TWI243206B - Decoupled fermentation process for producing riboflavin and microorganism and polynucleotide sequence used therein - Google Patents
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Description
1243206 A7 B7 五、發明説明（1 ) 本發明係有關於一種製備標的醱酵產物之方法。更特定 言之，本發明係有關於一種利用微生物超量生產標的醱酵 產物之方法，該微生物具有可導致其營養缺陷性生長之突 變，但此突變並不影響其過度生產標的醱酵產物之能力。本 發明亦提供可運用於本方法之宿主細胞及多核甞酸序列。 許多極具市場價値的產品物係藉由醱酵反應來製備。如 核黃素係一種所有細菌、動物及植物皆需要之必須維生素 ，其可由植物及細菌合成，然而，高等動物無法製造核黃 素，必須由其飲食中獲得。 市售核黃素_商品係用作食品及飼料添加物，其係利用如 阿旭拜亞賈西皮、依力摩歇西恩阿旭拜亞 (Eremothecium ashbyii)、氣福拉雷力念缘桿 m (Candida pareri) 等細胞之酿酵反應而製備。（見於如艾因沃司（Ainsworth)， G.C·及蘇司曼（Sussman)，A.S.，The Fungi，Academic Press，New York(1965);希夫納（Heefner)，D.L.，等人，WO 88/09822;希奇 (Hickey), R.J.，Production of Riboflavin by Fermentation, in Industrial Fermentation (恩德寇夫勒（Underkofler)，L.A.及希奇， R.J.編第 157-190 頁，Chemical Publishing Co.，New York (1954) ;及波曼（Perlman)，D.等人，Fermentation Ind. Eng. Chem. 44:1996-2001 (1952)。 催化鳥嘌呤核謀三磷酸鹽（GTP)及五磷核酮糖之生物合 成核黃素所需的酵素係由枯草桿菌之四個基因 、η·Μ、及编碼而成。見於圖1Α。這些基因位於操縱 子内，其基因順序與由該酵素催化之酵素反應的順序不同 -4- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)
琴·‘ 訂
1243206 A7 B7 五、發明説明（2 ) 。如可催化核黃素生物合成第一步驟之GTP環水解酶II係由 操縱子之第三個基因編碼而成。見於圖2。第二個酵 素（即DHB合成酶）之活性亦可由r/M蛋白質編碼而成，其 可催化五磷核酮糖轉化爲四碳單位之DHB。脱胺酶及還原 酶係由操縱子之第一個基因（h6G)編碼而成。及r/ftG基 因產物之雙重功能可促進協調核黃素前趨物流通。核黃素 生物合成之倒數第二個步驟爲由2,4 -二氧四氫蝶淀（Lum)合 成酶所催化，其爲最後一個W6基因之產物。控制此 合成途徑最後一步驟之核黃素合成酶係由操縱子之第二個 基因（r沁5)編碼而成。位於操縱子3’端之基因X (圖1 )的功 能目前仍不明，然而於核黃素合成時並不需其基因產物。 由啓動基因轉錄核黃素操縱子之步驟係由與位於 及間之調節前導區有關的致弱機制來控制。該前 導區中之7?沁0突變可導致核黃素操縱子之去調節表現。去 調節表現亦可見於内含錯義突變rzIC基因之菌株。基 因近來已顯示可編碼#享岸蔚之黃素激酶/ FAD合成酶。見 於麥克（Mack)，Μ 等人，J· , 180:950-55(1998)。去調節 突變減低基因產物黃素激酶活性並導致黃素單核苷酸 (FMN)(核黃素調節系統之受動分子）的細胞内濃度降低。 近來，一種經基因工程處理#草#苈微生物可於短暫的 醱酵週期内製備高產量的核黃素。見於伯金斯（Perkins)， J.B.，美國專利號5,837,528 ("伯金斯，528，，），其全文以引用 的方式併入本文中。該方法結合了傳統基因突變選擇以及 利用基因工程改造核黃素生物合成基因而增進醱酵作用； -5- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1243206 A7 B7 五、發明説明（3 ) 後者係藉由去調節及增加基因表現程度來達成目的。於此 系統中，基因之表現可藉黃素激酶編碼nIC基因之突變 、連接基因至強力、組成性之啓動基因、以及增加m 基因之複製數量而加強。 如在伯金斯’528所揭露之質體pRF69中的基因工程WZ?操縱 子中，整個啓動基因及大部分調節前導區皆遭刪除並 以組成性噬菌體SP01啓動基因取代。見於圖1Β。此外 ，將噬菌體啓動基因插入至及基因之間以進一步增 加相同下游基因之轉錄。最後，於W6基因下游加入含有氯 黴素耐受基因之pRF69。pRF69係經由單一互換標定轉化而 進入宿主微生物RB50之WZ)操縱子中，其中RB50含去調節嘌 呤生物合成之突變且其中包括去調節核黃素生物合成之 ⑽C基因突變。 以pRF69之單一互換轉化RB50後所產生之基因組構造包 含了氣黴素耐受基因，其一端爲野生型他操縱子且另一端 爲pRF69之基因工程η·δ操縱子。當選擇pRF69來轉化細菌以 增加氣黴素耐受性時，來自於該構造内之反覆元素可增加 耐受基因及側翼r/δ操縱子之複製數量。 含多重(n) pRF69修改rz_6操縱子複本之RB50 (即RB50:: [pRF69]n)内的W6基因轉錄的增加係以北方墨點分析 (Northern blot analysis)來確認。與野生型#草#廣不同之處 爲野生型僅聚集非常少量之包含整個他啓動基因的RNA轉 錄本，而RB50r.[pRF69]n可堆積大量僅包含原來啓動基因之 前二個基因之較短轉錄本。r/M上游之第二個尸μ基因工程 -6- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐） A7 B7 1243206 五、發明説明（4 啓動基因可使包含啓動基因之三鍾下游基因的RNA轉錄 本大量堆積。見於伯金斯，j B等人，j仏汶汹·⑽⑽厂
BiotechnoL，22:8-18 (1999) 〇 於含如泰享莽苈RB50::[pRF69]n之核黃素進料批次醱酵反 應器中’由一般酸酵基質（葡萄糖）產生生物量及核黃素係 。葡萄糖灌注至反應器之速率（”葡萄糖供給速率"）對其被 選擇用來分別製備生物量或核黃素相當關键。快速的葡萄 糖供給速率使培養物成長加速而引起過多生物量形成並降 低核黃素產量。然而，葡萄糖供給速率太低時會同時降低 生物量產生並可降低核黃素的生產力。由於低產量、低生 產力、或二者同時發生時皆會增加核黃素之製備成本，因 此需藉小心調節供給商用核黃素醱酵反應器之葡萄糖速率 以達成生物量及核黃素製備之平衡。 鑑於上述缺陷，有需要將標的醱酵產物（如核黃素）之製 備加以最佳化，而同時將生物量之產生程度保持於適合所 使用反應裝置大小和樣式之最佳效率。 、本發明—具體實施例爲-種製備標㈣酵產物之方法。 該方法包含提供-種含重組製備微生物之輯培養基，該 微生物可超量生產撥酵產物並含有可導致其營養缺陷性生 長（突變，其中該微生物之營養缺陷衫會影響微生物製 備醱酵產物之能力。再供給該培養基製備_產物所需之 所有基質1製備標的撥酵產物之基質以及補充營養缺陷 (基質。-種基質中前者應過量供、给以確保最高 種基質中後者（即補充營養缺陷之基質）則限量供给以便 訂
