KR101746252B1

KR101746252B1 - 프리 비타민 ｄ의 면역 분석

Info

Publication number: KR101746252B1
Application number: KR1020127028242A
Authority: KR
Inventors: 미카엘 프란체스코 빌헬무스 코르넬리스 마틴; 조지 헨리 파슨스; 프란체스코 마리아 안나 로스말렌; 레온 마리아 자코버스 빌헬무스 스윈켈스
Original assignee: 퓨처 디아그노스틱스 비.브이.
Priority date: 2010-04-01
Filing date: 2011-04-01
Publication date: 2017-06-12
Also published as: US11927595B2; RU2592229C2; CA2794831C; RU2012141513A; US20180196071A1; EP2553467A1; CA2794831A1; WO2011122948A1; US9897615B2; US20130143241A1; KR20130018813A; JP2013524208A; US10935557B2; JP5808390B2; ES2707811T3; AU2011233816B2; BR112012025075A2; CN102985826A; EP2372365A1; AU2011233816A1

Abstract

흡수된 물질이 측정된 후, 혈액 또는 혈액 성분, 특히 혈청 또는 플라스마로부터 프리 25(OH) 비타민 D의 면역 흡수법을 행하는 것이 본 발명에 기재되어 있다. 플루오로-알킬 계면 활성제는 비타민 D의 가용성을 향상시키는데 사용되고, 프리 비타민 D를 측정시킨다. 따라서, 본 발명은 프리 25(OH) 비타민 D를 흡수하기 위해 결합 단백질을 적용한다. 그 후, 25-OH 비타민 D를 포함하는 결합 단백질은 표지 비타민 D 화합물, 바람직하게는 방사선 표지, 형광 표지, 발광 표지, 바이오틴 표지, 금 표지 또는 효소 표지로 경잭적 결합 분석이 행해진다. 또한, 면역 포획된 25-OH 비타민 D는 질량 분광 분석법에 의해 정량화될 수 있다.

Description

프리 비타민 Ｄ의 면역 분석{IMMUNOASSAY FOR FREE VITAMIN D}

본 발명은 프리 비타민 D의 혈액 또는 혈액 성분의 샘플을 분석하는 면역 분석 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 면역 분석법 및 현장 진단 시험을 포함하는 면역 분석법을 행하는 키트에 관한 것이다.

비타민 D라고 하는 물질은, 지용성 프로호르몬 및 대사물질 및 이들의 유사체를 포함한다. 비타민 D가 체내에 존재하는 주요 형태는 비타민 D₂ (에르고칼시페롤, ergocalciferol) 및 비타민 D₃ (콜레칼시페롤, cholecalciferol)이다. 비타민 D₃ (콜레칼시페롤, cholecalciferol)은 인간이 햇빛의 영향 하에서 피부에서 형성할 수 있는, 비타민 D의 내생의 형태이다. 비타민 D₂ (에르고칼시페롤, ergocalciferol)은 음식물로 섭취해야 하는 비타민 D의 외생의 형태이다. 미국에서, 비타민 D2는 약제학적 비타민 D 첨가제로서 사용된다. 달리 언급하지 않으면, 본 발명에서 비타민 D는 비타민 D 대사물질, 예컨대 25-히드록시-비타민 D (25-hydroxy-Vitamin D) 또는 1,25 디히드록시 비타민 D (1,25 dihydroxy Vitamin D)를 포함하는 비타민 D의 형태 또는 임의의 형태를 말한다.

비타민 D₂ 및 D₃은 이들의 측쇄의 분자 구조가 다르지만, 특히 칼시트리올이라고도 하는 1,25 디히드록시 비타민 D (1,25-(OH)2-Vitamin D), 또는 1,25 디히드록시 콜레칼시페롤 (1,25 dihydroxy cholecalciferol)로 두단계로 대사되는 프로호르몬에 존재하는 동일한 생물학적 활성을 공유한다. 앞선 대사물질, 25-히드록시 비타민 D (25-(OH)-Vitamin D) 또는 칼시디올(calcidiol)은 간에서의 전환으로부터 생성되고, 인체에 비타민 D의 저장 형태로 간주된다.

순환하는 비타민 D는 주로 25-(OH)-비타민 D3 및 25-(OH)-비타민 D2로 이루어진다. 생물학적으로, 25-(OH)-비타민 D2는 25-(OH)-비타민 D3만큼 효과적이다. 순환에서 25-(OH)-비타민 D2의 반감기는 더 짧다. 임상 시험에 있어서, 25-(OH)-비타민 D3 및 25-(OH)-비타민 D2를 측정하는, 25-(OH)-비타민 D 분석법의 사용이 추천된다 (1).

비타민 D는 중요한 물질로 오랫 동안 인식되어 왔고, 비타민 D의 활성 형태는 뼈의 형성과 유지 뿐만 아니라 인체 또는 동물체의 다른 과정들에서 역할을 한다. 따라서, 장에서 음식으로부터 칼슘 및 인의 흡수, 신장에서 칼슘의 재흡수를 증진시킴으로써 증진 혈류로 칼슘의 흐름을 증가시키고; 뼈의 보통의 무기물화를 가능하게 하고, 저칼슘성 테타니(hypocalcemic tetany)을 억제하기 위해 비타민 D가 제공된다. 또한, 비타민 D는 조골세포(osteoblast) 및 파골세포(osteoclast)에 의한 뼈의 개조 및 뼈의 성장에 필요하다.

