ES2307559T3 - Proceso para producir un producto de fermentacion. - Google Patents
Proceso para producir un producto de fermentacion. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2307559T3 ES2307559T3 ES01118952T ES01118952T ES2307559T3 ES 2307559 T3 ES2307559 T3 ES 2307559T3 ES 01118952 T ES01118952 T ES 01118952T ES 01118952 T ES01118952 T ES 01118952T ES 2307559 T3 ES2307559 T3 ES 2307559T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- microorganism
- fermentation
- biotin
- auxotrophy
- product
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 title claims abstract description 141
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 title claims abstract description 141
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 60
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims abstract description 45
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 claims abstract description 121
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 114
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims abstract description 112
- 239000000047 product Substances 0.000 claims abstract description 81
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 64
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 61
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 claims abstract description 61
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 claims abstract description 61
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 claims abstract description 61
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 57
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims abstract description 56
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims abstract description 56
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims abstract description 56
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 26
- GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N (D)-(+)-Pantothenic acid Chemical compound OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N 0.000 claims abstract description 8
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 claims abstract description 6
- GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N Chick antidermatitis factor Natural products OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 229940055726 pantothenic acid Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 235000019161 pantothenic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 239000011713 pantothenic acid Substances 0.000 claims abstract description 4
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 3
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 claims abstract description 3
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 3
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000013589 supplement Substances 0.000 claims abstract description 3
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 claims abstract description 3
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 claims abstract description 3
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims description 47
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 33
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims description 32
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 32
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 32
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 32
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 26
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 26
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 11
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 11
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 10
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 7
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 claims description 4
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 claims description 4
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 claims description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 4
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 claims description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 4
- LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N pyridoxine Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 241000186145 Corynebacterium ammoniagenes Species 0.000 claims description 3
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 claims description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 3
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 claims description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 2
- 235000008160 pyridoxine Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000011677 pyridoxine Substances 0.000 claims description 2
- 229940011671 vitamin b6 Drugs 0.000 claims description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 25
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 9
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 9
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 9
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 8
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 8
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 7
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 6
- 101150084911 ribA gene Proteins 0.000 description 6
- 101150036579 ribBA gene Proteins 0.000 description 6
- 101150003625 ribD gene Proteins 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 5
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 101150060382 ribC gene Proteins 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 4
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 4
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 4
- 101150005793 ribB gene Proteins 0.000 description 4
- 101150073450 ribE gene Proteins 0.000 description 4
- 101100525051 Brucella abortus biovar 1 (strain 9-941) ribH2 gene Proteins 0.000 description 3
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 3
- 101100469067 Escherichia coli (strain K12) ribE gene Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 3
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 101150003160 X gene Proteins 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- -1 for example Substances 0.000 description 3
- UYEUUXMDVNYCAM-UHFFFAOYSA-N lumazine Chemical compound N1=CC=NC2=NC(O)=NC(O)=C21 UYEUUXMDVNYCAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 101150051820 ribH gene Proteins 0.000 description 3
- 101150088248 ribH1 gene Proteins 0.000 description 3
- 108091000042 riboflavin kinase Proteins 0.000 description 3
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100028789 Arabidopsis thaliana PBS1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000702194 Bacillus virus SPO1 Species 0.000 description 2
- 229910021591 Copper(I) chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- FNZLKVNUWIIPSJ-UHNVWZDZSA-N D-ribulose 5-phosphate Chemical compound OCC(=O)[C@H](O)[C@H](O)COP(O)(O)=O FNZLKVNUWIIPSJ-UHNVWZDZSA-N 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 101100218845 Escherichia coli (strain K12) bioH gene Proteins 0.000 description 2
- XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N Guanosine-5'-triphosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- FNZLKVNUWIIPSJ-UHFFFAOYSA-N Rbl5P Natural products OCC(=O)C(O)C(O)COP(O)(O)=O FNZLKVNUWIIPSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000048125 Riboflavin kinases Human genes 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 2
- 101150029327 bioB gene Proteins 0.000 description 2
- 101150023452 bioD gene Proteins 0.000 description 2
- 101150032820 bioF gene Proteins 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M copper(I) chloride Chemical compound [Cu]Cl OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 230000002074 deregulated effect Effects 0.000 description 2
- 229940013640 flavin mononucleotide Drugs 0.000 description 2
- 239000011768 flavin mononucleotide Substances 0.000 description 2
- FVTCRASFADXXNN-SCRDCRAPSA-N flavin mononucleotide Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O FVTCRASFADXXNN-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 2
- FVTCRASFADXXNN-UHFFFAOYSA-N flavin mononucleotide Natural products OP(=O)(O)OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O FVTCRASFADXXNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- WLJVNTCWHIRURA-UHFFFAOYSA-N pimelic acid Chemical compound OC(=O)CCCCCC(O)=O WLJVNTCWHIRURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 235000019231 riboflavin-5'-phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- 108010016219 Acetyl-CoA carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 102000000452 Acetyl-CoA carboxylase Human genes 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 108010018763 Biotin carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 241001043481 Debaryomyces subglobosus Species 0.000 description 1
- 241001465321 Eremothecium Species 0.000 description 1
- 241001465328 Eremothecium gossypii Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 102000036509 GTP Cyclohydrolase Human genes 0.000 description 1
- 108010023555 GTP Cyclohydrolase Proteins 0.000 description 1
- 241000899717 Itaya Species 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 241000364057 Peoria Species 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010053763 Pyruvate Carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 102100039895 Pyruvate carboxylase, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 229910003797 SPO1 Inorganic materials 0.000 description 1
- 101100150136 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) SPO1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- 230000001651 autotrophic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 1
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000003831 deregulation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L disodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC([O-])=O PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000009655 industrial fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 239000012092 media component Substances 0.000 description 1
- 238000013048 microbiological method Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- LPUQAYUQRXPFSQ-DFWYDOINSA-M monosodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O LPUQAYUQRXPFSQ-DFWYDOINSA-M 0.000 description 1
- 235000013923 monosodium glutamate Nutrition 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 125000001452 riboflavin group Chemical group 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 229940073490 sodium glutamate Drugs 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- JRMUNVKIHCOMHV-UHFFFAOYSA-M tetrabutylammonium bromide Chemical compound [Br-].CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC JRMUNVKIHCOMHV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000021468 vitamin B8 Nutrition 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P25/00—Preparation of compounds containing alloxazine or isoalloxazine nucleus, e.g. riboflavin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
- C12P17/182—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system
Landscapes
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- General Preparation And Processing Of Foods (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Un proceso de fermentación desacoplado para producir en un medio de fermentación un producto de fermentación objetivo seleccionado a partir del grupo que consiste en riboflavina, ácido pantoténico, tiamina, ácido fólico y piroxidina, dicho proceso que comprende: (a) proporcionar un microorganismo recombinante producido que produce en exceso un producto de fermentación objetivo y comprende una mutación que causa auxotrofía para la biotina, donde la auxotrofía dentro del microorganismo no compromete la capacidad del microorganismo para producir el producto de fermentación objetivo, y (b) suplementar el medio con una cantidad ilimitada de los sustratos requeridos para la producción del producto de fermentación objetivo, y con una cantidad limitada de la biotina que complementa la auxotrofía.
Description
Proceso para producir un producto de
fermentación.
La presente invención se refiere a un proceso
para producir un producto de fermentación objetivo. Más
particularmente, la presente invención se refiere a un proceso para
producir en exceso un producto de fermentación objetivo en un
microorganismo que tiene una mutación la cual causa el crecimiento
autotrófico del microorganismo, pero que no compromete su capacidad
para producir en exceso el producto de fermentación objetivo. Las
células hospederas y las secuencias polinucleotídicas usadas en el
proceso son también proporcionadas.
Muchos productos de valor comercial son
producidos por reacciones de fermentación. Por ejemplo, la
riboflavina, la cual es una vitamina esencial que es requerida de
todas las bacterias, animales y plantas, es sintetizada por las
plantas y las bacterias, sin embargo, no puede ser producida por los
animales superiores, que tienen que adquirirla a partir de su
dieta.
La riboflavina es producida comercialmente para
su uso como un alimento y un aditivo para piensos mediante, por
ejemplo, reacciones de fermentación usando células de Ashbya
gossypii, Eremothecium ashbyii o Candida flareri.
(Véase, por ejemplo, Ainsworth, G.C. y Sussman, A.S., The Fungi,
Academic Press, Nueva York (1965); Heefner, D.L., y otros.,
WO 88/09822; Hickey, R.J., Production of Riboflavin by
Fermentation, in Industrial Fermentation (Underkofler, L.A. y
Hickey, R.J., eds.) p. 157-190, Chemical Publishing
Co., Nueva York (1954), y Perlman, D. y otros., Fermentation
Ind. Eng. Chem. 44:1996-2001 (1952).
Las enzimas requeridas para catalizar la
biosíntesis de la riboflavina a partir de trifosfato de guanosina
(GTP) y ribulosa-5-fosfato, son
codificadas por cuatro genes (ribG, ribB, ribA,
y ribH) en B. subtilis. Véase, la Fig. 1A.
