WO2023082454A1

WO2023082454A1 - 一种基于一种或多种细菌全细胞组分的预防或治疗疾病的疫苗系统及其制备方法与应用

Info

Publication number: WO2023082454A1
Application number: PCT/CN2021/144063
Authority: WO
Inventors: 刘密
Original assignee: 苏州尔生生物医药有限公司
Priority date: 2021-11-15
Filing date: 2021-12-31
Publication date: 2023-05-19
Also published as: CN114028550A

Abstract

基于一种或多种细菌全细胞组分的预防或治疗疾病的疫苗系统，具体为将细菌全细胞裂解后水溶性组分和/或非水溶性组分重新组装成预防或治疗疾病的疫苗系统，利用纳米级尺寸或微米级尺寸的粒子装载一种或多种细菌的全细胞组分的水溶性成分和非水溶性成分，用于制备预防和治疗疾病的疫苗，水溶性组分和非水溶性组分都被负载于纳米粒子或微米粒子中，即细菌组分都被负载于纳米疫苗或微米疫苗中，从而可用于疾病的预防和治疗。

Description

一种基于一种或多种细菌全细胞组分的预防或治疗疾病的疫苗系统及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于免疫预防和治疗领域，具体涉及一种将一种或多种细菌裂解后的全细胞组分重新组装成的纳米或微米疫苗，尤其是涉及一种基于一种或两种以上细菌的全细胞组分的疫苗及其在预防和治疗相应疾病中的应用。

背景技术

免疫是人体的一种生理功能，人体依靠这种功能识别“自己”和“非己”成分，从而破坏和清除人体内的异常物质如细菌和病毒等，或人体本身所产生的损伤细胞和肿瘤细胞等，以维持人体的健康。通过调节机体免疫系统的平衡，我们可以影响机体感染细菌后所引发疾病的发生、发展和治疗。

疫苗是疾病免疫治疗和预防的重要方法之一。开发针对细菌引发的疾病的疫苗的基础是选择合适的抗原来激活人体免疫系统对细菌的识别，而细菌本身是最好的识别抗原的来源。科学家曾采用灭活技术、减毒活疫苗技术或抗原蛋白质体外表达重组技术等从制备相应的疫苗。这些技术在制备疫苗的实践中均表现出了一定的疗效，但是也存在一些弊端，比如循环效果不佳、预防或者治疗效果还需要改善等。

技术问题

有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种负载一种或多种细菌的全细胞组分的微米或纳米疫苗系统，用于预防或治疗由细菌引起的疾病或癌症的方法。本发明将一种或多种细菌全细胞组分分为可在纯水或不含增溶剂水溶液中溶解的水溶性部分和可用一定增溶剂溶解于水溶液中的非水溶性部分，并将水溶性部分和非水溶性部分包载于纳米粒子或微米粒子中和负载于其表面，从而保证了抗原物质都被负载于所制备的疫苗中。

技术解决方案

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：一种基于一种或多种细菌全细胞组分的预防或治疗疾病的疫苗系统，包括纳米粒子和/或微米粒子、一种或多种细菌的全细胞组分；所述疫苗系统为纳米疫苗系统和/或微米疫苗系统；所述全细胞组分为水溶性组分和/或非水溶性组分。全细胞组分由一种或多种细菌的全细胞裂解得到，或者所述全细胞组分由一种或多种细菌的全细胞裂解后加工得到，或者所述全细胞组分由一种或多种细菌的全细胞加工后裂解得到，其中，一种细菌裂解得到的产物称为全细胞组分，两种或者以上细菌裂解得到的产物称为全细胞组分混合物。所述加工包括灭活、变性、核酸降解、辐射、固化、化学修饰、离子化、生物矿化处理，具体操作方法为常规技术。所述纳米粒子或微米粒子内部或表面可进行或者不进行生物矿化、核酸酶降解、化学修饰、固化、离子化处理，具体操作方法为常规技术。

本发明中，水溶性组分溶于纯水或不含增溶剂的水溶液；非水溶性组分在纯水中不溶，在含增溶剂的水溶液中或有机溶剂中可溶。具体的，全细胞组分为一种或多种细菌中全细胞的水溶性成分和/或非水溶性成分，水溶性成分为一种或多种细菌裂解的可溶于纯水或不含增溶剂的水溶液中的原水溶性部分；非水溶性成分为一种或多种细菌裂解的原非水溶性部分采用增溶方法由在纯水中不溶变为在含增溶剂的水溶液中或有机溶剂中可溶的部分。水溶性组分、非水溶性组分分别负载于不同粒子上，或者水溶性组分、非水溶性组分负载于同一粒子上。

本发明基于一种或多种细菌的疫苗系统为纳米或微米的疫苗系统，称为纳米疫苗或微米疫苗，可以预防或治疗细菌引起的疾病，由纳米级尺寸或微米级尺寸的粒子和所述粒子负载的全细胞组分或全细胞组分混合物组成，或者由纳米级尺寸或微米级尺寸的粒子和所述粒子负载的全细胞组分或全细胞组分混合物、免疫佐剂组成；所述全细胞组分为一种或多种细菌的全细胞的水溶性成分混合物和/或非水溶性成分或相应的混合物。混合物可为但不限于水溶性成分互相混合，或者非水溶性成分互相混合，或者全部和/或部分水溶性组分与全部和/或部分水溶性组分互相混合。

本发明所述基于一种或多种细菌的全细胞组分的预防或治疗疾病的疫苗系统的制备方法为，先使用超纯水或水溶液或含增溶剂的溶液将细菌裂解，收集细菌全细胞组分，然后将一种细菌或者多种细菌的全细胞组分负载于纳米粒子和/或微米粒子的内部和/或表面，得到所述基于一种或多种细菌全细胞组分的预防或治疗疾病的疫苗系统；或者将一种细菌或者多种细菌的全细胞组分、免疫佐剂负载于纳米粒子和/或微米粒子内部和/或表面，得到所述基于一种或多种细菌全细胞组分的预防或治疗疾病的疫苗系统。具体的，将一种或多种细菌的全细胞组分负载于纳米和/或微米粒子内部和/或表面，得到所述疫苗系统；或者将一种或多种细菌全细胞组分、免疫佐剂负载于纳米和/或微米粒子内部和/或表面，得到所述疫苗系统。具体的，本发明所述疫苗系统可以按照纳米尺寸粒子和微米尺寸粒子已开发的制备方法制备得到，包括但不仅限于常见的溶剂挥发法、透析法、挤出法、沉淀法、热熔法。在一些实施方案中，所述的疫苗系统采用溶剂挥发法中的复乳法制备得到。

本发明公开了上述基于一种或多种细菌全细胞组分的预防或治疗疾病的疫苗系统在制备预防和/或治疗疾病的疫苗中的应用，该疫苗系统用于预防或治疗疾病及其复发；所述疾病为由细菌引起的疾病或癌症，比如，预防或治疗与细菌有关的疾病时，制备疫苗所使用的细菌中有一种与用于预防或治疗的引发疾病的细菌相同。

本发明所述基于一种或多种细菌全细胞组分的预防或治疗疾病的疫苗系统的活性成分全细胞组分为全细胞的水溶性成分混合物和/或非水溶性成分或其混合物，由一种或多种细菌制备，多种指两种或者两种以上。此为本发明的创造性所在，将细菌全细胞组分重组为纳米疫苗或微米疫苗，本发明采用一种或一种以上细菌以上全细胞组分预防或治疗细菌引起的疾病或者癌症，取得了技术效果显著进步。

本发明所述基于一种或多种细菌全细胞组分全细胞组分的预防或治疗细菌所致疾病的疫苗系统中，所述负载方式为全细胞的水溶性成分和非水溶性成分分别或同时被包载于粒子内部，和/或分别或同时负载于粒子表面。具体的，所述负载方式为全细胞的水溶性成分和非水溶性成分分别或同时被包载于粒子内部，和/或分别或同时负载于粒子表面，包括但不仅限于水溶性成分同时装载于粒子中和负载于粒子表面，非水溶性成分同时装载于粒子中和负载于粒子表面，水溶性成分装载于粒子中而非水溶性成分负载于粒子表面，非水溶性成分装载于粒子中而水溶性成分负载于粒子表面，水溶性成分和非水溶性成分装载于粒子中而只有非水溶性成分负载于粒子表面，水溶性成分和非水溶性成分装载于粒子中而只有水溶性成分负载于粒子表面，水溶性成分装载于粒子中而水溶性成分和非水溶性成分同时负载于粒子表面，非水溶性成分装载于粒子中而水溶性成分和非水溶性成分同时负载于粒子表面，水溶性成分和非水溶性成分同时装载于粒子中而且水溶性成分和非水溶性成分同时负载于粒子表面。

本发明所述基于一种或多种细菌全细胞组分的预防或治疗疾病的疫苗系统中，所述粒子内部和/或表面还包括免疫佐剂。所述免疫佐剂的添加方式包括装载于纳米粒子或微米粒子内，或者负载于纳米粒子或微米粒子表面，或者同时装载于纳米粒子或微米粒子内及负载于纳米粒子或微米粒子表面。

本发明中，基于一种或多种细菌全细胞组分的预防或治疗疾病的疫苗系统的表面不连接或者连接靶头，具体的，疫苗系统表面可以不连接具有主动靶向功能的靶头或者连接有主动靶向功能的靶头；所述靶头可带领疫苗系统靶向到特定细胞；所述特定细菌细胞为树突状细胞、巨噬细胞、B细胞、T细胞、NK细胞、NKT细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴结、胸腺、脾脏、骨髓中的一种或两种以上。具体的，疫苗系统表面连接具有主动靶向功能的靶头时，所述靶头包括但不限于可与细胞膜表面配体特异性结合的抗体、糖类物资、脂类物质、多肽类物质、核酸类物质；或者所述靶头可以为甘露糖、CD32抗体、CD11c抗体、CD103抗体、CD44抗体、DEC205抗体、CD40抗体。

本发明所述基于一种或多种细菌全细胞组分的预防或治疗疾病的疫苗系统中，所述全细胞组分按照在纯水或不含增溶剂的水溶液中的溶解性可分为两部分：水溶性成分和非水溶性成分。所述水溶性成分为可溶于纯水或不含增溶剂的水溶液的原水溶性部分，所述非水溶性成分为在纯水中不溶的原非水溶性部分，采用增溶方法由在纯水或不含增溶剂的水溶液中不溶变为在含增溶剂的水溶液中或有机溶剂中可溶的部分。所述全细胞组分中的水溶性部分和非水溶性部分都可以被含增溶剂的增溶水溶液或有机溶剂溶解。所述增溶剂为可以增加蛋白质或多肽在水溶液中溶解性的增溶剂中的至少一种；所述有机溶剂为可以溶解蛋白质或多肽的有机溶剂。本领域技术人员可以理解，所述非水溶性成分也可采用其他可使蛋白质和多肽片段增溶的方法由在纯水中不溶变为可溶。所述有机溶剂包括但不限于DMSO、乙腈、乙醇、甲醇、DMF、异丙醇、丙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯。本领域技术人员可以理解，所述有机溶剂也可采用其他可使蛋白质和多肽片段增溶的含有机溶剂的方法。

