. colistrain DH5α(Promega, 미국)에 형질전환시킨 후 항생제 카나마이신 (100 mg/㎖)이 포함된 LB 배지에서 항생제 저항성 균주를 선별하였다.

선발된 클론으로부터 알칼리 방법을 이용하여 플라스미드 DNA를 분리하였고, 정방향 프라이머 5'-AAT CTA GAA ATG GCT ACT AT-3'과 역방향 프라이머 5'-AAG GAT CCC CGA GCT TGA GA-3'를 사용해서 중합효소연쇄반응 (PCR)을 실시하였다. PCR 증폭에서 이용된 효소는 Taq 중합효소(솔젠트, 한국)이고, 온도 조건은 다음과 같이 세팅하였다: 96℃에서 2분간 전변성한 후, 94℃에서 1분간 변성, 55℃에서 1분간 연결반응, 72℃에서 2분간의 중합반응을 35회 반복하였고, 추가로 72℃에서 10분간 연장 반응을 하였다.

이어, 증폭 생성물을 1.0% 아가로스 겔에서 분석하여 목적하는 인서트 서열이 플라스미드에 있음을 확인하였다 (참조: 도 2).

실시예 3: 식물체의 형질전환

실시예 3-1:아그로박테리움 튜머페이션스 ( Agrobacterium tumefaciens ) GV3101 감염 브로스의 제조

실시예 2에서 제작한 재조합 pHS737/SNV 벡터를 접합 (conjugation)에 의하여 아그로박테리움 튜머페이션스 GV3101 (Mp90)에 도입하였다. 재조합 pHS737/HTNV 벡터를 가진 대장균 S17-1과 아그로박테리움 튜머페인션스 GV3101 (Mp90)를 각각 액체 LB배지에서 대수기까지 배양하였다. 이들 각각의 세포들을 에펜도르프 튜브에 1:1로 함께 혼합한 다음 30초간 원심분리하여 세포들을 농축시킨 후 28℃에서 1-2일 동안 정치배양을 하였다. 시간이 경과한 세포들이 든 에펜도르프 튜브는 살살 흔들어 주어 농축된 세포를 부유화시킨 다음, 50 mg/L 카나마이신 및 30 mg/L 겐타마이신이 첨가된 LB 고체배지에 도말한 다음, 28℃에서 2일 동안 배양한 후 콜로니를 선별하였다. 상기 벡터가 도입된 균주를 아그로박테리움 튜머페이션스 GV3101-pHS737/HTNV로 명명하였다 (Alt-Morbe et al.,J. Bacteriol.178:4248-4257(1996)).

pHS737/HTNV를 갖는 아그로박테리움 튜머페이션스 GV3101-pHS737/HTNV 를 슈퍼브로스 (BHI 배지, pH 5.6)에 접종한 후 28℃에서 2일간 배양하였으며, 이 배양물을 식물체의 감염에 사용하였다.

실시예 3-2:식물세포의 형질전환 및 재분화

먼저 소독한 담배의 종자를 파종하여 2 주 이상 무균 배양한 신선하고 어린 잎을 채취하였다. 한탄 바이러스 뉴클레오캡시드 유전자를 가진 pHS737 벡터를 갖는 아그로박테리움 튜머페이션스 GV3101(Mp90)를 100 μM 아세토시링곤 (acetosyringone)이 함유된 수퍼 브로스 (Super broth: 37 g/l Brain heart infusion broth(Difco), 0.2% 수크로스, pH 5.6)에서 18시간 동안 배양한 다음, 이 배양액에 상기 자엽 절편을 침지시켜 20 분간 혼합하였다.