비타민 D 결핍은 손상된 뼈의 무기질화(impaired bone mineralization)를 야기하고, 골 연화 질병(bone softening disease), 어린이의 구루병, 성인의 골연화증을 야기하고, 골다공증을 유발할 수 있다.

비타민 D는 갑상샘으로부터 방출되는 칼시토닌을 억제하는 것을 포함하여 인간 건강의 다른 많은 역할을 한다. 칼시토닌은 파골세포에 직접 작용하여, 골 흡수 및 연골 퇴화(cartilage degradation)를 억제시킨다. 또한, 비타민 D는 갑상샘으로부터의 부갑상샘 호르몬 분비를 억제하고, 신경근 및 면역 기능을 조절하고, 염증을 감소시킨다. 따라서, 적당한 수준의 비타민 D를 갖는 것은 인간 또는 동물의 건강에 필수적인 것이다.

그러나, 과잉의 비타민 D (과다 복용의 결과로 발생할 수 있는)는 독성이 있다. 비타민 D 독성의 일부 증상은, 창자의 칼슘 흡수가 증가됨으로써 야기되는 고칼슘혈증(hypercalcaemia, 혈액 중 칼슘의 수준이 증가된 것)이다. 비타민 D의 독성은 고혈압의 원인이 되는 것이 알려져 있다. 비타민 D 독성의 위장의 증상은, 식욕 부진증, 메스꺼움, 및 구토를 포함할 수 있다. 이러한 증상은 종종 다뇨증(polyuria, 소변의 과잉 생산), 구갈(polydipsia, 목마름의 증가), 허약, 신경과민, 소양증(pruritus, 가려움(itch)), 결국 신부전으로 이어진다.

명백하게, 가능한 비타민 D 결핍에 대해 피험자를 진단할 수 있는 것은 중요하다. 또한, 잠재적인 과잉의 비타민 D에 대해 피험자에게 시험할 수 있다는 것은, 특히 비타민 D 첨가제를 섭취한 피험자에게 중요하다. 총 25-(OH)-비타민 D의 혈청 수준은 비타민 D 상태 (2)의 최초 지표(primary indicator)로 간주된다. 그러나, 이러한 생각은 반박되어 왔다.

혈청 중 거의 모든 순환하는 25-(OH)-비타민 D는 비타민 D 결합 단백질(88%) 및 알부민(12%)에 결합된다. 비타민 D 결합 단백질(DBP)은 혈청 중 250-400 mg/L의 농도를 갖는 혈청 중 주요 성분이다. 일부분, 오직 약 2%의 DBP의 비타민 D 결합 부위가 점유된다. 매우 적은 부분, 25-(OH)-비타민 D의 0.04%는 프리(free), 단백질 비결합 형태(non-protein bound)로 순환한다.

DBP의 농도는 모든 사람에게 일정하지 않으며, 임신, 구강 피임제(oral contraceptives)의 사용, 신장 질환 및 간 질환을 포함하여 다른 요인에 의해 영향받을 수 있다. DBP의 농도를 아는 것은 환자의 진정한 25-(OH)-비타민 D 상태의 정확한 평가에 중요하다. 예컨대, 경구 피임약을 섭취한 젊은 여성은 보통의 범위인, 총 25-(OH)-비타민 D 수준을 가질 수 있다. 그러나, 그 여성의 증가된 DBP에 기인하여, 프리 25-(OH)-비타민 D의 농도는 현저하게 침체되고, 여성의 임상 25-(OH)-비타민 D 결핍의 위험 및 이러한 상태를 수반하는 모든 위험을 증가시킨다.

생체 내에서 티로이드 및 스테로이드 호르몬의 생리학적 활성은, 플라스마에서 호르몬의 총 농도보다, 이들의 프리, 단백질 비결합 부분(free, non-protein bound fraction)과 더 연관성이 있다는 것을 보여준다. 특히, 결합 단백질이 증가되거나 또는 감소되는 경우에, 총 순환 호르몬의 측정은 오진을 야기할 수 있다. 이러한 경우에, 프리 순환 호르몬의 농도 측정은 더 나은 정보를 제공한다. 이러한 생각은 "프리 호르몬 가설(free hormone hypothesis)"로 알려져 있다. 멘델 (3)은 프리 호르몬 가설은 "티로이드 호르몬, 코르티솔, 또한 비타민 D의 히드록실화 대사물질의 모든 조직에 대해 유효할 것이다"라고 제안했다.

Bikle et al (4)은 1,25-(OH)2-비타민 D의 프리 호르몬 가설의 유효성을 시험한다. 데이터는, 총 1,25-(OH)2-비타민 D의 현저한 감소에도 불구하고, DBP 수준이 감소되고, 프리 1,25-(OH)-2-비타민 D 수준은 간 질환을 겪고 있는 피험자에게 조차 잘 유지되는 것이 나타나는 것을 시사하고 있다.