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維持低比例之生物量形成 本發明 物量生成 提供一種 編碼出標 於該方法 微生物標 微生物中 來控制生 醱酵微生 培養基中將來自生 方法。該方法包含 基因工程使包含可 的多核甞酸序列。 取決於無限量供給 普養缺陷基因插入 養缺陷之基質濃度 述方法製備之產生 另一具體實施例爲一種於驗酵 的標的醱酵產物去偶聯製備之 重組製備之微生物，其已經由 的撥酵產物中之生物合成酵素 中’標的酸酵產物之最高產量 的酸酵產物之基質。接下來將 以藉由限制補充酸酵培養基營 物量產生。本發明亦提供藉上 物0 於更進一步之具體實施例中，本發明亦包含一種多核茹 酸，其係選自序列確認編號（SEQ ID NO): i、導入營養缺 陷基因之序列確認编號：丨的同系物或片段、或含插入、 刪除、或取代之序列確認編號·丨的多核芬酸序列，該多核 苷酸保留可導致宿主細胞營養缺陷之能力。 本發明另一具體實施例爲以多核：y：酸序列轉化之宿主細 胞’其中該多核苷酸序列包含序列確認編號（SEQ ID NO): 1、導入營養缺陷基因之序列確認編號：1的同系物或片段 、或含插入、刪除、或取代之序列確認編號：1的多核酸 序列，該多核芬酸保留可導致宿主細胞營養缺陷之能力。 於另一具體實施例中，本發明亦提供一種可製備核黃素 之微生物RB50，其含有基因工程W操縱子pRF69之多重複 製本並經多核茹酸序列序列確認編號：1轉化。 本發明包含一種製備標的醱酵產物之方法。該方法提供 -8- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1243206 A7 B7 五、發明説明（6 ) 一種含重組-製備微生物之醱酵培養基，該微生物可超量 生產醱酵產物。該微生物亦包含可導致微生物營養缺陷型 生長之突變，其中該營養缺陷並不影響微生物製備醱酵產 物之能力。 在此所用之’’重組-製備微生物” 一詞意指任何經重組 DNA技術修改，以適於製備商用標的醱酵產物（如核黃素） 之微生物。如本發明之微生物可包含細菌細胞。微生物可 逸鱼艾歇利希菌（Escherichia)、桿菌、藍細菌、鍵黴菌、反 #我·#崴細胞。較佳地，微生物可選自乂麖#苈、栝享岸 菌、解Μ粉芽胞桿菌（B· amyloliquefaciens)、鮮樣芽胞桿菌 (B. licheniformis)、C·古盧它米康（glutamicum)菌、氣氨建芽 胞桿菌（B. ammoniagene) ° 於本發明中，該微生物係使用重組DNA技術加以修改以 便增加較野生型更高量之標的醱酵產物生產，其細節如前 所述。在此所用之”標的醱酵產物”一詞意指一種由醱酵反 應製備之化合物，如核黃素、泛酸、生物素、硫胺素、葉 酸、維生素B6、及胺基酸。 如當標的醱酵產物爲核黃素時，該重組-製備微生物爲 #草岸當細胞，如稱爲RB50::[pRF69]n之#草##生產微生 物，其中包含可編碼多重（n) r沁操縱子複本（如約5至約20次 複製本）之pRF69，其中該η·6操縱子係經由強力噬菌體SP01 啓動基因（Ρ15)修改以增加轉錄作用。該重組-製備微生物 較野生型微生物可明顯產生更多的核黃素。見於伯金斯 丨528 〇 -9- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X297公釐） 1243206 A7 B7 IT發明説明~~) ~ 本發明中所使用之#享岸#微生杨RB50係根據1989年5 月23日所簽訂的布達佩斯協定（Budapest Treaty)之條件貯存 於 Agricultural Research Culture Collection (NRRL)，Peoria，IL， 其編號爲B 18502。本發明中所使用之質體pRF69係於1990年 6 月 6 日貯存於 American Type Culture Collection (ATCC)， Rockville，MD，其編號爲 ATCC 68338。 於本發明中，該重組-製備微生物含有可導致其營養缺 陷性生長之突變。在此所用之”突變"一詞係指微生物之基 因組序列改變，其可藉任何便利方法（包含如化學及UV致 突變）插入改變；事先應篩選或選擇所需表現型基因，以 單一及雙重交換重組、及其它爲吾人所熟知之重組技術於 生體外建構基能障礙基因以取代微生物基因組中基因之完 整副本。見於山普魯克（Sambrook)等人，Molecular Cloning, A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press ( 1989 年）及哈伍德（Harwood)與卡丁（Cutting)， Molecular Biology Methods For Bacillus, John Wiley and Sons (1990年），第 27-74 頁。 ••營養缺陷型”、”營養缺陷的n及’'營養缺陷"等詞句在此 可互換使用且係指一種以如突變加以修改而成爲需要額外 添加化合物方能生長之微生物，在突變之前該微生物自身 可製備該化合物。因此，”營養缺陷型生長”係指對特定基 質有營養缺陷之微生物於特定醱酵培養基生長之能力。 營養缺陷型生長必需之外來化合物在此稱爲''補充營養 缺陷之基質”或”補充基質"。本發明中補充營養缺陷基質 -10- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X297公釐) 1243206 五、發明説明（8 之實例包含胺基酸、核菩酸 '及維生素。本發明中，微生 物（呂養缺可馬生物素、色胺酸、離胺酸、及，或腺嘌 7微生物亦可經基因工程成爲包含一個以上的營養缺陷 。對本發明而言並不嚴格限定特定之營養缺陷，其條件爲 營養缺陷可將自生物量生產之標的醱酵產物加以去偶聯製 備，且該營養缺陷並不會影響微生物製備標的檢酵產物之 能力。 對使用於酸酵反應器中之某些微生物（如料岸彦），應 提供各種基質做爲碳、t、及氧之來源。該基質應可同時 供應製備標㈣酵產物以及生物f。對營養缺陷型微生物 亦需供給上述之，，補充•，基質。 在此所用之，，最高生產力"一詞意指於特定化學-物理未 數（如pH及溫度）下，當提供過量所有標的撥酵產物（如碳 、氮、及氧等之來源）形成需要或有益之基質時，微生物 所能製備標的撥酵產物之最大量。