그런 다음, 25℃에서 암배양 조건으로 공동배양 배지 [3.0% 수크로스 , 0.5 g/L MES(2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid Monohydrate) , 1.0 mg/L BAP, 0.1 mg/L NAA가 함유된 MSB5 (Murashige & Skoog medium including Gamborg B5 vitamins)]에서 2 일 동안 공동배양하였다. 그리고 나서, 세균을 제거하는 클린 업 (clean up) 단계를 거쳐, 잎 절편을 선발 배지 (MSB5, 0.5 g/L MES , 3 % 수크로스 및 0.6 % 피타겔을 기본으로 하는 배지에 BAP 1.0 mg/L , NAA 0.1 mg/L, 카르베니실린 500 mg/L 및 카나마이신 100 mg/L 포함)에 이식하여 2 주 동안 배양하여 형질전환된 것으로 추정되는 발근된 신초를 선별하여, 재분화 배지 (MSB5, 500 mg/L 의 MES, BAP 0.01 mg/L, NAA 0.1 mg/L, 카르베니실린 500 mg/L, 카나마이신 100 mg/L, 3% 수크로스, 0.6% 아가)에서 배양하였다. 재분화된 신초를 발근 배지 (MSB5, 500 mg/L 의 MES, NAA 0.1 mg/L, 카르베니실린 500 mg/L, 카나마이신 100 mg/L, 3% 수크로스, 0.6% 아가)에 옮겨 배양하여 발근한 개체를 형질전환체로 추정하여 하기 실시예 4의 방법을 이용하여 분석하였다.

실시예 4: 형질전환 식물체의 PCR 분석

상기 실시예 3에서 확보한 형질전환 식물체의 확인은 다음과 같이 실시하였다: 선발 배지에서 형질전환체로 선발된 신초 10 mg을 에드워드 (Edward) 방법 (Nucleic Acids Research, 19:1349(1991))을 사용하여 식물 지놈 DNA를 분리한 후, 이를 주형 DNA로 하여 PCR 분석을 실시하였다.

한탄 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질 유전자의 형질전환 식물체의 PCR 분석에 사용된 프라이머는 뉴클레오캡시드 단백질 유전자 의 염기 서열에 대응하는 것으로서, 정방향 프라이머는 5'-AAT CTA GAA ATG GCT ACT AT-3' 이고, 역방향 프라이머는 5'-AAG GAT CCC CGA GCT TGA GA-3' 이다. PCR 반응은 Taq 중합효소 (솔젠트, 한국)를 이용하여 96℃에서 2분간 전변성한 후, 94℃에서 1분간 변성, 55℃에서 1분간 연결반응, 72℃에서 2분간의 중합반응을 35회 반복하였고, 추가로 72℃에서 10분간 연장 반응을 한 후 반응산물은 1.0% 아가로스 겔에서 분석하였다 (참조: 도 3). 도 3 에서 M 열은 분자량 마커, 1 열은 한탄 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질 유전자를 포함하는 양성 표준 플라스미드의 PCR 산물, 2 열은 야생종 담배의 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR 산물, 3 열부터 10 열까지는 선발된 담배 형질전환체의 DNA를 주형으로 한 PCR 산물들을 나타낸 것이다. 도 3에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 식물 형질전환체에서 한탄 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질 유전자에 해당하는 1.3 kb DNA 밴드가 관찰되어 형질전환되었음을 확인할 수 있었다.

실시예 6: 형질전환 식물체에서 한탄 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질의 분리 및 정제

적당량의 액체질소가 들어있는 막자사발에 형질전환 식물체의 잎 1 g을 잘라서 넣고 식물조직을 분쇄하였다. 식물 생중량 0.5 g 당 단백질 분해효소 제거제가 함유된 추출완충액 (250 mM Sucrose, 1 M Hepes, 1 mM MgCl₂, 1 mM DTT) 2 ㎖ 를 첨가하여 미세하게 갈았다. 추출액을 12,000 rpm, 4℃에서 30분 이상 원심분리한 후 상등액을 취하여 새 튜브로 옮겼다. 이 용해된 세포용액을 니켈 수지가 함유된 프로본드 (Probond) 컬럼 (Quiagen GmbH, 독일)에 첨가하여 실온에서 10분간 약하게 흔들어주면서 세포용액내의 한탄 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질이 니켈 수지에 잘 흡착되도록 하였다.