25-(OH)-비타민 D에 대한 이어지는 연구에서, 동일한 군은 결합 단백질의 농도가 변화된 조건에서 프리 25-(OH)-비타민 D를 측정하도록 권고했다. 저자는, 총 비타민 D 대사물질의 측정이 간 질환을 겪고 있는 환자의 비타민 D 상태의 평가에 오해의 소지가 있을 수 있다고 결론을 내리고, 프리 25-(OH)-비타민 D 수준 또한 비타민 D 결핍을 진단하기 전에 측정할 것을 권고했다. Bikle et al 은 프리 25-(OH)-비타민 D (5)의 수준을 측정하기 위해 초미세여과(ultrafiltration)를 사용했다. 이러한 방법은 고정제된 방사선표지 비타민 D를 필요로 하고, 프리 비타민 D의 부분을 과대평가하는 경향이 있다.

Lauridsen et al (6)은 다양한 DBP 표현형을 갖는 여성이 다양한 농도의 1,25(OH)2VitD 및 25(OH)VitD를 갖는다는 것을 보여준다. 이들 저자는, Gc2-2를 갖는 여성은 낮은 플라스마 수준의 25(OH)VitD에서 비타민 D가 충분하다는 것을 제시했다.

일부 배경기술은 프리 아날라이트(free analyte)의 측정에 관해 언급할 수 있다.

US 특허 4366143은 결합 및 유리된 형태로 생물학적 유체에 존재하는 리간드 또는 유기 물질의 유리된 부분(free portion)의 분석에 관한 발명을 개시하고 있다. 이러한 방법은 필수적으로, 하나의 단계에서, 표지된 리간드 및 특정 바인더가 샘플에 동시에 첨가되는, 경쟁적 면역분석법이다. 리간드 및 표지 리간드의 유리된 부분은 특정 바인더와의 반응과 경쟁하고, 샘플에 존재하는 유리된 리간드 부분의 양에 따라 달라지는 비율로 그것에 결합되게 된다. 개시된 방법의 단점은, 특정 바인더 및 표지된 리간드의 존재에 기인하여, 결합 및 유리된 리간드 사이에 평형을 해칠 수 있는 복수의 요인이 존재하고, 이것은 상기 방법이 비타민 D의 경우만큼 상대적으로 적은 양으로 존재하는 유리된 리간드의 사용에 덜 적합하도록 한다는 것이다. 사실, 프리 비타민 D의 측정을 위한 분석법을 어떻게 사용하는지가 개시되어 있지 않다.

US 특허 4,292,296은 프리 아날라이트 및 리셉터-결합된 아날라이트를 함유하는 샘플 중 프리 아날라이트의 측정 방법을 개시하고 있다. 상기 방법은 2단계를 포함하는데, 제1단계는 용액으로부터 아날라이트를 제거하기 위해, 아날라이트의 흡수제와 샘플을 접촉시킨다. 제2단계는 표지된 아날라이트 유사체(labelelled analyte analogue)와 흡수제-결합된 아날라이트(absorbent-bound analyte)를 접촉시키는 것을 포함한다. 그 결과로, 가용성 상은 흡수제로부터 제거되고, 결합 및 세정된 상 중 표지된 양을 측정했다. 상기 방법은 프리 티로이드 호르몬의 농도를 측정하는 것이 개시되어 있다.

US 특허출원 2008/0182341은 유체 중 유리 또는 비결합된 아날라이트 농도의 측정에 유용한 안정화제에 관한 것이다. 상기 특허는 안정화제가 결합 단백질의 리간드의 해리를 억제한다는 것을 제시한다. 상기 참조는 동시 분석 절차 및 각종 안정화제의 리스트를 적용한다. 안정화제는 알킬 아민 플루오로 계면활성제를 포함하지 않도록 제공된다.

선행 기술 참조 중 어떤 것도 구체적으로 프리 비타민 D의 상태를 반영하여 비타민 D의 측정을 위한 분석법이 제공되지 않았다.

프리 비타민 D의 분석법은 수십년간 알려졌지만, 이들은 그 근거로서 평형 투석(equilibrium dialysis) 또는 레이트 투석(rate dialysis)과 같은 방법을 사용한다. 이러한 방법은 고숙련된 기술진과 연구자에게 허용 가능하지만, 재정적 목표를 달성하기 위해 고출력 자동화 시험을 필요료하는 일반적인 실험실에 부적당했다. 따라서, 자동화될 수 있고, 포인트-오브-케어 시험(point-of-care testing)에 적합한, 프리 비타민 D의 분석법을 제공하는 것이 바람직하다.

상기 번호로 매긴 참조는 이하와 같다:

1. Hollis BW. Measuring 25-hydroxyvitamin D in a clinical environment: challenges and needs.

Am J Clin Nutr.　2008 Aug;88(2):507S-510S.

2. Holick MF. Vitamin D: extraskeletal health.

Endocrinol Metab Clin North Am.　2010 Jun;39(2):381-400.

3 Mendel CM. The free hormone hypothesis: a physiologically based mathematical model.

Endocr Rev.　1989 Aug;10(3):232-74.

4. Bikle D, Gee E, Halloran B, Haddad J. Free 1,25-Dihydroxyvitamin D Levels in Serum from Normal Subjects, Pregnant Subjects, and Subjects with Liver Disease.

J Clin Invest. 1984; 74: 1966-1971.

5. Bikle D,　Gee E,　Halloran B,　Kowalski MA,　Ryzen E,　Haddad J. Assessment of the free fraction of 25-hydroxyvitamin D in serum and its regulation by albumin and the vitamin D-binding protein.

J Clin Endocrinol Metab.　1986 Oct;63(4):954-9.

