FI93657C - Mikrobinen biotiinin tuotantosysteemi ja menetelmä biotiinituotannon lisäämiseksi - Google Patents
Mikrobinen biotiinin tuotantosysteemi ja menetelmä biotiinituotannon lisäämiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI93657C FI93657C FI871689A FI871689A FI93657C FI 93657 C FI93657 C FI 93657C FI 871689 A FI871689 A FI 871689A FI 871689 A FI871689 A FI 871689A FI 93657 C FI93657 C FI 93657C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- biotin
- gene
- plasmid
- coli
- bio
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
- C12P17/185—Heterocyclic compounds containing sulfur atoms as ring hetero atoms in the condensed system
- C12P17/186—Heterocyclic compounds containing sulfur atoms as ring hetero atoms in the condensed system containing a 2-oxo-thieno[3,4-d]imidazol nucleus, e.g. Biotin
Landscapes
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
93657
Mikrobinen biotiinin tuotantosysteemi ja menetelmä bio-tiinituotannon lisäämiseksi
Taustaa 5 Tämä keksintö koskee yleisesti systeemejä biotiinin tuottamiseksi mikrobien avulla ja erityisesti systeemejä, joissa vähintään osa biotiinioperonista on läsnä plasmi-dissa isäntäsoluna olevassa puutteellisesti biotiinia säilyttävässä mutantissa.
10 Biotiini, joka tunnetaan myös H-vitamiinina, on to dennäköisesti välttämätön komponentti kaikissa soluissa. Jotkut mikro-organismit, mukaan lukien leipomohiiva, ja kaikki eläimet (paitsi alkueläin Tetrahvmena) ovat kykenemättömiä syntetisoimaan biotiinia tehokkaasti ja niiden 15 täytyy sen vuoksi saada biotiini ympäristöstään selviytyäkseen hengissä.
Huolimatta biotiinin hyödyllisyydestä leipomohiivan kasvun edistämisessä ja ihmisten ja eläinten ravinnon lisäaineena, on sen valmistaminen nykyään käytettävissä ole-20 villa kemiallisilla synteesimenetelmillä hyvin kallista. Lisäksi vaikka juurikasmelassia (joka sisältää 0,015 -0,15 pg biotiinia grammaa kohden) tai muita luonnon bio-tiinilähteitä voidaan käyttää synteettisen biotiinin lisänä, on olemassa tarve löytää muita lähteitä.
25 Johtuen helppoudesta saada käyttöön tietoja määrät tyjen sellaisten mikro-organismien geneettisestä kokoonpanosta, joiden on ilmoitettu sisältävän suhteellisen suuria konsentraatioita biotiinia, on tullut mahdolliseksi suorittaa näille mikro-organismeille geneettisiä manipu-30 laatioita. On esimerkiksi selostettu, että määrättyjä kro-mosomaalisia geenejä, jotka koodittavat biotiinin syntee-sitien entsyymejä, voidaan eristää, lisätä ja sijoittaa uudelleen isäntäsoluina toimiviin Escherichia coli (E. coli) -bakteereihin.
2 » i y -j D «j /
Tarkemmin kuvaten Mukherjee et ai. ovat teoksessa "Plasmids and Transposons", Stuttard et ai., toim., Academic Press, New York (1980), 379 - 386, selostaneet E. coli K-12-kannan biotiinioperonin eristämisen transduktiota 5 suorittavasta bakteriofaagista EcoRl -entsyymillä pilkkomisen avulla. Restriktiopalanen sijoitettiin DNA-plasmi-diin (pMB8), jolla transformoitiin E. coli -isäntäsoluja, jotta saataisiin näihin isäntiin monia "ylimääräisiä" kopioita biotiinioperonigeenejä. Mukherjee et ai. eivät kui-10 tenkaan selosta tai edes ehdota sellaisen isäntäsolun käyttöä, joka on genotyypiltään biotiinia puutteellisesti säilyttävä mutantti. Vaikka selostettiin erittymisen lisääntyneen runsaammaksi kuin biotiiniprototrofilla ("luonnonvaraisella tyypillä"), ei tätä rekombinaation avulla 15 saatua systeemiä ole käytetty suuressa mittakaavassa tapahtuvaan biotiinin kaupalliseen tuottamiseen transformoitujen isäntäsolujen fermentaatiokasvatuksen avulla.