Estos genes están localizados en un operón, el orden de cuyos genes
difiere del orden de las reacciones enzimáticas catalizadas por las
enzimas. Por ejemplo, la GTP ciclohidrolasa II, la cual cataliza el
primer paso en la biosíntesis de la riboflavina, es codificada por
el tercer gen en el operón, ribA. Véase, la Fig. 2. La
proteína ribA también codifica una segunda actividad
enzimática, es decir, la DHB sintetasa, la cual cataliza la
conversión de ribulosa-5-fosfato a
la unidad de DHB de cuatro carbonos. La deaminasa y la reductasa
son codificadas por el primer gen del operón, ribG. La
bifuncionalidad de los productos génicos de ribA y
ribG puede facilitar un flujo coordinado de precursores de la
riboflavina. El penúltimo paso en la biosíntesis de la riboflavina
es catalizado por la lumazina (Lum) sintetasa, el producto del
último gen rib, ribH. La riboflavina sintetasa, que
controla el último paso de la vía, es codificada por el segundo gen
del operón, ribB. La función del gen X (Fig. 1) localizada en
el extremo 3' del operón rib es, hasta el momento, incierta,
sin embargo, su producto génico no es requerido para la síntesis de
la riboflavina.
La transcripción del operón riboflavina a partir
del promotor ribP_{1} es controlada por un mecanismo de
atenuación que involucra una región líder reguladora localizada
entre ribP_{1} y ribG. Las mutaciones de
RibO dentro de esta región líder, resultan en la expresión
desregulada del operón riboflavina. La expresión desregulada es
también observada en cepas que contienen mutaciones de aminoácidos
en el gen ribC. El gen ribC ha sido mostrado
recientemente que codifica la flavin quinasa/FAD sintetasa de B.
subtilis. Véase, Mack, M, y otros., J. Bact.,
180:950-55 (1998). Las mutaciones desreguladoras
reducen la actividad flavoquinasa del producto del gen ribC,
resultando en la concentración intracelular reducida de
flavinmononucleótido (FMN), la molécula efectora del sistema
regulador de la riboflavina.
Recientemente, un microorganismo de Bacillus
subtilis fue genéticamente modificado para producir altos
rendimientos de riboflavina durante un corto ciclo de fermentación.
Véase, Perkins, J.B., Patente U.S. No. 5,837,528. Este enfoque
combinó la selección de mutantes genéticos clásica y el mejoramiento
de la fermentación con ingeniería genética de los genes de la
biosíntesis de riboflavina, mediante la desregulación y el
incremento del nivel de la expresión génica. En este sistema, la
expresión de los genes rib fue incrementada mediante la
mutación del gen ribC que codifica la flavoquinasa, mediante
el ligamiento de los genes rib a promotores constitutivos,
fuertes, y mediante el incremento del número de copias de los genes
rib.
Por ejemplo, en el operón rib modificado
presente en el plásmido pRF69 divulgado por US 5,837,528, el
promotor ribP_{1} entero y la mayor parte de la región
líder reguladora fueron eliminados, y reemplazados con un promotor
constitutivo P_{15} del fago SPO1. Véase, Fig. 1B. Además, el
promotor del fago fue introducido entre los genes ribB y
RibA para aumentar aún más la transcripción de los genes
correspondientes corriente abajo. Finalmente, pRF69 fue provisto
con un gen de resistencia al cloranfenicol corriente debajo de los
genes rib. pRF69 fue direccionado mediante transformación
por entrecruzamiento simple en el operón rib del
microorganismo hospedero RB50, el cual contenía mutaciones que
desregulan la biosíntesis de purina y el cual contenía una mutación
en el gen ribC que desregula la biosíntesis de la
riboflavina.
La estructura genómica resultante a partir de la
transformación por entrecruzamiento simple de RB50 con pRF69
incluye un gen de resistencia al cloranfenicol, flanqueado por el
operón rib tipo salvaje en un extremo y por el operón rib
de pRF69 modificado de en el otro extremo. Los elementos
repetitivos dentro de esta estructura originan el número de copias
incrementado del gen de resistencia y del operón rib que lo
flanquea, luego de la selección de las bacterias transformadas con
pRF69 para la resistencia al cloranfenicol incrementada.
La transcripción incrementada de los genes
rib en RB50 que contiene múltiples(n) copias del
operón rib modificado de pRF69 (es decir,
RB50::[pRF69]_{n}) ha sido confirmada mediante el análisis
de membranas de Northern. A diferencia del B. subtilis tipo
salvaje, el cual acumuló cantidades muy pequeñas del transcripto de
ARN que cubrió todo el operón rib, RB50::[pRF69]_{n}
acumuló grandes cantidades de transcriptos más cortos que cubrieron
principalmente los dos primeros genes del operón. El segundo
promotor P_{15} modificado corriente abajo de ribA dio
lugar a la acumulación significativa de transcriptos de ARN que
cubrieron los tres genes corriente abajo del operón rib.
Véase, Perkins, J.B., y otros., J. Ind. Microbiol.
Biotechnol., 22:8-18 (1999).
En un reactor de fermentación de tipo lote
alimentado de riboflavina, que contiene por ejemplo B.
subtilis
RB50::[pRF69]_{n}, la biomasa y la riboflavina son producidos a partir de un sustrato de fermentación común, la glucosa. La velocidad mediante la cual la glucosa es bombeada en el reactor ("velocidad de alimentación de glucosa") es crítica para su utilización en la producción de biomasa y de riboflavina, respectivamente. Una velocidad de alimentación de glucosa rápida le permite al cultivo crecer a velocidades elevadas, causando un exceso de formación de biomasa y una reducción en el rendimiento de riboflavina. Velocidades de alimentación de glucosa que son demasiado lentas, sin embargo, mientras que reducen la producción de biomasa, resultan en una baja productividad de riboflavina. Debido al bajo rendimiento, baja productividad, o ambos, se incrementan los costos de producción de riboflavina, de aquí que debe lograrse un balance entre la producción de biomasa y la producción de riboflavina mediante la regulación cuidadosa de la velocidad de alimentación de la glucosa en los reactores de fermentación comercial de riboflavina.
RB50::[pRF69]_{n}, la biomasa y la riboflavina son producidos a partir de un sustrato de fermentación común, la glucosa. La velocidad mediante la cual la glucosa es bombeada en el reactor ("velocidad de alimentación de glucosa") es crítica para su utilización en la producción de biomasa y de riboflavina, respectivamente. Una velocidad de alimentación de glucosa rápida le permite al cultivo crecer a velocidades elevadas, causando un exceso de formación de biomasa y una reducción en el rendimiento de riboflavina. Velocidades de alimentación de glucosa que son demasiado lentas, sin embargo, mientras que reducen la producción de biomasa, resultan en una baja productividad de riboflavina. Debido al bajo rendimiento, baja productividad, o ambos, se incrementan los costos de producción de riboflavina, de aquí que debe lograrse un balance entre la producción de biomasa y la producción de riboflavina mediante la regulación cuidadosa de la velocidad de alimentación de la glucosa en los reactores de fermentación comercial de riboflavina.
A la vista de las deficiencias señaladas
anteriormente, sería deseable optimizar la producción de un producto
de fermentación objetivo, tal como la riboflavina, y al mismo
tiempo mantener la producción de biomasa a un nivel que sea el más
eficiente para el tamaño y el tipo de reactor usado.
Una realización de la presente invención es un
proceso para desacoplar la producción de un producto de fermentación
objetivo de la producción de biomasa. Este proceso incluye
proporcionar un medio de fermentación que contiene un
microorganismo producido por vía recombinante que produce en exceso
un producto de fermentación objetivo y que contiene una mutación
que causa crecimiento auxotrófico para la biotina del
microorganismo, donde la auxotrofía en el microorganismo no
compromete la capacidad del microorganismo para producir el producto
de fermentación objetivo. El medio es entonces suministrado con
todos los sustratos requeridos para la producción del producto de
fermentación, un sustrato para el producto de fermentación objetivo,
y biotina como un sustrato para complementar la auxotrofía para la
biotina. El(los) primer(os) sustrato(s) es/son
proporcionado(s) siempre en exceso, asegurando la máxima
productividad. El sustrato subsiguiente (es decir, la biotina) es
suministrado en cantidades limitadas para mantener la formación de
la biomasa a una velocidad baja.
Una fermentación de un microorganismo de
producción hecho mediante el proceso establecido anteriormente, es
también proporcionada.
La presente invención incluye un proceso para
producir un producto de fermentación objetivo. En este proceso, un
medio de fermentación es proporcionado que contiene un
microorganismo producido por vía recombinante que produce en exceso
un producto de fermentación objetivo. El microorganismo también
contiene una mutación que causa crecimiento auxotrófico para la
biotina del microorganismo, donde la auxotrofía no compromete la
capacidad del microorganismo para producir el producto de
fermentación.
Tal como se utilizan en este documento, la frase
"microorganismo producido por vía recombinante" significa
cualquier microorganismo modificado por técnicas de ADN recombinante
para producir productos de fermentación objetivos útiles
comercialmente, tales como por ejemplo, la riboflavina. Por ejemplo,
un microorganismo de acuerdo con la presente invención puede
incluir células bacterianas. El microorganismo puede ser
seleccionado a partir de célulasde Escherichia,
Bacillus, Cyanobacter, Streptomyces, y
Corynebacteria. Preferiblemente, el microorganismo es
seleccionado a partir de E. coli, B. subtilis, B.
amyloliquefaciens, B. licheniformis, C.
glutamicum, o B. ammoniagenes.
En la presente invención, el microorganismo es
modificado usando técnicas de ADN recombinante para incrementar la
producción del producto de fermentación objetivo por encima de los
niveles de producción tipo salvaje según lo establecido en más
detalle en los ejemplos. Tal como se utiliza en este documento,
"producto de fermentación objetivo" significa un compuesto
producido por fermentación, el cual es seleccionado a partir del
grupo que consiste de riboflavina, ácido pantoténico, tiamina,
ácido fólico y piridoxina.