6. Lauridsen AL, Vestergaard P, Hermann AP, Brot C, Heickendorff L, Mosekilde L, Nexo E.

Plasma concentrations of 25-hydroxy-vitamin D and 1,25-dihydroxy-vitamin D are related to the phenotype of Gc (vitamin D-binding protein): a cross-sectional study on 595 early postmenopausal women.

Calcif Tissue Int. 2005 Jul;77(1):15-22.

7. van Hoof HJ,　Swinkels LM,　Ross HA,　Sweep CG,　Benraad TJ.

Determination of non-protein-bound plasma 1,25-dihydroxyvitamin D by symmetric (rate) dialysis. Anal Biochem 1998 May 1;258(2):176-83.

하나 이상의 상기 바람직한 본 발명을 더 잘 주장하기 위해, 일 실시형태에 있어서, 프리 비타민 D (비타민 D 대사물질, 예컨대 25-히드록시-비타민 D 또는 1,25 디히드록시 비타민 D를 포함함)의 존재에 대한 혈액 또는 혈액 성분 샘플의 분석 방법으로서,

(a) 상기 샘플에 25-OH 비타민 D의 항체 또는 고정화 결합 단백질을 첨가하는 단계;

(b) 상기 샘플과 희석액을 혼합하는 단계로서, 상기 희석액은 플루오로알킬 계면활성제를 포함하는, 혼합 단계;

(c) 바람직한 양의 25-OH 비타민 D를 결합 단백질과 결합시키기 위해, 충분한 시간 동안 상기 샘플을 배양하는 단계;

(d) 세정에 의해 비결합 혈청 및 혈청 성분을 제거하는 단계;

(e) 그것에 결합되는 25-OH 비타민 D를 포함하는 항체 또는 고정화 결합 단백질을 표지 비타민 D 화합물과 경쟁적 결합시키는 단계;

(f) 결합 단백질과 결합된 표지 비타민 D 화합물의 농도를 측정하는 단계;

를 포함하는, 분석 방법이 제시된다.

일 실시형태에 있어서, 본 발명은 상기 방법을 행하는 키트가 있다.

다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 프리 비타민 D의 존재에 대한 혈액 또는 혈액 성분 샘플의 분석 방법으로서,

제1 단계에서 비타민 D의 고정화 바인더 상에 비타민 D를 포획하는 단계,

다음 단계에서 표지 비타민 D 변종에 대항하여, 포획된 비타민 D에 경쟁적 결합 분석을 행하는 단계를 포함하고,

상기 프리 비타민 D의 포획은 반복 시험을 만족시킬 정도로 제한되는 결합된 비타민 D의 양을 봉쇄함으로써 행해지고,

비타민 D가 포획된 샘플은 비타민 D를 포획하는 동일 단계가 행해지고, 포획된 비타민 D에 동일한 경쟁적 결합 분석을 행하고,

양 경쟁적 결합 분석 후에, 상기 프리 비타민 D의 측정된 농도는 실질적으로 동일한, 분석 방법이 적용된다.

또 다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 프리 비타민 D의 존재에 대한 혈액 또는 혈액 성분 샘플의 분석 방법으로서,

제1 단계에서 25-OH 비타민 D의 항체 또는 고정화 결합 단백질과 같은 고정화 바인더 상에 비타민 D를 포획하는 단계,

다음 단계에서 표지 비타민 D 변종에 대항하여, 포획된 25-OH 비타민 D에 경쟁적 결합 분석을 행하는 단계를 포함하고,

상기 결합 비타민 D의 0.5 내지 5 중량%가 포획되는, 분석 방법이 적용된다.

또 다른 실시형태에 있어서, 상기 방법은 포인트-오브-케어(point-of-care)" 시험에 사용될 수 있다. 포인트-오브-케어(point-of-care)란 환자 케어 부위나 가까이에서 시험하는, 즉 혈액 샘플을 채취(drawing)하고, 진단 연구실로 이들을 보내는 것보다, 샘플을 가능한 제한된 수의 단계, 메뉴얼 작동으로 분석을 행할 수 있기 위해, 직접 이동가능한, 바람직하게는 손에 들고 쓰는 장치에 도입할 수 있는 것을 말한다(In yet another aspect the method can be used for point-of-care" testing. The latter refers to testing at or near the site of patient care, i.e. rather than drawing blood samples and sending these to a diagnostic laboratory, a sample can be immediately introduced into a portable, preferably handheld device which is able to perform the assay in as limited a number of steps as possible, and with as limited a number of manual operations as possible.).

다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 플루오로알킬 계면활성제, 바람직하게는 퍼플루오로 카르복실산이고, 더욱 바람직하게는 프리 비타민 D를 측정하기 위한 면역분석법에서 비타민 D의 가용성 향상제(solubility enhancer)로서, 퍼플루오로옥탄산(PFOA)이 적용된다.

도 1은 본 발명의 분석법의 제1 패스와 제2 패스(the first and the second pass) 사이의 프리 비타민 D 농도의 연관성을 나타낸다. 표시한 선은 다른 레벨 수준의 프리 비타민 D를 갖는 10 샘플을 사용하여 반복된 면역추출(immunoextraction)로부터 비롯된 것이다.

넓은 의미에서, 본 발명은 혈액 또는 혈액 성분, 특히 혈청 또는 플라스마로부터 단백질 비결합 25(OH)-비타민 D의 면역-흡수 단계, 그 후 흡수된 비타민 D가 측정 단계를 포함하는, 프리 비타민 D의 측정을 위한 2단계 분석법에 관한 것이다.

