JP2013524208A - 遊離型ビタミンdのイムノアッセイ - Google Patents
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Abstract
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(a)25-OHビタミンD用の固定化結合タンパク質または抗体をサンプルに加えるステップ;
(b)前記サンプルを希釈液と混合するステップであって、前記希釈液はフルオロアルキル界面活性剤を含むステップ;
(c)所望の量の25-OHビタミンDを前記結合タンパク質と結合可能にするのに有効な時間量の間、前記サンプルをインキュベートするステップ;
(d)洗浄によって、結合していない血清および血清成分を除去するステップ;
(e)結合した25-OHビタミンDを含む前記固定化結合タンパク質または抗体を、標識化ビタミンD化合物との競合的結合に供するステップ;
(f)前記結合タンパク質に結合した標識化ビタミンD化合物の濃度を測定するステップ
を含む。
コーティングしたマイクロタイタープレート
Nunc maxisorpマイクロタイタープレートを、200ng/ウェルの濃度の抗マウスIgG抗体でコーティングした。その後、モノクローナル抗25(OH)-ビタミンD抗体の層を、抗マウスIgG層上に2ng/ウェルの濃度で吸収させた。BSAおよびショ糖を含むホウ酸塩緩衝剤を用いて、プレートをブロッキングした。
サンプル希釈液は、保存料および0.15%のPFOAを含む、pH8.0の0.1M TRIS緩衝液からなる。
本アッセイは、次のように行う。マイクロタイタープレートのウェルに、90μlのサンプル希釈液をピペットで分注する。次に、希釈液に10μlのサンプルを加える。この混合物を37℃で90分間インキュベートする。その後、ウェルを洗浄緩衝液で3回洗浄する。100μlの西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体(HRP複合体)をキュベットに加え、30分間インキュベートする。再度、ウェルを洗浄緩衝液で3回洗浄する。次に、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識化ストレプトアビジンの添加によって比色シグナルを生成させる。37℃で20分間インキュベート後、ウェルを洗浄緩衝液で3回洗浄する。その後、100μlのTMB溶液をウェルに加える。室温で20分間、暗所でインキュベートした後、100μlの停止溶液を加え、450nmでの吸光度を読み取る。
標準参照サンプルに対して本発明のアッセイを使用して、遊離型25(OH)-ビタミンDの測定の典型的な較正曲線を作成し、下記Table(表1)に示す。
Claims (16)
- 遊離型ビタミンD(25-ヒドロキシ-ビタミンDまたは1,25-ジヒドロキシ-ビタミンDなどのビタミンD代謝産物を含む)の存在について血液または血液成分のサンプルをアッセイする方法であって、
(a)25-OHビタミンD用の固定化結合タンパク質または抗体をサンプルに加えるステップ;
(b)前記サンプルを希釈液と混合するステップであって、前記希釈液はフルオロアルキル界面活性剤を含むステップ;
(c)所望の量のビタミンDを前記結合タンパク質に結合させるのに有効な時間量の間、前記サンプルをインキュベートするステップ;
(d)洗浄によって、結合していない血清および血清成分を除去するステップ;
(e)結合した捕捉ビタミンDを含む前記固定化結合タンパク質または抗体を、標識化ビタミンD化合物との競合的結合に供するステップ;
(f)前記結合タンパク質に結合した標識化ビタミンD化合物の濃度を測定するステップ
を含む方法。 - 前記フルオロアルキル界面活性剤がペルフルオロカルボン酸であり、好ましくは、ペルフルオロオクタン酸、ペルフルオロヘプタン酸、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記界面活性剤の濃度が、0.05〜0.5重量%、好ましくは0.1〜0.25重量%である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記希釈液が、6.0〜8.0の範囲の緩衝pHを有する緩衝液である、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記結合タンパク質が抗体である、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記結合タンパク質が、ビタミンD結合タンパク質である、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記サンプルが、ヒトの血清または血漿である、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記結合タンパク質が、磁性粒子上にコーティングされた形態で提供される、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標識化ビタミンD化合物が、放射性標識、蛍光標識、発光標識、ビオチン標識、金標識、酵素標識からなる群より選択される標識を含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記濃度が、遊離型25-OHビタミンDの標準物質濃度を基準にして測定される、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- 第1のステップにおいて、ビタミンD用の固定化結合剤上にビタミンDを捕捉し、その後のステップにおいて、前記捕捉ビタミンDを標識化ビタミンD変異型に対する競合結合アッセイに供することを含む、遊離型ビタミンDの存在について血液または血液成分のサンプルをアッセイする方法であって、遊離型ビタミンDの捕捉が、反復試験を満たすように制限されたある量の結合ビタミンDを隔離することによって達成され、ビタミンDが捕捉された前記サンプルを、ビタミンDを捕捉し、前記捕捉ビタミンDを同じ競合結合アッセイに供する同じステップに供し、両方の競合結合アッセイ後の遊離型ビタミンDの測定濃度が実質的に同じである、方法。
- 請求項1から10のいずれか一項に記載の方法に従って行われる、請求項11に記載の方法。
- 隔離されたビタミンDの割合が、前記サンプル中に存在する全ビタミンDの0.1〜10重量%であり、好ましくは全ビタミンDの5重量%以下である、請求項11または12に記載の方法。
- 請求項1に記載のステップ(a)、(b)、(c)、および(d)、ならびに、捕捉ビタミンDを質量分光アッセイによる定量分析に供するステップを含む、血清または血漿サンプルから遊離型ビタミンDを定量する方法。
- 請求項1から14のいずれか一項に記載の方法を使用する、血液または血液成分中の遊離型ビタミンDを決定するためのイムノアッセイ。
- 固相上に固定化されたビタミンDのための結合タンパク質、および標識化ビタミンD化合物を含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法を使用してイムノアッセイを行うためのキット。
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