Por ejemplo, cuando el producto de fermentación
objetivo es riboflavina, el microorganismos producido por vía
recombinante es una célula de B. subtilis, tal como por
ejemplo, el microorganismo de producción B. subtilis
designado como RB50::[pRF69]_{n} que contiene
múltiples(n) copias (por ejemplo, aproximadamente 5 hasta
aproximadamente 20 copias) de pRF69 que codifica un operón
rib modificado con el promotor (P_{15}) fuerte del fago
SPO1, para incrementar la transcripción de los genes rib.
Este microorganismo producido por vía recombinante produce un
significativamente más riboflavina que los microorganismos tipo
salvaje. Véase, US 5,837,528.
El microorganismo Bacillus subtilis RB50
usado en la presente invención fue depositado en Agricultural
Research Culture Collection (NRRL), Peoria, IL, bajo los términos
del Tratado de Budapest el 23 de mayo de 1989, y se le asignó el
número de acceso B 18502. El plásmido pRF69 usado en la presente
invención fue depositado en la American Type Culture Collection
(ATCC), Rockville, MD, el 6 de junio de 1990, y se le asignó el
número de acceso ATCC 68338.
En la presente invención, el microorganismo
producido por vía recombinante contiene una mutación que causa
crecimiento auxotrófico para la biotina. Según lo usado en este
documento, el término "mutación" se refiere a una alteración
en la secuencia genómica del microorganismo, la cual puede ser
introducida por cualquier medio conveniente, incluyendo, por
ejemplo, mutagénesis con productos químicos y radiación
ultravioleta, seguido de identificación o selección para un
fenotipo deseado, construcción de genes disfuncionales in
vitro mediante técnicas de recombinación usados para reemplazar
las contrapartes intactas de los genes en el genoma del
microorganismo, por recombinaciones mediante entrecruzamiento
simples y dobles, y otras técnicas bien conocidas. Véase, Sambrook,
y otros., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed.,
Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) y, Harwood y Cutting,
Molecular Biology Methods For Bacillus, John Wiley and Sons
(1990), p. 27-74.
Los términos "auxótrofo",
"auxotrófico", y "auxotrofía" son usados de forma
intercambiable en este documento y se refieren a un microorganismo
que ha sido modificado, mediante por ejemplo, una mutación, para
requerir la adición de un compuesto exógeno para crecer, que previo
a la mutación, el microorganismo podía producirlo por sí mismo.
Así, "crecimiento auxotrófico " se refiere a la capacidad de un
microorganismo que se ha vuelto auxotrófico para un sustrato
particular para crecer en un medio de fermentación definido.
El compuesto exógeno requerido para el
crecimiento auxotrófico es referido aquí como "un sustrato que
complementa la auxotrofía" o "el sustrato que complementa".
Un sustrato que complementa la auxotrofía en la presente invención
incluye la biotina. En la presente invención, un microorganismo es
uno que es auxótrofo para la biotina.
En ciertos microorganismos usados en los
reactores de fermentación, tales como B. subtilis, varios
sustratos son usados como fuentes de carbono, nitrógeno y oxígeno.
Tales sustratos son requeridos para producir tanto el producto de
fermentación objetivo, así como la biomasa. Los microorganismos
auxotróficos también requieren un suministro de un sustrato "que
complementa" según lo establecido anteriormente.
La frase "máxima productividad", tal como
se utiliza en este documento, significa la máxima cantidad de un
producto de fermentación objetivo que un microorganismo es capaz de
producir cuando todos los sustratos requeridos o beneficiosos para
la formación del producto de fermentación objetivo (por ejemplo,
fuentes de carbono, oxígeno, nitrógeno, etc.) están
disponibles en exceso, a parámetros químico-físicos
dados, tales como el pH y la temperatura. La máxima productividad
es medida por: gm del producto producido/gm de biomasa/hr.
La frase "máxima velocidad de crecimiento",
según se utiliza en este documento significa la velocidad de
crecimiento más alta que es lograda por un microorganismo, cuando
es proporcionado con un exceso de todos los sustratos requeridos
para el crecimiento a parámetros químico-físicos
dados, tales como el pH y la temperatura. Así, la velocidad de
crecimiento máxima de un microorganismo es la cantidad de incremento
relativo de la biomasa del microorganismo por tiempo. La máxima
velocidad de crecimiento y la máxima productividad de un
microorganismo pueden ser determinadas por aquellos expertos en el
arte usando, por ejemplo, fermentaciones de cultivo continuo.
Si uno de los sustratos requeridos para la
producción del producto de fermentación no es proporcionado en
exceso, este sustrato se convertirá en el sustrato limitante de la
velocidad de producción, y su suministro determinará la velocidad
mediante la cual el producto de fermentación objetivo es producido
(es decir, la productividad del proceso). Del mismo modo, si uno de
los sustratos requeridos para el crecimiento de la biomasa no es
proporcionado en exceso, este sustrato se convertirá en el sustrato
limitante del crecimiento y su suministro determinará la velocidad
de crecimiento.
La producción de la biomasa y del producto de
fermentación objetivo se dice que están "acopladas" si el
suministro limitado de un sustrato determina tanto la velocidad de
crecimiento de la biomasa como la productividad del producto de
fermentación objetivo. En un proceso acoplado, el mismo sustrato es
el sustrato limitante para el crecimiento y la producción. Para un
sistema de fermentación de riboflavina, la glucosa es usada por el
microorganismo como principal fuente de carbono requerida para la
formación de biomasa y del producto. La limitación de la glucosa
resultará a un proceso "acoplado". Un incremento o disminución
en la velocidad en que la glucosa es suministrada al fermentador
(y, por tanto, el microorganismo) determina si ambas, la producción
de biomasa y de riboflavina, son reguladas positiva o negativamente,
respectivamente.
La producción de la biomasa y del producto de
fermentación objetivo se dice que están "desacopladas" si el
suministro limitado de un sustrato (sustrato 1) determina la
velocidad de crecimiento del microorganismo, mientras que el
suministro de otro sustrato (sustrato 2), determina la productividad
para el producto de fermentación objetivo. En un proceso
desacoplado, el suministro ilimitado del sustrato 2 resultará en la
máxima productividad del microorganismo. Así, en un proceso
desacoplado, tal como por ejemplo, uno que usa un microorganismo
auxotrófico de la presente invención, la glucosa (sustrato 2) puede
ser suministrada a un reactor de fermentación en una proporción no
limitante para lograr la máxima productividad del producto de
fermentación objetivo, mientras que el sustrato que complementa la
auxotrofía (sustrato 1) es suministrado al reactor de fermentación
en una proporción que impide el aumento de la biomasa en su máxima
velocidad de crecimiento y, por tanto, limita la producción de la
biomasa.
La presencia de una auxotrofía en un
microorganismo de acuerdo con la presente invención y el suministro
limitante del crecimiento del correspondiente sustrato que
complementa la auxotrofía, no pueden comprometer la capacidad del
microorganismo para producir el producto de fermentación objetivo.
En la presente invención, una auxotrofía "compromete" la
capacidad del microorganismo para producir el producto de
fermentación objetivo si el suministro limitado del sustrato que
complementa la auxotrofía resulta en menos del 50% de la
productividad máxima para el producto de fermentación objetivo. La
productividad del producto de fermentación objetivo se dice también
estar "comprometida" por la auxotrofía si la productividad
máxima de un microorganismo de producción que lleva esa auxotrofía
es menor que el 50% de la productividad máxima de un microorganismo
idéntico que de otra manera carecería de la auxotrofía.
En la presente invención, la presencia de una
auxotrofía en un microorganismo es confirmada determinando la
producción de biomasa en un medio de fermentación apropiado, en
presencia o ausencia del correspondiente sustrato que complementa
la auxotrofía. Véase, el Ejemplo 1. Tal como se utilizan en este
documento, "la producción de biomasa" o "el crecimiento de
biomasa" significan la capacidad de un microorganismo para crecer
y dividirse. En la presente invención, la producción de biomasa es
determinada por métodos microbiológicos estándares, tales como por
ejemplo, pesando la masa seca de las células totales o midiendo la
turbidez de una muestra de fermentación a una longitud de onda
particular entre, por ejemplo, 550-660 nm. Véase, el
Ejemplo 3. Alternativamente, la capacidad de un microorganismo para
crecer y dividirse, es decir, para producir biomasa, puede ser
evaluada por la formación de colonias sobre una placa de agar.
Donde fuera aplicable, la presencia de una
mutación en el genoma de un microorganismo que conduzca a una
auxotrofía puede ser confirmada por técnicas de biología molecular
estándares, tales como por ejemplo hibridación por Southern, PCR
(como en el Ejemplo 1), o secuenciación del ADN. Tales técnicas
están fácilmente disponibles para un experto en el arte. Véase, por
ejemplo, capítulos 8-14 de Sambrook, y
otros., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2 Ed., Cold
Spring Harbor Laboratory Press (1989) y capítulo 15 de Ausubel y
otros., Eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley
and Sons, Inc (1998).
Como se indica más arriba, un microorganismo de
acuerdo con la presente invención es un auxótrofo para la biotina.
La biotina o vitamina B_{8} es requerida como grupo prostético por
un número de enzimas incluyendo piruvato carboxilasa y
acetil-CoA carboxilasa. La biotina es
bio-sintetizada a partir del ácido pimélico
involucrando un número de pasos enzimáticos. Véase, la Fig. 3. Los
genes para la síntesis de la biotina son agrupados en un solo
operón en B. subtilis. Véase, la Fig. 4. Un microorganismo
que es un auxótrofo para la biotina es incapaz de crecer sin la
suplementación con biotina, es decir, el sustrato complementa la
auxotrofía.