Tiivistelmä keksinnöstä Tämän keksinnön mukainen systeemi biotiinin tuotta-20 miseksi käsittää solun, joka on genotyypiltään biotiinia puutteellisesti säilyttävä mutantti, ja mainitussa solussa olevan, kromosomin ulkopuolisen DNA:n, joka koodittaa vähintään yhden biotiinioperonin geenin tuotteen tai sellaisen funktionaalisen homologin. Keksinnön mukaiselle 25 mikrobiselle tuotantosysteemille on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään.
Tämä keksintö koskee lisäksi menetelmää E. colin, joka on genotyypiltään biotiinia puutteellisesti säilyttävä mutantti, muuttamiseksi E. coliksi, jonka biotiinin 30 tuotanto on lisääntynyt, transformoimalla organismi au-·, tonomisesti replikoitavalla kromosomin ulkopuolisella DNA:11a, joka koodittaa biotiinioperonin geenin tuotteita tai niiden funktionaalisia homologeja. Menetelmälle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 2 esitetään.
35 93657 3
Lyhyt kuvaus piirroksista
Kuvio 1 on biotiinin biosynteesitien kulkukaavio;
Kuvio 2 on kaavamainen kuvaus bioR- ja birA -geenin funktiosta; 5 Kuvio 3 on E. colin kromosomissa olevan bio (A, B, F, C, D) -operonin ja sen vieressä olevan uvrB -lokuksen osittainen restriktiokartta;
Kuvio 4 on kaavamainen kuvaus väliplasmidin 322PstI rakentamisesta; 10 Kuvio 5 on kaavamainen kuvaus bioD-geeni -restrik- tiopalasen aikaansaamisesta;
Kuvio 6 on kaavamainen kuvaus väliplasmidin pBAL4 rakentamisesta;
Kuvio 7 on kaavamainen kuvaus biotiinioperonin si-15 sältävän plasmidin pBP5 rakentamisesta;
Kuvio 8 on kaavamainen kuvaus plasmidien pKA5 ja pKH4 rakentamisesta; ja
Kuvio 9 on kaavamainen kuvaus plasmidin pBFl rakentamisesta.
20 Yksityiskohtainen kuvaus Tässä käytettynä tarkoitetaan termillä "biotiinia puutteellisesti säilyttävän mutantin genotyyppi" birA-gee-nissä olevaa vauriota, josta aiheutuu birA -geeniin sellainen muutos, että siitä on seurauksena birA -geenin 25 tuotteen aktiivisuuden väheneminen, s.o. sellaista mutaatiota birA -lokuksessa, josta on seurauksena heikentynyt kyky adenyloida biotiinia, ja siihen viitataan tästä lähtien ilmauksella birA". Erityisen hyvänä pidetty birA:n vaurioiden luokka käsittää vaurioita, jotka saavat entsyy-30 min aktiivisuuden riippuvaiseksi lämpötilasta, s.o. saavat aikaan lämpötilalle herkän birA -geenin (birATS). Tällaisilla birATS mutanteilla birA -funktio heikkenee systeemin lämpötilan kohotessa.
Keksinnön mukaisesti sopivia isäntäsoluja ovat bio-35 tiinia vaativat kannat, joilla repressorifunktio on puutteellinen (genotyyppi: bio' , bioR').
4 q 7 c c 7 y j 0 o /
Termillä "biotiinioperonin geenin tuotteen funktionaalinen homologi" tarkoitetaan polypeptidiä, jolla on sama funktio, mutta jolla joko voi olla sama aminohappo-sekvenssi tai jonka aminohapposekvenssi voi olla erilainen 5 kuin geenin tuotteella. Tällaiset funktionaaliset homologit ovat esimerkiksi biotiinioperonin geenien alleelimuun-nelmien polypeptidituotteita; näiden polypeptidien analogeja ja kappaleita; ja synteettisiä polypeptidejä, jotka voivat primääriseltä rakenteeltaan (aminohapposekvenssin 10 suhteen) olla erilaisia, mutta joilla voi olla sekundaarisia rakenteita, joiden ansiosta niillä on biotiinioperonin geenin tuotteiden biologisia ja immunologisia aktiivisuuksia (Kaiser et ai., Science, 223, 249 - 255 (1984).