뉴클레오캡시드 단백질이 흡착된 수지를 동량의 pH 7.8 흡착 완충용액 (20mM Sodium Phosphate, 500 mM Sodium Chloride)으로 2회 세척하여 수지에 흡착된 식물세포 유래 단백질을 제거하였다. 이와 같이 세척된 수지에 동량의 pH 6.0 세척 완충용액 (20 mM Sodium Phosphate, 500 mM Sodium Chloride)을 첨가하여 실온에서 약하게 흔들어주어 수지를 재차 세척하고, 다시 동량의 pH 4.0 용출 완충용액 (20 mM Sodium Phosphate, 500 mM Sodium Chloride)을 첨가하여 한탄 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질을 용출시켰다.

식물 형질전환체에서 발현된 한탄 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질은 아미노 말단에 6개의 히스티딘 잔기를 가지고 있어 양이온을 띠는 니켈 수지에 결합되어 쉽게 분리된다. 이러한 과정을 거쳐 식물세포 단백질들이 모두 제거된 한탄 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질만을 순수하게 정제하였다. 이와같이 용출된 단백질을 센트리콘 (Amicon Co., U.S.A.)을 사용하여 농축하였다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 한탄 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질을 SDS-PAGE 겔 상에서 전기영동한 후 쿠마시블루로 염색한 결과 야생형 담배에서는 검출되지 않는 48 kD의 한탄 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질이 세포 용출액에서 검출되었고, 특히 니켈 수지 칼럼으로 용출한 경우는 식물세포 단백질이 모두 제거된 순수한 한탄 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질이 검출됨을 확인하였다.

상기의 방법으로 정제된 한탄 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질은 브래드포드 (Bradford) 방법에 의해 염색제 (Protein assay kit, Bio-Rad)를 넣고 UV-분광광도계로 595 nm에서 흡광도를 측정하고 BSA (Bovine Serum Albumin) standard와 비교해서 단백질 정량을 실시하였다. 추출된 단백질은 양이 동일하도록 조정하여 각 시료를 8% 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 하였고, 이에 대해 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다 (참조: Peter B. Kaufma et al.,Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, 108-121, CRC press). 웨스턴 블럿 분석은 아래와 같은 방법으로 시행되었다. 상기 SDS-PAGE 겔에 있는 단백질을 Semi-Dry Transfer Units (Hoefer, 미국)를 이용하여 PVDF 막으로 이동시켰다. 겔에 있는 단백질 전부가 PVDF 막에 이동한 것을 확인한 다음 PVDF막을 건조시켰다. 이 PVDF막을 한탄 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질 항원에 특이적으로 반응하는 단일클론 항체 (Center of disease control, Georgia, USA)가 첨가된 0.5% BSA/TBS (Tris-Buffered Saline) 용액에 1시간 동안 반응시킨 다음 TBS 용액으로 PVDF 막을 5분씩 세 번 세척하였다. 그런 다음 퍼옥시다아제 표지 2차 항체 (peroxidase labelled-anti human IgG, KPL, U.S.A.)와 1시간 동안 반응시킨 후 다시 TBS 용액으로 PVDF 막을 10분씩 세 번 세척하였다. 마지막으로 ABTS 발색기질액 (KPL, U.S.A.)을 첨가된 왼충액에 PVDF 막을 넣고 실온에서 30분간 반응시켜 발색시킨 후 그 결과를 판독하였다(도 5). 도 5에서 확인할 수 있듯이, 웨스턴 블럿 분석을 수행한 결과 상기 결과와 동일하게 48 kD의 한탄 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질이 확인되었다.