En procesos de fermentación comercial, es
deseable limitar la velocidad de crecimiento de la biomasa para,
por ejemplo, reducir el consumo de los costosos sustratos de
fermentación y para mantener la demanda de oxígeno y el desarrollo
del calor de la biomasa metabólicamente activa dentro de los límites
de la transferencia de oxígeno y las capacidades de enfriamiento
del reactor de fermentación. En un proceso "acoplado", la
limitación de la producción de biomasa mediante la limitación del
suministro de un sustrato de fermentación objetivo reducirá la
productividad del microorganismo para el producto de fermentación
objetivo. En una proceso "desacoplado", usando un
microorganismo auxotrófico de acuerdo con la presente invención, la
producción de biomasa puede ser limitada restringiendo el
suministro del sustrato que complementa la auxotrofía, mientras que
el producto de fermentación objetivo es producido a la máxima
productividad del microorganismo para ese producto, ya que todos
los sustratos requeridos para la formación del producto son
proporcionados en exceso.
En la presente invención, el desacople de la
producción del producto de fermentación objetivo de la producción
de biomasa se logra mediante la introducción de una auxotrofía para
la biotina en un microorganismo que ya ha sido modificado para
expresar en exceso un producto de fermentación objetivo, por
ejemplo, la riboflavina. Así, en la presente invención, la
producción máxima del producto de fermentación objetivo es lograda
cuando el microorganismo está sintetizando el producto de
fermentación objetivo en su máxima productividad.
En consecuencia, el microorganismo auxotrófico
para la biotina de la presente invención es cultivado en un medio
de fermentación que contiene un sustrato que complementa la
auxotrofía para la biotina a una concentración suficiente para
mantener la biomasa a una velocidad de crecimiento definida. Todos
los demás sustratos requeridos por el microorganismo son
suministrados al medio de fermentación en concentraciones que no
limitan la capacidad del microorganismo para producir el producto
de fermentación objetivo en su máxima productividad.
Las concentraciones particulares del sustrato
que complementa la auxotrofía para la biotina y de los otros
sustratos requeridos para lograr la máxima productividad del
producto de fermentación objetivo que están en o son suministrados
al medio fermentación, variarán dependiendo del producto de
fermentación objetivo, el reactor usado, el microorganismo de
producción, y otras variables de la fermentación bien conocidas. Por
ejemplo, en un cultivo de producción de riboflavina que contiene un
microorganismo de producción auxotrófico para la biotina, la
cantidad de glucosa (es decir, el sustrato de la fermentación
objetivo) añadida al medio de fermentación tiene que ser suficiente
para producir en exceso la riboflavina (es decir, el producto de
fermentación objetivo). Según lo usado en este documento, el
término "producir en exceso" significa que el microorganismo
produce el producto de fermentación objetivo a partir de un
sustrato que es usado como una fuente de carbono por encima de al
menos el 0.1%(p/p) de rendimiento, preferiblemente por encima del 1%
(p/p) de rendimiento, tal como por ejemplo por encima del 4% (p/p)
de rendimiento.
En la presente invención, la relación entre la
concentración del sustrato que complementa la auxotrofía con
respecto al sustrato para el producto de fermentación objetivo en el
medio de fermentación es desde aproximadamente 1:10,000,000 hasta
aproximadamente 1:10, preferiblemente desde aproximadamente
1:1,000,000 hasta aproximadamente 1:100.
En la presente invención, el producto de
fermentación objetivo puede ser aislado a partir del microorganismo
y/o del medio. Tal como se utilizan en este documento, el término
"aislado" significa que el producto de fermentación objetivo
está purificado, o al menos parcialmente purificado. El producto de
fermentación objetivo puede ser purificado por métodos conocidos en
el arte. Tales métodos incluyen, por ejemplo, filtración,
centrifugación, y/o extracción. El producto de fermentación
objetivo puede ser posteriormente purificado por recristalización a
partir de solventes orgánicos o acuosos o aplicando otros métodos
conocidos en el arte, tales como por ejemplo, cromatografía de
intercambio iónico, de exclusión por tamaño, o de interacción
hidrofóbica. Para una descripción detallada de los procedimientos
para el aislamiento y purificación de la riboflavina a partir del
caldo de fermentación, véase Kupfer E., Solicitud de Patente Europea
EP 0 730 034 A1.
En una realización preferida, un microorganismo
producido por vía recombinante que produce un exceso de riboflavina
es producido. Este microorganismo es modificado adicionalmente para
que contenga una auxotrofía para la biotina que desacople la
producción de riboflavina de la producción de biomasa. De este modo,
el sustrato que complementa la auxotrofía es la biotina y es el
sustrato para el producto de fermentación es la glucosa. Por
ejemplo, un microorganismo de acuerdo con la presente invención es
el microorganismo de producción de riboflavina B. subtilis
RB50 que contiene múltiples copias del operón rib de pRF69
modificado. Véase, US 5,837,528. En esta realización, una
auxotrofía para la biotina es introducida en células RB50 que
contienen el operón rib de pRF69 modificado, el cual
desacopla la producción de riboflavina de la producción de biomasa.
Este microorganismo de producción de riboflavina auxotrófico para
la biotina ha sido designado como RB50::[pRF69]Bio^{-}.
Cuando es cultivado con biotina como sustrato limitante del
crecimiento, la productividad de riboflavina específica de esta
cepa es incrementada hasta aproximadamente de tres veces en
comparación con un cultivo limitado en glucosa. Véase, el Ejemplo
3.
La presente invención también incluye los
derivados de RB50::[pRF69]Bio^{-}. Según lo usado en este
documento, un "derivado" de RB50::[pRF69]Bio^{-} es
cualquier célula de B. subtilis la cual contiene el operón
rib de pRF69 modificado o una secuencia polinucleotídica que
es al menos 25% idéntica al operón rib de pRF69 modificado,
de preferencia al menos el 50% idéntica al operón rib de
pRF69 modificado, y que es un auxótrofo para la biotina, tal como
por ejemplo, otros microorganismos Bacillus con los operones
rib modificados por vía recombinante, en los cuales la
producción de riboflavina está desacoplada de la producción de
biomasa. En la presente invención, el porcentaje de identidad de la
secuencia polinucleotídica es determinado usando el programa BLAST
y el servidor en el National Center of Biotechnology Information
(Bethesda, MD, E.U.A.).
En la presente invención, el microorganismo
puede contener primero una secuencia polinucleotídica que codifica
para uno o más polipéptidos con actividades enzimáticas para
producir riboflavina, y uno o más elementos de transcripción los
cuales no están naturalmente asociadas con, pero los cuales están
ahora transcripcionalmente ligados a esta secuencia
polinucleotídica.
Según lo usado en este documento, "el elemento
de transcripción" incluye potenciadores, promotores, sitios de
unión ribosomal naturales o sintéticas, y/o terminadores, como son
conocidos por aquellos con conocimientos en el arte. Véase, US
5,837,528. En la presente invención, la secuencia polinucleotídica
puede contener más de un elemento de transcripción según lo
anteriormente indicado. Preferiblemente, la secuencia
polinucleotídica incluye al menos un promotor.
La presente invención también incluye un proceso
para desacoplar la producción de un producto de fermentación
objetivo de la producción de biomasa en un medio de fermentación.
Este proceso incluye proporcionar un microorganismo producido por
vía recombinante que ha sido modificado para que contenga una
secuencia polinucleotídica la cual codifica para las enzimas
biosintéticas para un producto de fermentación objetivo, la máxima
producción del cual es dependiente de un suministro ilimitado de un
sustrato para la fermentación del producto objetivo. Una auxotrofía
para la biotina es entonces introducida dentro del microorganismo
para controlar la producción de biomasa mediante la limitación de
la concentración de un sustrato que complementa la auxotrofía para
la biotina en el medio de fermentación.
A los efectos de la presente invención, la
auxotrofía para la biotina es "introducida" en el
microorganismo, usando cualquier medio conveniente. Por ejemplo, la
auxotrofía puede ser introducida en el microorganismo usando
técnicas de mutagénesis clásica, así como las técnicas biológicas de
recombinación. Preferiblemente, una secuencia polinucleotídica que
codifica un gen defectuoso o un conjunto de genes defectuosos, cuyas
contrapartes intactas dentro del microorganismo son requeridas para
producir un compuesto esencial para la producción de biomasa, es
introducida en el microorganismo mediante transformación.
El término "transformación", tal como se
utiliza en este documento se refiere a la introducción de la
secuencia polinucleotídica en un microorganismo y la recombinación
de la secuencia polinucleotídica con el ADN genómico del
microorganismo mediante el mecanismo de simple o doble
entrecruzamiento, reemplazando así el gen o el conjunto de genes
intactos correspondientes. Véase, Harwood y Cutting, Molecular
Biology Methods For Bacillus, John Wiley and Sons (1990), p.
27-74. La introducción de la secuencia
polinucleotídica en el microorganismo puede ser lograda mediante
cualquier medio conveniente bien conocido por los expertos en el
arte, tales como por ejemplo, la transformación de secuencias
polinucleotídicas linealizadas o circulares en células receptoras
competentes naturales o protoplastos, transducción generalizada,
transfección, lipofección, electroporación, bombardeo de partículas
y similares. Véase, Id. y Sambrook y otros., Molecular
Cloning. A Laboratory Manual (2ª Ed.) Cold Spring Harbor Laboratory
Press (1989).