이러한 샘플은 피험자, 특히 인간으로부터, 프리 25-OH-비타민 D의 존재를 분석하기에 바람직한 인간의 혈액에서 공지된 기술의 임의의 방법으로 채취될 수 있다.

프리 비타민 D는 비타민 D의 순환하는, 결합되지 않은 부위를 말한다(Free Vitamin D refers to the circulating, unbound fraction of Vitamin D). 프리 비타민 D는 비타민 D2, 비타민 D3, 및 대사물질 25(OH)-비타민 D2, 25-(OH)-비타민 D3, 1,25(OH)₂-비타민 D2, 및 1,25(OH)₂-비타민 D3을 포함하는 25-(임의의 형태의 비타민 D를 말한다. 분석은 이러한 형태의 프리 비타민 D가 단독으로 또는 조합하여 측정에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 분석은 프리 25(OH)-비타민 D의 측정에 사용되어, 25(OH)-비타민 D2 및 25-(OH)-비타민 D3의 측정을 가능하게 한다. 프리(free) 및 비결합된(bound)이란 비타민 D 결합 단백질 (VDBP 또는 DBP)을 주로 포함하는 임의의 단백질에 결합되지 않은 부분을 말한다.

샘플은 바람직하게는 결합 단백질의 첨가 전, 첨가 동안, 또는 첨가 후에 희석된다. 샘플 희석액은 수성계일 수 있고, 바람직하게는 완충 용액일 것이다. 바람직하게는, 완충된 pH는 6.0 내지 8.0의 범위이다. 완충액은 플루오로 알킬 계면활성제를 포함한다. 완충액과 샘플을 혼합하는 것은, 샘플에 희석액을 첨가함으로써, 희석액에 샘플을 첨가함으로써, 또는 서로 완충액과 샘플을 동시에 첨가함으로써 행해질 수 있다고 알려져 있다. 현실적인 이유로, 희석액을 샘플에 첨가하는 것이 바람직하다.

이론에 얽매이지 않고, 본 발명자들은 비타민 D의 제한된 봉쇄를 위해 이러한 방법으로 계면활성제가 비타민 D의 가용성을 향상시킨다는 것을 알았다(ithout wishing to be bound by theory, the inventors believe that the surfactants enhances the solubility of Vitamin D.in such a way as to result in a limited sequestering of Vitamin D.).

다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 프리 비타민 D를 분석하는 새로운 개념을 적용한다. 프리 비타민 D를 분석하는 것의 문제점은, 프리 비타민 D의 원래 농도가 매우 낮고, 기존의 면역분석법에 의해 측정될 수 없다는 것이다. 이러한 문제를 해결하기 위한 기존의 시도들은, DBP로부터 비타민 D의 제거를 피하기 위한 바람에 기초한 것 (예컨대, 프리 및 결합 비타민 D 사이의 평형을 안정화하기 위한 시도에 의함) 또는 프리 DBP는 분석될 수 없다는 사실을 인정하고(just involve surrendering to the fact that free DBP cannot be assayed), 이들 분석이 DBP로부터 비타민 D의 변위를 포함하는(these assays just involve displacement of Vitamin D from DBP) 것이다.

본 발명에서, 비타민 D의 한정된 봉쇄는 예견되었고, 봉쇄된 비타민 D의 부분은 충분히 적고, 원래의 프리 비타민 D 농도를 여전히 반영하기 위해(to still reflect the original free Vitamin D concentration), 바람직하게는 총 비타민 D의 0.1-10%가 샘플 중에 존재하고, 바람직하게는 이들의 5%를 초과하지 않는 것이다.

이는 과도한 실험 없이 단순히 삼중 수소화 비타민 D 및 희석 완충액의 첨가에 의해 변경될 수 있다. 비타민 D 결합 단백질에 결합된 비타민 D는 5% 이상 감소되지 않는다. 또한, 샘플은 웰이 코팅된 항체의 벽에 흡수되지 않을 수 있다(sample can be absorbed to the wall of antibody coated wells). 샘플 제거 후, 비오티닐화 비타민 D가 첨가되고, 항체에 흡수되는 프리 비타민 D는 정량화된다. 비타민 D의 최초량이 제거된 샘플이 제2 웰에 도입되고 다시 배양되고 정량화되었다. 프리 비타민 D의 측정된 농도는 제1 배양의 결과와 동일해야한다.

비타민 D의 제한된 봉쇄화는 플루오로 알킬 계면활성제의 0.05 내지 0.5중량%, 바람직하게는 0.1 내지 0.25중량%의 첨가에 의해 행해지는 것이 바람직하다. 바람직하게는 플루오로 알킬 계면활성제는 퍼플루오로 알킬 계면활성제, 더욱 바람직하게는 퍼플루오로 카르복실레이트 계면활성제, 가장 바람직하게는 퍼플루오로옥탄산(PFOA)이다. 바람직하게는 0.1 내지 0.2%, 더욱 바람직하게는 0.15%의 PFOA가 사용된다. 이러한 조건 하에서, 총 비타민 D의 농도는 동일하지만, DBP의 수준이 다른 샘플의 반응은, 대칭 투석(symmetric dialysis)에 의해 측정된 바와 같이, 프리 비타민 D의 농도와 연관된다.