本发明所述基于一种或多种细菌全细胞组分的预防或治疗疾病的疫苗系统中，纳米粒子为纳米级尺寸的粒子，微米粒子为微米级尺寸的粒子。所述纳米疫苗和纳米级尺寸的粒子的粒径为1nm～1000nm，优选为50nm～800nm，进一步优选为100nm～600nm；所述微米疫苗和微米级尺寸的粒子的粒径为1μm～1000μm，优选为1μm～100μm，进一步优选为1μm～10μm，最优选为1μm～5μm。所述的纳米尺寸粒子或微米尺寸粒子表面可为电中性，带负电或者带正电。

本发明所述基于一种或多种细菌全细胞组分的预防或治疗疾病的疫苗系统中，微纳粒子的形状为常见的任意形状，包括但不限于球形、椭球形、桶形、多角形、棒状、片状、线形、蠕虫形、方形、三角形、蝶形或圆盘形。

本发明所述基于一种或多种细菌全细胞组分的预防或治疗疾病的疫苗系统中，纳米粒子和/或微米粒子的制备材料为有机合成高分子材料、天然高分子材料或者无机材料。其中所述有机合成高分子材料为生物相容或可降解的高分子材料，包括但不限于PLGA、PLA、PGA、Poloxamer、PEG、PCL、PEI、PVA、PVP、PTMC、聚酸酐、PDON、PPDO、PMMA、聚氨基酸、合成多肽、合成脂质。所述的天然高分子材料为生物相容或可降解的高分子材料，包括但不限于卵磷脂、胆固醇、淀粉、脂类、糖类、多肽、海藻酸钠、白蛋白、胶原蛋白、明胶、细胞膜成分。所述的无机材料为无明显生物毒性的材料，包括但不限于三氧化二铁、四氧化三铁、碳酸钙、磷酸钙。

本发明所述基于一种或多种细菌全细胞组分的预防或治疗疾病的疫苗系统可将装载的全细胞组分递送给相关免疫细胞，通过所装载成分的免疫原性而激活和增强自身免疫系统对致病细菌的杀伤作用。因此本发明还提供了所述基于一种或多种细菌全细胞组分的预防或治疗疾病的疫苗系统在制备预防和/或治疗疾病的疫苗中的应用。

本发明所述全细胞组分的疫苗系统在预防或治疗疾病时可以同时使用只负载水溶性组分的纳米粒子和/或微米粒子和只负载非水溶性组分的纳米粒子和/或微米粒子、使用只负载水溶性组分的纳米粒子和/或微米粒子、使用只负载非水溶性组分的纳米粒子和/或微米粒子或者使用同时负载水溶性组分和非水溶性组分的纳米粒子和/或微米粒子。

有益效果

由上述技术方案可知本发明提供了一种利用纳米级尺寸或微米级尺寸的粒子递送细胞水溶性成分和非水溶性成分的输送系统，以及用于制备预防和治疗疾病的疫苗中的应用。因为相关细菌细胞的全细胞组分按照在纯水中的溶解性被分为两部分，可溶于纯水的水溶性部分和在纯水中不溶的非水溶性部分，并且水溶性部分和非水溶性部分都被负载于纳米粒子或微米粒子中，所以细胞组分中的抗原物质就大部分都被负载于纳米粒子或微米粒子中。细胞组分中水溶性部分和非水溶性部分囊括了整个细胞的成分；细胞组分中水溶性部分和非水溶性部分也可以同时被含有增溶剂的水溶液溶解。其中具有免疫原性的物质可激活免疫反应。利用全细胞组分中这些因为疾病突变而产生的具有免疫原性的物质即可用于疾病的预防或治疗。

本发明所述全细胞组分的疫苗系统可以制备预防和/或治疗细菌所致疾病的疫苗。在用作疾病疫苗以预防和治疗细菌所致疾病时，本发明所述的疫苗可以在疾病发生前或疾病发生后以激活机体免疫系统，从而预防疾病的发生、延缓疾病的进展、或治疗疾病或者预防疾病的复发。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明所述疫苗的制备过程及应用领域示意图；a:水溶性组分和非水溶性组分分别收集和制备纳米疫苗或微米疫苗的示意图；b:采用含有增溶剂的增溶液溶解全细胞组分和制备纳米疫苗或微米疫苗的示意图。

图2为疫苗结构示意图。

图3为疫苗结构示意图。

图4为疫苗结构示意图。

图5为疫苗结构示意图。

图6为疫苗结构示意图。

图7为疫苗结构示意图。

图8为疫苗结构示意图。

图9为疫苗结构示意图。

图10为疫苗结构示意图。

图11为疫苗结构示意图。

图12为疫苗结构示意图。

图13为实施例1技术效果图。

图14为实施例2技术效果图。

图15为实施例3技术效果图。

图16为实施例4技术效果图。

图17为实施例5技术效果图。

图18为实施例6技术效果图。

图19为实施例7技术效果图。

图20为实施例8技术效果图。

图21为实施例9技术效果图。

本发明的实施方式

本发明公开了一种纳米级或微米级的负载一种或一种以上细菌全细胞组分的疫苗系统及其应用预防或治疗细菌导致的疾病，或者癌症。本领域技术人员可以借鉴本发明内容，常规改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明保护范围内。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术方案。

作为具体的步骤，本发明将细菌裂解后首先获取在纯水或不含增溶剂的水溶液中可溶的水溶性组分，尔后采用含有增溶剂的增溶水溶液将水不溶性的组分溶解于增溶液中，从而将所有的细胞组分都转变为可在水溶液中溶解的组分，进而将其负载于纳米粒子或微米粒子内外以制备纳米疫苗或微米疫苗，用于疾病，比如癌症的预防和治疗。在实际应用中也可采用含有增溶剂的增溶液直接裂解细胞或者组织，或者将细菌裂解后直接采用含有增溶剂的增溶液溶解全细胞组分而不分别收集水溶性组分和非水溶性组分，并采用含有增溶剂的增溶液溶解后的全细胞组分制备纳米疫苗或微米疫苗。本发明通过采用含有增溶剂的水溶液将细胞中不溶于纯水或不含增溶剂水溶液的组分转化为在增溶溶液中可溶并可被用于制备纳米粒子和微米粒子，从而提高了纳米粒子或微米粒子所负载的抗原物质或成分的全面性和免疫原性。细胞组分中水溶性部分和非水溶性部分囊括了整个细胞的成分和组分。其中具有免疫原性的组分可激活机体针对相应细菌的免疫反应。利用全细胞组分中这些免疫原性的物质即可用于疾病的预防和治疗。

本发明公开的细菌全细胞组分的疫苗系统可用于制备预防和/或治疗疾病的疫苗，其制备过程及应用领域如图1所示。在制备时可裂解细菌全细胞后先分别收集水溶性组分和非水溶性组分并分别制备纳米疫苗或微米疫苗；或者也可以直接采用含有增溶剂的增溶液直接裂解细菌全细胞并溶解全细胞组分并制备纳米疫苗或微米疫苗。

本发明所述全细胞组分在裂解前或（和）裂解后既可经过灭活或（和）变性或（和）核酸降解处理后再制备纳米疫苗或微米疫苗，也可细胞裂解前或（和）裂解后不经过任何灭活或（和）变性或（和）核酸降解处理直接制备纳米疫苗或微米疫苗。本发明部分实施例中，细胞在裂解前经过了灭活或（和）变性或（和）核酸降解处理，在实际使用过程中也可以在细胞裂解后做灭活或（和）变性或（和）核酸降解处理，或者也可以细胞裂解前和裂解后均做灭活或（和）变性或（和）核酸降解处理；本发明部分实施例中细胞裂解前或（和）裂解后的灭活或（和）变性或（和）核酸降解处理方法为紫外照射和高温加热，在实际使用过程中也可以采用放射线辐照、高压、冷冻干燥、DNA酶、RNA酶、核酸酶和甲醛等灭活或变性处理方法。本发明的纳米疫苗或微米疫苗在负载细菌全细胞组分过程中部分实施例进行了生物矿化处理中的冷冻硅化处理，部分实施例没有进行加工处理，在实际应用时可根据情况决定是否对抗原组分或者纳米粒子或者微米粒子进行加工处理以及加工处理的方式。加工处理的方式包括但不限于化学修饰、固化、生物矿化、离子化。本领域技术人员可以理解，在实际应用过程中技术人员可根据具体情况进行适当调整。

本发明所述疫苗系统，表面可以不连接具有主动靶向功能的靶头或者连接有主动靶向功能的靶头。

本发明所述基于一种或多种细菌全细胞组分的预防或治疗疾病的疫苗系统的结构示意图如附图所示。在实际使用过程中可以为只使用其中的某一种特定结构的纳米疫苗和/或微米疫苗，或者是同时使用两种或两种以上的不同结构的纳米疫苗和/或微米疫苗。

图2～图5为载有水溶性和非水溶性细胞组分的纳米尺寸粒子或微米尺寸粒子的结构示意图，每幅图中1：细菌细胞组分中的水溶性成分；2，细菌细胞组分中的非水溶性成分；3，免疫佐剂；4，纳米粒子或微米粒子；5：纳米粒子中的内核部分；a：纳米粒子或微米粒子内部包载和表面负载的均为细菌细胞组分中的水溶性成分；b：纳米粒子或微米粒子内部包载和表面负载的均为细菌细胞组分中的非水溶性成分；c：纳米粒子或微米粒子内部包载的为细菌细胞组分中的非水溶性成分而表面负载的均为细菌细胞组分中的水溶性成分；d：纳米粒子或微米粒子内部包载的为细菌细胞组分中的水溶性成分而表面负载的均为细菌细胞组分中的非水溶性成分；e：纳米粒子或微米粒子内部同时包载的细菌细胞组分中的水溶性成分和非水溶性成分，而纳米粒子或微米粒子表面也同时负载细菌细胞组分中的水溶性成分和非水溶性成分；f: 纳米粒子或微米粒子内部同时包载的细菌细胞组分中的水溶性成分和非水溶性成分，而纳米粒子或微米粒子表面只负载细菌细胞组分中的水溶性成分；g: 纳米粒子或微米粒子内部同时包载的细菌细胞组分中的水溶性成分和非水溶性成分，而纳米粒子或微米粒子表面只负载细菌细胞组分中的非水溶性成分；h：纳米粒子或微米粒子内部只包载的细菌细胞组分中的非水溶性成分，而纳米粒子或微米粒子表面同时负载细菌细胞组分中的水溶性成分和非水溶性成分；i: 纳米粒子或微米粒子内部只包载的细菌细胞组分中的水溶性成分，而纳米粒子或微米粒子表面同时负载细菌细胞组分中的水溶性成分和非水溶性成分。图2中纳米粒子或微米粒子表面和内部均含有免疫佐剂；图3中免疫佐剂只分布于纳米粒子或微米粒子的内部；图4中纳米粒子或微米粒子只在外表面含有免疫佐剂；图5中纳米粒子或微米粒子内部和外表面均无免疫佐剂；图2的2a～2i，图3的6a～6i，图4的10a～10i和图5的14a～14i中纳米粒子或微米粒子所负载的细菌细胞组分中的水溶性成分或非水溶性成分分布于纳米粒子或微米粒子内部时未形成明显的内核；图2的3a～3i，图3的7a～7i，图4的11a～11i和图5的15a～15i中纳米粒子或微米粒子所负载的细菌细胞组分中的水溶性成分或非水溶性成分分布于纳米粒子或微米粒子内部时形成了一个内核部分，内核可为制备过程中生成或通过使用聚合物或无机盐等方式形成；图2的4a～4i，图3的8a～8i，图4的12a～12i和图5的16a～17i中纳米粒子或微米粒子所负载的细菌细胞组分中的水溶性成分或非水溶性成分分布于纳米粒子或微米粒子内部时形成了多个内核部分，内核可为制备过程中生成或通过使用聚合物或无机盐等方式形成；图2的5a～5i，图3的9a～9i，图4的13a～13i和图5的17a～17i中纳米粒子或微米粒子所包载的细菌细胞组分中的水溶性成分或非水溶性成分分布于纳米粒子或微米粒子内部时位于所形成内核的外层。