\newpage
La secuencia polinucleotídica de la presente
invención puede contener mutaciones de
deleción-inserción dentro de un casete génico
bioFDB de Bacillus subtilis como se establece con más
detalle en los ejemplos. Preferiblemente, la secuencia
polinucleotídica es la ID SEC NO: 1. En la presente invención, la
ID SEC NO: 1 puede estar modificada en sus extremos 3' y 5' con
secuencias de extensión, cada una de las cuales son varios
centenares de pares de bases de longitud, para incrementar la
eficiencia de la transformación de la ID SEC NO: 1. La secuencias
de extensión son secuencias aleatorias, las cuales deben tener menos
de un 80% de homología con las secuencias de ADN de las células
receptoras para evitar la recombinación en loci indeseables. Tal
secuencia polinucleotídica es usada entonces para transformar un
microorganismo capaz de producir en exceso un producto de
fermentación objetivo.
Los transformantes positivos para la mutación de
deleción-inserción, es decir, los cuales son ahora
auxótrofos, son seleccionados usando protocolos estándares de
selección. Véase, Id. Por ejemplo, la secuencia
polinucleotídica usada para transformar el microorganismo puede
incluir distintos marcadores de selección, incluyendo por ejemplo
marcadores de resistencia a antibióticos, marcadores para la
producción de color, etc. Preferiblemente, el marcador es un
marcador de resistencia a la neomicina, y la selección para la
transformación deseada incluye la identificación de los
microorganismos capaces de crecer en el medio de fermentación
complementado con neomicina, y los cuales producen en exceso el
producto de fermentación objetivo, tal como la riboflavina, según se
indica en más detalle en el Ejemplo 1.
En otra realización de la presente invención,
una secuencia polinucleotídica es proporcionada. Bacillus
subtilis o una especie estrechamente relacionada, por ejemplo,
Bacillus amyloliquefaciens o Bacillus licheniformis
son hechos auxotróficos para la biotina luego de la transformación
con esta secuencia polinucleotídica. Preferiblemente, la secuencia
polinucleotídica es la ID SEC NO: 1 o una homóloga de la ID SEC NO:
1 que introduce una auxotrofía para la biotina. Preferiblemente,
una célula hospedera de Bacillus es transformada con la ID
SEC NO: 1 o una secuencia homóloga de la misma que introduce una
auxotrofía para la biotina, la cual retiene su capacidad para
causar una auxotrofía para la biotina en una célula hospedera.
En la presente invención, un polinucleótido es
considerado un "homólogo que introduce auxotrofía" de la ID
SEC NO: 1, si el polinucleótido contiene secuencias que son más del
70% idénticas a las secuencias parciales bioF y bioB
presentes dentro de la ID SEC NO: 1 según lo determinado por
BLAST.
La presente invención también incluye células
hospederas transformadas con un polinucleótido que contiene la ID
SEC NO: 1 o un homólogo de la ID SEC NO: 1, que causa una auxotrofía
en la célula hospedera, o una secuencia polinucleotídica que
contiene una o más inserciones, deleciones, y/o sustituciones de la
ID SEC NO: 1, cuya secuencia retine la capacidad para causar una
auxotrofía para la biotina en la célula hospedera.
La célula hospedera puede ser cualquier
microorganismo capaz de producir un producto de fermentación
objetivo de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, la
célula hospedera puede ser seleccionada a partir de células de
Escherichia, Bacillus, Cyanobacter,
Streptomyces, y Corynebacteria. Preferiblemente, el
microorganismo es seleccionado a partir de E. coli, B.
subtilis, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis,
C. glutamicum, o B. ammoniagenes. Más preferiblemente,
la célula hospedadora es una célula B. subtilis, tal como
por ejemplo RB50 que contiene múltiples copias operón rib de
pRF69 modificado.
Algunos de los resultados más importantes de la
presente invención son resumidos en las figuras.
La Figura 1 muestra el operón riboflavina tipo
salvaje de B. subtilis y el operón rib de pRF69
modificado de conformidad con la presente invención. (A) muestra la
ubicación del sitio regulatorio ribO y los genes
estructurales ribG, ribB, ribA, y ribH,
y el gen X. El promotor ribP_{1} corriente arriba del
sigma A y el promotor interno putativo ribP_{2} son
marcados. El terminador de la transcripción independiente de rho
corriente abajo del gen X y el atenuador de la transcripción
corriente arriba de ribG son representados también. (B)
muestra la estructura operón rib de pRF69 modificado, con la
ubicación de las secuencias de ADN que contienen el promotor
constitutivo P_{15} del fago SPO1.
La Figura 2 muestra la vía de la biosíntesis de
la riboflavina de B. subtilis.
La Figura 3 muestra la vía de la biosíntesis de
la biotina de Bacillus.
La Figura 4 muestra el operón biosintético
(bio) de la biotina de B. subtilis.
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes ejemplos son establecidos para
ilustrar los procesos y las composiciones de la presente invención.
Estos ejemplos son sólo ilustrativos y no pretenden limitar el
alcance de la invención en alguna manera. Por ejemplo, la presente
invención puede ser modificada llevando a cabo un proceso
desacoplado en fermentadores industriales a gran escala, variando
la velocidad de dilución desde 0.3 l/h hasta 0.001 l/h,
incrementando la concentración de los componentes en el medio de
fermentación, incrementando la concentración de glucosa hasta 400
g/l, y llevando a cabo un proceso desacoplado de acuerdo con la
invención en un lote o en un reactor de fermentación de lote
alimentado. Los componentes de los medios para todas estas
variaciones, incluyendo la biotina, serán determinados y ajustados
por un experto en el arte.
En los siguientes ejemplos, una secuencia
polinucleotídica que introduce una auxotrofía para la biotina fue
primero construida en E. coli. La transformación de un
microorganismo competente natural de B. subtilis con la
secuencia polinucleotídica resultó en un mutante de B.
subtilis auxotrófico para la biotina. Un lisado del fago PBS1
preparado a partir de este mutante, fue entonces usado para
introducir la auxotrofía, vía transducción generalizada, en el
microorganismo de producción RB50 que contiene múltiples copias del
operón rib de pRF69 modificado. Técnicas de ADN recombinante
estándares fueron usadas para la construcción de la secuencia
polinucleotídica y los mutantes de Bacillus subtilis. Véase,
por ejemplo, Sambrook y otros., Molecular Cloning. A
Laboratory Manual (2ª Ed.) Cold Spring Harbor
Laboratory Press (1989) y Harwood y Cutting, Molecular Biology Methods For Bacillus, John Wiley and Sons (1990).
Laboratory Press (1989) y Harwood y Cutting, Molecular Biology Methods For Bacillus, John Wiley and Sons (1990).
Para construir una mutación de
deleción-inserción en bioFDB, un fragmento de
ADN de 2938 bp que contiene los genes completos bioF,
bioD, y bioB, fue amplificado por PCR usando el ADN
genómico proveniente del microorganismo B. subtilis 1012
(Saito y otros., Mol. Gen. Genet. 170:117-122
(1979)) como molde y los siguientes cebadores:
| BioF+1 | (5'-GAGAGGATCCACGAGGTTACGAGC-3') | (ID SEC NO: 2) | |
| BioB-1 | (5'-GCGACGAATTCGACATCATACCGATTGC-3') | (ID SEC NO: 3). |
Las condiciones de reacción para la reacción de
PCR consistió de 25 ciclos de desnaturalización a 95ºC durante 1
minuto, apareamiento a 55ºC durante 1 minuto, y extensión a 72ºC
durante 3 minutos. El producto de la PCR fue purificado usando el
kit de purificación Wizard PCR (Promega Corp) y fue doblemente
digerido con BamHI y EcoRI. El producto de la PCR
digerido, fue clonado en (1) un pUC19 digerido con
BamHI-EcoRI, resultando en el plásmido pNMR3 y en (2)
un pBluescriptII SK^{+} digerido con BamHI-EcoRI,
resultando en el plásmido pNMR4.
El casete para la resistencia a la neomicina de
1.2-kb proveniente del plásmido pBEST501 (Itaya y
otros., Nucleic Acid Res. 17:4410 (1989)) fue amplificado,
usando los siguientes cebadores en una reacción de PCR consistente
de 25 ciclos de desnaturalización a 95ºC durante 1 minuto,
apareamiento a 55ºC durante 1 minuto, y extensión a 72ºC durante 3
minutos:
| pBESTBstBI+1 | (5'-GCGCTTCGAAGCTTGGGCAGCAGGTCG-3') | (ID SEC NO: 4) | |
| pBESTBstBI-1 | (5'-GCGCTTCGAATTCAAAATGGTATGCG-3') | (ID SEC NO: 5) |
Ambos pNMR3 y pNMR4 fueron digeridos con
BstBI la cual removió 1019 bp, que comprenden parte de los
genes bioF y bioB y el gen completo bioD. El
casete de resistencia a la neomicina amplificado fue purificado y
digerido con BstBI, y fue clonado en pNMR3 y pNMR4 digeridos
con BstBI.
Los siguientes plásmidos fueron entonces
creados: pNMR5, que contiene el casete de resistencia a la neomicina
insertado dentro de los genes bioFDB en la misma orientación
de la transcripción de bio en pUC19; pNMR6 que contiene el
casete de resistencia a la neomicina insertado dentro de los genes
bioFDB en la orientación opuesta de la transcripción de
bio en pUC19; y pNMR7 que contiene el casete de resistencia
a la neomicina insertado dentro de los genes bioFDB en la
orientación opuesta de la transcripción de bio en
pBluescriptII SK^{+}. Los tres plásmidos fueron linearizados con
XbaI y transformados en células naturales competentes de
B. subtilis 1012. Los transformantes fueron seleccionados en
placas TBAB que contienen neomicina a una concentración final de 5
\mug/ml. Aproximadamente 250 transformantes fueron observados, a
partir de los cuales 30 fueron parcheados sobre medio mínimo de
Spizen (SMM) en presencia o ausencia de 0.1 mg/ml de biotina. 23 de
30 colonias fueron auxotróficas para la biotina. 6 colonias fueron
analizados por análisis de PCR de los cruzamientos por fusión, y 2
clones (designados B. subtilis NM1 y NM2, respectivamente)
fueron mantenidos, para su posterior uso.