Biotiinin biosynteesin kulkukaavio on esitetty ku-15 viossa 1. Kuusi biotiinin biosynteesiin liittyvää entsyymiä on määritetty kuuluviksi kuuteen geenilokukseen; bioA, bioB, bioC, bioD, bioF ja bioH. On karakterisoitu erityiset reaktiot, joita katalysoivat bioA-, bioB-, bioD- ja bioF -geenin tuotteet. On tunnistettu kofaktorit 20 ja substraatit kutakin näistä reaktioista varten, lukuun ottamatta rikkiatomin luovuttajaa viimeisessä entsymaat-tisessa vaiheessa. Vaikka bioC- ja bioH -geenin tuotteiden funktioita ei ole karakterisoitu johtuen ristiinsyöttö-tutkimusten puutteista (joissa biotiinipuutteiset kannat 25 säilyvät hengissä vain käyttämällä hyväksi biotiinia tai käyttämällä hyväksi biotiinin biosynteesin edeltäjämuoto-ja, joita erittävät niiden kanssa yhdessä kasvatettavat solut), on nämä lokukset tunnistettu välttämättömiksi geneettisen komplementaation avulla.
30 Kuusi geeniä, jotka koodittavat biotiinin syntee- ·, sin entsyymejä, on paikallistettu kahteen alueeseen E.
coli -kromosomissa. Viisi näistä kuudesta geenistä (bioA. bioB. bioC. bioD ja bioF) sisältyy kahteen suuntaan kopioituvaan operoniin, joka on kartoitettu kohtaan 17 mi-35 nuuttia. BioH on paikallistettu kohtaan 74 minuuttia. Bio- 5 q 7 £ ς 7 ?ju O / tiinioperonin geenien ja kahden muun geenifunktion, jotka vaikuttavat biotiinin biosynteesitiehen, bioR:n ja birA:n. sijainnit on annettu taulukossa I.
5 Taulukko I
Sijainti E. colin
Geenilokus kromosomissa Ehdotettu funktio bioA 17 min synteesin entsyymi bioB 17 min synteesin entsyymi 10 bioC 17 min synteesin entsyymi bioD 17 min synteesin entsyymi bioF 17 min synteesin entsyymi bioH 74 min synteesin entsyymi bioR 88 min transkription repressori 15 birA 88 min biotiinin hyväksikäyttö
Biotiinin synteesin kontrolli tapahtuu E. colissa transkriptiotasolla. Sen jälkeen, kun biotiini on syntetisoitu, sen adenyloi birA:ksi nimetyssä lokuksessa sijait-20 sevan geenin tuote, jolloin muodostuu biotinyyli-5fadeny-laatti, kuten on esitetty kuviossa 2. Biotiinirepressori-proteiini, joka on tunnistettu bioR -lokuksen tuotteeksi, voi myös sitoutua biotinyyli-5'-adenylaattiin suurentaen siten 25-kertaiseksi bioR -geenin tuotteen affiniteetin 25 bio- operaattoria kohtaan. Howard et ai., Gene, 35, 321 - 331, (1985), ovat paljastaneet, että birA -funktion ja bioR -funktion suorittaa sama proteiini.
bio-operaattori sijaitsee bioA -rakennegeenin ja bioB -rakennegeenin välissä, kuten on esitetty kuviossa 3. 30 bio -operaattori menee päällekkäin sekä bioA -geenin promoottorin että bioB -geenin promoottorin kanssa. bioR-geenin tuote voi lopettaa transkription sitoutumalla bio-operaattoriin ja estämällä RNA-polymeraasia pääsemästä näihin kahteen eri suuntaiseen promoottoriin.
93657 6
Biotinyyli-5'-adenylaatti on myös substraatti birA-geenin tuotteen kolmanneksi funktioksi uskotulle biotii-nin holoentsyymi-syntetaasille. Biotiinin holoentsyymi-syntetaasi siirtää biotiinin asetyyli-CoA-karboksylaa-5 sille. Asetyyli-CoA-karboksylaasi katalysoi kriittistä vaihetta rasvahappojen synteesissä, joka on elinkykyisyy-delle välttämätön. Tämä merkitsee, että birA -aktiivisuuden täydellinen eliminointi fermentaation alkuunpanon vaiheessa olisi kuolettavaa. Sen vuoksi on välttämätöntä, 10 että fermentaatiota aloitettaessa on läsnä riittävästi birA -aktiivisuutta ylläpitämään solujen kasvua. Tällaisen birA -aktiivisuuden voi alan normaalin ammattitaidon omaava työskentelijä helposti todeta. Pidetään parhaimpana, että kun fermentaatio on suoritettu loppuun, birA -aktii-15 visuus on huomattavasti vähentynyt ja kaikkein mieluimmin eliminoitunut. Käyttämällä birATS -geeniä on mahdollista säädellä birA -funktiota kontrolloimalla fermentaatiosys-teemin lämpötilaa. Siis kun systeemin lämpötilaa nostetaan, solun birA -funktio vähenee.