图6-图9所示为主动靶向靶头修饰的载有水溶性和非水溶性细胞组分的纳米粒子或微米粒子的结构示意图，图6中纳米粒子或微米粒子表面和内部均含有免疫佐剂；图7中免疫佐剂只分布于纳米粒子或微米粒子的内部；图8中纳米粒子或微米粒子只在外表面含有免疫佐剂；图9纳米粒子或微米粒子内部和外表面均无免疫佐剂；每幅图中1：细菌细胞组分中的水溶性成分；2：细菌细胞组分中的非水溶性成分；3：免疫佐剂；4：纳米粒子或微米粒子；5：纳米粒子中的内核部分；6：可以靶向特定细胞或者组织的靶头。a：纳米粒子或微米粒子内部包载和表面负载的均为细菌细胞组分中的水溶性成分；b：纳米粒子或微米粒子内部包载和表面负载的均为细菌细胞组分中的非水溶性成分；c：纳米粒子或微米粒子内部包载的为细菌细胞组分中的非水溶性成分而表面负载的均为细菌细胞组分中的水溶性成分；d：纳米粒子或微米粒子内部包载的为细菌细胞组分中的水溶性成分而表面负载的均为细菌细胞组分中的非水溶性成分；e：纳米粒子或微米粒子内部同时包载的细菌细胞组分中的水溶性成分和非水溶性成分，而纳米粒子或微米粒子表面也同时负载细菌细胞组分中的水溶性成分和非水溶性成分；f: 纳米粒子或微米粒子内部同时包载的细菌细胞组分中的水溶性成分和非水溶性成分，而纳米粒子或微米粒子表面只负载细菌细胞组分中的水溶性成分；g: 纳米粒子或微米粒子内部同时包载的细菌细胞组分中的水溶性成分和非水溶性成分，而纳米粒子或微米粒子表面只负载细菌细胞组分中的非水溶性成分；h：纳米粒子或微米粒子内部只包载的细菌细胞组分中的非水溶性成分，而纳米粒子或微米粒子表面同时负载细菌细胞组分中的水溶性成分和非水溶性成分；i: 纳米粒子或微米粒子内部只包载的细菌细胞组分中的水溶性成分，而纳米粒子或微米粒子表面同时负载细菌细胞组分中的水溶性成分和非水溶性成分。图6中2.a-2.i，图7中6.a-6.i，图8中10.a-10.i和图9中14.a-14.i纳米粒子或微米粒子所负载的细菌细胞组分中的水溶性成分或非水溶性成分分布于纳米粒子或微米粒子内部时未形成明显的内核；图6中3.a-3.i，图7中7.a-7.i，图8中11.a-11.i和图9中15.a-15.i中纳米粒子或微米粒子所负载的细菌细胞组分中的水溶性成分或非水溶性成分分布于纳米粒子或微米粒子内部的一个内核部分；图6中4.a-4.i，图7中8.a-8.i，图8中12.a-12.i和图9中16.a-16.i纳米粒子或微米粒子所负载的细菌细胞组分中的水溶性成分或非水溶性成分分布于纳米粒子或微米粒子内部的多个内核部分；图6中5.a-5.i，图7中9.a-9.i，图8中13.a-13.i和图9中17.a-17.i纳米粒子或微米粒子所包载的细菌细胞组分中的水溶性成分或非水溶性成分分布于纳米粒子或微米粒子内部所形成内核的外层。

图10细胞组分和/或免疫佐剂只分布于纳米粒子或微米粒子内部；图11细胞组分和/或免疫佐剂只分布于纳米粒子或微米粒子外部；图12细胞组分和免疫佐剂分别分布于纳米粒子或微米粒子内部或外部。在图10-12中，a, b和c中纳米粒子或微米粒子所负载的细菌细胞组分中的水溶性成分或非水溶性成分分布于纳米粒子或微米粒子内部时未形成明显的内核；d, e和f中纳米粒子或微米粒子所负载的细菌细胞组分中的水溶性成分或非水溶性成分分布于纳米粒子或微米粒子内部的一个内核部分；g，h和i中纳米粒子或微米粒子所负载的细菌细胞组分中的水溶性成分或非水溶性成分分布于纳米粒子或微米粒子内部的多个内核部分； j，k和l中纳米粒子或微米粒子所包载的细菌细胞组分中的水溶性成分或非水溶性成分分布于纳米粒子或微米粒子内部所形成内核的外层； a, d, g 和j中纳米粒子或微米粒子负载的均为细菌细胞组分中的水溶性成分；b，e，h和k中纳米粒子或微米粒子负载的均为细菌细胞组分中的非水溶性成分；c，f，i和l中纳米粒子或微米粒子同时负载细菌细胞组分中的水溶性成分和非水溶性成分。

在实施例中，免疫佐剂包载于纳米粒子或微米粒子内并同时负载于纳米粒子或微米粒子表面，在实际使用过程中免疫佐剂也可只包载于纳米粒子或微米粒子内，或者只负载于纳米粒子或微米粒子表面，或者不加入免疫佐剂。

在一些实施例中，本发明先将细胞组分中的可溶于纯水的水溶性部分或（和）非水溶性部分经增溶剂进行增溶后包载于纳米粒子或微米粒子内，同时负载免疫佐剂；然后，将细胞组分中的水溶性部分或（和）非水溶性部分负载于纳米粒子表面，同时负载有免疫佐剂。这样就使得纳米粒子或微米粒子中细胞的水溶性组分或非水溶性组分的负载能力可以达到最大。在实际应用中，也可以直接采用含有增溶剂的增溶液（如8M尿素水溶液或6M盐酸胍水溶液）直接裂解细菌并直接溶解全细胞组分，尔后以此制备纳米疫苗或微米疫苗。

本发明所述制备纳米疫苗及微米疫苗的具体操作方法为常用制备方法。在一些实施方案中，制备纳米疫苗或微米疫苗采用溶剂挥发法中的复乳法，所采用的纳米粒子或微米粒子制备材料为有机高分子聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA），分子量为24KDa-38KDa, 所采用的免疫佐剂为 poly(I:C)、卡介苗（BCG）或CpG。本领域技术人员可以理解，在实际应用过程中技术人员可根据具体情况对制备方法、制备过程、所采用的纳米粒子制备材料、免疫佐剂的种类和浓度等进行适当调整。

在一些实施方案中，本发明所采用的复乳法的具体制备方法如下：步骤1，将第一预定体积的含有第一预定浓度的水相溶液加入第二预定体积的含有第二预定浓度医用高分子材料的有机相中。

在一些实施例中，水相溶液含有一种细菌裂解物中的各组分；细菌裂解物中的各组分在制备时分别为水溶性组分和/或是溶于增溶剂（8M尿素）中的原非水溶性组分。水相溶液所含有的来自一种细菌的水溶性组分的浓度和/或是来自一种细菌的溶于增溶剂（8M尿素）中的原非水溶性组分的浓度，也即第一预定浓度要求蛋白质多肽浓度含量大于0.01 pg/mL，能负载足够抗原以激活相关免疫反应。

在一些实施例中，水相溶液含有多种细菌裂解物中的各组分混合物；细菌裂解物中的各组分在制备时分别为水溶性组分混合物，或者是溶于增溶剂（8M尿素）中的原非水溶性组分混合物，或者是水溶性组分和非水溶性组分的混合物。水相溶液所含有的来自多种细菌的水溶性组分的总浓度和/或来自多种细菌的溶于增溶剂（8M尿素）中的原非水溶性组分的浓度，也即第一预定浓度要求蛋白质多肽浓度含量大于0.01 pg/mL，能负载足够抗原以激活相关免疫反应。

在一些实施例中，水相溶液除了含有上述细菌裂解物之外，还含有免疫佐剂poly(I:C) 或CpG；免疫佐剂在初始水相中的浓度为大于0.01 pg/mL。

在本发明中，将医用高分子材料溶解于有机溶剂中，得到第二预定体积的含有第二预定浓度医用高分子材料的有机相。在一些实施例中，医用高分子材料为PLGA，有机溶剂选用二氯甲烷。另外，在一些实施例中，医用高分子材料的第二预定浓度的范围为0.5mg/mL-5000mg/mL，优选为100 mg/mL。

本发明选择PLGA或修饰的PLGA，为生物可降解材料且已被FDA批准用作药物敷料，研究表明PLGA具有一定的免疫调节功能，因而适合作为疫苗制备时的辅料，为现有产品。

实际中，有机相的第二预定体积根据其和水相溶液的第一预定体积的比例进行设定，在本发明中，水相溶液的第一预定体积和有机相的第二预定体积之比的范围为1:1.1-1:5000，优先地为1:10。在具体实施过程中可根据需要对第一预定体积、第二预定体积和第一预定体积与第二预定体积之比进行调整以调整制备的纳米粒或微米粒的尺寸大小，为现有技术。

优选的，水相溶液为裂解物组分溶液时，其中蛋白质和多肽的浓度大于0.01 pg/mL，优选0.01 mg/mL～100 mg/mL；水相溶液为裂解物组分/免疫佐剂溶液时，其中蛋白质和多肽的浓度大于0.01 pg/mL，优选0.1 ng/mL～100 mg/mL，免疫佐剂的浓度大于0.01 pg/mL，优选0.01 mg/mL～20 mg/mL。高分子材料有机相溶液中，溶剂为DMSO、乙腈、乙醇、氯仿、甲醇、DMF、异丙醇、二氯甲烷、丙醇、乙酸乙酯等，优选二氯甲烷；高分子材料的浓度为0.5 mg/mL～5000 mg/mL，优选为100 mg/mL。第一乳化剂溶液优选为聚乙烯醇水溶液，浓度为10 mg/mL～50 mg/mL，优选20 mg/mL。第二乳化剂溶液优选为聚乙烯醇水溶液，浓度为1 mg/mL～20 mg/mL，优选5 mg/mL。分散液为PBS缓冲液或生理盐水或纯水。