본 발명에서, PFOA 자체 , 또는 이들의 유도체가 사용될 수 있다. 이들 유도체는 일반적으로 퍼플루오로 옥탄 부위, 특히 PFOA 염, 예컨대 PFOA 암모늄염을 포함하는 유도체, 및 대응하는 설폰산, 즉 PFOS(퍼플루오로 옥탄 설포네이트, 퍼플루오로 옥탄 설폰산으로도 알려짐)로 축약되는 PFOA 설포네이트를 말한다.

본 발명에 따른 프리 비타민 D(비타민 D 대사물질 포함)의 측정 방법의 이점은, 자동화될 수 있는 분석 포멧을 제공한다는 것이다. 이것은 본 발명의 분석을 프리 비타민 D의 특정을 위한 기존에 존재하는 분석과 현저히 구분 짓는다.

본 발명의 분석에서, 25-OH-비타민 D에 대한 결합 단백질이 첨가된다. 비타민 D에 대한 결합 단백질, 예컨대 항체는 공지 기술이고, 비타민 D에 대해 현존하는 면역분석법에 널리 사용된다. 이들 동일 항체 또한 다른 결합 단백질은 웰로서 본 발명에 사용될 수 있다. 예컨대, 비타민 D에 대한 항체의 자리에 항체 단편은 파지 디스플레이 기술로 생산되는 것과 같이(such as produced with phage display technology) 사용될 수 있다. 적합한 항체는 단일항체 또는 다중클론성 항체(monoclonal or polyclonal antibodies)일 수 있다. 이들 항체는, 공지 방법, 예컨대 다중 클론성 염소 항 비타민 D, 다중클론성 토끼 항 비타민 D, 또는 비타민 D의 면역분석법의 용도로부터 공지된 비타민 D에 대한 다른 적합한 항체로 얻어질 수 있다. 적합한 항체는, 예컨대 참조: Hollis, Clin.Chem 31/11, 1815-1819 (1985); Hollis, Clin.Chem 39/3, 529-533 (1993)에 공지되어 있다.

결합 단백질은 바람직하게는 고형의 담체를 포함하여 특정 형태로 첨가된다. 일반적으로, 결합 단백질은 고체상(solid phase), 예컨대 미세역가 플레이트(microtiter plate) 상에 코팅된다. 바람직한 실시형태에 있어서, 결합 단백질은 자기장의 분리를 가능하게 하는 자기 입자 상에 코팅된다.

결합 단백질, 예컨대 항체의 첨가 후, 샘플을 배양시킨다. 필요한 시간은 환경, 예컨대 시약의 농도, 결합 단백질의 형태, 배양의 조건, 예컨대 흔듦 및 온도에 따라 달라진다. 일반적으로, 배양 시간은 10초 내지 몇 시간, 바람직하게는 1분 내지 2시간의 범위일 것이다. 자동화 플랫폼에서는, 단기간의 배양 시간(10초 내지 10분, 바람직하게는 30초 내지 30분)이 바람직하다. 기본적으로, 기간은 소망하는 기간 동안 환경하에서 어느 정도의 프리 비타민 D가 결합되는지, 칼리브레이션 시스템에서 측정하는 한, 특정 관련성은 없다. 적절한 칼리브레이션이 발생하면, 더 짧은 기간, 더 긴 기간이 자유롭게 가능하다. 따라서, 바람직하게는 칼리브레이터의 비교는 동일한 조건 하에서, 동일한 기간을 수반한다(comparison with calibrators involves the same period of time, under the same conditions).

배양 기간 후, 샘플은 공지된 방법으로 표지된 비타민 D 화합물을 사용하여 경쟁적 결합 분석이 행해질 수 있다. 다수의 표지된 화합물은 비타민 D의 측정을 위한 면역분석법에서 경쟁적 결합 항원으로 작용할 수 있는 것으로 알려져 있다. 일반적인 표지는 방사선 표지(radiolabels), 형광 표지(fluorescent labels), 발광 표지(luminescent labels), 바이오틴 표지(biotin labels), 금 표지(gold labels), 효소 표지(enzyme labels)이다. 경쟁적 결합 분석은 당업자에게 잘 알려져 있고, 특히 본 발명의 방법 중 이 부분은 비타민 D 측정에 적합할 것으로 알려진 임의의 표지를 사용하여 행할 수 있기 때문에, 설명을 요하지 않는다. 사용될 수 있는 표지는, 현존하는 비타민 D 면역분석법에 대한 앞선 참조에 개시된 것들이다.

농도를 측정하게 하는 표지를 사용하여, 결과적으로, 샘플 중 프리 비타민 D의 농도가 측정된다. 측정된 값의 해석은 칼리브레이션 측정, 즉 칼리브레이터의 동일 분석에서의 반응에 의해 측정된다는 것을 알 수 있다(It will be understood that the interpretation of the values measured, is determined by a calibration measurement, i.e. by the response-in the same assay-of calibrators).

또한, 포획된 비타민 D는 질량 분석법을 사용하여 정량적 분석이 행해질 수 있다.

