JPH05307020A - 生体成分の分析法 - Google Patents
生体成分の分析法Info
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- JPH05307020A JPH05307020A JP5001221A JP122193A JPH05307020A JP H05307020 A JPH05307020 A JP H05307020A JP 5001221 A JP5001221 A JP 5001221A JP 122193 A JP122193 A JP 122193A JP H05307020 A JPH05307020 A JP H05307020A
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- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 ゲル状支持体または支持膜に生体成分を担持
させ、電気泳動法により生体成分を展開させる方法にお
いて、生体成分と抗原特異性の異なる蛋白質を内部標準
物質として用い、ゲル状支持体または支持膜中に該蛋白
質と特異的に結合する物質を受容体として添加すること
を特徴とする生体成分の展開方法。 【効果】 本発明により、精度および再現性に優れた生
体成分の展開方法が提供される。
させ、電気泳動法により生体成分を展開させる方法にお
いて、生体成分と抗原特異性の異なる蛋白質を内部標準
物質として用い、ゲル状支持体または支持膜中に該蛋白
質と特異的に結合する物質を受容体として添加すること
を特徴とする生体成分の展開方法。 【効果】 本発明により、精度および再現性に優れた生
体成分の展開方法が提供される。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、生体成分を免疫血清学
的および病理組織学的に定性，定量するに際して用いら
れる分析法の改良ならびにこの分析法を用いる癌の診断
法に関する。
的および病理組織学的に定性，定量するに際して用いら
れる分析法の改良ならびにこの分析法を用いる癌の診断
法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、生体成分たとえば血清蛋白質の検
出には色素染色法，シルバーステイン法，オートラジオ
グラフィー法，標識抗体を用いる免疫学的方法、たとえ
ば酵素免疫測定法（ＥＩＡ），螢光免疫測定法（ＦＩ
Ａ），放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ）などが知ら
れている。酵素免疫測定法としてはTakedaらの方法（El
ectrophoresis 1983, 4, 371 −373 ）が知られてい
る。従来これらの測定法に従って癌の診断が行われてき
た。
出には色素染色法，シルバーステイン法，オートラジオ
グラフィー法，標識抗体を用いる免疫学的方法、たとえ
ば酵素免疫測定法（ＥＩＡ），螢光免疫測定法（ＦＩ
Ａ），放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ）などが知ら
れている。酵素免疫測定法としてはTakedaらの方法（El
ectrophoresis 1983, 4, 371 −373 ）が知られてい
る。従来これらの測定法に従って癌の診断が行われてき
た。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】色素染色法は、バック
グラウンドが高く、不鮮明で検出感度が劣る。シルバー
ステイン法，オートラジオグラフィー法は、高感度で精
度的にも優れているが、操作が煩雑で、迅速、簡便に行
えない。また、重金属やアイソトープを用いるため、廃
棄上の問題があり、さらには、測定対象も限られてお
り、汎用性に乏しい。
グラウンドが高く、不鮮明で検出感度が劣る。シルバー
ステイン法，オートラジオグラフィー法は、高感度で精
度的にも優れているが、操作が煩雑で、迅速、簡便に行
えない。また、重金属やアイソトープを用いるため、廃
棄上の問題があり、さらには、測定対象も限られてお
り、汎用性に乏しい。
【０００４】免疫学的手法は、単一物質を特異的に検出
でき測定感度が非常に高く、定量性に優れており、応用
範囲が広い。しかし、放射性同位元素免疫測定法は、ラ
ジオアイソトープを用いるため、被爆，取扱い管理，廃
棄などの問題があり、螢光免疫測定法は、操作が煩雑
で、また二重染色法への適用ができず、用途が限られて
いる。酵素免疫測定法は、一般に検出感度が高く、鮮明
で、かつ操作も比較的簡単で、迅速性も優れているとい
われている。しかし、従来の酵素標識抗体を用い、ゲル
状支持体内で発色を行わせる方法においては、バックグ
ラウンドが高く、不鮮明で、感度が低いなどの問題点が
あった。
でき測定感度が非常に高く、定量性に優れており、応用
範囲が広い。しかし、放射性同位元素免疫測定法は、ラ
ジオアイソトープを用いるため、被爆，取扱い管理，廃
棄などの問題があり、螢光免疫測定法は、操作が煩雑
で、また二重染色法への適用ができず、用途が限られて
いる。酵素免疫測定法は、一般に検出感度が高く、鮮明
で、かつ操作も比較的簡単で、迅速性も優れているとい
われている。しかし、従来の酵素標識抗体を用い、ゲル
状支持体内で発色を行わせる方法においては、バックグ
ラウンドが高く、不鮮明で、感度が低いなどの問題点が
あった。
【０００５】ゲル状支持体または支持膜に生体成分を担
持させ、電気泳動法により生体成分を展開させるとき、
一般に泳動のコントロールマーカーは生体成分とは別に
生体成分と平行に泳動させている。この方法において
は、生体成分の移動距離の再現性が悪く、測定値の精度
も低いなどの問題点があった。
持させ、電気泳動法により生体成分を展開させるとき、
一般に泳動のコントロールマーカーは生体成分とは別に
生体成分と平行に泳動させている。この方法において
は、生体成分の移動距離の再現性が悪く、測定値の精度