步骤2，将步骤1得到的混合液进行大于2秒的超声处理或大于1分钟的搅拌或均质处理或微流控处理。优选的，搅拌为机械搅拌或者磁力搅拌时，搅拌速度大于50 rpm，搅拌时间大于1分钟，比如搅拌速度为50 rpm～1500 rpm，搅拌时间为0.1小时～24小时；超声处理时，超声功率大于5W，时间大于0.1秒，比如2～200秒；均质处理时使用高压/超高压均质机或高剪切均质机，使用高压/超高压均质机时压力大于5 psi，比如20psi～100psi，使用高剪切均质机时转速大于100 rpm，比如1000 rpm～5000 rpm；使用微流控处理流速大于0.01 mL/min, 比如0.1 mL/min-100 mL/min。超声或者搅拌或者均质处理或者微流控处理进行纳米化和/或微米化，超声时间长短或搅拌速度或均质处理压力及时间能控制制备的微纳粒子大小。

步骤3，将步骤2处理后得到的混合物加入第三预定体积的含有第三预定浓度乳化剂的水溶液中并进行大于2秒的超声处理或大于1分钟的搅拌或进行均质处理或微流控处理。该步骤将步骤2得到的混合物加入到乳化剂水溶液中继续超声或搅拌纳米化或微米化，超声时间长短或搅拌速度及时间能控制制备的纳米粒子或微米粒子大小，得到合适的粒子。在本发明中，超声时间大于0.1秒，比如2～200秒，搅拌速度大于50rpm，比如50 rpm～500 rpm，搅拌时间大于1分钟，比如60～6000秒。优选的，搅拌为机械搅拌或者磁力搅拌时，搅拌速度大于50 rpm，搅拌时间大于1分钟，比如搅拌速度为50 rpm～1500 rpm，搅拌时间为0.5小时～5小时；超声处理时，超声功率为50W～500W，时间大于0.1秒，比如2～200秒；均质处理时使用高压/超高压均质机或高剪切均质机，使用高压/超高压均质机时压力大于20psi，比如20psi～100psi，使用高剪切均质机时转速大于1000 rpm，比如1000 rpm～5000 rpm；使用微流控处理流速大于0.01 mL/min, 比如0.1 mL/min-100 mL/min。选择参数得到合适的粒子。

在本发明中，乳化剂水溶液为聚乙烯醇（PVA）水溶液；第三预定体积根据其与第二预定体积的比例进行调整，比如第三预定体积为5 mL，第三预定浓度为20 mg/mL。在本发明中，第二预定体积与第三预定体积之的范围为1:1.1～1:1000进行设定，优选为2:5。在具体实施过程中可以对第二预定体积和第三预定体积之比进行调整，得到所需尺寸的纳米粒子或微米粒子。同样地，本步骤的超声时间或搅拌时间、乳化剂水溶液的体积以及浓度的选择，得到尺寸大小合适的纳米粒或微米粒。

步骤4，将步骤3处理后得到的液体加入第四预定体积的第四预定浓度的乳化剂水溶液中，并进行搅拌直至满足预定搅拌条件。

本步骤中，乳化剂水溶液为PVA。第四预定浓度可为5 mg/mL，以得到尺寸大小合适的纳米粒或微米粒为依据。第四预定体积的选择依据第三预定体积与第四预定体积之比决定。在本发明中，第三预定体积与第三预定体积之比为范围为1:1.5～1:2000，优先地为1:10。在具体实施过程中为了控制纳米粒子或微米粒子的尺寸可以对第三预定体积和第四预定体积之比进行调整。

本步骤的预定搅拌条件为直至有机溶剂挥发完成，比如步骤1中的二氯甲烷挥发完成。

步骤5，将步骤4处理满足预定搅拌条件的混合液在以大于100rpm，比如100rpm～3000rpm的转速进行大于1分钟，比如1分钟～1小时的离心后，去除上清液，并将剩下的沉淀物重新混悬于第五预定体积的第五预定浓度的含有冻干保护剂的水溶液中或者第六预定体积的PBS（或生理盐水）中。

在本发明一些实施方案中，步骤5所得沉淀重新混悬于第六预定体积的PBS（或生理盐水）中时不需要冻干，可直接进行后续纳米粒子或微米粒子表面结合或吸附细菌细胞裂解物。在冷冻干燥前或者纳米粒子或微米粒子表面结合或吸附细菌细胞裂解物前，可对纳米粒子或微米粒子表面进行适当的处理，如表面添加或修饰阳离子等，以增加纳米粒子或微米粒子结合或吸附细菌裂解物的能力或增加纳米疫苗或微米疫苗激活免疫系统的能力。

在本发明一些实施方案中，步骤5所得沉淀重新混悬于含有冻干保护剂的水溶液中时需进行冷冻干燥，再冷冻干燥以后再进行后续纳米粒子或微米粒子表面吸附细菌裂解物。

在本发明中，所述冻干保护剂选用海藻糖（Trehalose）。

优选的，该步骤的冻干保护剂的第五预定浓度为质量百分比4%，在后续进行冷冻干燥中不影响冻干效果。

步骤6，将步骤5得到的含有冻干保护剂的混悬液进行冷冻干燥处理后，将冻干物质备用。

步骤7，将第六预定体积的步骤5中得到的重悬于PBS（或生理盐水）中的含纳米粒的混悬液或者采用第六预定体积的PBS（或生理盐水）重悬步骤6得到的冷冻干燥后的含有纳米粒或微米粒和冻干保护剂的冻干物质，与第七预定体积的水溶性组分和/或溶于增溶剂（比如8M尿素）中的原非水溶性组分混合后即得纳米疫苗或微米疫苗。

在本发明中，第六预定体积与第七预定体积的体积比为1:10000～10000:1，优选体积比为1:100～100:1，最优体积比为1:30～30:1。

在一些实施例中，所述重悬的纳米粒子混悬液体积为10 mL时，含有细菌裂解物中的水溶性组分或者溶于增溶剂中的原非水溶性组分的体积为1 mL。在实际使用时可将二者体积和比例根据需要进行调整。

纳米疫苗或微米疫苗的粒径大小为纳米级或微米级，这样能保证疫苗被抗原提呈细胞吞噬，而为了提高吞噬效率，粒径大小要在适宜的范围内。纳米疫苗的粒径大小为1nm-1000nm，更优选地，粒径大小为30nm-1000nm，最优选地，粒径大小为100nm-600nm；微米疫苗的粒径大小为1μm-1000μm，更优选地，粒径大小为1μm-100μm，更优选地，粒径大小为1μm-10μm，最优选地，粒径大小为1μm-5μm。本实施例中，纳米粒疫苗粒径大小为100nm-600nm，微米疫苗粒径大小为1μm-5μm。

在本发明中，增溶剂包括但不限于尿素、盐酸胍、脱氧胆酸钠，SDS，pH大于7的碱性溶液，pH小于7的酸性溶液，白蛋白，卵磷脂、高浓度无机盐、Triton、吐温、DMSO、乙腈、乙醇、甲醇、DMF、异丙醇、丙醇、醋酸、胆固醇、氨基酸、糖苷、胆碱、Bri-35、Octaethylene glycol monododecyl ether、CHAPS、Digitonin、lauryldimethylamine oxide、IGEPAL CA-630；或者也可以使用上述增溶液同时溶解水溶性组分和非水溶性组分。优选采用尿素和盐酸胍来增溶细菌裂解物中的原非水溶性组分，在实际使用中亦可使用任何其他可使细菌裂解物中的原非水溶性组分溶解于水溶液的增溶物质。作为具体实施例，采用8M的尿素和6M的盐酸胍水溶液来增溶细菌裂解物中的原非水溶性组分，在实际使用中亦可使用任何其他可使细菌裂解物中的原非水溶性组分溶解于水溶液的尿素浓度或盐酸胍浓度；或者使用8M尿素水溶液同时溶解水溶性组分和非水溶性组分。

在本发明中，纳米疫苗和微米疫苗的制备采用复乳法，在实际中也可采用任何其他常用的纳米粒子或微米粒子制备方法。纳米疫苗和微米疫苗的制备材料为PLGA，在实际中亦可采用任何其他可以制备纳米粒子或微米粒子的材料。细菌裂解物中水溶性组分或者溶于8M尿素中的原非水溶性组分分别包载在纳米粒子内部和吸附在纳米粒子表面，在实际使用时，细菌裂解物中水溶性组分和溶于8M尿素中的原非水溶性组分亦可混合后再包载到纳米粒子内部或吸附到纳米粒子表面；或者也可以采用8M尿素同时溶解水溶性组分和非水溶性组分然后包载于纳米粒子或微米粒子内部和/或吸附于纳米粒子或微米粒子表面。

本发明中，免疫佐剂包括但不限于微生物来源的免疫佐剂、人或动物免疫系统的产物、固有免疫激动剂、适应性免疫激动剂、化学合成药物、真菌多糖类、中药及其他类中的至少一类；所述免疫佐剂包括但不限于模式识别受体激动剂、卡介苗细胞壁骨架、卡介苗甲醇提取残余物、卡介苗胞壁酰二肽、草分枝杆菌、多抗甲素、矿物油、病毒样颗粒、免疫增强的再造流感病毒小体、霍乱肠毒素、皂苷及其衍生物、Resiquimod、胸腺素、新生牛肝活性肽、米喹莫特、多糖、姜黄素、免疫佐剂CpG、免疫佐剂poly(I:C)、免疫佐剂poly ICLC、短小棒状杆菌苗、溶血性链球菌制剂、辅酶Q10、锰相关佐剂、左旋咪唑、聚胞苷酸、白细胞介素、干扰素、聚肌苷酸、聚腺苷酸、明矾、磷酸铝、羊毛脂、植物油、内毒素、脂质体佐剂、GM-CSF、MF59、双链RNA、双链DNA、铝相关佐剂、CAF01、人参、黄芪的有效成分中的至少一种。本领域技术人员可以理解，所述免疫佐剂也可采用其他可使免疫反应增强的物质，在实际中亦可不加入免疫佐剂。

本发明中，部分实施例中采用的疫苗为纳米疫苗，部分实施例采用的是微米疫苗。本领域技术人员在实际中可以根据实际情况选择采用纳米疫苗和/或微米疫苗。

为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例涉及的动物实验符合苏州大学动物实验要求。实施例中，负载裂解物的量是利用测试蛋白质浓度的方法确定，负载佐剂根据所在裂解物的包封率测定。