20 Geenilokukselle, joka sijaitsee kartassa bioD -lo- kuksen vieressä, on annettu nimi uvrB. uvrB -geenillä ei ole tehtävää biotiinifysiologiassa, vaan sen toiminta suojaa jollakin tavoin E. coli -soluja ultraviolettisäteilyltä, kuten ovat selostaneet Sancar et ai., Cell, 28, 25 523 - 530 (1982). uvrB -lokuksesta kopioituu kolme RNA- molekyyliä, joista yksi voi vaikuttaa RNA-polymeraasiin A. Siten jos uvrB -geeni moninkertaistuisi, tämä keskinäinen vaikutus voisi olla kuolettava E. coli -solulle. Sen vuoksi pitäisi uvrB -funktiot mieluimmin eliminoida, ennen 30 kuin suurennetaan sellaisen plasmidin kopioiden lukumää-• rää, joka sisältää DNA-palasen biotiinioperonin sisältä vältä E. colin kromosomin alueelta.
Sen lisäksi, että käytetään birATS -geeniä, pidetään parhaimpana käyttää suuren kopioiden lukumäärän omaa-35 vaa plasmidia ja kaikkein mieluimmin plasmidia, jolla 7 C- 7 C u 7 y j 0 j / esiintyy kohtalainen kopioiden lukumäärän suureneminen (40:stä 200:aan) lämpötilaindusoinnin vaikutuksesta. Sellaisia plasmideja on kuvattu EP-patenttihakemuksessa nro 136 490 ja niitä tarkoitetaan tästä lähtien lämpötilaher-5 kiliä plasmideilla. Siten tällaisia lämpötilaherkkiä plasmideja käytettäessä on mahdollista reaktion lämpötilaa kohottamalla lisätä kohtuullisesti kopioiden lukumäärää ja geeniannosta säilyttäen solujen elinvoimaisuus ja vähentäen birA -funktiota, jolloin lopputuloksena on systeemi, 10 joka kykenee tuottamaan hämmästyttävän suuria saantoja biotiinia. Seuraavien esimerkkien tarkoituksena on valaista lisää tämän keksinnön suoritusmuotoja. Vaikka esimerkeissä on käytetty Barkerin et ai., J. Bacteriol., 143, 789 - 800 (1980) ja Campbellin et ai., Proc. Natl. Acad. 15 Sei. (USA), 69, 676 - 680 (1972), birA' -kantoja, voidaan myös käyttää muita biotiinia puutteellisesti säilyttäviä kantoja, kuten esimerkiksi E. coli -kantaa P48, joka on selostettu julkaisussa Pai, J. Bacteriol. 112, 1280 - 1287 (1972).
20 Esimerkki 1
Kuten on esitetty kuviossa 4, ensimmäistä plasmi-dia, jolle on annettu nimi pLC2523 (tallennettu 23. elokuuta 1985 tallennusnumerolla A.T.C.C. 53237 kokoelmaan the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn ; 25 Drive, Rockville, Maryland) ja jonka tiedetään sisältävän biotiinioperonin (katso esim. Sancar et ai., J. Mol.
Biol., 148, 63 - 76, (1981), ja toista plasmidia, jolle on annettu nimi pBR322 (ATCC nro 37017) pilkottiin PstI:llä ja suoritettiin yhdistäminen T4-DNA-ligaasin avulla. Seos 30 transformoitiin sitten Hanahanin, J. Mol. Biol., 166, 557-580 (1983), menetelmän mukaan biotiiniauksotrofisen kannan SA291 (bio' , bioR* , birA*) (tallennettu 23. elokuuta 1985 kokoelmaan the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, tallennusnumerolla 35 A.T.C.C. 53236) bakteerisoluihin. Pesäkkeitä selektoitiin >3657 8 tetrasykliiniä (12 mg/litra) sisältävillä L-agar-levyillä, joilla kuolivat kaikki ne solut, jotka eivät sisältäneet pBR322:n tetrasykliiniresistenssipalasen omaavia plasmide-ja. Selektoiduista pesäkkeistä seulottiin esiin ampisil-5 liiniherkkyyden omaavat, joka herkkyys osoitti, että
PstI:llä pilkkomalla saatu pLC2523:n palanen oli sijoittunut pBR322:n ampisilliiniresistenssipalasen PstI -kohtaan tehden sen kykenemättömäksi aiheuttamaan resistenssiä.