も低いなどの問題点があった。
【０００６】
【課題を解決するための手段】ゲル状支持体内での発色
系に酵素免疫測定法を応用する方法はあまり知られてお
らず、反応の最適条件、つまり標的物質に特異的に結合
する受容体と、酵素，基質などとの組み合わせなどにつ
いては充分に検討されていない。本発明者は、生物現象
の中で特異反応と考えられるもの、たとえば抗原と抗体
との特異反応、酵素と基質，酵素と補酵素，アビジンと
ビオチン，ホルモンとレセプター，レクチンと特殊な糖
結合，核酸の相補性（たとえば poly U と polyA な
ど），特異結合蛋白（例えばＢ−２蛋白結合蛋白，Ｃ−
反応性蛋白など），プロテインＡとＩｇＧ分子などに着
目し、生体成分の分析について研究を行った。その結
果、これらの反応の生成物の検出をゲル状支持体中で行
う場合、(a) 生体成分または標的物質に、(b) パーオキ
シダーゼ（ＰＯＤ）で標識した該生体成分または該標的
物質に特異的に結合する受容体を反応させた後、反応結
合したパーオキシダーゼの量に基づいて該生体成分また
は該標的物質を分析する方法において、過酸化水素およ
び４−メトキシ−１−ナフトールを用いれば、生体成分
または標的物質を高感度，鮮明，簡便，迅速に定量分析
できることを見出した。
系に酵素免疫測定法を応用する方法はあまり知られてお
らず、反応の最適条件、つまり標的物質に特異的に結合
する受容体と、酵素，基質などとの組み合わせなどにつ
いては充分に検討されていない。本発明者は、生物現象
の中で特異反応と考えられるもの、たとえば抗原と抗体
との特異反応、酵素と基質，酵素と補酵素，アビジンと
ビオチン，ホルモンとレセプター，レクチンと特殊な糖
結合，核酸の相補性（たとえば poly U と polyA な
ど），特異結合蛋白（例えばＢ−２蛋白結合蛋白，Ｃ−
反応性蛋白など），プロテインＡとＩｇＧ分子などに着
目し、生体成分の分析について研究を行った。その結
果、これらの反応の生成物の検出をゲル状支持体中で行
う場合、(a) 生体成分または標的物質に、(b) パーオキ
シダーゼ（ＰＯＤ）で標識した該生体成分または該標的
物質に特異的に結合する受容体を反応させた後、反応結
合したパーオキシダーゼの量に基づいて該生体成分また
は該標的物質を分析する方法において、過酸化水素およ
び４−メトキシ−１−ナフトールを用いれば、生体成分
または標的物質を高感度，鮮明，簡便，迅速に定量分析
できることを見出した。
【０００７】先に示した Takeda らの方法においては、
４−クロロ−１−ナフトールを用いる方法が示されてい
るが、本発明方法は４−メトキシ−１−ナフトールを用
いる点で異なり、しかも効果の点で顕著に優れている。
たとえば発色時間，泳動時間が非常に短縮され、しかも
泳動図が鮮明で分析感度，分解能が１桁以上上昇した。
４−クロロ−１−ナフトールを用いる方法が示されてい
るが、本発明方法は４−メトキシ−１−ナフトールを用
いる点で異なり、しかも効果の点で顕著に優れている。
たとえば発色時間，泳動時間が非常に短縮され、しかも
泳動図が鮮明で分析感度，分解能が１桁以上上昇した。
【０００８】また電気泳動により生体成分を分析定量す
るとき、従来法のように泳動のコントロールマーカーを
平行して泳動させず、ブロムフェノールブルーなどの色
素を結合したコントロールマーカーを生体成分と混合し
て泳動させることによって、従来の方法に比べ、泳動距
離の再現性を著しく高め、測定値の精度を上げることが
できた。
るとき、従来法のように泳動のコントロールマーカーを
平行して泳動させず、ブロムフェノールブルーなどの色
素を結合したコントロールマーカーを生体成分と混合し
て泳動させることによって、従来の方法に比べ、泳動距
離の再現性を著しく高め、測定値の精度を上げることが
できた。
【０００９】
【作用】以下本発明を詳細に説明する。本発明は、生体
成分または標的物質に、パーオキシダーゼで標識した該
生体成分または該標的物質に特異的に結合する受容体を
反応させた後、反応結合したパーオキシダーゼの量に基
づいて該生体成分または該標的物質を分析する方法にお
いて、過酸化水素および４−メトキシ−１−ナフトール
を用いる生体成分の分析法に関する。
成分または標的物質に、パーオキシダーゼで標識した該
生体成分または該標的物質に特異的に結合する受容体を
反応させた後、反応結合したパーオキシダーゼの量に基
づいて該生体成分または該標的物質を分析する方法にお
いて、過酸化水素および４−メトキシ−１−ナフトール
を用いる生体成分の分析法に関する。
【００１０】本発明において分析できる生体成分として
は、抗原，抗体，酵素，酵素の基質，補酵素，蛋白質，
糖蛋白質，糖質，糖脂質，リポ蛋白質，核酸またはホル
モンなどがあげられ、これらは通常各種体液，病理組織
切片中に存在する。各種の体液としては例えば血液，
尿，唾液，胃液，腸液，膵液，胆汁，組織液，浮腫液，
腹水，胸水，心嚢液，関節液，脳脊髄液，羊水，性器分
泌液，母乳，鼻汁，喀液，涙，汗，硝子体等が挙げられ
るが、就中特に血液を血清または血漿として使用するの
が好ましい。
は、抗原，抗体，酵素，酵素の基質，補酵素，蛋白質，
糖蛋白質，糖質，糖脂質，リポ蛋白質，核酸またはホル
モンなどがあげられ、これらは通常各種体液，病理組織
切片中に存在する。各種の体液としては例えば血液，
尿，唾液，胃液，腸液，膵液，胆汁，組織液，浮腫液，
腹水，胸水，心嚢液，関節液，脳脊髄液，羊水，性器分
泌液，母乳，鼻汁，喀液，涙，汗，硝子体等が挙げられ
るが、就中特に血液を血清または血漿として使用するの
が好ましい。
【００１１】標的物質とは、生体成分と標識物質とが結
合したものであり、標識物質には、抗原，抗体，酵素，
酵素の基質，補酵素，蛋白質，糖蛋白質，糖質，糖脂
質，リポ蛋白質，核酸，ホルモン，アビジン，ビオチン
などが挙げられる。受容体としては抗体，抗原，プロテ
インＡ，酵素，酵素の基質，補酵素，核酸，ホルモン−
レセプター，特異結合蛋白（Ｂ−２蛋白結合蛋白，Ｃ−
反応性蛋白など），アビジン，ビオチン，レクチンなど