如无特殊说明，本发明实施例中所使用的方法均为常规方法；所使用的材料、试剂等均可从商业途径得到。本发明实施例中所涉及到的纳米尺寸粒子或微米尺寸粒子结构、制备方法、疾病治疗时的使用策略等仅为代表性方法，其他纳米尺寸粒子或微米尺寸粒子结构、制备方法、疾病预防或治疗时的使用策略、与其他药物的联用策略亦可采用本发明所述的方法。实施例中仅列出了本发明在部分细菌所致疾病中的应用，但是本发明亦可用在其他类型的任何细菌所致疾病。对于实施例中所用到的具体方法或材料，本领域技术人员可以在本发明技术思路的基础上，根据已有的技术进行常规的替换选择，而不仅限于本发明实施例的具体记载。在实际应用时具体给药时间、给药次数、给药方案、与其他药物联用情况可根据情况调整。

实施例 1 细菌全细胞组分负载于纳米粒子内部和表面用于疾病的预防：本实施例以制备负载有大肠杆菌菌株CFT073裂解物组分的纳米疫苗为例，来说明如何制备负载细菌全细胞组分的纳米疫苗并应用该疫苗预防疾病。本实施例中，首先将大肠杆菌在纯水中反复冻融裂解，以制备细菌的水溶性组分和溶于8M尿素中的原非水溶性组分。然后，以PLGA为纳米粒骨架材料，以Polyinosinic-polycytidylic acid (poly(I:C))为免疫佐剂制备纳米疫苗，并采用该纳米疫苗来预防细菌感染导致的败血症。

（1）细菌的裂解及各组分的收集：使用纯水将大肠杆菌菌株CFT073反复冻融5次，并辅以常规超声以裂解细胞。待细胞裂解后，将裂解物以5000g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入8M尿素溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性组分转化为在8M尿素水溶液中可溶。上述组分即为制备疫苗的原料来源。

（2）纳米疫苗的制备：本实施例中纳米疫苗及作为对照的空白纳米粒采用溶剂挥发法中的复乳法制备，所采用的纳米粒子制备材料PLGA分子量为24KDa-38KDa，所采用的免疫佐剂为poly(I:C) 且poly(I:C)只分布于纳米粒子内部。制备方法如前所述。在制备时先分别制备负载全细胞组分中水溶性组分的纳米疫苗、负载全细胞组分中非水溶性组分的纳米疫苗，然后在使用时二者混合同时使用。负载全细胞组分的纳米疫苗平均粒径为320nm左右，纳米疫苗表面电位为-5mV左右；每1mg PLGA纳米粒子约负载 20μg细菌蛋白质或多肽组分，每1mgPLGA纳米粒内外所使用的poly(I:C)免疫佐剂共约为0.02mg。空白纳米粒平均粒径为270nm左右，空白纳米粒制备时分别采用含有等量poly(I:C)的纯水或8M尿素代替相对应的水溶性组分和非水溶性组分。

（3）细菌灭活疫苗制剂的制备：分别采用福尔马林固定法和加热法两种方法制备灭活的细菌疫苗。在使用福尔马林固定法制备灭活疫苗时，在1mg大肠杆菌菌株CFT073 细菌加入1 mL 5% 的福尔马林，并作用18个小时。尔后，将细菌在4000g离心，并用PBS洗涤两遍后即可得福尔马林固定法所制备的灭活疫苗。在使用加热法制备灭活疫苗时，在80ºC作用30分钟后收集细菌即得灭活疫苗。

（4）纳米疫苗用于败血症的预防：选取6-8周的雌性BALB/c进行疫苗免疫和细菌致病保护实验。

在接种细菌致病实验之前第35天、第28天、第21天、第14天和第7天分别皮下注射50μL内部和表面都负载癌细胞裂解物中水溶性成分的1mg PLGA纳米疫苗和50μL内部和表面都负载溶于8M尿素中原非水溶性成分的1 mg PLGA纳米疫苗。PBS空白对照组方案如下：在接种细菌致病实验之前第35天、第28天、第21天、第14天和第7天分别皮下注射100 μL PBS。空白纳米粒+游离裂解物对照组：在接种细菌致病实验之前第35天、第28天、第21天、第14天和第7天分别接种100μL空白纳米粒和与疫苗所负载的等量的游离细胞裂解物；空白纳米粒和游离细胞裂解物注射在不同部位。灭活疫苗对照组：在接种细菌致病实验之前第35天、第28天、第21天、第14天和第7天分别接种20 μg灭活细菌疫苗。在第0天进行大肠杆菌菌株CFT073活菌致病造模实验。造模实验时，每只小鼠腹腔注射3.6×10 ⁸ CFU高剂量的大肠杆菌活菌，尔后连续观察48个小时。当小鼠出现濒死症状时，出于实验动物伦理学对小鼠进行安乐死处理。濒死症状为发蔫并在外界刺激时连续15分钟不活动。记录小鼠在细菌注射造模后的生存时间。

如图13所示，PBS对照组以及空白纳米粒+游离裂解物对照组小鼠死亡速度较快；固定法制备的灭活疫苗和加热法制备的灭活疫苗组小鼠死亡相对较慢。纳米疫苗组小鼠的生存期显著延长，在48小时后仍有75%小鼠存活。由此可见，本发明所述的负载细菌全细胞裂解物中水溶性组分和非水溶性组分的纳米疫苗对细菌所致疾病具有预防效果。

实施例2 短双歧杆菌全细胞组分负载于纳米粒子内部和表面用于黑色素瘤的治疗。

本实施例以小鼠黑色素瘤为癌症模型来说明如何制备负载有短双歧杆菌全细胞组分的纳米疫苗，并应用该疫苗治疗黑色素瘤。本实施例中，以B16F10小鼠黑色素瘤细胞制备癌症模型。首先裂解短双歧杆菌以制备该菌的水溶性组分和非水溶性组分。然后，以有机高分子材料PLGA为纳米粒骨架材料，以poly(I:C)为免疫佐剂采用溶剂挥发法制备负载有短双歧杆菌的水溶性组分和非水溶性组分的纳米疫苗。然后采用该纳米疫苗来治疗黑色素瘤。

（1）短双歧杆菌的裂解及各组分的收集：短双歧杆菌后使用纯水反复冻融5次，伴有超声以裂解细胞。待细胞裂解后，将裂解物以8000 g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入8M尿素溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性组分转化为在8M尿素水溶液中可溶。上述组分即为制备疫苗的原料来源。

（2）黑色素瘤肿瘤组织的裂解及各组分的收集：在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种1.5×10 ⁵个B16-F10黑色素瘤细胞，在各只小鼠所接种肿瘤长到体积分别为约1000 mm ³时处死小鼠并摘取肿瘤组织。将肿瘤组织切块后研磨，通过细胞过滤网加入纯水并反复冻融5次，伴有超声以裂解细胞。待细胞裂解后，将裂解物以5000g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入8M尿素溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性组分转化为在8M尿素水溶液中可溶。上述所得来源于癌细胞裂解物的水溶性组分和溶解于8M尿素中的原非水溶性组分即为制备黑色素瘤肿瘤组织纳米疫苗的原料来源。

（3）纳米疫苗的制备：本实施例中纳米疫苗及作为对照的空白纳米粒采用溶剂挥发法中的复乳法制备，所采用的纳米粒子制备材料PLGA分子量为24KDa-38KDa，所采用的免疫佐剂为poly(I:C)只分布于疫苗内。制备方法如前所述。在本实施例中，分别制备了负载细菌全细胞组分的纳米疫苗和负载肿瘤组织全细胞组分的纳米疫苗，并分析了两者联用的效果。在制备时先分别制备负载全细胞组分中水溶性组分的纳米疫苗和负载全细胞组分中非水溶性组分的纳米疫苗，然后在使用时二者混合同时使用。负载全细胞组分的纳米疫苗平均粒径均为320 nm左右，纳米疫苗表面电位均为-5mV左右；每1 mg PLGA纳米粒子负载约100 μg细菌或者肿瘤组织的蛋白质或多肽组分，每1mgPLGA纳米粒内外所使用的poly(I:C)免疫佐剂共约为0.02mg。空白纳米粒平均粒径为270nm左右，空白纳米粒制备时分别采用含有等量poly(I:C)的纯水或8M尿素代替相对应的水溶性组分和非水溶性组分。所有粒子在使用前重悬于PBS中。

（4）纳米疫苗用于癌症的治疗：本研究对照组分别是PBS组和空白纳米粒+细菌裂解物组。选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备黑色素瘤荷瘤小鼠。在第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种1.5×10 ⁵个B16F10细胞。肿瘤纳米疫苗组在第4天、第7天、第10天、第15天和第20天分别瘤内注射50 μL内部和表面都负载肿瘤裂解物中水溶性成分的2 mg PLGA纳米粒子和50 μL内部和表面都负载溶于8M尿素中原非水溶性成分的2 mg PLGA纳米粒子。细菌纳米疫苗组在第4天、第7天、第10天、第15天和第20天分别瘤内注射50 μL内部和表面都负载细菌裂解物中水溶性成分的2 mg PLGA纳米粒子和50 μL内部和表面都负载溶于8M尿素中原非水溶性成分的2 mg PLGA纳米粒子。细菌和肿瘤纳米疫苗联用组在第4天、第7天、第10天、第15天和第20天分别瘤内注射25 μL内部和表面都负载细菌裂解物中水溶性成分的1 mg PLGA纳米粒子、25 μL内部和表面都负载细菌裂解物中溶于8M尿素中原非水溶性成分的1 mg PLGA纳米粒子、25 μL内部和表面都负载肿瘤裂解物中水溶性成分的1 mg PLGA纳米粒子和25μL内部和表面都负载肿瘤裂解物中溶于8M尿素中原非水溶性成分的1 mg PLGA纳米粒子。PBS空白对照组在第4天、第7天、第10天、第15天和第20天分别瘤内注射100μL PBS。空白纳米粒+裂解物对照组在第4天、第7天、第10天、第15天和第20天分别瘤内注射100μL 4mg 空白纳米粒和与疫苗所负载的等量的游离裂解物。在实验中，从第3天起每3天记录一次小鼠肿瘤体积的大小。肿瘤体积采用公式v=0.52×a×b ²计算，其中v为肿瘤体积，a为肿瘤长度，b为肿瘤宽度。出于动物实验伦理，在小鼠生存期试验中当小鼠肿瘤体积超过2000mm ³即视为小鼠死亡并将小鼠安乐死。

如图14所示，与PBS对照组和空白纳米粒对照组小鼠相比，肿瘤组织疫苗组和细菌疫苗组小鼠的肿瘤生长速度变慢生存期延长。而且，肿瘤组织疫苗和细菌疫苗联用时效果要好于两种疫苗单独使用。综上所述，本发明所述的负载细菌的水溶性组分和非水溶性组分的纳米疫苗对黑色素瘤具有治疗效果。

实施例3 短双歧杆菌和卡介苗（BCG）全细胞组分负载于纳米粒子内部和表面的纳米疫苗用于肝癌的治疗：本实施例以小鼠肝癌为癌症模型来说明如何制备负载有短双歧杆菌和卡介苗全细胞组分的纳米疫苗并应用该疫苗治疗肝癌。本实施例中，首先裂解短双歧杆菌和卡介苗的水溶性组分和非水溶性组分，分别按质量比3:1混合。然后，以PLGA为纳米粒子骨架材料，采用溶剂挥发法制备纳米疫苗。