실시예 7: 한탄 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질이 흡착된 96-웰 플레이트를 이용한 신증후출혈열의 진단

실시예 7-1 :한탄 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 항체 역가 측정

식물 형질전환체에서 분리·정제된 한탄 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질을 신증후출혈열의 진단에 사용할 수 있는지를 확인하기 위하여, 뉴클레오캡시드 단백질을 항원-항체 반응을 96-웰 마이크로타이터 플레이트를 이용하여 측정하였다.

96-웰 마이크로타이터 플레이트에 정제된 뉴클레오캡시드 단백질을 인산염 완충용액에 연속적으로 희석하여, 웰당 100 ㎕ 씩 분주한 후, 4℃에서 8시간 이상 방치하여 항원을 웰에 고정시켰다. 단백질 항원이 흡착된 플레이트를 세척 완충용액 (0.05 % Tween 20, 0.01 M Phosphate, pH 7.6)으로 3회 세척하여 플레이트에 흡착되지 못한 항원을 제거하고, 신 놈브레바이러스 뉴클레오캡시드 단백질 항원에 대한 단일클론항체 (Centers of disease control, Georgia, USA)를 희석액 (0.1% BSA, 0.05% Tween 20, 20 mM Trisma base, 150 mM NaCl)에 일정 희석배수로 희석하여 웰 당 100 ㎕ 씩 분주한 후 실온에서 1시간 이상 반응시켜 항원-항체반응을 유도하였다. 그런 다음 세척 완충용액으로 각각의 웰을 3회 세척한 후에 블롯킹 완충액을 각 웰에 분주하고 실온에서 1시간 동안 반응시킨 다음 상기와 동일하게 세척하였다. 퍼옥시다아제 표지 2차 항체 (peroxidase labelled-anti human IgG, KPL, U.S.A.)를 분주하고 상기와 동일하게 반응 및 세척하였다. 마지막으로 각 웰에 ABTS 발색기질액 (KPL, U.S.A.)을 첨가하여 실온에서 30분간 반응시켜 발색시킨 후 ELISA 판독기 (ELISA Reader, Titertek, USA) 로 405 nm 파장에서 그 결과를 판독하였으며, 그 결과를 표 1에 나타내었다. 표의 가로축은 정제된 한탄 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질의 희석 배수를 나타내며 (희석 전 양: 73 ng, 20480배 희석: 36 pg), 세로축은 상기 단백질에 대한 항체의 초기 역가를 1로 보았을 때 희석한 배수를 나타낸 것이다. 표 1에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 뉴클레오캡시드 단백질은 우수한 항원성을 나타낸다.

도 6은 정제 완료 된 한탄 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질 36 pg과 반응하는 항체 역가군을 야생형 식물체에서 분리한 단백질과 비교하여 도식화 한 것이다. 그림에서와 같이 재조합 식물체에서 분리 정제한 뉴클레오캡시드 단백질의 항원성은 탁월하게 나타났으며, 이와 비교하여 야생형 식물체에서 분리한 단백질은 전혀 항원성을 나타내지 않았다.

	뉴클레오캡시드 단백질의 희석 배수
항체 희석배수	10	20	40	80	160	320	640	1280	2560	5120	10240	20480
100	< 3.0	< 3.0	< 3.0	< 3.0	2.33	2.36	2.18	2.15	2.10	1.97	1.71	1.55
200	< 3.0	< 3.0	< 3.0	< 3.0	2.24	2.26	2.09	2.03	2.03	1.89	1.60	1.45
400	< 3.0	< 3.0	< 3.0	2.83	2.21	2.22	2.00	2.01	1.98	1.69	1.55	1.34
800	< 3.0	< 3.0	2.75	2.61	2.09	2.01	2.00	2.01	1.94	1.58	1.50	1.21
1600	< 3.0	2.63	2.51	2.33	1.99	1.87	1.82	1.78	1.87	1.43	1.3	1.14
3200	2.58	2.40	2.31	2.23	1.95	1.79	1.75	1.45	1.76	1.24	1.13	0.87
6400	2.40	2.32	2.19	2.11	1.68	1.56	1.43	1.19	1.64	1.15	0.83	0.68
1280	2.05	1.9	1.74	1.68	1.25	1.20	0.9	0.9	0.65	0.66	0.68	0.53