が挙げられる。
合したものであり、標識物質には、抗原，抗体，酵素，
酵素の基質，補酵素，蛋白質，糖蛋白質，糖質，糖脂
質，リポ蛋白質，核酸，ホルモン，アビジン，ビオチン
などが挙げられる。受容体としては抗体，抗原，プロテ
インＡ，酵素，酵素の基質，補酵素，核酸，ホルモン−
レセプター，特異結合蛋白（Ｂ−２蛋白結合蛋白，Ｃ−
反応性蛋白など），アビジン，ビオチン，レクチンなど
が挙げられる。
【００１２】本発明方法は一般的酵素免疫測定法に適用
できるが、特にゲル状支持体に担持された生体成分の分
析に有用である。特に、受容体としてプロテインＡ，酵
素としてパーオキシダーゼ，基質に過酸化水素および４
−メトキシ−１−ナフトールを用いる方法が優れてい
る。測定を実施するにあたって検体試料の量，酵素標識
受容体の量および比率，基質の量，反応時間および温度
などの条件は測定する物質の種類，使用する受容体の力
価，支持体の種類などによって異なるので各測定につい
て最も適当な条件を選択する。
できるが、特にゲル状支持体に担持された生体成分の分
析に有用である。特に、受容体としてプロテインＡ，酵
素としてパーオキシダーゼ，基質に過酸化水素および４
−メトキシ−１−ナフトールを用いる方法が優れてい
る。測定を実施するにあたって検体試料の量，酵素標識
受容体の量および比率，基質の量，反応時間および温度
などの条件は測定する物質の種類，使用する受容体の力
価，支持体の種類などによって異なるので各測定につい
て最も適当な条件を選択する。
【００１３】例えば、ゲル電気泳動後の染色に、標識プ
ロテインＡを用いた場合では、ゲル電気泳動後、脱蛋白
操作をしたのち、ＰＯＤ標識プロテインＡを一定量ゲル
の表面上に滴下し、ほぼ室温下、好ましくは１５〜２５
℃で３０〜４５分間放置する。次いで３０〜４０分間適
当な緩衝液で洗浄した後、４−メトキシ−１−ナフトー
ルを加えて酵素反応を行わせる。
ロテインＡを用いた場合では、ゲル電気泳動後、脱蛋白
操作をしたのち、ＰＯＤ標識プロテインＡを一定量ゲル
の表面上に滴下し、ほぼ室温下、好ましくは１５〜２５
℃で３０〜４５分間放置する。次いで３０〜４０分間適
当な緩衝液で洗浄した後、４−メトキシ−１−ナフトー
ルを加えて酵素反応を行わせる。
【００１４】沈降線が十分に発色したのち（通常は２〜
３分間で反応）洗浄脱色し、未反応物質を洗い流し反応
を停止する。洗浄脱色には、適当な試液を使用しても良
いが、流水を用いるのが簡便迅速で好ましい。急激に乾
燥処理するとゲルの乾燥に斑が生じ、表面が凸凹とな
り、測定に支障をきたすので、室温〜６０℃で乾燥させ
るのが好ましい。破損に気をつければ永久保存も可能で
ある。
３分間で反応）洗浄脱色し、未反応物質を洗い流し反応
を停止する。洗浄脱色には、適当な試液を使用しても良
いが、流水を用いるのが簡便迅速で好ましい。急激に乾
燥処理するとゲルの乾燥に斑が生じ、表面が凸凹とな
り、測定に支障をきたすので、室温〜６０℃で乾燥させ
るのが好ましい。破損に気をつければ永久保存も可能で
ある。
【００１５】ＰＯＤ標識プロテインＡ濃度は、適当な希
釈液で０．０１〜０．５％（ W／V）に調製されたもの
が好ましく、希釈液には、ｐＨ約８．６のバルビタール
緩衝液を用いるのが好ましい。バルビタール緩衝液のＮ
ａＣｌ濃度０．０５〜０．５Ｍが好ましい。さらに発色
用試液には４−メトキシ−１−ナフトールを適当な溶剤
で約１％に溶解したものをさらに０．００１〜０．１％
に希釈して用いる。希釈液としては、ｐＨ約７．０〜
８．５のトリス塩酸緩衝液が好ましい。ゲル状支持体の
調製法は特に限定されることなく、通常の方法を採用で
きる。例えば蒸留水、ｐＨ約８．６のバルビタール緩衝
液またはトリス塩酸緩衝液などの希釈液に一定量の寒
天，アガロースなどを加え、静かに撹拌下、６０〜８０
℃に加温して溶解し所定の平板上に流し、放冷してゼリ
ー状に凝固させる。
釈液で０．０１〜０．５％（ W／V）に調製されたもの
が好ましく、希釈液には、ｐＨ約８．６のバルビタール
緩衝液を用いるのが好ましい。バルビタール緩衝液のＮ
ａＣｌ濃度０．０５〜０．５Ｍが好ましい。さらに発色
用試液には４−メトキシ−１−ナフトールを適当な溶剤
で約１％に溶解したものをさらに０．００１〜０．１％
に希釈して用いる。希釈液としては、ｐＨ約７．０〜
８．５のトリス塩酸緩衝液が好ましい。ゲル状支持体の
調製法は特に限定されることなく、通常の方法を採用で
きる。例えば蒸留水、ｐＨ約８．６のバルビタール緩衝
液またはトリス塩酸緩衝液などの希釈液に一定量の寒
天，アガロースなどを加え、静かに撹拌下、６０〜８０
℃に加温して溶解し所定の平板上に流し、放冷してゼリ
ー状に凝固させる。
【００１６】ゲルの濃度は生体成分（標的物質）−標識
受容体結合体，および反応生成物（色素）の大きさ（分
子量，立体構造など）により選択される。該ゲルは通常
０．５〜２．０％（ W／V ）、特に０．８〜１．０％
（ W／V ）が好ましく、またこのゲルには必要により防
腐剤を添加してもよい。本発明では、ゲル状支持体のほ
か、支持膜に担持させた生体成分の分析においても有用
であり、支持膜としては、例えば、ニトロセルロース
膜，セルロース−アセテート膜，アセテート膜などが用
いられる。さらには、組織化学，細胞化学の分野で行わ
れる組織切片の免疫組織化学染色にも応用可能である。
受容体結合体，および反応生成物（色素）の大きさ（分
子量，立体構造など）により選択される。該ゲルは通常
０．５〜２．０％（ W／V ）、特に０．８〜１．０％
（ W／V ）が好ましく、またこのゲルには必要により防
腐剤を添加してもよい。本発明では、ゲル状支持体のほ
か、支持膜に担持させた生体成分の分析においても有用
であり、支持膜としては、例えば、ニトロセルロース
膜，セルロース−アセテート膜，アセテート膜などが用
いられる。さらには、組織化学，細胞化学の分野で行わ
れる組織切片の免疫組織化学染色にも応用可能である。
【００１７】電気泳動法により体液中の生体成分を分析
定量する場合は、泳動のコントロールマーカーとして、