（1）短双歧杆菌的裂解及各组分的收集：该实施例中短双歧杆菌的裂解及裂解物收集同实施例2。

（2）BCG的裂解及各组分的收集：该实施例中BCG的裂解及裂解物收集和增溶方法同短双歧杆菌的裂解方法。

（3）纳米疫苗的制备：本实施例中纳米疫苗的制备方法、所使用的材料以及方法等均同上。制备疫苗的水溶性组分为短双歧杆菌和卡介苗的水溶性组分按3:1混合成的混合物；制备疫苗的非水溶性组分为短双歧杆菌和卡介苗的非水溶性组分按3:1混合成的混合物。负载全细胞组分的纳米疫苗平均粒径为320nm，纳米疫苗表面电位为-5mV左右；每1mg PLGA纳米粒子负载80μg细菌蛋白质或多肽组分。空白纳米粒平均粒径为270nm，空白纳米粒制备时分别采用含有等量的纯水或8M尿素代替相对应的水溶性组分和非水溶性组分。

（4）纳米疫苗用于肝癌的治疗：选取雌性C57BL/6为模型小鼠制备肝癌荷瘤小鼠。在第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种2×10 ⁶个Hepa1-6肝癌细胞。疫苗组在肿瘤接种后第4天、第7天、第10天、第15天和第20天分别瘤内注射50μL内部和表面都负载癌细胞裂解物中水溶性成分的2mg PLGA纳米疫苗和50μL内部和表面都负载溶于8M尿素中原非水溶性成分的2mg PLGA纳米疫苗。PBS空白对照组在肿瘤接种后第4天、第7天、第10天、第15天和第20天分别瘤内注射 100 μL PBS。只负载水溶性组分的纳米疫苗或者只负载非水溶性组分的纳米疫苗对照组：在肿瘤接种后第4天、第7天、第10天、第15天和第20天分别瘤内注射 100 μL 只负载水溶性组分的纳米疫苗（4mg）或者只负载非水溶性组分的纳米疫苗（4mg）。空白纳米粒+裂解物对照组在肿瘤接种后第4天、第7天、第10天、第15天和第20天分别瘤内注射 100μL 空白纳米粒和与疫苗所负载的等量的游离裂解物。在实验中，从第3天起每3天记录一次小鼠肿瘤体积的大小。肿瘤体积采用公式v=0.52×a×b ²计算，其中v为肿瘤体积，a为肿瘤长度，b为肿瘤宽度。出于动物实验伦理，在小鼠生存期试验中当小鼠肿瘤体积超过2000mm ³即视为小鼠死亡并将小鼠安乐死。

如图15所示，与对照组相比，纳米疫苗给药组肿瘤生长速度明显变慢且小鼠生存期明显延长。而且，同时注射水溶性组分纳米疫苗和非水溶性组分纳米疫苗好于只注射水溶性组分纳米疫苗或者只注射非水溶性组分纳米疫苗。由此可见，本发明所述负载短双歧杆菌和卡介苗全细胞组分混合物的纳米疫苗可以用于治疗肝癌。

实施例4 短双歧杆菌和卡介苗全细胞组分中水溶性组分负载于微米粒子内部和表面用于黑色素瘤的治疗：本实施例以小鼠黑色素瘤为癌症模型来说明如何制备只负载有短双歧杆菌和卡介苗组分中水溶性部分的微米疫苗，并应用该疫苗治疗黑色素瘤。本实施例中，首先裂解短双歧杆菌和卡介苗以制备水溶性组分和非水溶性组分。然后，以有机高分子材料PLGA为微米粒子骨架材料，二价锰离子（Mn ²⁺）为免疫佐剂采用溶剂挥发法制备负载有全细胞的水溶性组分的微米疫苗。

（1）细菌的裂解及各组分的收集：收集短双歧杆菌或卡介苗，使用超纯水重悬后反复冻融3次，伴有超声以破坏裂解细胞。待细胞裂解后，将裂解物以3000g的转速离心6min取上清液即为可溶于纯水的水溶性组分。上述所得来源于两种细菌裂解物的水溶性组分按质量比1:1混合即为制备微米疫苗的抗原来源。

（2）微米疫苗的制备：本实施例中制备微米疫苗及作为对照的空白微米粒采用溶剂挥发法中的复乳法，所采用的微米粒子制备材料为有机高分子材料PLGA分子量为38KDa-54KDa，所采用的免疫佐剂为MnCl ₂且MnCl ₂既分布于微米粒子内部也负载于微米粒子表面。制备方法如前所述。在微米粒子内部和表面负载细菌组分和锰佐剂的微米疫苗粒径为1.80 μm 左右，每1 mg PLGA微米粒子负载90μg蛋白质或多肽组分，每1mgPLGA微米粒内外所使用的MnCl ₂免疫佐剂为0.2 mg且内外各半。在微米粒子内部和表面只负载细菌组分的微米疫苗粒径为1.75 μm 左右，每1 mg PLGA微米粒子负载 90 μg蛋白质或多肽组分。空白微米粒粒径为1.60 μm左右，空白微米粒制备时分别采用含有等量锰佐剂的纯水代替相对应的水溶性组分，空白微米粒子外表面负载与纳米疫苗等量的MnCl ₂。

（3）微米疫苗用于癌症的治疗：选取6-8周的雌性C57BL/6制备黑色素瘤荷瘤小鼠。第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种1.5×10 ⁵个B16F10细胞。微米疫苗组方案如下：在接种黑色素瘤之后第4天、第7天、第10天、第15天和第20天分别瘤内注射100 μL内部和表面都负载细菌裂解物中水溶性成分的4 mg PLGA纳米粒子。PBS空白对照组方案如下：在接种黑色素瘤之后第4天、第7天、第10天、第15天和第20天分别瘤内注射100 μL PBS。空白微米粒+细胞裂解物对照组：在接种黑色素瘤之后第4天、第7天、第10天、第15天和第20天分别瘤内注射100 μL空白微米粒子和与疫苗中等量的裂解物。在实验中，从第3天开始每3天记录一次小鼠肿瘤体积的大小。肿瘤体积采用公式v=0.52×a×b ²计算，其中v为肿瘤体积，a为肿瘤长度，b为肿瘤宽度。由于动物实验伦理，在小鼠生存期试验中当小鼠肿瘤体积超过2000mm ³即视为小鼠死亡并将小鼠安乐死。

如图16所示，与PBS空白对照组相比，空白微米粒+裂解物对照组相比，微米疫苗给药组中小鼠肿瘤体积生长速度均明显变慢且小鼠生存期均明显延长。而且，包含Mn ²⁺佐剂的微米疫苗效果好于未包含佐剂的微米疫苗。由此可见，本发明所述的负载短双歧杆菌和卡介苗水溶性组分的微米疫苗对黑色素瘤具有治疗效果。

实施例5 格式乳球菌和加氏乳酸杆菌全细胞组分负载于甘露糖修靶头修饰的纳米粒子内部用于胰腺癌的治疗：本实施例以小鼠胰腺癌为癌症模型来说明如何制备负载有格式乳球菌和加氏乳酸杆菌全细胞组分的纳米疫苗并应用该疫苗治疗胰腺癌。首先裂解乳球菌和乳酸杆菌以制备全细胞组分的水溶性组分和非水溶性组分并按1:2的质量比例混合。然后，以PLGA为纳米粒子骨架材料，以CpG为免疫佐剂采用溶剂挥发法制备同时负载有乳球菌和加氏乳酸杆菌水溶性组分和非水溶性组分的纳米疫苗。然后采用该纳米疫苗来治疗胰腺癌。本实施例使用甘露糖靶头靶向树突状细胞，在实际应用中研究人员可根据具体情况调整所使用的靶头，如还可以使用DEC205抗体、CD40抗体、CD32抗体、CD103抗体等靶头。

（1）格式乳球菌和加氏乳酸杆菌的裂解及各组分的收集，方法同实施例3，更换细菌即可。

（2）纳米疫苗的制备：本实施例中制备纳米疫苗采用溶剂挥发法中的复乳法，所采用的纳米粒子制备材料PLGA分子量为24KDa-38KDa，所采用的甘露糖修饰的PLGA分子量为24KDa-38KDa。制备靶头修饰纳米疫苗时使用的未修饰PLGA与甘露糖修饰的PLGA的质量比为8:2，制备无靶头修饰纳米疫苗时全部使用未修饰PLGA。所采用的免疫佐剂为CpG且CpG只分布于纳米粒子内部。在制备疫苗时，水溶性组分为格式乳球菌水溶性组分和加氏乳酸杆菌水溶性组分的混合物，只分布于疫苗内部；非水溶性组分为乳球菌和加氏乳酸杆菌非水溶性组分的混合物，只分布于疫苗内部。靶头修饰和无靶头修饰的纳米疫苗粒径均为300nm左右，纳米粒子平均表面电位为-6mV左右。每1 mg PLGA纳米粒子约负载 50 μg蛋白质或多肽组分, 每1mgPLGA纳米粒内外所使用的CpG免疫佐剂为0.02mg且内外各半。空白纳米粒粒径为250nm左右，空白纳米粒制备时分别采用含有CpG的纯水或8M尿素代替相对应的水溶性组分和非水溶性组分。

（3）纳米疫苗用于胰腺癌的治疗：选取6-8周的雌性C57BL/6制备胰腺癌荷瘤小鼠。第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种1×10 ⁶个Pan 02细胞。纳米疫苗组方案如下：在接种胰腺癌之后第4天、第7天、第10天、第15天和第20天分别瘤内注射100 μL内部和表面都负载细菌裂解物中水溶性成分的4 mg PLGA纳米疫苗。PBS空白对照组方案如下：在接种胰腺癌之后第4天、第7天、第10天、第15天和第20天分别瘤内注射100 μL PBS。空白纳米粒+细胞裂解物对照组：在接种胰腺癌之后第4天、第7天、第10天、第15天和第20天分别瘤内注射100 μL空白纳米粒子和与疫苗中等量的裂解物。在实验中，从第3天开始每3天记录一次小鼠肿瘤体积的大小。肿瘤体积采用公式v=0.52×a×b ²计算，其中v为肿瘤体积，a为肿瘤长度，b为肿瘤宽度。由于动物实验伦理，在小鼠生存期试验中当小鼠肿瘤体积超过2000mm ³即视为小鼠死亡并将小鼠安乐死。

如图17所示，与对照组相比，疫苗治疗组肿瘤生长速度和小鼠生存期都有显著性差异。此外，靶头修饰疫苗组对小鼠的保护效果好于无靶头修饰组小鼠。由此可见，本发明所述的负载格式乳球菌和加氏乳酸杆菌中全细胞组分的纳米疫苗对胰腺癌具有预防效果。