실시예 7-2 :신증후출혈열의 진단

식물 형질전환체에서 분리·정제된 한탄 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질을 실질적으로 신증후출혈열의 진단에 사용할 수 있는지를 확인하기 위하여, 신증후출혈열 환자의 혈청 내의 항체 역가를 측정하였다.

96-웰 마이크로타이터 플레이트에 인산염 완충용액으로 일정량 희석된 항-인간 IgM 항체 (goat anti-human IgM, KPL, U.S.A.) 를 웰당 100 ㎕ 씩 분주한 후, 4℃에서 8시간 이상 방치하여 항체를 웰에 고정시켰다. 항체가 흡착된 플레이트를 세척 완충용액 (0.05 % Tween 20, 0.01 M Phosphate, pH 7.6)으로 3회 세척하여 플레이트에 흡착되지 못한 항체를 제거하고, 환자 혈청을 희석액 (0.1% BSA, 0.05% Tween 20, 20 mM Trisma base, 150 mM NaCl)에 일정 희석배수로 희석하여 웰 당 100 ㎕ 씩 분주한 후 실온에서 1시간 이상 반응시키고 상기와 동일한 세척액으로 3회 세척하였다.

농도별로 희석액에 용해된 한탄 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질을 각 웰에 100 ㎕ 씩 분주한 후 실온에서 1시간 이상 방치하여 2차 항원-항체반응을 유도하였다. 다시 세척 완충용액으로 각각의 웰을 세척한 후에 희석액에 10 ug/ ㎖ 농도로 용해된 뉴클레오캡시드 항원 단백질에 대한 단일클론항체 (Center of disease control, Georgia, USA)를 각 웰당 100 ㎕씩 분주하여 실온에서 1 시간 동안 반응시킨 후 세척액으로 3회 세척하였다.

그런 다음 퍼옥시다아제 표지 2차 항체 (peroxidase labelled-anti human IgG, KPL, U.S.A.)를 분주하고 상기와 동일하게 반응 및 세척하였다. 마지막으로 각 웰에 ABTS 발색기질액 (KPL, U.S.A.)을 첨가하여 실온에서 30분간 반응시켜 발색시킨 후 ELISA 판독기 (ELISA Reader, Titertek, USA) 로 405 nm 파장에서 그 결과를 판독하였으며, 그 결과를 표 2에 나타내었다. 결과는 흡광도 값이 1.5 이상인 희석배수를 양성으로 판독하였다.

번호	혈청	항체 역가
1	환자 1	800
2	환자 2	800
3	환자 3	6400
4	환자 4	400
5	환자 5	6400
6	환자 6	200
7	환자 7	200
8	환자 8	800
9	환자 9	6400
10	환자 10	6400
11	환자 11	12800
12	환자 12	400
13	환자 13	25600
14	환자 14	12800
15	환자 15	25600
16	환자 16	12800
17	환자 17	800
18	환자 18	1600
19	환자 19	200
20	환자 20	25600
21	정상인 1	< 100
22	정상인 2	< 100
23	정상인 3	< 100
24	정상인 4	< 100
25	정상인 5	< 100
26	정상인 6	< 100
27	정상인 7	< 100
28	정상인 8	< 100
29	정상인 9	< 100
30	정상인 10	< 100