El microorganismo B. subtilis NM2 fue
usado como un microorganismo donante para la preparación del lisado
del fago PBS1. Este lisado fue usado para transducir el
microorganismo de producción de riboflavina RB50 proporcionado con
la modificación del operón riboflavina de pRF69. RB50 se refiere al
microorganismo hospedero de B. subtilis, el cual contiene
varias mutaciones introducidas para mejorar la producción de
nucleótidos y riboflavina. pRF69 se refiere a un operón rib
modificado mediante la introducción de promotores fuertes de fagos
los cuales fueron introducidos en el locus rib de pRF50. El
operón de pRF69 modificado fue amplificado a números de copias
elevados. Una descripción detallada del microorganismo RB50 y el
operón rib de pRF69 modificado es presentada en Perkins
'528. Un número de colonias resistentes a la neomicina fueron
obtenidas las cuales fueron incapaces de crecer en SMM en ausencia
de biotina exógena. Tres de estos clones fueron analizados por PCR
e hibridación por Southern, y mostraron contener la mutación
bioFDB::neo. Uno de estos clones designado como NM9 fue
seleccionado y renombrado RB50::[pRF69]Bio^{-}. La
hibridación en la membrana del Southern reveló la presencia de
pRF69.
RB50::[pRF69]Bio^{-} fue cultivado en
un medio complejo rico, (medio VY, Medio DSMZ 577) complementado con
10 \mug/ml de cloranfenicol a una densidad óptica DO 660 = 1. Un
mililitro de este caldo fue transferido a 20 ml de medio VY
suplementado con 30 \mug/ml de cloranfenicol y luego de alcanzar
una DO de 1, de nuevo 1 ml del cultivo fue transferido a 20 ml de
medio VY suplementado con 60 \mug/ml de cloranfenicol. El mismo
paso se repitió usando medio VY que contiene 80 \mug/ml de
cloranfenicol. Después de alcanzar una DO de 1, este cultivo fue
suplementado con un 15% (vol/vol) de glicerol y alícuotas de 1 ml a
-80ºC fueron conservadas. El incremento gradual en la concentración
del antibiótico fue usado para seleccionar las bacterias con número
de copias incrementado del operón rib depRF69 modificado. Ver
Perkins '528.
El desacoplamiento del crecimiento y la
producción fue logrado y resultó en el efecto positivo deseado sobre
la productividad de la riboflavina de RB50::[pRF69]Bio^{-}
según lo descrito en detalle más adelante usando cultivos continuos
en quimiostato. Según los libros de texto estándares, por ejemplo,
ver Neidhardt y otros., Physiology Of The Bacterial Cell,
Sinauer Associates, Inc. (1990), la velocidad de crecimiento de las
células dentro de un cultivo de fermentación continua, el cual ha
alcanzado condiciones de fase estacionaria (quimiostato), es igual
a la velocidad de la dilución a la cual el fermentador es operado.
La concentración de la biomasa dentro de tal fermentador está
correlacionada con la proporción de la concentración del sustrato
limitante.
Las fermentaciones fueron llevadas a cabo en
bio-reactores New Brunswick Model Bioflow 3000
(volumen total de 3 l) equipados con cuchillas agitadoras. El
cultivo continuo en quimiostato fue usado con una bomba de entrada
que controló la velocidad del flujo y un rebosadero que controló el
nivel del líquido en el reactor. Las variables de fermentación
fueron establecidas de la siguiente manera:
Volumen de líquido: 1200 ml
Velocidad de dilución: 0.15
Temperatura: 37ºC
pH: 6.75
Aireación: 1 l/min de aire comprimido
Velocidad de agitación: 1000 rpm
\vskip1.000000\baselineskip
La concentración de oxígeno disuelto fue en cada
etapa del cultivo por encima del 20% de saturación del aire.
El medio de fermentación usado en la fase de
lote así como en el medio de alimentación contuvieron los siguientes
componentes en las concentraciones finales dadas: glutamato de
sodio 0.25 g/l, KH_{2}PO_{4} 1.57 g/l, K_{2}HPO_{4} 1.57
g/l, Na_{2}HPO_{4} x 12 H_{2}O 2.74 g/l, NH_{4}Cl 4.00 g/l,
ácido cítrico 0.1 g/l, (NH_{4})_{2}SO_{4} 6.80 g/l,
glucosa x H_{2}O 22 g/l, antiespumante (basado en silicio) 0.2
ml/l, FeSO_{4} x 7 H_{2}O 14.1 mg/l; CaCl_{2} x 2 H_{2}O
10.5 mg/l, MnSO_{4} x 1 H_{2}O 9.4 mg/l, CoCl_{2} x 6
H_{2}O 2.7 mg/l, (NH_{4})_{6}HMo_{7}O_{24} x 4
H_{2}O 1.0 mg/l, AlCl_{3} x 6 H_{2}O 0.67 mg/l, CuCl_{2} x
2 H_{2}O 0.50 mg/l; MgSO_{4} x 7 H_{2}O 6.7 g/l, ZnSO_{4} x
7 H_{2}O 2.68 mg/l.
El glutamato de sodio, KH_{2}PO_{4},
K_{2}HPO_{4}, Na_{2}HPO_{4} x 12 H_{2}O, NH_{4}Cl, ácido
cítrico, y (NH4)_{2}SO_{4} fueron disueltos en 85% del
volumen final, el pH fue ajustado a pH 4 mediante adición de ácido
clorhídrico y la solución fue esterilizada en autoclave. La glucosa
fue disuelta en el 10% del volumen final y esterilizada por
separado en autoclave. El antiespumante fue esterilizado en
autoclave por separado, como un concentrado. La solución de
FeSO_{4} x 7 H_{2}O fue preparada en fresco como un concentrado
500 veces para cada lote de medio y esterilizada por filtración. Las
otras sales fueron preparadas como concentrados 500 veces y
esterilizadas por filtración en los siguientes grupos: grupo 1:
CaCl_{2} x 2 H_{2}O; grupo 2: MnSO_{4} x 1 H_{2}O,
CoCl_{2} x 6 H_{2}O, (NH_{4})_{6}HMo_{7}O_{24} x
4 H_{2}O, AlCl_{3} x 6 H_{2}O, CuCl_{2} x 2 H_{2}O; grupo
3: MgSO_{4} x 7 H_{2}O, ZnSO_{4} x 7 H_{2}O. Las soluciones
esterilizadas separadamente fueron combinadas bajo condiciones
estériles, y se les añadió agua estéril con el objetivo de alcanzar
el volumen final.
Los fermentadores fueron inoculados con 40 ml de
un cultivo semilla preparado de la siguiente manera: Una alícuota
de la suspensión bacteriana de RB50::[pRF69]Bio^{-}
congelada del Ejemplo 1, fue descongelada y transferida a 100 ml de
medio VY suplementado con 60 \mug/ml de cloranfenicol. El cultivo
fue incubado a 37ºC hasta alcanzar DO = 1 (típicamente después de 12
a 15 horas).
La fase de lote de la fermentación, es decir, la
fase durante la cual la glucosa en el medio de fermentación fue
usada para el crecimiento de la bacteria, duró aproximadamente 24
horas. Después que el agotamiento de la glucosa fue alcanzado,
según lo indicado por una sostenida elevación en el valor del
oxígeno disuelto, las fermentaciones fueron cambiadas a modo
continuo (inicio de las bombas de entrada y de salida) a una
velocidad de dilución del 0.15 por hora. Los medios de
fermentación, que fueron administrados a los fermentadores, fueron
los medios descritos anteriormente (que contienen 20 g/l de
glucosa), complementados ya sea con 10 \mug/l de biotina
(fermentación A del Ejemplo 3) ó 3 \mug/l de biotina (fermentación
B del Ejemplo 3). Las muestras de la fermentación fueron tomadas y
analizadas después que los cultivos habían alcanzado la fase
estacionaria, es decir, después que el volumen del fermentador
había sido intercambiado más de 5 veces.
\vskip1.000000\baselineskip
20 \mul de solución de NaOH al 40% fueron
añadidos a 1 ml de la muestra de fermentación del Ejemplo 2
inmediatamente después de la colección a partir del reactor de
fermentación. La muestra fue incubada durante 20 segundos a
temperatura ambiente para disolver los cristales de riboflavina en
la muestra. Una alícuota de esta suspensión fue diluida y
neutralizada con tampón fosfato de potasio 0.1 molar pH 7,0. El
contenido de la biomasa en la suspensión fue medido mediante la
determinación de la turbidez a 660 nm. La dilución de la muestra fue
ajustada para lograr lecturas entre 0.05 y 0.3 unidades de
absorción.
Como una confirmación, el contenido de la
biomasa en la suspensión fue determinado pesando la masa celular
seca. Una alícuota de 1 ml de la suspensión obtenida anteriormente
fue transferida a viales Eppendorf previamente pesados y las
bacterias fueron colectadas por centrifugación (14000 rpm, 5
minutos). Las bacterias fueron lavadas una vez con 1 ml de agua
desionizada y secadas al vacío a 80ºC hasta que la estabilidad del
peso fue lograda. La masa celular seca fue determinada
gravimétricamente.