通常は色素を結合したアルブミンを平行して泳動する
が、一般的に従来の方法ではゲルの位置による構造の歪
み，ゲル構造の不均一性，電気的負荷条件，温度の相違
などにより、コントロールマーカーと生体成分の泳動条
件に差異が生じやすく、再現性に乏しく、測定値の精度
にも問題が残る。
定量する場合は、泳動のコントロールマーカーとして、
通常は色素を結合したアルブミンを平行して泳動する
が、一般的に従来の方法ではゲルの位置による構造の歪
み，ゲル構造の不均一性，電気的負荷条件，温度の相違
などにより、コントロールマーカーと生体成分の泳動条
件に差異が生じやすく、再現性に乏しく、測定値の精度
にも問題が残る。
【００１８】本発明者は、生体成分と抗原特異性の異な
る蛋白質を内部標準物質として用い、かつ支持体中にこ
の内部標準物質と特異的に結合する受容体を添加すれ
ば、従来法より精度および再現性に優れた測定値が得ら
れることを見出した。すなわち、色素（例えばブロムフ
ェノルブルー以下ＢＰＢ）で着色された内部標準物質と
体液との混合物を、生体成分および内部標準物質に対す
る抗体を含むゲル状支持体上で電気泳動を行えば、精度
および再現性に優れた測定値が得られる。
る蛋白質を内部標準物質として用い、かつ支持体中にこ
の内部標準物質と特異的に結合する受容体を添加すれ
ば、従来法より精度および再現性に優れた測定値が得ら
れることを見出した。すなわち、色素（例えばブロムフ
ェノルブルー以下ＢＰＢ）で着色された内部標準物質と
体液との混合物を、生体成分および内部標準物質に対す
る抗体を含むゲル状支持体上で電気泳動を行えば、精度
および再現性に優れた測定値が得られる。
【００１９】本発明に用いる内部標準物質は、生体成分
と交差反応性を示さない物質が適用される。該蛋白質と
しては、ヒト血清アルブミン，ウシ血清アルブミン，卵
白アルブミン，ニワトリ血清アルブミンなどが挙げられ
るが、とくに、卵白アルブミン，ニワトリ血清アルブミ
ンが好ましい。受容体としては、これらアルブミンに対
するモノクローナルまたはポリクローナル抗体が用いら
れる。
と交差反応性を示さない物質が適用される。該蛋白質と
しては、ヒト血清アルブミン，ウシ血清アルブミン，卵
白アルブミン，ニワトリ血清アルブミンなどが挙げられ
るが、とくに、卵白アルブミン，ニワトリ血清アルブミ
ンが好ましい。受容体としては、これらアルブミンに対
するモノクローナルまたはポリクローナル抗体が用いら
れる。
【００２０】内部標準物質を着色する色素としては、ブ
ロムフェノールブルー，ブロムチモールブルーなどが挙
げられる。泳動中の非結合型色素によるテーリングを避
けるため、これらの色素の濃度は０．００１〜０．１％
（ W／V ）に調整するのが好ましい。本発明方法におい
ては、色素，内部標準物質，および体液を直接混合させ
るか、あるいは色素と内部標準物質との混合物を反応平
板上に塗抹し乾燥したのち、体液をこの平板上に滴下し
て混合する。
ロムフェノールブルー，ブロムチモールブルーなどが挙
げられる。泳動中の非結合型色素によるテーリングを避
けるため、これらの色素の濃度は０．００１〜０．１％
（ W／V ）に調整するのが好ましい。本発明方法におい
ては、色素，内部標準物質，および体液を直接混合させ
るか、あるいは色素と内部標準物質との混合物を反応平
板上に塗抹し乾燥したのち、体液をこの平板上に滴下し
て混合する。
【００２１】後者の方法は体液中の生体成分濃度の影響
を受けず、かつ内部標準物質の保存安定性も優れてお
り、操作も簡便迅速で好ましい。次に本発明を実施例を
用いることによって具体的に説明するが、本発明は以下
の実施例によってその範囲を限定されるものではない。
を受けず、かつ内部標準物質の保存安定性も優れてお
り、操作も簡便迅速で好ましい。次に本発明を実施例を
用いることによって具体的に説明するが、本発明は以下
の実施例によってその範囲を限定されるものではない。
【００２２】
実施例１ ロケット電気泳動法による定量性の検討 ａ）ＡＦＰ標準血清の調製：ＡＦＰ標準血清〔１０４１
ng／ml，ダコ（ＤＡＫＯ）社（デンマーク）製〕を正常
ヒト血清（ＡＦＰ：５ng／ml以下）で希釈し、ＡＦＰ標
準血清（１００，２００，４００，６００，８００ng／
ml）を調製した。
ng／ml，ダコ（ＤＡＫＯ）社（デンマーク）製〕を正常
ヒト血清（ＡＦＰ：５ng／ml以下）で希釈し、ＡＦＰ標
準血清（１００，２００，４００，６００，８００ng／
ml）を調製した。
【００２３】ｂ）抗ＡＦＰ含有アガロース板の作製：
１．０％アガロース〔FMC Marine Colloids Division社
（米）製，ｐＨ８．６，イオン強度０．０５のバルビタ
ール緩衝液で溶解〕１０mlに抗ＡＦＰ血清（ダコ社製）
を２０μｌ混合した。この抗ＡＦＰ血清含有アガロース
ゲルをゲルボンド（FMC Marine Colloids Division社
製, 110 ×125 mm）に流し込み、凝固させて厚さ約１mm
の抗ＡＦＰ含有アガロース板を作製した。
１．０％アガロース〔FMC Marine Colloids Division社
（米）製，ｐＨ８．６，イオン強度０．０５のバルビタ
ール緩衝液で溶解〕１０mlに抗ＡＦＰ血清（ダコ社製）
を２０μｌ混合した。この抗ＡＦＰ血清含有アガロース
ゲルをゲルボンド（FMC Marine Colloids Division社
製, 110 ×125 mm）に流し込み、凝固させて厚さ約１mm
の抗ＡＦＰ含有アガロース板を作製した。
【００２４】ｃ）ＰＯＤ標識プロテインＡ希釈液の調
製：ＰＯＤ標識プロテインＡ〔E.Y.Laboratories社
（米）製〕２０μｌに、希釈液〔ＮａＣｌ１４．０ｇを
バルビタール緩衝液（ｐＨ８．６）１ｌに溶解したも
の〕１０mlを混和し、０．２％ＰＯＤ標識プロテインＡ
希釈液とした。
製：ＰＯＤ標識プロテインＡ〔E.Y.Laboratories社
（米）製〕２０μｌに、希釈液〔ＮａＣｌ１４．０ｇを
バルビタール緩衝液（ｐＨ８．６）１ｌに溶解したも