最高生產力係以：製備 產物（克）/生物量（克）/小時來測量。 在此所用之"最高生長速率詞意指於特定化學-物理 參數（如PH及溫度）下，當超量供應所有生長所需之基質時 ，微生物可達到之最高生長速率。因&，微生物最=長 速率即爲微生物之生物量的相對單位時間増加量。微生物 之最高生長速率及最高生產力可由熟諳此藝者掌握決定， 如可利用連續培養醱酵法。 若製備酸酵產物所需基質之一未能超量供應，該基質將 成爲製備率限制基質，而其:應量將決定標的醱酵 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐） 1243206 A7 B7 五、發明説明（9 備速率（即該方法之生產力）。同樣地，若生物量生長所需 的基質之一未能超量供應，該基質將成爲生長限制基質， 而其供應量將決定其生長率。 若可同時決定生物量生長速率及標的醱酵產物生產力之 基質被限量供給時，則生物量及標的醱酵產物生產即被” 偶聯"。於偶聯方法中，一種基質同時爲生長及生產之限 制基質。在核黃素醱酵系統中，|生物利用葡萄糖做爲生 物量及產物形成所需之主要碳來源。限制葡萄糖可導致，, 偶聯’，方法。增加或減少對醱酵裝置（即對微生物）之葡萄 糖供給速率可同時決定核黃素及生物量生產二者是石白上 或向下調節。 若限量供給一種可決定微生物生長速率之基質（基質q ) ，但供給另一種決定標的醱酵產物生產力之基質（基質2 ) ，則生物量及標的醱酵產物生產即爲”去偶聯，，。於去偶聯 方法中，無限供給基質2可使.導致微生物之最高生產力f 因此，於去偶聯方法（如使用本發明之營養缺陷型微生物） 中，葡萄糖（基質2 )可以無限速率提供給醱酵反應裝置以 達到標的酸酵產物之最高生產力，同時以可限制^物^生 產之速率供給醱酵反應裝置補充營養缺陷（基質丨）之基質 ，如此可預防生物量增至最高生長速率。 存在於如本發明微生物之營養缺陷及爲限制生長而限旦 供給相關補充營養缺陷基質之過程不可影響微生物製備標 的撥酵產物之能力。於本發明中，若限量供給補充營養= 陷之基質會導致標的醱酵產物之最高生產力降低超過
1243206 A7 B7 五、發明説明（1〇 ) ，則判定該營養缺陷會”影響”微生物製備標的醱酵產物之 能力。若具有營養缺陷之生產微生物的最高生產力低於# 營養缺陷之相同微生物最高生產力的50%，則稱該營養缺 陷會"影響”標的醱酵產物之生產力。 於本發明中，微生物之營養缺陷係以含有或缺乏同_補 充營養缺陷基質之兩組適當醱酵培養基中之生物量產 定來確認。見於實例1。在此所用之"生物量生產’’或”生物 量生長"意指特定微生物生長及分裂之能力。於本發明巾 ，生物量生產可以標準微生物學方法測定，如測量總細胞 乾物量重或測量醱酵樣品於介於如550-660毫微米特定波長 之混濁度。見於實例3。或者，可藉由瓊脂培養皿之菌落 形成進行評估微生物生長及分裂之能力（即產生生物量）。 可能的話，可藉標準分子生物學技術，如南方雜交 (Southern hybridization)、PCR·丨（如實例 1 )，或 DNA排序，來 確認存在於微生物之基因組中、可導致營養缺陷之突變。 熟諳此技藝者可隨時運用該技術。見於如山普魯克等人， Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第二版，8-14 章， Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)及奥蘇貝爾 (Ausubel)等人所编之 Current Protrocois in Molecular Biology，15 章 ’ John Wiley and Sons，Inc. (1998)。 如上所述，如本發明之微生物較佳爲生物素營養缺陷型 。生物素或維生素B8爲某些酵素（包含丙酮羧酸化酶及乙 醯輔酶A羧化酶）之輔基所必需。生物素係由庚二酸經過數 個酵素步驟而生物合成。見於圖3。生物素合成基因係簇 _____-13-_；_ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1243206 A7 B7 五、發明説明（” 集於枯早桿菌之單一操敬子上。見於圖4。具生物素營養 缺陷心微生物只要未補充生物素(即補充營養缺陷之 即無法生長。同樣的，具有離胺酸、色胺H㈣Μ 養缺陷之細胞如未於醱酵掉春其由、 鮮^餐基中補无個別營養缺陷基質 ，則無法生長。 於商用撥酵方法中，需限制生物量之生長速率以便如^ 低昴貴撥酵基質之消耗量並確保代謝活性生物量之氧·: 量及產熱低於醱酵反應裝置之氧氣轉移及冷卻能力上 於，，偶聯，，方法中’限制標㈣酵基質的供應以限制生物量 生產會降低微生物製備標的撥酵產物之生產力。於使用如
本發明之營養缺陷型微生物的"去偶聯"方法中，可藉限J 補充營養缺陷基質之供應來限制生物量生產，同時因曰過量 供給形成產物所需之所有基質可獲至微生物以最高生產力 來生產標的醱酵產物。 於本發明中，爲達成自生物量生產中製備去偶聯標的醱 ^產物〈目的’在已修改爲超量表現標的酸酵產物（如核 黃素）之微生物中再插入營養缺陷基因。因此，於本發明 中’當微生物以^高生產力合成才票的撥酵產⑼時即可達成 標的撥酵產物之最高產量。 _ , 據此，將本發明之營養缺陷型微生物置於含足以維持生 物量於特定生長速率之濃度的難營養缺陷^赌酵培 養基中培養。其它製備標的醱酵產物所需之基質皆以不限 制微生物最鬲生產力之濃度供給醱酵培養基。 在醱酵培養基中或供應給醱酵培養基之補充營養缺陷基 L________ - I 今 本紙張尺度適用中@國豕標準(CNS) Μ規格(伽公爱) -14- 土 1243206
貝及其b欲達成標的驗酵產物最高生產力所需基質之特定 ;辰度係取決於所選擇之特定營養缺陷、標的鏺酵產物、所 使用之反應裝置、生產微生物、及其它眾所皆知的醱酵變 數。如於生產核黃素之培養物（含生物素營養缺陷型之生 產微生物）中，添加至醱酵培養基之葡萄糖（即標的醱酵基 質）量需足以超量生產核黃素（即標的醱酵產物）。在此所 用之過度生產"一詞意指微生物將基質作爲碳來源以製備 標的醱酵產物時，其產量高於〇1%(體積/體積），較佳爲 高於1 % (體積/體積），如產量高於4 % (體積/體積）。 於本發明酸-酵培養基中，標的醱酵產物與補充營養缺陷 之基質濃度比例由約i : 10,000,000至約1 : 1〇，較佳由約i :1，000,000至約 1 : 100。 於本發明中，標的撥酵產物可由微生物及/或培養基中 分離。在此所用之”分離”一詞意指將標的醱酵產物純化或 至少邵分純化。標的醱酵產物可藉由本技藝已知方法來純 化。該方法包含如過濾、離心、及/或萃取。標的醱酵產 物可藉由水性或有機溶劑再結晶或應用其它該技藝中已知 之方法（如離子交換、篩除、或疏水交互色層分析）進一步 加以純化。由醱酵肉汁分離及純化核黃素之步驟詳見於庫 普佛（Kupfer) E·，歐洲專利申請EP 0 730 034 A1。 