实施例 6 6M盐酸胍溶解嗜酸乳杆菌和卡介苗组分并负载于微米粒子内部和表面用于乳腺癌的治疗：本实施例以小鼠乳腺癌为癌症模型来说明如何采用6M盐酸胍溶解细菌全细胞组分并制备负载有细菌全细胞组分的微米疫苗以治疗乳腺癌。本实施例中，以4T1小鼠三阴性乳腺癌为癌症模型。首先对嗜酸乳杆菌和卡介苗进行灭活和变性处理并以6M盐酸胍裂解细菌后溶解细菌全细胞组分。然后，以PLGA为微米粒子骨架材料，采用溶剂挥发法制备负载有细菌全细胞组分的微米疫苗。然后采用该微米疫苗来治疗4T1乳腺癌荷瘤小鼠体内的肿瘤。

（1）细菌的裂解及各组分的收集：收集嗜酸乳杆菌或卡介苗，然后分别采用紫外线和高温加热对其进行灭活和变性处理，然后采用6M盐酸胍裂解嗜酸乳杆菌和卡介苗并溶解细菌裂解物，将嗜酸乳杆菌裂解物与卡介苗裂解物按照质量比4:1比例混合后即为制备疫苗的原料来源。

（2）微米疫苗的制备：本实施例中微米疫苗及空白微米粒子采用分子量为38KD-54KD的PLGA，的制备方法如前所述。所制备微米疫苗平均粒径为2.5μm左右，微米粒子表面Zeta电位为-4mV。每1mg PLGA微米粒子内外负载蛋白质和多肽组分为100μg。空白微米粒的平均粒径为2.2μm左右。

（3）微米疫苗用于癌症的治疗：选取6-8周的雌性BALB/c制备4T1荷瘤小鼠。在第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种4×10 ⁵个4T1细胞。疫苗治疗组在第4天、第7天、第10天、第15天和第20天瘤内注射100 μL内部和表面都负载细菌全细胞组分的4 mg PLGA微米疫苗。PBS空白对照组在第4天、第7天、第10天、第15天和第20天分别瘤内注射100μL PBS。空白微米粒+细菌裂解物对照组在第4天，第7天，第10天，第15天和第20天分别瘤内注射等量细菌裂解物，以及不负载任何成分的4mg PLGA空白微米粒。在实验中，从第3天开始每3天记录一次小鼠肿瘤体积的大小。肿瘤体积采用公式v=0.52×a×b ²计算，其中v为肿瘤体积，a为肿瘤长度，b为肿瘤宽度。生存期实验中小鼠肿瘤体积超过2000mm ³即视为小鼠死亡并将小鼠安乐死。

如图18所示，与对照组相比，微米疫苗给药组肿瘤生长速度明显变慢且小鼠生存期明显延长。由此可见，本发明所述的负载嗜酸乳杆菌和卡介苗全细胞组分的微米疫苗对乳腺癌具有治疗效果。

实施例7 短双歧杆菌和卡介苗全细胞组分中非水溶性组分负载于微米粒子内部和表面用于黑色素瘤的治疗：本实施例说明如何制备只负载有短双歧杆菌和卡介苗组分中非水溶性部分的微米疫苗，并应用该疫苗治疗黑色素瘤。本实施例中，首先裂解短双歧杆菌和卡介苗以制备水溶性组分和非水溶性组分。然后，以有机高分子材料PLGA为微米粒子骨架材料，以poly(I:C)为免疫佐剂采用溶剂挥发法制备负载有全细胞的非水溶性组分的微米疫苗。

（1）癌细胞的裂解及各组分的收集：收集短双歧杆菌或卡介苗，使用超纯水重悬后反复冻融3次，伴有超声以破坏裂解细胞。待细胞裂解后，将裂解物以3000 g的转速离心5min取上清液即为可溶于纯水的水溶性组分，将沉淀部分的非水溶性组分采用8M尿素增溶后即得增溶后的原非水溶性组分。上述所得来源于两种细菌裂解物的原非水溶性组分增溶后按质量比1:1混合即为制备微米疫苗的抗原来源。

（2）微米疫苗的制备：本实施例中制备微米疫苗及作为对照的空白微米粒采用溶剂挥发法中的复乳法，所采用的微米粒子制备材料为有机高分子材料PLGA分子量为38KDa-54KDa，未加入免疫佐剂。制备方法如前所述。在微米粒子内部和表面负载细菌组分的微米疫苗粒径为1.90 μm 左右。每1 mg PLGA微米粒子负载90 μg蛋白质或多肽组分。空白微米粒粒径为1.80 μm左右，空白微米粒制备时分别采用等量的8M尿素代替相对应的非水溶性组分。

（3）微米疫苗用于癌症的治疗：选取6-8周的雌性C57BL/6制备黑色素瘤荷瘤小鼠。第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种1.5×10 ⁵个B16F10细胞。纳米疫苗组方案如下：在接种黑色素瘤之后第4天、第7天、第10天、第15天和第20天分别瘤内注射100 μL内部和表面都负载细菌裂解物中非水溶性成分的4 mg PLGA微米粒子。PBS空白对照组方案如下：在接种黑色素瘤之后第4天、第7天、第10天、第15天和第20天分别瘤内注射100 μL PBS。空白微米粒+游离裂解物对照组：在接种黑色素瘤之后第4天、第7天、第10天、第15天和第20天分别瘤内注射100 μL空白微米粒子和与疫苗中等量的裂解物。在实验中，从第3天开始每3天记录一次小鼠肿瘤体积的大小。肿瘤体积采用公式v=0.52×a×b ²计算，其中v为肿瘤体积，a为肿瘤长度，b为肿瘤宽度。由于动物实验伦理，在小鼠生存期试验中当小鼠肿瘤体积超过2000mm ³即视为小鼠死亡并将小鼠安乐死。

如图19所示，与PBS空白对照组相比，空白微米粒+游离裂解物对照组相比，微米疫苗给药组中小鼠肿瘤体积生长速度均明显变慢且小鼠生存期均明显延长。由此可见，本发明所述的负载短双歧杆菌和卡介苗非水溶性组分的微米疫苗对黑色素瘤具有治疗效果。

实施例 8 细菌全细胞组分负载于纳米粒子内部和表面用于疾病的预防：本实施例制备负载有大肠杆菌菌株CFT073裂解物组分的纳米疫苗，并应用该疫苗提高菌血症小鼠的存活率。本实施例中，首先将大肠杆菌在纯水中反复冻融裂解，以制备细菌的水溶性组分和溶于8M尿素中的原非水溶性组分。然后，以PLGA为纳米粒骨架材料，以Mn ²⁺和胸腺5肽为免疫佐剂制备纳米疫苗，并采用该纳米疫苗来预防败血症。

（1）细菌的裂解及各组分的收集：使用纯水将大肠杆菌菌株CFT073细菌反复冻融5次，并伴有超声以破坏裂解细胞。待细胞裂解后，将裂解物以5000g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入8M尿素溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性组分转化为在8M尿素水溶液中可溶。上述组分即为制备疫苗的原料来源。

（2）纳米疫苗的制备：本实施例中纳米疫苗及作为对照的空白纳米粒采用溶剂挥发法中的复乳法制备，所采用的纳米粒子制备材料PLGA分子量为24KDa-38KDa，所采用的免疫佐剂为MnCl ₂和胸腺5肽，且MnCl ₂和胸腺5肽既分布于纳米粒子内部也负载于纳米粒子表面。制备方法如前所述。在制备时先分别制备负载全细胞组分中水溶性组分的纳米疫苗和负载全细胞组分中非水溶性组分的纳米疫苗，然后二者混合使用或者分别单独使用。负载全细胞组分的纳米疫苗平均粒径为320nm左右，纳米疫苗表面电位为-5mV左右；每1mg PLGA纳米粒子约负载 20 μg细菌蛋白质或多肽组分，每1 mg PLGA纳米粒内外所使用的MnCl ₂和胸腺5肽免疫佐剂质量比为1:1，各约为0.1mg。空白纳米粒平均粒径为270nm左右，空白纳米粒制备时分别采用含有等量MnCl ₂和胸腺5肽的纯水或8M尿素代替相对应的水溶性组分和非水溶性组分。

（3）纳米疫苗用于败血症的预防：选取6-8周的雌性BALB/c进行疫苗免疫和细菌致病保护实验。

纳米疫苗组：在接种细菌致病实验之前第35天、第28天、第21天、第14天和第7天分别皮下注射50μL水溶性成分的1mg PLGA纳米疫苗和50μL内部和非水溶性成分的1 mg PLGA纳米疫苗。PBS空白对照组方案如下：在接种细菌致病实验之前第35天、第28天、第21天、第14天和第7天分别皮下注射100 μL PBS。只负载水溶性组分的纳米疫苗或者只负载非水溶性组分的纳米疫苗对照组：在接种细菌致病实验之前第35天、第28天、第21天、第14天和第7天分别接种100μL只负载水溶性组分的纳米疫苗或者只负载非水溶性组分的纳米疫苗。灭活疫苗对照组：在接种细菌致病实验之前第35天、第28天、第21天、第14天和第7天分别接种20 μg灭活细菌疫苗。在第0天进行大肠杆菌菌株CFT073活菌致病造模实验。造模实验时，每只小鼠腹腔注射3.6×10 ⁸ CFU致死剂量的大肠杆菌活菌，尔后连续观察48个小时。当小鼠出现濒死症状时，处于实验动物伦理学对小鼠进行安乐死处理。濒死症状为发蔫并在外界刺激时连续15分钟不活动。记录小鼠在细菌注射造模后的生存时间。

如图20所示，PBS对照组小鼠死亡速度最快；使用只负载水溶性组分或者只负载非水溶性组分的纳米疫苗组的小鼠生存期明显延长。而且，同时使用水溶性组分和非水溶性组分纳米疫苗组小鼠的生存期最长，比单独使用水溶性组分的纳米疫苗或者单独使用非水溶性组分的纳米疫苗要好。由此可见，本发明所述的负载细菌全细胞组分的纳米疫苗对细菌所致疾病具有良好的预防效果。

实施例 9 细菌全细胞组分负载于纳米粒子内部和表面用于疾病的预防：本实施例以制备负载有大肠杆菌菌株CFT073裂解物组分的纳米疫苗为例，说明如何负载细菌全细胞组分过程中进行适当的加工处理。在本实施例中采用的是生物矿化处理中的冷冻硅化处理后添加阳离子物质，在实际应用时也可以采用化学修饰、离子化、固化、核酸降解等其他加工处理方案。本实施例中，首先将大肠杆菌在纯水中反复冻融裂解，以制备细菌的水溶性组分和溶于8M尿素中的原非水溶性组分。然后，以PLGA为纳米粒骨架材料，以CpG为免疫佐剂制备纳米疫苗，并用该纳米疫苗来预防败血症。