の〕１０mlを混和し、０．２％ＰＯＤ標識プロテインＡ
希釈液とした。
【００２５】ｄ）発色用試液の調製：４−メトキシ−１
−ナフトール〔４−methoxy −１−naphtol ，アルドリ
ッチ（Aldrich ）社（米）製〕２００μｌ，０．０５Ｍ
トリス塩酸緩衝液（トリスヒドロキシメチルアミノメタ
ン１２．１１４ｇ／ｌと０．１Ｍ ＨＣｌを１００：７
７で混合した液、ｐＨ７．６）１０mlおよび３０％H2O2
１滴を使用直前に混合し発色用試液とした。
−ナフトール〔４−methoxy −１−naphtol ，アルドリ
ッチ（Aldrich ）社（米）製〕２００μｌ，０．０５Ｍ
トリス塩酸緩衝液（トリスヒドロキシメチルアミノメタ
ン１２．１１４ｇ／ｌと０．１Ｍ ＨＣｌを１００：７
７で混合した液、ｐＨ７．６）１０mlおよび３０％H2O2
１滴を使用直前に混合し発色用試液とした。
【００２６】ｅ）ＡＦＰの測定：上記(a) で得たＡＦＰ
標準血清（１００，２００，４００，６００，８００ng
／ml）各々１０μｌを上記(b) で調製した抗ＡＦＰ含有
アガロース板の孔（直径４．０mm）に注入し、３mA/cm,
９０分，１０℃冷却下にて電気泳動を行った。泳動後、
吸着パット（日本商事社製）で２〜３分間処理して脱蛋
白したのち、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で３０分間洗
浄した。再び吸着パットを用いて乾燥し、上記(c) で調
製したＰＯＤ標識プロテインＡ１０mlを平板上に流し
た。３０分間反応後、再び吸着パットによる乾燥，洗浄
〔リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で３０分間〕，吸着パッ
トによる乾燥を上記と同様に繰り返したのち、上記(d)
で調製した発色用試液１０mlを加え、２〜３分間反応さ
せた。２〜３分間水洗したのち、吸着パットで乾燥させ
て、沈降線の高さを測定した。得られた標準曲線を図１
に示した。
標準血清（１００，２００，４００，６００，８００ng
／ml）各々１０μｌを上記(b) で調製した抗ＡＦＰ含有
アガロース板の孔（直径４．０mm）に注入し、３mA/cm,
９０分，１０℃冷却下にて電気泳動を行った。泳動後、
吸着パット（日本商事社製）で２〜３分間処理して脱蛋
白したのち、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で３０分間洗
浄した。再び吸着パットを用いて乾燥し、上記(c) で調
製したＰＯＤ標識プロテインＡ１０mlを平板上に流し
た。３０分間反応後、再び吸着パットによる乾燥，洗浄
〔リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で３０分間〕，吸着パッ
トによる乾燥を上記と同様に繰り返したのち、上記(d)
で調製した発色用試液１０mlを加え、２〜３分間反応さ
せた。２〜３分間水洗したのち、吸着パットで乾燥させ
て、沈降線の高さを測定した。得られた標準曲線を図１
に示した。
【００２７】実施例２ コンカナバリン−Ａ〔以下“Ｃｏｎ−Ａ”という。ファ
ルマシア・ファインケミカルズ社（スウェーデン）製〕
−吸着交叉免疫電気泳動（ＣＡＩＥ）法による羊水中Ａ
ＦＰの測定 ａ）被検試料の調製：妊娠７〜１８週の妊婦１６名から
採取した羊水を遠心分離（３０００ｒｐｍ，２０分間）
にかけ、上清にＮａＮ3 を約０．００１％（ w／v ）に
なるように加えて−２０℃にて凍結乾燥し被検試料とし
た。
ルマシア・ファインケミカルズ社（スウェーデン）製〕
−吸着交叉免疫電気泳動（ＣＡＩＥ）法による羊水中Ａ
ＦＰの測定 ａ）被検試料の調製：妊娠７〜１８週の妊婦１６名から
採取した羊水を遠心分離（３０００ｒｐｍ，２０分間）
にかけ、上清にＮａＮ3 を約０．００１％（ w／v ）に
なるように加えて−２０℃にて凍結乾燥し被検試料とし
た。
【００２８】ｂ）Ｃｏｎ−Ａ含有アガロース板の作製
（一次元泳動用）：１．０％アガロース（ｐＨ８．６，
イオン強度０．０５のバルビタール緩衝液で溶解）１０
mlにＣｏｎ−Ａを６００μｇ／ml混合した。このＣｏｎ
−Ａ含有アガロースゲル１５mlをゲルボンド（FMC Mari
ne Colloids Division社製，１１０×１２５mm）上に流
し込み、凝固させて、厚さ約１mmのＣｏｎ−Ａ含有アガ
ロース板を作製した。
（一次元泳動用）：１．０％アガロース（ｐＨ８．６，
イオン強度０．０５のバルビタール緩衝液で溶解）１０
mlにＣｏｎ−Ａを６００μｇ／ml混合した。このＣｏｎ
−Ａ含有アガロースゲル１５mlをゲルボンド（FMC Mari
ne Colloids Division社製，１１０×１２５mm）上に流
し込み、凝固させて、厚さ約１mmのＣｏｎ−Ａ含有アガ
ロース板を作製した。
【００２９】ｃ）ＡＦＰの測定：(a) で得たサンプル１
０μｌを(b) で調製したＣｏｎ−Ａ含有アガロース板の
孔（直径４mm）に注入し、一次元電気泳動を行った。泳
動は、バルビタール緩衝液（ｐＨ８．６）を用いて、３
ｍＡ／cm，９０分，１０℃冷却下に行った。また対照と
して３％（ W／V ）ヒト血清アルブミン〔シグマ社
（米）製，fractionＶ，０．０１％（ W／V ）ＢＰＢ含
有〕５μｌを用い、約６cm泳動した位置に印をつけた。
一次元電気泳動後、アガロース板を泳動方向と平行に約
１cmの巾で切り取り、実施例１−(b) で調製した抗ＡＦ
Ｐ含有アガロース板に密着させ、一次元展開方向に対し
て直角方向に２．５ｍＡ／cm，２時間，１０℃冷却下に
二次元電気泳動を行った。
０μｌを(b) で調製したＣｏｎ−Ａ含有アガロース板の
孔（直径４mm）に注入し、一次元電気泳動を行った。泳
動は、バルビタール緩衝液（ｐＨ８．６）を用いて、３
ｍＡ／cm，９０分，１０℃冷却下に行った。また対照と
して３％（ W／V ）ヒト血清アルブミン〔シグマ社
（米）製，fractionＶ，０．０１％（ W／V ）ＢＰＢ含
有〕５μｌを用い、約６cm泳動した位置に印をつけた。