於一較佳具體實施例中製備了可超量生產核黃素之重組 製備微生物。該微生物可進一步修改爲含生物素營養缺陷 以便將生物量產生及核黃素生產加以去偶聯。因此，補充 營養缺陷之基質爲生物素，而醱酵產物之基質爲葡萄糖。 _—__-15-_ 本紙張尺度財g g家標準(CNS) A4規格(⑽χ 297公爱) --- 1243206 A7 B7 五、發明説明（13 ) 如本發明之一種微生物實例爲含基因工程r/6操縱子pRF69 多重複製本之枯草桿菌生產核黃素微生物RB50。見於伯金 斯'528。於該具體實施例中，係將生物素營養缺陷插入含 基因工程rib操縱子pRF69之RB50細胞中，其可將核黃素生 產及生物量產生加以去偶聯。該生物素營養缺陷型核黃素 生產微生物稱爲RB50\[pRF69] Bio·。與限制葡萄糖培養法 相比，當以生物素做爲生長限制基質來進行培養時，該菌 株之特定核黃素生產力可增進約三倍。見於實例3。 本發明亦包含RB50::[pRF69]BicT之衍生物。在此所用之 RB50::[pRF69]Bio-n衍生物’’可爲任何枯草桿菌細胞，條件 爲其中包含基因工程pRF69之操縱子或與pRF69之基因工 程rzl操縱子至少25%相同之多核苷酸序列，較佳爲與 pRF69之基因工程操縱子至少50%相同之多核苷酸序列， 以及具有生物素營養缺陷者，如其它具重組基因工程啓 動基因之桿菌微生物，其中核黃素生產與生物量產生係去 偶聯。於本發明中，多核甞酸序列之相似百分比係使用
National Center of Biotechnology Information(Bethesda，MD, USA)之BLAST程式及伺月艮器來測定。 於本發明中，微生物首先所包含的多核苷酸序列應可编 碼出能製備核黃素之一或多種具酵素活性的多核甞酸，以 及一或多種轉錄因子；後者原本並無關連，但現將其以轉 錄方式與該多核#酸序列連接。 在此所用之”轉錄因子"包含爲精於此技藝者所熟知之增 強器、啓動基因、天然或合成核醣體結合部位、及/或終 -16- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1243206 A7 B7 五、發明説明（14 ) 止轉錄基因終結子。見於伯金斯528。於本發明中，該多 核嘗酸序列可含一種以上如上述之轉錄因子。該多核嘗酸 序列較佳包含至少一種啓動基因。 本發明亦包含一種將醱酵培養基生物量產生及製備標的 醱酵產物加以去偶聯之方法。該方法包含提供一種重組製 備微生物，其已經基因工程而含有可编碼出生物合成標的 醱酵產物所需酵素的多核甞酸序列，而其最高產量係仰賴 於無限量供給標的醱酵產物之基質。再將營養缺陷插入至 微生物中，以限制醱酵培養基内補充營養缺陷基質之濃度 來控制生物量的產生。 爲達成本發明目的，可使用任何便利方法將營養缺陷π 插入”微生物。如可使用傳統致突變技術以及重组生物技 術將營養缺陷插入至微生物中。較佳藉由轉化將可編碼缺 陷型之基因或一組缺陷型基因之多核荅酸序列插入至微生 物中，該多核苷酸序列於微生物内所產生之完整對應物爲 生物量產生所必需之化合物。 在此所用之"轉化”一詞係指將多核甞酸序列插入至微生 物以及藉由單一或雙重互換機轉重組微生物基因組DNA之 多核苷酸序列，從而取代相對應之完整基因或基因組。見 於哈伍德與卡丁，Molecular Biology Methods For Bacillus，
John Wiley and Sons (1990年），第27-74頁。可藉任何爲精於 該技藝人士所熟知之便利方法將多核苷酸序列插入至微生 物中，如將線狀或環狀多核苷酸序列轉化至天然反應潛能 受體細胞或原生質體、普通轉導作用、轉移感染、脂感染 -17- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐)
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!243206 A7 _ B7 五、發明説明（15 ) (lipofection)、電穿透（electroporation)、顆粒撞擊及其類似方 法。見於同上及山普魯克等人，Molecular Cloning A Laboratory Manual (第 2 版)Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989年）。 本發明之多核荅酸序列可於枯草菌素δ/oFDB之基因匣内 包含刪除-插入突變，其細節可見於實例中。較佳地，該 多核苷酸序列爲序列確認編號：1。於本發明中，可以伸 展序列修改序列確認編號：1之1 -及7端，各伸展序列長 度爲數百個驗基對，可以增加序列確認編號：1之轉化效 率。 伸展序列爲隨機序列，其與接受細胞之DNA序列之相似 性應低於80%以預防於意外處發生重組作用。再以該種多 核甞酸序列轉化能超量生產標的醱酵產物之微生物。 含有刪除·插入突變之轉化株（即已成爲營養缺陷者）可 利用標準選擇準則來選定。見於从。如用於轉化微生物之 多核苷酸序列可包含各種選定標記，包含如抗生素耐受性 標記、產色標記等。較佳標記爲新黴素耐受性標記，而選 擇所需之轉化步驟包含確認該微生物可於添加新黴素之醱 酵培養基中生長，並可超量生產標的醱酵產物，如核黃素 :其細節請見實例1。 於本發明另一具體實施例係提供一種多核甞酸序列。枯 草桿菌或一密切相關的菌種（如摩源淤穿虑斧蘑或淨燊f 方έ#窗')經過該多核：y：酸序列轉化成爲生物素營養缺陷型 。較佳地，該多核苷酸序列爲序列確認編號：1或其插入 ______-18-_'_ 本紙張尺度適用中國國家襟準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1243206 A7 __ B7 五、發明説明（16 ) 營養缺陷之同系物。桿菌宿主細胞較佳以序列確認編號： 1、或其插入營養缺陷之同系物轉化，後者須保留可導致 宿主細胞營養缺陷之能力。 於本發明中’若經由BLAST檢測出一多核：y：酸包含70% 以上與序列確認編號：i之部分及以〇5序列相同者，則 該多核苷酸即視爲序列確認編號：1之"插入營養缺陷之同 系物”。 本發明亦包含以多核甞酸序列轉化的宿主細胞，其中該 多核甞酸序列包含序列確認編號：1或序列確認編號：1同 系物’其可導致宿主細胞之營養缺陷，或該多核嘗酸序列 包含一或多種序列確認編號：1之插入、刪除、及/或取代 物’而該序列可保留導致宿主細胞營養缺陷之能力。 宿主細胞可爲任何如本發明可製備標的醱酵產物之微生 物。如宿主細胞可選自艾歇利希菌、桿菌、藍細菌、鏈黴 菌、及棒狀桿菌細胞。微生物較佳係選自乂廣岸彦、於草 桿菌、解澱粉芽胞桿菌、鮮樣芽胞桿菌、c、古盧它米康）菌 、或肩建f應#蔚。該宿主細胞更佳爲栝享岸一細胞，如 含多重基因工程⑽操縱子PRF69複製本之RB50。 本發明之部分重要結果概述於圖中。 : 圖1顯示於享岸蔚野生型核黃素操縱子及如本發明之 pRF69基因工程⑽操縱子。（a)顯示灿ο調節部位及結構基 因，、及rz’6//、與基因X。將上游σ a啓動 基因及推定内部啓動基因r/6p2加以標記。基因X下游之 非rho依賴性轉錄終結子及上游之轉錄致弱子也同樣被 -19 - g張尺度適财s a家標準(CNS) Μ驗(21G χ 297公爱) ------ 1243206 A7 -- —_______B7 五、發明説明（17 ) 描緣出。（B)顯示pRF69基因工程咐操·縱子構造以及其中含 原有組成嗟菌體SP〇i啓動基因p15之dna序列之指定區域。 圖2顯示栝罩#薜核黃素之生物合成路徑。 圖3顯示於享岸廣·生物素之生物合成路徑。 圖4顯示於享岸蘑生物素❶叫之生物合成操縱子。 下列所提出之實例係用以説明本發明方法及組合物。這 些實例僅作爲説明之用且絕非欲限制本發明之範圍。如本 發明可經由各種大規模工業醱酵裝置來實行去偶聯方法、 稀釋速率可有0.3公升/小時至〇 〇〇1公升/小時之變化、可 增加酸酵培養基中各成分之濃度、可增加葡萄糖濃度達 400克/升、亦可於一分批或進料分批醱酵反應裝置中實行 如本發明之去偶聯方法。所有這些變化方式中之培養基成 分（包含生物素）可由熟於該技藝人士來決定及調節。 實例 實例1·建構栝享斧磨營養缺陷型突變種 於下列實例中，插入生物素營養缺陷之多核荅酸序列首 先於大腸样菌中建構。以該多核：y：酸序列轉化天然反應潛 能#享#蘑微生物可產生一種生物素營養缺陷型栝享舁崴 突變種。由該突變種製備之PBS1噬菌體溶菌產物再利用來 經由普通轉導將營養缺陷插入含基因工程⑽操縱子pRF69 之多重複製本之生產性微生物RB50。將標準重組DNA技術 運用於建構多核甞酸序列及祜享岸薜突變種。見於如山普 魯克等人，Molecular Cloning A Laboratory Manual(第 2 版）
Cold Spring Harbor Laboratory Press(l989)及哈伍德與卡丁， _ -20- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐）
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1243206 A7 B7 五、發明説明（19 ) (序列確認编號：4 ) pBESTBstBI-1 (5’-GCGCTTCGAATTCAAAATGGTATGCG-3，）（序 列確認編號：5 ) pNMR3及pNMR4二者皆以BstBI消化，其可移除1019個鹼 基對，包含部分及基因及完整基因。經放大之 新黴素-耐受性基因匣再以扔ί5/純化及消化，並選殖成爲 BstBI-消化 pNMR3及 pNMR4。 再製作下列質體：pNMR5，其中包含以與pUC19中的 轉錄之相同定向將新黴素-耐受性之基因匣插入至6沁F/λδ 基因中、pNMR6，其中包含以與pBluescriptll SK+中的轉 錄之相反定向將新黴素-耐受性之基因匣插入至基 因中、及pNMR7，其中包含以與pUC19中的6b轉錄之栢反 定向將新黴素-耐受性之基因匣插入至基因中。以 Χ6α/將所有這三種質體拉直並轉化進入天然反應潛能枯草 桿菌1012細胞中。於含最終濃度爲5微克/毫升新黴素之 ΤΒΑΒ培養皿中揀選轉化株。約可觀察到250個轉化株，自 其中補綴30個至含有或缺乏〇·1毫克/毫升生物素之史皮仁 氏最小培養基（Spizen’s Minimal Medium，SMM)中。30個菌落 中之23個爲生物素營養缺陷型 > 使用PCR分析6個菌落之融 合連接，其中保存2個菌落（分別使用指定之枯草桿菌NM1 及NM2)以供進一步使用。 以枯草捍菌微生物NM2做爲供體微生物以製備PBS1噬菌 體溶菌產物。該溶菌產物係用於轉導含有修改核黃素操縱 子pRF69之生產核黃素微生物RB50。RB50係指枯草桿菌之 _ - 22 - 本紙張尺度適用中國國家@(CNS) A4規格(210X297公釐) — 1243206 A7 B7 五、發明説明（20 ) 宿主微生物，其含數種突變插入以增進核芸酸及核黃素之 製備。pRF69係指一經由插入強力噬菌體啓動基因而修改 之操縱子，該啓動基因係插入在pRF50之所在處。將 經修改操縱子pRF69放大以提高複製量。微生物RB50及經 修改操縱子pRF69詳述於伯金斯'528。可獲得數種新黴素 -耐受性菌落，其於未補充外源生物素之SMM中無法生長 。藉由PCR及南方雜交法分析其中三種選殖株，可顯示其 中含突變。由這些選殖株中選出一種（稱爲 NM9)並重新命名爲RB50::[pRF69] Bio-。由南方墨點雜交 (Southern blot hybridization)法可顯示出 pRF69之存在。 將RB50\[pRF69] Bio-於補充10微克/毫升氯黴素之高營養 、複合培養基（VY培養基、DSMZ培養基577)中培養至光密 度〇D 660= 1爲止。將1毫升之該肉汁轉移至20毫升、補充 30微克/毫升氯黴素之VY培養基，並於達到0D爲1後再將1 毫升之培養物轉移至20毫升、補充60微克/毫升氣黴素之 VY培養基。使用含80微克/毫升氣黴素之VY培養基重覆相 同步驟。於達到0D爲1之後，於-80°C將該培養基補充15%( 體積/體積）甘油及1毫升整份。逐步增加抗生素濃度可用 於挑選其修改η·ό操縱子pRF69之複製量增加的細菌。見於 伯金斯'528。 實例2 .連續培養醱酵 欲達到並導致將生長及生產加以去偶聯之目的，可如下 詳述使用連續恆化器培養物、利用RB50z[pRF69] Bio_於生 產核黃素時之正面作用。如標準敎科書，見如尼德哈特 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1243206 A7 B7 五、發明説明（21 ) (Neidhardt)等人，Physiology Of The Bacterial Cell，Sinauer Associates，Inc· (1990年），在醱酵裝置運轉中，當連續醱酵 培養細胞之生長速率相當於稀釋速率時即可達到穩定狀態 (恆化器），於稀釋速率運轉。該醱酵裝置之生物量濃度係 與限制補充速率之基質濃度相關。 醱酵係於配備有葉片攪拌器之紐布魯司維克生物反應器 (New Brunswick bio-reactors)生物流 3000 型（Model Bioflow 3000)(總容積3公升）中進行。所使用連續恆化培養器中的 輸入幫浦可控制反應裝置内之流速，而溢流管可控制液體 量。醱酵可變因子設定如下： 液體量：1200毫升 稀釋速率·· 0.15 溫度：37X： pH ： 6.75 通氣·· 1公升/分壓縮空氣 攪;摔速率：l〇〇〇rpm(每分鐘轉數） 培養時各期之溶解氧濃度高於20%空氣飽和度。 用於分批階段及作爲培育培養基之醱酵培養基含下列成 分之設定最終濃度：0.25克/升Na-麩胺酸鹽、1.57克/升 KH2P〇4、1.57克 / 升 K2HP〇4、2.74 克 / 升 Na2HP〇4 X 12 H20、 4.00克/升ΝΗ4α、0.1克/升擰檬酸、6.80克/升（NH4)2S〇4、 22克/升葡萄糖X η2〇、〇·2毫升/升抗泡沫劑（主要含矽）、 14.1毫克/升！^3〇4\7 112〇、10.5毫克/升〇30：12\2 112〇、9.4毫 克 / 升 MnS〇4 X 1 h20、2.7毫克 / 升 CoCl2 X 6 H20、1.0毫克 / 升 __-24- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐）