표 2에 나타낸 바와 같이 정상인의 혈청은 항체 역가가 모두 100 이하를 나타낸 반면, 신증후 출혈열 환자의 혈청에서는 항체 역가가 200-25600을 나타내어 신증후 출혈열 환자와 정상인의 감별이 뚜렷하게 나타났다. 이는 재조합 식물체에서 분리한 한탄 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질 항원을 이용한 항원-항체 반응이 높은 특이성으로 발생함을 보여주는 것으로서, 이를 통해 신증후 출혈열 환자를 감별할 수 있음을 확인하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 한탄 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 신규한 폴리뉴클레오타이드 및 그를 포함하는 식물발현용 벡터를 제공한다. 또한, 본 발명은 한탄 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 발현하는 형질전환 식물체의 제조방법 및 식물 형질전환체를 제공한다. 본 발명은 한탄 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질의 제조방법 및 한탄 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 제공한다. 한편, 본 발명은 신증후출혈열의 항체 진단용 키트 및 신증후출혈열의 항체 측정 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 저비용으로 우수한 항원성을 나타내는 한탄 바이러스의 재조합 뉴클레오캡시드 단백질을 얻을 수 있고, 이를 이용하는 경우에는 우수한 민감도 및 특이성으로 신증후출혈열을 진단할 수 있다.