La concentración de riboflavina fue determinada
por análisis de HPLC del sobrenadante libre de células de la
suspensión obtenida anteriormente. Un sistema
Hewlett-Packard 1100 equipado con una bomba binaria,
un termostato de columna y un detector de matriz de diodos fue
usado. La muestra fue fraccionada sobre una columna Supelcosil
LC-8-DB de acero inoxidable (150 x
4.6 mm, tamaño de partícula de 3 \mum). Un gradiente de elución
del solvente A (solución de ácido sulfúrico en agua 4 mmol/l) y
disolvente B (metanol) de acuerdo con el siguiente perfil de tiempo
fue usado:
La temperatura de la columna se estableció a
20ºC, y la velocidad del flujo fue de 1,0 ml/minuto. La absorción
UV fue registrada a 280 nm y el pico de riboflavina fue detectado a
aproximadamente los 11 minutos (tiempo total de la corrida de 20
minutos). Las concentraciones de riboflavina fueron calculadas
comparando el pico integrado de la muestra con los de los estándares
de riboflavina (Sigma, St Louis, MO, E.U.A.).
Los resultados de las corridas de fermentación
descritos en el Ejemplo 2 se resumen en la Tabla 1 (los valores
representan las medias obtenidos a partir de 3 muestras tomadas
entre las 45 horas y las 71 horas después del inicio del modo
continuo).
En la fermentación B (Tabla 1) con 3 \mug/l de
biotina y 20 g/l de glucosa en el medio de fermentación se
produjeron 3.36 g/l de biomasa. Luego del incremento de la biotina a
10 \mug/l, mientras se mantiene la glucosa en 20 g/l la
producción de la biomasa se incrementó hasta 5.87 g/l de biomasa
(fermentación A, Tabla 1). El incremento posterior del suplemento de
biotina no resultó en mayor producción de biomasa. Así, en una
fermentación A, la glucosa (el sustrato de fermentación) es el
sustrato limitante del crecimiento. En la fermentación B, la
glucosa es suplementada en una proporción no limitante del
crecimiento. Más bien, la biotina (el sustrato complementante)
limita el crecimiento de la biomasa. De aquí, que las fermentaciones
A y B de la Tabla 1 representan, procesos acoplado y desacoplado
respectivamente, según lo definido en este documento.
Los resultados de este ejemplo muestran que en
un proceso desacoplado con biotina como el sustrato limitante del
crecimiento y la glucosa como sustrato de fermentación (fermentación
B), la productividad de la biomasa es significativamente
incrementada (3 veces) sobre un proceso acoplado (fermentación A).
Además, el rendimiento del producto, es decir, la cantidad de
riboflavina producida por glucosa consumida es 33% más alta en el
proceso desacoplado en comparación con el proceso acoplado.
La invención que ha sido descrita así, será
evidente que la misma pueda ser variada de muchas maneras. Tales
variaciones no deberán ser consideradas como una desviación del
espíritu y el alcance de la invención.
<110> F. Hoffmann-La Roche
AG
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Proceso para producir un producto de
fermentación objetivo
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Caso 20606
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<150> USSN 09/633,927
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-08-08
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3156
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus subtilis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia Cebadora BioF+1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia Cebadora BioB-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia Cebadora pBESTstBI+1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia Cebadora pBESTstBI-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (14)
1. Un proceso de fermentación desacoplado para
producir en un medio de fermentación un producto de fermentación
objetivo seleccionado a partir del grupo que consiste en
riboflavina, ácido pantoténico, tiamina, ácido fólico y piroxidina,
dicho proceso que comprende:
(a) proporcionar un microorganismo recombinante
producido que produce en exceso un producto de fermentación objetivo
y comprende una mutación que causa auxotrofía para la biotina,
donde la auxotrofía dentro del microorganismo no compromete la
capacidad del microorganismo para producir el producto de
fermentación objetivo, y
(b) suplementar el medio con una cantidad
ilimitada de los sustratos requeridos para la producción del
producto de fermentación objetivo, y con una cantidad limitada de
la biotina que complementa la auxotrofía.
2. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
1, que además comprende aislar el producto de fermentación objetivo
a partir del microorganismo y/o del medio de fermentación.
3. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1
ó 2, donde la biotina es proporcionada al medio de fermentación en
una concentración suficiente para mantener el crecimiento de la
biomasa a una velocidad de crecimiento definida, y los sustratos
requeridos para la producción del producto de fermentación objetivo
son proporcionados al medio de fermentación en concentraciones que
no limitan la capacidad del microorganismo para producir el producto
de fermentación objetivo.
4. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
3, donde la relación de biotina: sustrato de fermentación objetivo
es desde 1:10000000 hasta 1:10.
5. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones de la 1 a la 4, donde el microorganismo comprende
una o más copias de una secuencia polinucleotídica que codifica para
uno o más polipéptidos con actividades enzimáticas para producir
riboflavina y uno o más elemento(s) de transcripción el/los
cual(es) no está(n) naturalmente
asociado(s) con, pero que si está(n) transcripcionalmente asociados con la secuencia polinucleotídica en el microorganismo.
asociado(s) con, pero que si está(n) transcripcionalmente asociados con la secuencia polinucleotídica en el microorganismo.
6. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
5, donde el elemento de transcripción comprende al menos un
promotor.
7. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, donde uno de los sustratos para la
fermentación del producto objetivo es glucosa.
8. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, donde el microorganismo es seleccionado a
partir del grupo que consiste de Escherichia,
Bacillus, Cyanobacter, Streptomyces, y
Corynebacteria.
9. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, donde el microorganismo es seleccionada a
partir del grupo que consiste de E. coli, B. subtilis,
B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, C.
glutamicum, y B. ammoniagenes.
10. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, donde el microorganismo es B.
subtilis RB50::[pRF69]Bio^{-} o un derivado del mismo
el cual retiene la capacidad de producir en exceso riboflavina.
11. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, donde la mutación que causa la auxotrofía
comprende la introducción de un polinucleótido que comprende una
mutación de deleción-inserción en el genoma del
microorganismo para afectar la capacidad del microorganismo para
producir biotina.
12. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
11, donde el polinucleótido comprende mutaciones de
deleción-inserción dentro de un casete génico
bioFDB.
13. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, que comprende transformar el microorganismo
con una secuencia polinucleotídica que comprende una mutación de
deleción-inserción en bioFDB o la ID SEC NO:
1.
14. Un proceso para producir un microorganismo
recombinante seleccionado del grupo que consiste de
Escherichia, Bacillus, Cyanobacter,
Streptomyces, y Corynebacteria, dicho proceso que
comprende:
(a) proporcionar un microorganismo que produce
en exceso un producto de fermentación objetivo seleccionado a partir
del grupo que consiste de riboflavina, ácido pantoténico, ácido
fólico y piridoxina; e
(b) introducir una mutación que causa una
auxotrofía para la biotina, donde la auxotrofía dentro del
microorganismo no compromete la capacidad del microorganismo para
producir el producto de fermentación objetivo.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US09/633,927 US6656721B1 (en) | 2000-08-08 | 2000-08-08 | Polynucleotide portions of the biotin operon from B. subtilis for use in enhanced fermentation |
| US633927 | 2000-08-08 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2307559T3 true ES2307559T3 (es) | 2008-12-01 |
Family
ID=24541718
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES01118952T Expired - Lifetime ES2307559T3 (es) | 2000-08-08 | 2001-08-04 | Proceso para producir un producto de fermentacion. |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6656721B1 (es) |
| EP (1) | EP1186664B1 (es) |
| JP (1) | JP2002253273A (es) |
| KR (1) | KR100841890B1 (es) |
| CN (1) | CN100471958C (es) |
| AT (1) | ATE396270T1 (es) |