一次元電気泳動後、アガロース板を泳動方向と平行に約
１cmの巾で切り取り、実施例１−(b) で調製した抗ＡＦ
Ｐ含有アガロース板に密着させ、一次元展開方向に対し
て直角方向に２．５ｍＡ／cm，２時間，１０℃冷却下に
二次元電気泳動を行った。
【００３０】泳動後、吸着パット（日本商事社製）で２
〜３分間処理して脱蛋白したのち、リン酸緩衝液（ｐＨ
７．２）で３０分間洗浄した。再び吸着パットを用いて
乾燥し、実施例１−(c) で調製したＰＯＤ標識プロテイ
ンＡ１０mlを平板上に流した。３０分間反応後、再び吸
着パットによる乾燥，洗浄〔リン酸緩衝液（ｐＨ７．
２）で３０分間〕，吸着パットによる乾燥を上記と同様
に繰り返したのち、実施例１−(d) で調製した発色試液
１０mlを加え、２〜３分間反応させた。２〜３分間水洗
し、吸着パットで乾燥させて、一次元電気泳動で得たア
ルブミンの位置から二次元電気泳動で現れた泳動ピーク
までの距離を測定した。
〜３分間処理して脱蛋白したのち、リン酸緩衝液（ｐＨ
７．２）で３０分間洗浄した。再び吸着パットを用いて
乾燥し、実施例１−(c) で調製したＰＯＤ標識プロテイ
ンＡ１０mlを平板上に流した。３０分間反応後、再び吸
着パットによる乾燥，洗浄〔リン酸緩衝液（ｐＨ７．
２）で３０分間〕，吸着パットによる乾燥を上記と同様
に繰り返したのち、実施例１−(d) で調製した発色試液
１０mlを加え、２〜３分間反応させた。２〜３分間水洗
し、吸着パットで乾燥させて、一次元電気泳動で得たア
ルブミンの位置から二次元電気泳動で現れた泳動ピーク
までの距離を測定した。
【００３１】羊水中のＡＦＰは、Ｃｏｎ−Ａ−ＣＡＩＥ
を用いると、２個の分画に分かれる。一次元電気泳動で
レクチンを含有しないアガロース平板上でＡＦＰが泳動
する位置に免疫沈降峰を作る分画がＣｏｎ−Ａ非吸着Ａ
ＦＰ（ｂ峰）で、これより陰極側に出現するピークがＣ
ｏｎ−Ａ吸着ＡＦＰ（ａ峰）である。ａ峰とｂ峰の高さ
の和を１００％として、ｂ峰の割合を胎令に従ってグラ
フにしたものが図２である。図２は、羊水中のＣｏｎ−
Ａ吸着ＡＦＰは経時的に増加の傾向をしていることを示
している。
を用いると、２個の分画に分かれる。一次元電気泳動で
レクチンを含有しないアガロース平板上でＡＦＰが泳動
する位置に免疫沈降峰を作る分画がＣｏｎ−Ａ非吸着Ａ
ＦＰ（ｂ峰）で、これより陰極側に出現するピークがＣ
ｏｎ−Ａ吸着ＡＦＰ（ａ峰）である。ａ峰とｂ峰の高さ
の和を１００％として、ｂ峰の割合を胎令に従ってグラ
フにしたものが図２である。図２は、羊水中のＣｏｎ−
Ａ吸着ＡＦＰは経時的に増加の傾向をしていることを示
している。
【００３２】実施例３ Ｃｏｎ−Ａ−ＣＡＩＥによる肝癌患者血清中のＡＦＰの
測定 ａ）被検試料の調製：原発性肝癌４７例，転移性肝癌８
例の各血清を正常ヒト血清（ＡＦＰ：５ng／ml以下）で
希釈し、１５，０００ng／ml以下に調製したものを被検
試料とした。
測定 ａ）被検試料の調製：原発性肝癌４７例，転移性肝癌８
例の各血清を正常ヒト血清（ＡＦＰ：５ng／ml以下）で
希釈し、１５，０００ng／ml以下に調製したものを被検
試料とした。
【００３３】ｂ）ＡＦＰの測定：実施例２と同様の方法
で行った。その結果、Ｃｏｎ−Ａ−ＣＡＩＥによる肝癌
患者血清の代表的な泳動像は、ａ峰のみ出現するタイプ
（１型），ａ峰，ｂ峰の２分画が出現するタイプ（２
型）、およびｂ峰のみ出現するタイプ（３型）に分かれ
る。第１表および第２表に示される通り、原発性肝癌血
清中のＡＦＰは、１型（ａ峰のみ）および２型（ａ峰＞
ｂ峰）に分画されるが、転移性肝癌では２型（ａ峰＜ｂ
峰）および３型（ｂ峰のみ）に分画され、癌の鑑別診断
に有用である。
で行った。その結果、Ｃｏｎ−Ａ−ＣＡＩＥによる肝癌
患者血清の代表的な泳動像は、ａ峰のみ出現するタイプ
（１型），ａ峰，ｂ峰の２分画が出現するタイプ（２
型）、およびｂ峰のみ出現するタイプ（３型）に分かれ
る。第１表および第２表に示される通り、原発性肝癌血
清中のＡＦＰは、１型（ａ峰のみ）および２型（ａ峰＞
ｂ峰）に分画されるが、転移性肝癌では２型（ａ峰＜ｂ
峰）および３型（ｂ峰のみ）に分画され、癌の鑑別診断
に有用である。
【００３４】
【表１】
【００３５】
【表２】
【００３６】実施例４ 内部標準物質としてニワトリ血清アルブミン（シグマ社
製品，fractionＶ）を用いる癌患者血清中のＡＦＰ測定
方法 ａ）被検試料の調製：０．００２５％（ W／V ）ニワト
リ血清アルブミンを用いて、ＢＰＢ（シグマ社製）を
０．００５％（ W／V ）に調製したのち、その１０μｌ
をプレート上に塗抹し乾燥させた。このプレート上に肝
癌患者血清をパスツールピペットで１滴（２５μｌ）滴
下混合し、被検試料とした。
製品，fractionＶ）を用いる癌患者血清中のＡＦＰ測定
方法 ａ）被検試料の調製：０．００２５％（ W／V ）ニワト
リ血清アルブミンを用いて、ＢＰＢ（シグマ社製）を
０．００５％（ W／V ）に調製したのち、その１０μｌ
をプレート上に塗抹し乾燥させた。このプレート上に肝
癌患者血清をパスツールピペットで１滴（２５μｌ）滴
下混合し、被検試料とした。
【００３７】ｂ）レンチルレクチン（以下ＬＣＨとい
う。ファルマシア・ファインケミカルズ社製）含有アガ
ロース板の作製（一次元泳動用）：実施例２−(b) のＣ
ｏｎ−Ａに替えてＬＣＨを２００μｇ／mlになるように
１．０％アガロースに混合し、以下実施例２−(b) と同
様の方法で作製した。
う。ファルマシア・ファインケミカルズ社製）含有アガ
ロース板の作製（一次元泳動用）：実施例２−(b) のＣ
ｏｎ−Ａに替えてＬＣＨを２００μｇ／mlになるように
１．０％アガロースに混合し、以下実施例２−(b) と同
様の方法で作製した。
【００３８】ｃ）二次元泳動用アガロース板の作製：実
施例１−(b) に準じて、１．０％アガロース１０mlに抗
ＡＦＰ血清（ダコ社製）２０μｌおよび抗ニワトリ血清
アルブミン血清〔Cappel社（米）製〕１０μｌを混合
し、以下同様の方法で作製した。