（1）细菌的裂解及各组分的收集：使用纯水将大肠杆菌菌株CFT073细菌反复冻融5次，伴有超声以破坏裂解细胞。待细胞裂解后，将裂解物以5000g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入8M尿素溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性组分转化为在8M尿素水溶液中可溶。上述组分即为制备疫苗的原料来源。水溶性组分、非水溶性组分分别负载于不同纳米粒上。

（2）纳米疫苗的制备：本实施例中纳米疫苗及作为对照的空白纳米粒采用溶剂挥发法中的复乳法制备，所采用的纳米粒子制备材料PLGA分子量为24KDa-38KDa，所采用的免疫佐剂为CpG且只分布于疫苗内部。在本实例中，负载水溶性组分的纳米疫苗和负载非水溶性组分的纳米疫苗分别制备后然后混合使用。未经冷冻硅化处理的纳米疫苗制备方法如前所述。经冷冻硅化处理的纳米疫苗制备方法如下：在内部负载抗原（裂解组分）后，将100mg纳米粒子在10000g离心20分钟，然后使用7mL PBS重悬纳米粒子并与3 mL含有细胞裂解物(40mg/mL)和CpG(0.5mg/mL)的PBS溶液混合，尔后在10000g离心20分钟，然后采用10mL 硅酸盐溶液 (含154 mM NaCl、10 mM 原硅酸四甲酯和1.0 mM HCl，pH 3.0), 并在室温固定10 min，尔后在-80ºC固定24 h，使用超纯水离心洗涤后使用 3 mL含鱼精蛋白（5 mg/mL）和聚赖氨酸（10 mg/mL）的PBS重悬并作用10 min, 然后使用10 mL含4%海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48 h，将其用7 mL PBS 重悬然后加入3 mL细菌裂解液组分（蛋白质浓度40 mg/mL）并室温作用 10 min，得到内外都负载细菌裂解物的经冷冻硅化处理和添加阳离子物质的纳米疫苗。负载全细胞组分的纳米疫苗平均粒径为320nm左右，纳米疫苗表面电位为-5mV左右；未矿化处理疫苗每1mg PLGA纳米粒子约负载 20 μg细菌蛋白质或多肽组分，每1mg PLGA纳米粒所使用的CpG免疫佐剂约为0.01mg；矿化处理疫苗每1mg PLGA纳米粒子约负载 30 μg细菌蛋白质或多肽组分，每1mg PLGA纳米粒所使用的CpG免疫佐剂约为0.01mg。空白纳米粒平均粒径为270nm左右，空白纳米粒制备时分别采用含有等量CpG的纯水或8M尿素代替相对应的水溶性组分和非水溶性组分。

（3）纳米疫苗用于败血症的预防：选取6-8周的雌性BALB/c进行疫苗免疫和细菌致病保护实验。未矿化处理疫苗组：在接种细菌致病实验之前第35天、第28天、第21天、第14天和第7天分别皮下注射50μL负载水溶性成分的1mg PLGA纳米疫苗和50μL负载非水溶性成分的1 mg PLGA纳米疫苗。矿化处理疫苗组：在接种细菌致病实验之前第35天、第28天、第21天、第14天和第7天分别皮下注射30μL负载水溶性成分的1mg PLGA纳米疫苗和30 μL负载非水溶性成分的1 mg PLGA纳米疫苗。PBS空白对照组方案如下：在接种细菌致病实验之前第35天、第28天、第21天、第14天和第7天分别皮下注射100 μL PBS。空白纳米粒+游离裂解物对照组：在接种细菌致病实验之前第35天、第28天、第21天、第14天和第7天分别接种100μL 空白纳米粒和与疫苗所负载的等量的游离细胞裂解物；空白纳米粒和游离细胞裂解物注射在不同部位。灭活疫苗对照组：在接种细菌致病实验之前第35天、第28天、第21天、第14天和第7天分别接种20 μg固定法制备的灭活细菌疫苗。在第0天进行大肠杆菌菌株CFT073活菌致病造模实验。造模实验时，每只小鼠腹腔注射3.6×10 ⁸ CFU致死剂量的大肠杆菌活菌，尔后连续观察48个小时。当小鼠出现濒死症状时，处于实验动物伦理学对小鼠进行安乐死处理。濒死症状为发蔫并在外界刺激时连续15分钟不活动。记录小鼠在细菌注射造模后的生存时间。

如图21所示，PBS对照组以及空白纳米粒+游离裂解物对照组小鼠死亡速度较快；未矿化处理和矿化处理的纳米疫苗组小鼠的生存期均显著延长；而且矿化处理的纳米疫苗组小鼠的生存期延长效果好于未矿化处理组。由此可见，本发明所述的负载细菌全细胞裂解物中水溶性组分和非水溶性组分的纳米疫苗对细菌所致疾病具有预防效果。

图13-21分别为实施例中用一种或多种细菌制备的纳米疫苗或微米疫苗用于预防或治疗细菌所致疾病或者癌症时小鼠实验结果；a, 纳米疫苗或微米疫苗预防或治疗癌症时的肿瘤生长速度实验结果（n≥8）； b, 纳米疫苗或微米疫苗预防或治疗其他癌症时的小鼠生存期实验结果（n≥8），每个数据点为平均值±标准误差（mean±SEM）；a图中肿瘤生长抑制实验的显著性差异采用ANOVA法分析，b图中显著性差异采用Kaplan-Meier和log-rank test 分析；*表示疫苗组与PBS空白对照组相比p＜0.05，有显著性差异；#代表疫苗组与空白纳米粒+游离裂解物对照组相比p＜0.05，有显著性差异； **表示疫苗组与PBS空白对照组相比p＜0.01，有显著性差异；##代表疫苗组与空白纳米粒+游离裂解物对照组相比p＜0.01，有显著性差异。 &与无佐剂疫苗组相比p＜0.05，有显著性差异；$代表与福尔马林固定灭活疫苗组相比p＜0.05，有显著性差异；θ表示与加热灭活疫苗组相比p＜0.05，有显著性差异；δ 表示与无靶头修饰的疫苗组相比p＜0.05，有显著性差异；§表示与细菌疫苗组相比p＜0.05，有显著性差异；§§表示与细菌疫苗组相比p＜0.01，有显著性差异；ε表示与肿瘤组织疫苗组相比p＜0.05，有显著性差异；¥表示与肿瘤组织疫苗组相比p＜0.05，有显著性差异；※表示与肿瘤组织疫苗组相比p＜0.05，有显著性差异。

本发明利用纳米技术，将一种或多种细菌裂解后的全细胞组分重组为纳米疫苗或微米疫苗，是很有前景的一种新的细菌疫苗的制备方法。现有技术都是采用灭活技术、减毒技术或蛋白质重组技术制备用于细菌引发疾病的预防和治疗。上述技术各有利弊，本发明创造性的将一种或多种细菌裂解后得到的全细胞组分重新组装成适合抗原提呈细胞吞噬的纳米疫苗或微米疫苗。

细菌组分在进入机体后，会激活机体的免疫反应，可以用来治疗或预防癌症。在肿瘤旁边或者肿瘤内注射细菌组分，能够首先激活天然免疫系统并招募免疫细胞至肿瘤部位。但是，游离细菌裂解物不易被免疫细胞等吞噬，而通过纳米粒重组为纳米疫苗或微米疫苗后更容易被免疫细胞吞噬，而且在免疫细胞吞噬肿瘤细胞坏死后的裂解物的同时吞噬细菌疫苗可以起到共激活的作用，从而更好的激活机体的抗肿瘤免疫反应。

Claims

一种基于一种或多种细菌全细胞组分的预防或治疗疾病的疫苗系统，其特征在于，包括纳米粒子和/或微米粒子、一种或多种细菌的全细胞组分；所述疫苗系统为纳米疫苗系统和/或微米疫苗系统；所述全细胞组分为水溶性组分和/或非水溶性组分。
根据权利要求1所述基于一种或多种细菌全细胞组分的预防或治疗疾病的疫苗系统，其特征在于，所述全细胞组分由一种或多种细菌的全细胞裂解得到，或者所述全细胞组分由一种或多种细菌的全细胞裂解后加工得到，或者所述全细胞组分由一种或多种细菌的全细胞加工后裂解得到；所述水溶性组分溶于纯水或不含增溶剂的水溶液；所述非水溶性组分在纯水中不溶，在含增溶剂的水溶液中或有机溶剂中可溶。
根据权利要求1所述基于一种或多种细菌全细胞组分的预防或治疗疾病的疫苗系统，其特征在于，所述基于一种或多种细菌全细胞组分的预防或治疗疾病的疫苗系统的表面不连接或者连接靶头。
根据权利要求1所述基于一种或多种细菌全细胞组分的预防或治疗疾病的疫苗系统，其特征在于，所述全细胞组分被包载于纳米粒子和/或微米粒子内部和/或负载于纳米粒子和/或微米粒子表面；所述纳米粒子和/或微米粒子内部和/或表面还包括免疫佐剂。
根据权利要求1所述基于一种或多种细菌全细胞组分的预防或治疗疾病的疫苗系统，其特征在于，所述纳米粒子为纳米级尺寸的粒子，微米粒子为微米级尺寸的粒子；所述纳米粒子和/或微米粒子的制备材料为有机合成高分子材料、天然高分子材料或者无机材料；所述纳米粒子或微米粒子内部或表面可进行或者不进行化学修饰、固化、生物矿化或者离子化处理；所述纳米粒子和/或微米粒子的形状为球形、椭球形、桶形、多角形、棒状、片状、线形、蠕虫形、方形、三角形、蝶形或圆盘形。
根据权利要求1所述基于一种或多种细菌全细胞组分的预防或治疗疾病的疫苗系统，其特征在于，所述纳米疫苗的粒径为1nm～1000nm，纳米粒子的粒径为1nm～1000nm；所述微米疫苗的粒径为1μm～1000μm，微米粒子的粒径为1μm～1000μm；所述纳米疫苗和/或微米疫苗表面为电中性、带负电或者带正电。
根据权利要求1所述基于一种或多种细菌全细胞组分的预防或治疗疾病的疫苗系统，其特征在于，所述疾病由所述一种或多种细菌引起，或者所述疾病与所述一种或多种细菌无关。
权利要求1所述基于一种或多种细菌全细胞组分的预防或治疗疾病的疫苗系统的制备方法，其特征在于，先使用超纯水或水溶液或含增溶剂的溶液将细菌裂解，收集细菌组分，然后将一种细菌或者多种细菌的全细胞组分负载于纳米粒子和/或微米粒子的内部和/或表面，得到所述基于一种或多种细菌全细胞组分的预防或治疗疾病的疫苗系统；或者将一种细菌或者多种细菌的全细胞组分、免疫佐剂负载于纳米粒子和/或微米粒子内部和/或表面，得到所述基于一种或多种细菌全细胞组分的预防或治疗疾病的疫苗系统。
权利要求1所述基于一种或多种细菌全细胞组分的预防或治疗疾病的疫苗系统在制备预防和/或治疗疾病的疫苗中的应用。
根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述疾病为由细菌引起的疾病或癌症。