본 발명의 분석을 위한 칼리브레이션은 프리 25-OH-비타민 D의 소정의 농도를 포함하여 칼리브레이터를 제공함으로써 행해질 수 있다. 이러한 칼리브레이터에서 프리 비타민 D의 부분은 대칭 투석에 의해 측정될 수 있다. 대칭 투석에 있어서, 혈청 샘플은 투석 셀(dialysis cell)의 한쪽에 적재된다. 다른 칸은 방사선 표지 비타민 D의 추적량이 첨가된 동일한 샘플이 적재된다. 한쪽의 투석 칸에서 다른 칸으로의 방사선 표지 비타민 D의 이동률(rate of migration)은 비타민 D(7)의 프리한 부분에 직접적으로 비례한다.

본 발명에 따른 프리 비타민 D의 측정은 상술한 비타민 D의 제한된 봉쇄에 기초하지만, 프리 비타민 D의 농도에 실질적인 영향 없이, 프리 비타민 D의 농도의 평가에 의존한다.

다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 혈액 또는 혈액 성분에 25-OH 비타민 D의 측정을 위한 면역 분석의 형태로 프러덕트가 존재하고, 이러한 분석은 상기 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법을 사용한다. 더욱 구체적으로, 이러한 프러덕트는 면역 분석을 시행하기 위한 키트의 형태로 제공될 것이다. 이러한 키트는 개별 시약, 즉 결합 단백질 및 표지 비타민 D 화합물을 포함할 수 있다. 이들 시약은 따로 제공될 수 있으므로, 본 발명의 분석 시에만 키트를 형성한다. 바람직하게는, 시약은 함께 제공되고, 바람직하게는 하나의 키트의 부분으로서 함께 패킹된다. 키트는 혈액 또는 혈액 성분의 샘플용 용기를 선택적으로 포함하지만, 관용적으로, 용기가 따로 제공될 수 있다. 일반적으로 키트는 고체상에 고정화된 바인더 및 분리된 콘쥬게이트 비타민 D를 포함한다. 다른 키트 성분은, 다른 표지는 다른 시약을 필요로 할 수 있기 때문에, 관용적으로 선택된 표지에 따라 달라진다.

또한, 본 발명은 프리 비타민 D의 측정을 위한 면역 분석에서 비타민 D의 가용성 향상으로서, 플루오로알킬 계면활성제, 바람직하게는 퍼플루오로 카르복실레이트 계면활성제, 더욱 바람직하게는 퍼플루오로옥탄산 및/또는 퍼플루오로헵탄산의 사용이 적용된다.

바람직한 계면활성제 퍼플루오로 알킬 계면활성제, 더욱 바람직하게 퍼플루오로 카르복실레이트, 예컨대 퍼플루오로헵탄산 또는 퍼플루오로옥탄산. 더욱 바람직하게, 계면활성제는 퍼플루오로옥탄산(PFOA), 또는 이들의 유도체이다. 이들 유도체는 일반적으로 퍼플루오로옥탄 부위(perfluorooctanoic moiety), 특히 PFOA 염, 예컨대 PFOA 암모늄 염을 포함하는 유도체, 및 대응하는 설폰산, 즉 PFOS로 축약되는(퍼플루오로 옥탄 설포네이트, 퍼플루오로 옥탄 설폰산으로도 알려짐) PFOA 설포네이트를 말한다. 또한, 다른 퍼플루오로 카르복실레이트 계면활성제의 유사 유도체가 사용될 수 있다.

본 발명은 상기 기재된 실시형태 및 식에 한정되지 않는 것으로 이해해야 한다. 또한 청구항에서 "포함하는(comprising)"은 다른 요소나 단계를 배제하는 것이 아니라고 이해해야 한다. 예컨대, "a" 또는 "an", "the"와 같은 단수를 언급하는 경우에 불분명한 또는 분명한 글이 사용되면, 달리 언급하지 않아도 그 복수형을 포함한다.

본 발명은 이하 한정되지 않은 실시예 및 한정되지 않는 첨부된 도면을 참조하여 설명될 것이다.

실시예

물질( Materials )

코팅된 미세역가 플레이트( Coated Microtiterplates )

Nunc maxisorp 미세역가 플레이트를 200 ng/well의 농도에서 항-마우스 IgG 항체(anti-mouse IgG antibody)로 코팅했다. 이어서, 단일항체 항-25(OH) 비타민 D 항체의 층을 2 ng/well 농도에서 항-마우스 IgG 층 상에 흡수시켰다. 상기 플레이트를 BSA 및 슈크로오스를 함유하는 보레이트 완충액(borate buffer)으로 차단했다(blocked).

샘플 희석액( sample diluent )

샘플 희석액은 보존제와 0.15%의 PFOA를 함유하는 pH 8.0의 0.1M TRIS 완충액으로 이루어진다.

콘쥬게이트( conjugate )(즉, 표지 비타민 D 화합물)는 비오티닐화된 비타민-D(biotinylated Vitamin-D)이다. 상기 콘쥬게이트는 0.1% 소 혈청 알부민 및 보존제를 함유하는 pH 7.5의 0.1M Tris 완충액 중 25 pg/ml의 농도로 존재한다.

스트렙타아비딘-HRP(Streptavidin-HRP) 및 TMB는 시판되는 것이다.