施例１−(b) に準じて、１．０％アガロース１０mlに抗
ＡＦＰ血清（ダコ社製）２０μｌおよび抗ニワトリ血清
アルブミン血清〔Cappel社（米）製〕１０μｌを混合
し、以下同様の方法で作製した。
【００３９】ｄ）ＡＦＰの測定：上記(a) で得た被検試
料１０μｌを上記(b) で調製したＬＣＨ含有アガロース
板の孔に注入し、実施例２−(c) と同一条件下で一次元
電気泳動を行い、泳動後のＢＰＢマーカーの位置に印を
つけた。
料１０μｌを上記(b) で調製したＬＣＨ含有アガロース
板の孔に注入し、実施例２−(c) と同一条件下で一次元
電気泳動を行い、泳動後のＢＰＢマーカーの位置に印を
つけた。
【００４０】次いで、アガロース板を泳動方向と平行に
切り取り、上記(c) で作製したアガロース板に密着さ
せ、以下実施例２−(c) と同一条件下で二次元電気泳動
を行い、発色させた。ニワトリ血清アルブミンの沈降峰
の位置を原点とし、ここから、各泳動ピークまでの距離
を測定した。その結果ニワトリ血清アルブミンの沈降峰
は、肝癌患者血清の沈降峰と交叉せず、かつ、一次元泳
動後のＢＰＢマーカーとほぼ同一の位置に、沈降峰を形
成した。
切り取り、上記(c) で作製したアガロース板に密着さ
せ、以下実施例２−(c) と同一条件下で二次元電気泳動
を行い、発色させた。ニワトリ血清アルブミンの沈降峰
の位置を原点とし、ここから、各泳動ピークまでの距離
を測定した。その結果ニワトリ血清アルブミンの沈降峰
は、肝癌患者血清の沈降峰と交叉せず、かつ、一次元泳
動後のＢＰＢマーカーとほぼ同一の位置に、沈降峰を形
成した。
【００４１】
【発明の効果】本発明により、生体成分の検出が従来よ
り低いバックグラウンドで、鮮明にかつ高感度で迅速，
簡便に、再現性よく、高い精度で行なえることとなっ
た。とくに、ゲル状支持体内での発色系においては、測
定感度が２，０００ng／mlから約１００ng／mlと約２０
倍感度アップし、またスクリーニング用としても充分適
用可能である。さらに内部標準系の導入で高い再現性と
高い精度がもたらされた。一般的に、反応時間を短縮す
ると測定感度および精度は低下するという問題があった
が、本発明により、測定時間が著しく短縮でき、しかも
測定感度および精度も著しく向上された。
り低いバックグラウンドで、鮮明にかつ高感度で迅速，
簡便に、再現性よく、高い精度で行なえることとなっ
た。とくに、ゲル状支持体内での発色系においては、測
定感度が２，０００ng／mlから約１００ng／mlと約２０
倍感度アップし、またスクリーニング用としても充分適
用可能である。さらに内部標準系の導入で高い再現性と
高い精度がもたらされた。一般的に、反応時間を短縮す
ると測定感度および精度は低下するという問題があった
が、本発明により、測定時間が著しく短縮でき、しかも
測定感度および精度も著しく向上された。
【００４２】例えば、実施例２のＣｏｎ−Ａ−ＣＡＩＥ
法の場合、第二次元の泳動時間は蛋白染色で１６時間を
要していたものが２時間で泳動可能となった。また発色
時間も、通常の方法では３０分〜１時間を要していたの
が、わずか２〜３分間に短縮された。さらには、感度ア
ップしたために、第二次元泳動の抗体濃度も、０．１５
〜０．３％で検出可能となったことも大きい。
法の場合、第二次元の泳動時間は蛋白染色で１６時間を
要していたものが２時間で泳動可能となった。また発色
時間も、通常の方法では３０分〜１時間を要していたの
が、わずか２〜３分間に短縮された。さらには、感度ア
ップしたために、第二次元泳動の抗体濃度も、０．１５
〜０．３％で検出可能となったことも大きい。
【００４３】また、本発明の染色物はまったく退色もせ
ず、データは永久保存もできるので非常に有利である。
本発明は、従来の酵素免疫測定法により分析し得た物質
はすべて分析可能であるが、定性的な分析のみならず定
量性にも優れているため、特に癌の診断，治療効果の判
定などに重要な意義を有する。
ず、データは永久保存もできるので非常に有利である。
本発明は、従来の酵素免疫測定法により分析し得た物質
はすべて分析可能であるが、定性的な分析のみならず定
量性にも優れているため、特に癌の診断，治療効果の判
定などに重要な意義を有する。
【図１】は、実施例１におけるＡＦＰ標準血清測定の標
準曲線を示す。
準曲線を示す。
【図２】は、実施例２における羊水中ＡＦＰ測定の結果
を示す。
を示す。
Claims (3)
- 【請求項１】 ゲル状支持体または支持膜に生体成分を
担持させ、電気泳動法により生体成分を展開させる方法
において、生体成分と抗原特異性の異なる蛋白質を内部
標準物質として用い、ゲル状支持体または支持膜中に該
蛋白質と特異的に結合する物質を受容体として添加する
ことを特徴とする生体成分の展開方法。 - 【請求項２】 内部標準物質を０．００１〜０．１％
（ W／V ）の色素で着色をすることを特徴とする請求項
１記載の展開方法。 - 【請求項３】 蛋白質として牛血清アルブミン，ヒト血
清アルブミン，ニワトリ血清アルブミンまたは卵白アル
ブミンを用い、受容体としてこれらアルブミンに対する
抗体をそれぞれ用いることを特徴とする請求項１記載の
展開方法。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59131556A JPS6110772A (ja) | 1984-06-26 | 1984-06-26 | 生体成分の分析法 |
| US06/748,050 US4738920A (en) | 1984-06-26 | 1985-06-24 | Method for assaying a biocomponent using 4-methoxy-1-naphthol and hydrogen peroxide |
| AU43981/85A AU579379B2 (en) | 1984-06-26 | 1985-06-24 | Method for assaying a biocomponent |