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1243206 A7 ________ B7 五、發明説明（22 ) (NH4)6HMo7〇24 X 4 H20、0.67毫克 / 升 A1C13 X 6 H20、0.50 毫克 / 升 CuCl2 x 2 H20、6.7克 / 升 MgS04x 7 H20、2.68毫克/升21^04 x 7 H20 〇 將 Na-麩胺酸鹽、κη2Ρ04、Κ2ΗΡ04、Na2HP04 xl2 Η20、 NH4C1、檸檬酸、及（NH4)2S04溶於85%之最終容量中，藉由 添加鹽酸將pH調節至pH 4並高壓消毒該溶液。將葡萄糖溶 於10%之最終容量中並獨自高壓消毒。個別高壓消毒抗泡 沫劑濃縮液。每一批培養基所使用之FeS〇4 x 7 h2〇溶液之 500倍濃縮液皆爲現場製備並經過濾消毒。其它鹽類皆製 備成500倍濃摩並分爲下列.組別來過濾消毒··第1組：CaCl2 X 2 H20 ;第 2 組：MnS04 X 1 H20、CoCl2 X 6 H20、 (NH4)6HMo7〇24 χ 4 jj20、A1C13 x 6 H20、CuCl2 x 2 H2〇 ;第 3 組 :MgS04 χ 7 H20、ZnS04 x 7 H20。於無菌狀態下混合各組無 菌溶液並添加無菌水以達到最終容量。 將40毫升如下製備之種培養物灌輸入醱酵裝置中：融解 1份實例1中的冷凍RB50::[pRF69]Bio-細菌懸浮液並移至補 充60微克/毫升氣黴素之1〇〇毫升νγ培養基内。將該培養基 保溫於37。(：中至達到〇d =1 (通常爲12至15小時後）。 醱酵之分批階段，即醱酵培養基中之葡萄糖被生長中細 菌耗盡之期間，持續約24小時。葡萄糖耗盡時溶解氧氣數 値會斗然升高，此時將醱酵轉換爲連續型式（啓動輸入及 輸出幫浦），稀釋速率爲每小時〇·15。投予至醱酵裝置之撥 酵培養基爲如上述培養基（含20克/升葡萄糖），其中加以補 充1〇微克/升之生物素（實例3之醱酵Α)或3微克/升之生 -25-
1243206 A7 B7 五、發明説明（23 ) 素（實例3之醱酵B )。俟培養達到穩定狀態後，即醱酵裝置 容量已經交換過五次以上後，採取醱酵樣品並加以分析。 實例3.於偶聯及去偶聯方法中之生物量及核黃素生產 由醱酵反應裝置收集1毫升之實例2醱酵樣品锋立即加入 20微升之40% NaOH溶液。於室溫下保溫樣品20秒以溶解樣 品内之核黃素晶體。將*份該懸浮液稀釋並以0.1莫耳之辨 酸鉀緩衝溶液（pH 7.0)加以中和。藉由660毫微.米測定混濁 度來測量懸浮液之生物量。調整樣品稀釋程度使讀數介於 0.05至0.3吸收單位間。 作爲確認之用，以稱重乾細胞質量來測定懸浮液中生物 量含量。將上述獲得之1毫升等份之懸浮液移入至預先稱 重之伊本多夫小管（Eppendorf vials)中並以離心作用（14,000 rpm，5分鐘）收集細菌。以1毫升去離子水沖洗細菌一次並於 80°C眞空乾燥至重量不變。以測重方法測定乾細胞質量。 藉HPLC分析由上述獲得之懸浮液的無細胞上清液以測定 核黃素濃度。可使用配備有雙幫浦、柱狀恆溫器及二極管 陣列探測器之休雷特-沛卡德（Hewlett-Packard) 1100系統。以 不鏽鋼蘇培寇希（Supelcosil) LC-8-DB管柱（150 X 4.6毫米，3 微米顆粒大小）來分餾樣品。A溶-液（4毫莫耳/升之硫酸水溶 液）及B溶劑（曱醇）之梯度洗脱係依據下列時間表來進行：
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時間[分鐘] %A %B 0 94 6 2 94 6 15 50 50 20 50 50 -26- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1243206 A7 B7 五、發明説明（24 ) 管柱溫度設定爲20°C且流速爲1.0毫升/分鐘。記錄280毫 微米UV吸收率，而在約11分鐘（共進行20分鐘）時可測得核 黃素峰値。藉對照樣品與核黃素之標準（Sigma，St. Lous，MO ，USA)積分峰値可計算出核黃素濃度。 描述於實例2之醱酵運作結果見述於表1 (其中之數値代 表連續模式開始後45小時及71小時由3種樣品中所獲得之 平均値）。 表1 醱酵A組 醱酵B組 • .偶聯方法 (10微克/升生物素， 20克/升葡萄糖） 去偶聯方法 (3微克/升生物素， 20克/升葡萄糖） 生物量濃度 克/升 5.87+/-0.19 3.36+/-0.18 核黃素濃度 克/升 0.608 +/- 0.033 0.802+/- 0.044 相對於葡萄糖之生物量產量％ 29.4 +/ 1.0 17.0 +/- 0.9 相對於葡萄糖之核黃素產量 % 3.04 +/-0.17 4.05+/-0.16 生物量生產力 克核黃素/克生物量X小時 0.0154+/- 0.0009 0.0354 +/- 0.0030 於撥酵培養基中含有3微克/-升之生物素及20克/升葡萄 糖之醱酵B組（表1)產生了 3.36克/升的生物量。當增加生 物素至10微克/升、而保持葡萄糖爲20克/升時，生物量產生 可增至5.87克/升（醱酵A組，表1)。進一步增加生物素供 給並不會導致較高生物量產生。因此，於醱酵A組中葡萄 糖（醱酵基質）爲生長限制基質。於醱酵B組中，葡萄糖係 - 27 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）
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1243206 A7
B7 以非生長-P艮制之速率供給。取而代之，生物素（補充基質 )可限制生物里的生長。因此，表丨之醱酵A組及b組分別 代表本文中所定義之偶聯及去偶聯方法。 孩實例結果顯示以生物素做爲生長限制基質並以葡萄糖 做爲醱酵基質之去偶聯方法(醱酵B組），其生物量之生產 ^較偶聯方法（輯A組）明顯增加（3倍）。除此之外，去偶 聯方法之產量(即相對於所消耗之葡萄糖的核黃素產量”匕 偶聯方法高出33%。 本發明經由以上的描述可以明顯發現仍有許多類似之變 化万法。it些變化不可視爲偏離本發明之精神及範圍，且 所有的改變應包含於下列之申請專利範圍内。 -28- A7 B7 I2432Q6