| AU (1) | AU784733B2 (es) |
| BR (1) | BR0103240A (es) |
| CA (1) | CA2353772A1 (es) |
| DE (1) | DE60134096D1 (es) |
| ES (1) | ES2307559T3 (es) |
| MX (1) | MXPA01007978A (es) |
| NO (1) | NO326383B1 (es) |
| TW (1) | TWI243206B (es) |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6656721B1 (en) * | 2000-08-08 | 2003-12-02 | Roche Vitamins, Inc. | Polynucleotide portions of the biotin operon from B. subtilis for use in enhanced fermentation |
| KR100422305B1 (ko) * | 2002-12-05 | 2004-03-10 | 씨제이 주식회사 | 리보플라빈을 생산하는 미생물 및 이를 이용한리보플라빈의 생산방법 |
| KR100422307B1 (ko) | 2002-12-05 | 2004-03-10 | 씨제이 주식회사 | 리보플라빈을 생산하는 미생물 및 이를 이용한리보플라빈의 생산방법 |
| EP1731617A1 (de) * | 2005-06-06 | 2006-12-13 | DSM IP Assets B.V. | Rückführung lysierter Biomasse als Nährmedium bei der fermentativen Herstellung von Riboflavin |
| US7423136B2 (en) * | 2005-10-19 | 2008-09-09 | Stephen F. Austin State University | Nucleic acid for biotin production |
| DE102006061479A1 (de) * | 2006-12-23 | 2008-06-26 | Evonik Degussa Gmbh | Verfahren zur Herstellung verschiedener, eine Zielsubstanz enthaltender Produkte |
| CA2680787C (en) * | 2007-03-16 | 2015-03-03 | The Regents Of The University Of California | Compositions and methods for reducing h2s levels in fermented beverages |
| EP2164975B1 (de) | 2007-07-06 | 2012-02-01 | Basf Se | Verfahren zur Herstellung einer konzentrierten wässrigen Glukoselösung aus Mais |
| EP2186880A1 (en) | 2008-11-07 | 2010-05-19 | DSM IP Assets B.V. | Improved production of riboflavin |
| EP2625268B1 (en) | 2010-10-06 | 2015-12-30 | BP Corporation North America Inc. | Variant cbh i polypeptides |
| US20120107888A1 (en) * | 2011-02-17 | 2012-05-03 | Qteros, Inc. | Modulation of fermentation products through vitamin supplementation |
| WO2015042114A1 (en) * | 2013-09-18 | 2015-03-26 | Novogy, Inc. | Fermentation process with distinct growth and production stages |
| CN103952422B (zh) * | 2014-04-15 | 2016-06-29 | 天津大学 | 枯草芽孢杆菌编码PRPP转酰胺酶突变基因purF及应用 |
| WO2018022595A1 (en) * | 2016-07-25 | 2018-02-01 | Invista Textiles (U.K.) Limited | Materials and methods utilizing biotin producing mutant hosts for the production of 7-carbon chemicals |
| EP3488010A4 (en) * | 2016-07-25 | 2020-04-08 | INVISTA Textiles (U.K.) Limited | MATERIALS AND METHOD FOR CONTROLLING A CARBON FLOW AND INCREASED PRODUCTION OF CARBON-BASED CHEMICALS |
| CN108277189A (zh) * | 2017-01-05 | 2018-07-13 | 上海创诺医药集团有限公司 | 一种生产核黄素的工程菌株及其应用 |
| FR3085960B1 (fr) * | 2018-09-14 | 2020-11-27 | Kyanos Biotechnologies | Procede de culture d’un microorganisme d’interet et installation associee |
| BR112021009177A2 (pt) | 2018-11-15 | 2021-10-26 | Dsm Ip Assets B.V. | Produção aprimorada de riboflavina |
| US20230235375A1 (en) | 2020-06-23 | 2023-07-27 | Dsm Ip Assets B.V. | Fermentation process |
| CN113755551A (zh) * | 2021-09-30 | 2021-12-07 | 天津科技大学 | 一种提高核黄素产量的发酵方法 |
Family Cites Families (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2666014A (en) * | 1949-02-21 | 1954-01-12 | Hiram Walker & Sons Inc | Process for producing riboflavin |
| GB952091A (en) | 1959-11-24 | 1964-03-11 | Yamasa Shoyu Kk | Process for the production of hypoxanthine derivatives |
| US5120655A (en) | 1985-12-20 | 1992-06-09 | Zeagen, Inc. | Riboflavin producing strains of microorganisms |
| JPH0740946B2 (ja) * | 1987-04-16 | 1995-05-10 | 東レ株式会社 | 発酵法によるピルビン酸の製造方法 |
| CN1066486C (zh) * | 1989-06-22 | 2001-05-30 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 高产核黄素的细菌菌株 |
| US5837528A (en) | 1989-06-22 | 1998-11-17 | Hoffmann La Roche, Inc. | Bacterial strains which overproduce riboflavin |
| EP0514405B1 (en) | 1990-01-31 | 1995-01-04 | The Upjohn Company | Strain ral-4, useful for production of small proteins and peptides |
| JP3245881B2 (ja) * | 1990-02-15 | 2002-01-15 | 味の素株式会社 | 塩基性アミノ酸と酸性アミノ酸の同時発酵法 |
| JP3081901B2 (ja) * | 1991-10-29 | 2000-08-28 | 工業技術院長 | γ−ポリグルタミン酸の製造法 |
| US5773267A (en) | 1992-02-07 | 1998-06-30 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University, A Division Of Yeshiva University | D29 shuttle phasmids and uses thereof |
| JPH0691A (ja) * | 1992-06-17 | 1994-01-11 | Mercian Corp | ピルビン酸の製造方法 |
| EP0635572A3 (en) * | 1993-06-25 | 1995-03-08 | Hoffmann La Roche | Biosynthesis of biotin in bacillus subtilis. |
| EP0730034A1 (en) | 1995-03-03 | 1996-09-04 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Purification of riboflavin |
| DE19547361A1 (de) * | 1995-12-19 | 1997-06-26 | Degussa | Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren durch Fermentation |
| EP1026236A1 (en) * | 1999-02-04 | 2000-08-09 | Dsm N.V. | Auxotrophic strains for secondary metabolite biosynthesis |
| US6656721B1 (en) * | 2000-08-08 | 2003-12-02 | Roche Vitamins, Inc. | Polynucleotide portions of the biotin operon from B. subtilis for use in enhanced fermentation |
-
2000
- 2000-08-08 US US09/633,927 patent/US6656721B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-08-02 AU AU57777/01A patent/AU784733B2/en not_active Ceased
- 2001-08-03 CA CA002353772A patent/CA2353772A1/en not_active Abandoned
- 2001-08-04 AT AT01118952T patent/ATE396270T1/de not_active IP Right Cessation
- 2001-08-04 ES ES01118952T patent/ES2307559T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-08-04 DE DE60134096T patent/DE60134096D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-08-04 EP EP01118952A patent/EP1186664B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-08-07 MX MXPA01007978A patent/MXPA01007978A/es active IP Right Grant
- 2001-08-07 BR BR0103240-2A patent/BR0103240A/pt not_active Application Discontinuation
- 2001-08-07 NO NO20013848A patent/NO326383B1/no not_active IP Right Cessation
- 2001-08-08 JP JP2001240984A patent/JP2002253273A/ja active Pending
- 2001-08-08 TW TW090119316A patent/TWI243206B/zh not_active IP Right Cessation
- 2001-08-08 CN CNB011247495A patent/CN100471958C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2001-08-08 KR KR1020010047647A patent/KR100841890B1/ko not_active IP Right Cessation
-
2003
- 2003-10-08 US US10/681,086 patent/US7695949B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20040063171A1 (en) | 2004-04-01 |
| EP1186664B1 (en) | 2008-05-21 |
| JP2002253273A (ja) | 2002-09-10 |
| DE60134096D1 (de) | 2008-07-03 |
| TWI243206B (en) | 2005-11-11 |
| CN1353192A (zh) | 2002-06-12 |
| US6656721B1 (en) | 2003-12-02 |
| KR100841890B1 (ko) | 2008-06-27 |
| AU5777701A (en) | 2002-02-14 |
| NO326383B1 (no) | 2008-11-24 |
| ATE396270T1 (de) | 2008-06-15 |
| KR20020013428A (ko) | 2002-02-20 |
| NO20013848D0 (no) | 2001-08-07 |
| CA2353772A1 (en) | 2002-02-08 |
| EP1186664A3 (en) | 2002-03-20 |
| MXPA01007978A (es) | 2003-08-20 |
| EP1186664A2 (en) | 2002-03-13 |
| BR0103240A (pt) | 2002-07-23 |
| NO20013848L (no) | 2002-02-11 |
| AU784733B2 (en) | 2006-06-08 |
| CN100471958C (zh) | 2009-03-25 |
| US7695949B2 (en) | 2010-04-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2307559T3 (es) | Proceso para producir un producto de fermentacion. | |
| RU2207376C2 (ru) | Способ получения l-аминокислоты методом ферментации, штамм бактерии escherichia coli - продуцент l-аминокислоты (варианты) | |
| AU712821B2 (en) | Production of tryptophan by the bacterium Escherichia coli | |
| US6303377B1 (en) | Biotin biosynthesis in bacillus subtilis | |
| JP5787089B2 (ja) | リボフラビンの改善された生産 | |
| CN101104865B (zh) | 属于芽孢杆菌属的肌苷生产细菌和生产肌苷的方法 | |
| JP5364376B2 (ja) | 改変型トランスケトラーゼおよびその使用 | |
| CZ288247B6 (en) | DNA fragment, vector a microorganism containing genes for metabolic transformation of butyrobetaine/crotonobetaine-L-carnitine and process for preparing L-carnitine | |
| US20220411837A1 (en) | Recombinant methanotrophic bacteria for indigo biosynthesis and methods thereof | |
| KR102473375B1 (ko) | 재조합 미생물, 그 제조방법 및 보효소 q10의 생산에 있어서 그의 사용 | |
| KR100954052B1 (ko) | Ａｂｃ-트랜스포터를 코딩하는 유전자가 불활성화된코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 5'-이노신산의제조방법 | |
| US8268597B2 (en) | Recombinant microorganism and method for producing L-lysine | |
| JP4582573B2 (ja) | ピルビン酸の製造方法及びｌ−バリンの製造方法 | |
| US20040235120A1 (en) | Method for producing vitamin b12 | |
| KR100576341B1 (ko) | 5'-뉴클레오티다제를 코딩하는 유전자가 불활성화된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 5'-이노신산의 제조방법 | |
| KR20050056668A (ko) | 코리네박테리움의 신규 ｌ-스레오닌 유입유전자 및 상기유전자를 이용한 ｌ-스레오닌 생산균주 개발방법 | |
| KR100937326B1 (ko) | 옥시도리덕테이즈를 코딩하는 유전자가 불활성화된코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 5'-이노신산의제조방법 | |
| CN117004545A (zh) | 生产3-脱氢莽草酸的重组微生物、其构建方法及应用 | |
| JPH11243976A (ja) | 単細胞又は多細胞生物、トレオニンアルドラーゼ遺伝子、該遺伝子を含有する構造体、該遺伝子を含有するベクター、形質転換生物、リボフラビンの製法及び生物、遺伝子もしくはベクターの使用 | |
| WO2004046347A1 (en) | Method for producing riboflavin | |
| WO2007030790A9 (en) | Oxygen-regulated microorganisms | |
| KR19990063278A (ko) | 리보플라빈 제조를 위한 단세포 또는 다세포 유기체 | |
| KR20120033807A (ko) | 박테리아 변이 균주를 이용한 이소루신 생산 |