<110> NEXGEN BIOTECHNOLOGIES, INC. <120> Diagnosis Kits for Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome Comprising Nucleocapsid Protein from Hantann Virus Expressed in Plants <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1287 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding nucleocapsid of hantann virus <220> <221> CDS <222> (1)..(1287) <400> 1 atg gct act atg gag gaa ctc caa cgc gaa atc aac gcc cat gaa ggg 48 Met Ala Thr Met Glu Glu Leu Gln Arg Glu Ile Asn Ala His Glu Gly 1 5 10 15 caa ttg gtg ata gcc cgc cag aaa gtg aga gac gcc gag aaa cag tat 96 Gln Leu Val Ile Ala Arg Gln Lys Val Arg Asp Ala Glu Lys Gln Tyr 20 25 30 gag aaa gat cca gat gaa ctt aac aag agg act ctc acc gat aga gaa 144 Glu Lys Asp Pro Asp Glu Leu Asn Lys Arg Thr Leu Thr Asp Arg Glu 35 40 45 gga gtc gca gtt tca att cag gct aag ata gat gag ctt aag cga cag 192 Gly Val Ala Val Ser Ile Gln Ala Lys Ile Asp Glu Leu Lys Arg Gln 50 55 60 ctc gcc gac cgg atc gct acc gga aaa aat cta ggg aag gag caa gat 240 Leu Ala Asp Arg Ile Ala Thr Gly Lys Asn Leu Gly Lys Glu Gln Asp 65 70 75 80 ccc aca ggt gtc gaa cca ggt gac cat tta aaa gag agg tcg atg ctt 288 Pro Thr Gly Val Glu Pro Gly Asp His Leu Lys Glu Arg Ser Met Leu 85 90 95 agc tac ggt aac gtc ctc gat ctt aat cac ctg gat att gac gag ccc 336 Ser Tyr Gly Asn Val Leu Asp Leu Asn His Leu Asp Ile Asp Glu Pro 100 105 110 aca gga cag acg gct gat tgg ctg tct atc att gtg tat ctt act tct 384 Thr Gly Gln Thr Ala Asp Trp Leu Ser Ile Ile Val Tyr Leu Thr Ser 115 120 125 ttc gtt gtt cca atc ctt ttg aaa gct cta tac atg ctc acc acg aga 432 Phe Val Val Pro Ile Leu Leu Lys Ala Leu Tyr Met Leu Thr Thr Arg 130 135 140 gga agg cag act acc aag gat aat aaa gga acc cgc att aga ttt aag 480 Gly Arg Gln Thr Thr Lys Asp Asn Lys Gly Thr Arg Ile Arg Phe Lys 145 150 155 160 gat gac agt agt ttc gaa gac gtg aac ggt ata cgt aag cca aag cat 528 Asp Asp Ser Ser Phe Glu Asp Val Asn Gly Ile Arg Lys Pro Lys His 165 170 175 ctg tac gtc agc ttg cct aac gcc caa tct agc atg aag gca gag 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tcc cca tca tca 912 Glu Ala Ala Gly Cys Ser Met Ile Glu Asp Ile Glu Ser Pro Ser Ser 290 295 300 atc tgg gtt ttt gcc ggt gca cca gat cgt tgc cct ccg aca tgc ttg 960 Ile Trp Val Phe Ala Gly Ala Pro Asp Arg Cys Pro Pro Thr Cys Leu 305 310 315 320 ttc ata gca gga att gcc gag ctg ggc gct ttt ttc tca att ttg caa 1008 Phe Ile Ala Gly Ile Ala Glu Leu Gly Ala Phe Phe Ser Ile Leu Gln 325 330 335 gac atg aga aat aca ata atg gcg tcc aaa act gtc ggc aca tca gaa 1056 Asp Met Arg Asn Thr Ile Met Ala Ser Lys Thr Val Gly Thr Ser Glu 340 345 350 gag aaa ttg cgg aag aag agt agc ttt tac caa tcc tat ttg cgt agg 1104 Glu Lys Leu Arg Lys Lys Ser Ser Phe Tyr Gln Ser Tyr Leu Arg Arg 355 360 365 acc caa tct atg ggt atc caa cta ggc cag cgt atc att gta ctc ttc 1152 Thr Gln Ser Met Gly Ile Gln Leu Gly Gln Arg Ile Ile Val Leu Phe 370 375 380 atg gtg gcg tgg ggc aaa gag gct gta gat aac ttt cac ctt gga gac 1200 Met Val Ala Trp Gly Lys Glu Ala Val Asp Asn Phe His Leu Gly Asp 385 390 395 400 gat atg gac cct gag ctt cgt act ctc gca caa tcc ttg atc gat gtt 1248 Asp Met Asp Pro Glu Leu Arg Thr Leu Ala Gln Ser Leu Ile Asp Val 405 410 415 aaa gtt aag gag att tcc aat caa gaa cct ctc aag ctc 1287 Lys Val Lys Glu Ile Ser Asn Gln Glu Pro Leu Lys Leu 420 425 <210> 2 <211> 429 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 2 Met Ala Thr Met Glu Glu Leu Gln Arg Glu Ile Asn Ala His Glu Gly 1 5 10 15 Gln Leu Val Ile Ala Arg Gln Lys Val Arg Asp Ala Glu Lys Gln Tyr 20 25 30 Glu Lys Asp Pro Asp Glu Leu Asn Lys Arg Thr Leu Thr Asp Arg Glu 35 40 45 Gly Val Ala Val Ser Ile Gln Ala Lys Ile Asp Glu Leu Lys Arg Gln 50 55 60 Leu Ala Asp Arg Ile Ala Thr Gly Lys Asn Leu Gly Lys Glu Gln Asp 65 70 75 80 Pro Thr Gly Val Glu Pro Gly Asp His Leu Lys Glu Arg Ser Met Leu 85 90 95 Ser Tyr Gly Asn Val Leu Asp Leu Asn His Leu Asp Ile Asp Glu Pro 100 105 110 Thr Gly Gln Thr Ala Asp Trp Leu Ser Ile Ile Val Tyr Leu Thr Ser 115 120 125 Phe Val Val Pro Ile Leu Leu Lys Ala Leu Tyr Met Leu Thr Thr Arg 130 135 140 Gly Arg Gln Thr Thr Lys Asp Asn Lys Gly Thr Arg Ile Arg Phe Lys 145 150 155 160 Asp Asp Ser Ser Phe Glu Asp Val Asn Gly Ile Arg Lys Pro Lys His 165 170 175 Leu Tyr Val Ser Leu Pro Asn Ala Gln Ser Ser Met Lys Ala Glu Glu 180 185 190 Ile Thr Pro Gly Arg Tyr Arg Thr Ala Val Cys Gly Leu Tyr Pro Ala 195 200 205 Gln Ile Lys Ala Arg Gln Met Ile Ser Pro Val Met Ser Val Ile Gly 210 215 220 Phe Leu Ala Leu Ala Lys Asp Trp Ser Asp Arg Ile Glu Gln Trp Leu 225 230 235 240 Ile Glu Pro Cys Lys Leu Leu Pro Asp Thr Ala Ala Val Ser Leu Leu 245 250 255 Gly Gly Pro Ala Thr Asn Arg Asp Tyr Leu Arg Gln Arg Gln Val Ala 260 265 270 Leu Gly Asn Met Glu Thr Lys Glu Ser Lys Ala Ile Arg Gln His Ala 275 280 285 Glu Ala Ala Gly Cys Ser Met Ile Glu Asp Ile Glu Ser Pro Ser Ser 290 295 300 Ile Trp Val Phe Ala Gly Ala Pro Asp Arg Cys Pro Pro Thr Cys Leu 305 310 315 320 Phe Ile Ala Gly Ile Ala Glu Leu Gly Ala Phe Phe Ser Ile Leu Gln 325 330 335 Asp Met Arg Asn Thr Ile Met Ala Ser Lys Thr Val Gly Thr Ser Glu 340 345 350 Glu Lys Leu Arg Lys Lys Ser Ser Phe Tyr Gln Ser Tyr Leu Arg Arg 355 360 365 Thr Gln Ser Met Gly Ile Gln Leu Gly Gln Arg Ile Ile Val Leu Phe 370 375 380 Met Val Ala Trp Gly Lys Glu Ala Val Asp Asn Phe His Leu Gly Asp 385 390 395 400 Asp Met Asp Pro Glu Leu Arg Thr Leu Ala Gln Ser Leu Ile Asp Val 405 410 415 Lys Val Lys Glu Ile Ser Asn Gln Glu Pro Leu Lys Leu 420 425