五、發明説明（ 序列表
<110〉F.霍夫曼(Hoffmann)-La Roche AG <120>製備標的醱酵產物之方法 <130> 案件 20606 <140> <141> <150>USSN 09/633,927 <151>2000-08-08 <160> 5 <170> Patentln Ver. 2.1 <210〉 1 <211> 3156 <212> DNA <213>枯草桿菌 <400> 1 60 120 180 240 300 3β0 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 102C 103C 114C 120C 1260 ggatccacga atgaaagaag aggaatattg agcgatagac agcggttcac gccagcttta ggtgtccttt gcaagtatga gatatgaatg gtaacagacg cttgcgaaac ggcgattcgg accttaagca gactttttgc tgtgcggctg ttactttctt gctgaaaaac ccgggtgaaa aaataaaaaa atcctgatac ggttacgagc ccggcgtaca atggcgaaaa gtttgatcga gtttaacgac aactgacaga catccttgcc tcgacggctg atcttgaaaa gagtattcag gctatcatgc gacaaggaac aagctgtcgg tgaaccatgc ctcacgaggc atatcagcat caccgattat tgcagggcaa gccggattcg agcacctgaa atatagaaat cttgaagatt tcgtaacctg tcaaacggtc tgcagcccaa aggcaattcg agcggccctg agaaaaggaa ccgactttct caagctgaat catggatggc cttcgtggtc gaqtgaatac cgcggaagga cagaacattt tttcaacatc gatcagaacc tcctgtagtc gggaatttat aagcttgggc aaggtgtctt aacgtcattt gattcctggt cggtcaatgg tggtcctcaa acagcattgc gtctggcatg ctgttttcga gatgtcattt aaggctgata gaaacacagc acaatcgccc gttgatgatg tttggtgttt ggttttgcgg atctttcaaa attgaagcca agtctgaaga attggcgatg gctcctgcca agcaggtcga tttttgatgg ttatttttat taaacgagcg atggagcgcc acaattattt agcaatttgg aaaagctaga gcggttactt taagtgacca cagttgttta gttatcagcg ctcttgatca cccacgcaac gtcccgacat caggatcagc ccgctattcc gcagggaaaa atatgggtta cccataaaac ttcggccgcc gatcagggaa ttttgaactt tttagttgct gttagacaga ggttccagag agggctcgca gacaggaagc aaagaagatt ggccaatgtc gctcaatcat tcggcatatt ccgttttatc gatcatctca aggagttttg tgttatcggc ggtcttc^tc gccagccagc acgacagctt tgtggtgaaa ggtcctattt aaccgttgcg tgagtttata gttctttctt gaaaggtgcg -29 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐） A7 B7 1243206 五、發明説明（27 ttgaagtgtt ggtatgtatg tgttttaaag tattgaaaac ccttaaaati: ggttgcacag aaaaacccca tctgttaaag ttataagtga ctaaacaaat aactaaatag atgggggttt cttttaatat tatgtgtcct aatagtagca tttattcaga tgaaaaatca agggctttag tggacaagac aaaaagtgga aaagtgagac catgtgctta ggaagacgag ttattaatag ctgaataaga acggtgctcn ccaaatattc ttatttagaa aagcaaatct aaaattatct gaaaagggaa tgagaacagt gaatggacca ataataatga ctagagaaga aagaatgaag attgttcatg aaattaagga acgaatattg gataaatatg gggatgatgt taaggctatt ggtgtttatg gctctcttgg tcgtcagact gatgggccct attcggatat tgagatgatg tgtgtcatgt caacagagga agcagagttc agccatgaat ggacaaccgg tgagtggaag gtggaagtga attttgatag cgaagagatt ctactagatt atgcatctca ggtggaatca gattggccgc ttacacatgg tcaatttttc tctattttgc cgatttatga ttcaggtgga tacttagaga aagtgtatca aactgctaaa tcggtagaag cccaaacgtt ccacgatgcc atttgtgccc ttatcgtaga agagctgttt gaatatgcag gcaaatggcg taatattcgt gtgcaaggac cgacaacatt tctaccatcc ttgactgtac aggtagcaat ggcaggtgcc atgttgattg gtctgcatca tcgcatctgt tatacgacga gcgcttcggt cttaactgaa gcaqttaaqc aatcagatct tccttcaggt tatgaccatc tgtgccagtc cgtaatgtct: ggtcaacttt ccgactctga gaaacttctg gaatcgctag agaatttctg gaatgggatt