프로토콜

분석은 이하와 같이 행해진다. 미세역가 플레이트의 웰에서, 90㎕의 샘플 희석액을 피펫팅했다. 이어서, 10㎕의 샘플을 희석액에 첨가했다. 이 혼합물을 37℃에서 90분간 배양했다. 이어서, 웰을 세정 완충액(washbuffer)으로 3번 세정했다. 100㎕의 HRP콘쥬게이트를 큐벳에 첨가하고, 30분 동안 배양했다. 다시 웰을 세정 완충액으로 3번 세정했다. 그 후, 스트렙타아비딘이 표지된 호스 라디시 퍼옥시다제(Horse Radish Peroxidase)의 첨가에 의해 비색 신호(colorimetric signal)가 발생되었다. 37℃에서 20분 배양 후, 웰을 세정 완충액으로 3번 세정했다. 이어서, 100㎕의 TMB 용액을 웰에 첨가했다. 암실에서 실온에서 20분 배양한 후, 100㎕의 정지액(stop solution)을 첨가하고, 450 nm에서 흡광도를 리딩했다. 웰에서 발생된 신호는 칼리브레이터 또는 샘플 중 프리 25(OH) 비타민 D의 농도에 반비례한다. 원래 샘플 중 프리 25(OH) 비타민 D의 농도는 미지 시료(unknown)의 신호와 칼리브레이터의 반응을 비교함으로써 산출될 수 있다.

결과

표준 참조 샘플에 대한 본 발명의 분석을 사용하여, 프리 25(OH) 비타민 D의 측정에 대한 일반적인 칼리브레이션 곡선을 작성하고, 이하 표에 설명했다.

인간 또는 동물 피험자, 예컨대 환자의 혈액 또는 혈액 성분의 샘플에 본 발명의 분석이 행해질 수 있다. 비타민 D의 측정량은 칼리브레이션 곡선과 연관성이 있을 수 있으므로 해석된다.

Claims

프리 비타민 D (비타민 D 대사물질)의 존재에 대한 혈액 또는 혈액 성분 샘플의 분석 방법으로서, 상기 프리 비타민 D는 비타민 D의 순환하는, 결합되지 않은 부위이고:
(a) 상기 샘플에 고체상으로 고정화된 25-OH 비타민 D의 항체 또는 결합 단백질을 첨가하는 단계;
(b) 상기 샘플과 희석액을 혼합하는 단계로서, 상기 희석액은 플루오로알킬 계면활성제를 포함하는, 혼합 단계;
(c) 비타민 D를 결합 단백질과 결합시키도록 상기 샘플을 배양하는 단계;
(d) 세정에 의해 비결합 혈청 및 혈청 성분을 제거하는 단계;
(e) 포획 비타민 D를 포함하는 항체 또는 고정화 결합 단백질을 표지 비타민 D 화합물과 경쟁적 결합시키는 단계(subjecting the immobilized binding protein or antibody comprising captured Vitamin D bound thereto, to competitive binding with a labeled vitamin D compound);
(f) 결합 단백질과 결합된 표지 비타민 D 화합물의 농도를 측정하는 단계;
를 포함하고,
상기 플루로오알킬 계면활성제는 퍼플루오로옥탄산이며,
상기 퍼플루오로옥탄산의 농도는 0.1 내지 0.25 중량%인,
프리 비타민 D의 존재에 대한 혈액 또는 혈액 성분 샘플의 분석 방법.
제1항에 있어서,
상기 희석액은 완충된 pH가 6.0 내지 8.0의 범위인 완충 용액인, 프리 비타민 D의 존재에 대한 혈액 또는 혈액 성분 샘플의 분석 방법.
제1항에 있어서,
상기 결합 단백질은 항체인, 프리 비타민 D의 존재에 대한 혈액 또는 혈액 성분 샘플의 분석 방법.
제1항에 있어서,
상기 결합 단백질은 비타민 D 결합 단백질인, 프리 비타민 D의 존재에 대한 혈액 또는 혈액 성분 샘플의 분석 방법.
제1항에 있어서,
상기 샘플은 인간 혈청 또는 플라스마인, 프리 비타민 D의 존재에 대한 혈액 또는 혈액 성분 샘플의 분석 방법.
제1항에 있어서,
상기 결합 단백질은 자기 입자 상에 도포된 형태로 제공되는, 프리 비타민 D의 존재에 대한 혈액 또는 혈액 성분 샘플의 분석 방법.
제1항에 있어서,
상기 표지 비타민 D 화합물은 방사선 표지(radiolabels), 형광 표지(fluorescent labels), 발광 표지(luminescent labels), 바이오틴 표지(biotin labels), 금 표지(gold labels), 효소 표지(enzyme labels)로 이루어진 군으로부터 선택된 표지를 포함하는, 프리 비타민 D의 존재에 대한 혈액 또는 혈액 성분 샘플의 분석 방법.
제1항에 있어서,
상기 농도는 프리 25-OH 비타민 D의 칼리브레이터 농도에 관해 측정되는, 프리 비타민 D의 존재에 대한 혈액 또는 혈액 성분 샘플의 분석 방법.
제1항에 정의된 (a), (b), (c) 및 (d) 단계, 및 포획된 비타민 D에 질량 분광 분석법을 이용하여 정량적 분석을 행하는 단계를 포함하는, 혈청 또는 플라스마 샘플로부터 프리 비타민 D을 정량하는 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 방법을 사용하는 면역 분석법을 실행하기 위한 키트로서,
상기 키트는 고체상으로 고정화된 비타민 D의 결합 단백질, 퍼플루오로옥탄산을 0.1 내지 0.25 중량% 농도로 포함하는 희석액 및 표지 비타민 D 화합물을 포함하는, 키트.
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