| DK286985A DK167237B1 (da) | 1984-06-26 | 1985-06-25 | Fremgangsmaade til immunelektroforetisk proevning for en biokomponent |
| EP85304521A EP0167340B1 (en) | 1984-06-26 | 1985-06-25 | Method for assaying a biocomponent |
| CA000485381A CA1266612A (en) | 1984-06-26 | 1985-06-26 | Method for assaying a biocomponent based on bound peroxidase |
| JP5001221A JPH0718880B2 (ja) | 1984-06-26 | 1993-01-07 | 生体成分の展開方法 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59131556A JPS6110772A (ja) | 1984-06-26 | 1984-06-26 | 生体成分の分析法 |
| JP5001221A JPH0718880B2 (ja) | 1984-06-26 | 1993-01-07 | 生体成分の展開方法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59131556A Division JPS6110772A (ja) | 1984-06-26 | 1984-06-26 | 生体成分の分析法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05307020A true JPH05307020A (ja) | 1993-11-19 |
| JPH0718880B2 JPH0718880B2 (ja) | 1995-03-06 |
Family
ID=26334399
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59131556A Granted JPS6110772A (ja) | 1984-06-26 | 1984-06-26 | 生体成分の分析法 |
| JP5001221A Expired - Lifetime JPH0718880B2 (ja) | 1984-06-26 | 1993-01-07 | 生体成分の展開方法 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59131556A Granted JPS6110772A (ja) | 1984-06-26 | 1984-06-26 | 生体成分の分析法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4738920A (ja) |
| EP (1) | EP0167340B1 (ja) |
| JP (2) | JPS6110772A (ja) |
| AU (1) | AU579379B2 (ja) |
| CA (1) | CA1266612A (ja) |
| DK (1) | DK167237B1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005050204A1 (ja) * | 2004-02-16 | 2005-06-02 | Intelligent Cosmos Research Institute | ラクトフェリン・ポリペプチドの測定による歯周病リスク診断法 |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5202233A (en) * | 1988-07-11 | 1993-04-13 | Boehringer Mannheim Gmbh | Process for the detection of substances with hydrolase activity |
| US5260428A (en) * | 1988-07-11 | 1993-11-09 | Boehringer Mannheim Gmbh | Agent for the detection of substances with hydrolase activity |
| IE911853A1 (en) * | 1990-06-21 | 1992-01-01 | Ici Plc | Heterocyclene derivatives |
| US6194222B1 (en) * | 1998-01-05 | 2001-02-27 | Biosite Diagnostics, Inc. | Methods for monitoring the status of assays and immunoassays |
| US7713703B1 (en) | 2000-11-13 | 2010-05-11 | Biosite, Inc. | Methods for monitoring the status of assays and immunoassays |
| ATE343130T1 (de) * | 1999-12-29 | 2006-11-15 | Perkinelmer Life Sciences Inc | Testtablett, kit und verfahren zum screening von körperflüssigkeiten von neugeborenen durch tandem-massenspektrometrie |
| US8435800B2 (en) * | 2004-11-22 | 2013-05-07 | Biosight Ltd. | Activated labeling reagents and methods for preparing and using the same |
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