caggagtgga cagaacgaca cggatatata gtggatgtgt caaaacgcat accattttga attcgaaagc gccgattgag tcttaccgga tggtgaataa ggaaacgctg cttgaaggcg cgaagcgggc gcacgatctg aatatcggca catattgtat cgtggcaagc ggcagaggtc cgtctaacag agaagtggat caggtcgtag atgcggttca ggaaattaaa gagacgtatg gactgaagat ttgtgcatgt cttggactgt tgaagccaga gcaggcgaag cggctcaaag atgcaggagt agaccgctat aatcataatt tgaatacgtc acagagaaac cattcaaaca tcacaacctc acatacatac gatgacagag tcaatacggt tgaaatcgca aaagaatcgg gqctgtctcc gtgttcaggc gccattatcg ggatgaagga gacqaaacag gatgtcattg acatcgccaa aagcttgaag gctcttgacg cggattccat tcctgtgaat tttttgcatg caattgatgg cacgccgtta gaaggcgtca acgaattaaa cccgctgtat tgtttaaaag tgctggcgct gttccgtttt atcaatccat caaaagaaat tcgcatttcc ggaggaagag aggtcaatct ccqcacattg cagccattag ggctttacgc cgcaaactcc atttttgtcg gagactactt aacaactgcc gggcaagagg agacggagga tcataaaatg ctgagtgatt taggctttga agttgaatca gtcgaagaaa tgaaggctag tttaagtgcg aaaagctgaa agaatcaata aaagcaatcg gtatgatgtc gaattc <210> 2 <211> 24 <212〉DNA <213〉人工序列 <220> <223>人工序列描述：引導子序列BioF+1 <400〉 2 gagaggatcc acgaggttac gage 24
<210> 3 <211> 28 <212> DNA <213〉人工序列 ___·30-_ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇χ297公釐） 1320 138C 1440 15CC 1560 162C 1β80 1740 1800 I8 60 192C 193C 20 4 C 21QC 216C 222C 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2830 2940 3000 3060 3120 3156 1243206 A7 B7 五、發明説明（28 <220> ‘ <223〉人工序列描述：引導子序列BioB-1 <400> 3 gcgacgaatt cgacatcata ccgattgc 28 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉人工序列描述：引導子序列pBESTstBI+1 <400> 4 27 gcgcttcgaa gcttgggcag caggtcg <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213>人工序列 <220〉 <223〉人工序列描述：引導子序列pBESTstBI-1 <400> 5 gcgcttcgaa ttcaaaatgg tatgcg 26 -31 - 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐)
Claims (1)
- Α8 Β8 C8 D8 ,090119316號專利申請案 中文申请專利範圍替換本(94年4月） —"― —一 申請專利範圍 1 · 一種用於於醱酵培養基中製備 口 I &甲I備核頁素又去偶聯醱酵方 法，其中該方法包括： ⑷提t重組枯草桿菌微生物，該微生物可過度生產該 核黃素並包括可導致生物素營養缺陷之突變，其中 該微生物之營養缺陷並不會影響微生物製備該核黃 素之能力；且 ⑻提供製備該核黃素所需之無限量基質及補充營養缺 陷所需之有限量基質之培養基。 2·如申請專利範圍第人項之方法，其進一步包括由微生物 及/或醱酵培養基分離該核黃素。 3 ·如申凊專利範圍第i或2項中之方法，其中提供給醱酵 培養基之生物素之濃度係足以維持生物量生長於一特 定生長速率，而提供給醱酵培養基以供製備該核黃素 所需之基質濃度則不限制微生物製備該核黃素之能 力。 4. 如申請專利範圍第3項之方法，其中該核黃素之基質對 生物素之比例為自1 ·· 10,000,000至丨：10。 5. 如申請專利範圍帛142項之方法，其中該微生物包括 一或多個多核苷酸序列複製本，該多核苷酸可編碼一 或多個具製備核黃素酵素活性之多肽，以及一或多個 轉錄因子，其雖非天然相關聯，但與微生物中之多核 苷酸序列轉錄連結。 6 ·如申請專利範圍第5項之方法，其中之轉錄因子包括至 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X297公釐) 1243206 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍少一個啟動基因。 7 ·如申請專利範圍第1或2項之方法，其中用於該核黃素 之基質為葡萄糖。 8.如申請專利範圍第1或2項之方法，其中該微生物為袷 阜#廣·ΪΙΒ50::[ρίΙΡ69] Bio·或其保留過度生產核黃素能力 之衍生物。 9·如申請專利範圍第1或2項之方法，其中該導致營養缺陷 之突變包括將包括刪除-插入突變之多核嘗酸導入微生 物基因組中，以中斷微生物製備生物素之能力。 10·如申請專利範圍第9項之方法，其中該多核甞酸包括 基因卡匣中之刪除-插入突變。 11·如申請專利範圍第9項之方法，其包括以多核：y：酸序列 轉形該微生物，其中該多核.嘗酸序列包括6沁/Γ/χβ刪除-插入突變或序列確認編號：1。 12· —種微生物，其係為枯草桿菌RB5〇::[pRF69] Bi〇·。 13 · —種多核:y：酸序列，其係由序列確認編號：1所表示。 -2- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 裝
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