Claims

서열목록 제 1 서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열 또는 그 일부를 포함하는 한탄 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
(ⅰ) 상기 제 1 항의 폴리뉴클레오타이드; (ⅱ) 상기 (ⅰ)의 폴리뉴클레오타이드에 작동적으로 연결되며 식물세포에서 작용하여 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 및 (ⅲ) 식물세포에서 작용하여 상기 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-비-해독화 부위를 포함하는 식물발현용 벡터.
다음의 단계를 포함하는 한탄 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 발현하는 형질전환 식물체의 제조방법:

(a) 식물 세포를 상기 제 2 항의 식물발현용 벡터로 형질전환하는 단계;

(b) 형질전환된 식물세포를 선별하는 단계; 및

(c) 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물체를 재분화시켜 형질전환 식물체를 수득하는 단계.
상기 제 3 항의 방법에 의해 제조된 식물 형질전환체.
다음의 단계를 포함하는 한탄 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질의 제조방법:

(a) 식물 세포를 상기 제 2 항의 식물발현용 벡터로 형질전환하는 단계;

(b) 형질전환된 식물세포를 선별하는 단계;

(c) 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물체를 재분화시켜 형질전환 식물체를 수득하는 단계; 및

(d) 상기 형질전환 식물체로부터 한탄 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 수득하는 단계.
상기 제 5 항의 방법에 의해 제조된 한탄 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질.
상기 제 6 항의 한탄 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 항원으로 포함하는 신증후출혈열의 항체 진단용 키트.
다음의 단계를 포함하는 신증후출혈열의 항체 측정 방법:

(a) 시험 대상의 개체로부터 시험액 (testing fluid)을 수득하는 단계;

(b) 상기 제 4 항의 한탄 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 항원으로 이용하여 상기 시험액과 항원-항체 반응을 유도하는 단계; 및

(c) 상기 단계 (b)에서 항원-항체 반응의 발생 (occurrence) 여부를 측정하는 단계.