Tetrasykliiniresistenssin aiheuttavien plasmidien 10 restriktiopalasia eroteltiin geelielektroforeesin avulla ja tutkittiin, esiintyikö palasia, joiden pituudet vastasivat biotiinioperonin oletettuja pituuksia. Tällä tavoin saatiin määritettyä, että plasmidi, jolle oli annettu nimitys 322PST1, sisälsi biotiinioperonin liittyneenä tetra-15 sykliiniresistenssi-merkkialueeseen. Todettiin kuitenkin, ettei tämän plasmidin bioD -geeni ollut ehyt, sillä se ei komplementoitunut biotiiniauksotrofista E. coli -kantaa SA291 ilman biotiinia kasvatettaessa.
Kuten kuviossa 5 on esitetty, niin jotta saataisiin 20 loput bioD -geenistä, pilkottiin pLC2523:a Ncol:llä. jolloin saatiin suurempi palanen ja pienempi palanen (pituudeltaan 4,4 kiloemästä), jotka erotettiin geelielektroforeesin avulla. Pienempi palanen uutettiin geelistä ja pienemmän palasen kumpaakin päätä pilkottiin eksonukleaasilla 25 BAL31.
Pilkottaessa BAL31;llä liuotettiin 30 pg restrik-tiopalasta 450 pl:aan BAL31 -nukleaasipuskuriliuosta, joka sisälsi 0,25 mg/ml naudan seerumin albumiinia. 200 pl:n osaa käsiteltiin määrällä 2 yksikköä/μΐ BAL31:tä 30 30 °C:ssa. Otettiin näytteitä ja uutettiin ne fenolilla ajankohtina 2,5 min, 5,5 min ja 10 min. Eetterillä uutta-mistä ja etanolilla saostamisen jälkeen analysoitiin osa kunkin ajankohdan näytteestä elektroforeesin avulla 0,5 % (paino/tilavuus) agaroosigeelissä. Kolmen ajankohdan näyt-35 teet yhdistettiin. Näin saatuja lyhentyneitä palasia pii- 93657 9 kottiin lisäksi Bqlll:11a ja PstI:llä. Johtuen kahden Bglll -kohdan ja yhden PstI -kohdan läsnäolosta pLC2523:n Ncol -palasessa, odotettiin neljän tyyppisiä palasia. Yhden näistä neljästä palastyypistä odotettiin sisältävän 5 loput bioD -geenistä ja omaavan sekä tylpän, BAL31;llä katkaistun pään että tarttuvan, PstI:llä katkaisemalla saadun pään.
Plasmidia pBR329 [jonka täydellisen nukleotidisek-venssin ovat julkaisseet Covarrubias et ai., Gene, 17, 79 10 (1982), joka julkaisu liitetään tähän viitteenä] pilkot tiin sekä PvuII:11a (joka katkaisee pBR329:n kloramfeniko-liresistenssikappaleen alueella aikaansaaden tylpän pään) että PstI:llä (joka katkaisee pBR329:n ampisilliiniresis-tenssikappaleessa olevasta kohdasta), jolloin saatiin kak-15 si palasta, jotka erotettiin geelielektroforeesin avulla. Suurempi palasista (joka sisälsi tetrasykliiniresistenssi-kappaleen ja replikaation aloituskohdan) sekoitettiin niiden neljän kappaletyypin kanssa, jotka oli tuotettu yllä kuvatulla tavalla pilkkomalla 4,4 kiloemäksen Ncol-palasta 20 Bglll:11a ja PstI:llä. T4-DNA-ligaasin läsnä ollessa.
Kuten on esitetty kuviossa 6, oli ainoastaan loput bioD-geenistä sisältävillä palasilla tylpän pään ja PstI:llä katkaistun pään yhdistelmä, joka vaadittiin yhdistymiseen suuremman pBR329:stä peräisin olevan PvuII/PstI -palasen 25 kanssa rengasmaiseksi plasmidiksi, jolle on annettu nimi pBAL4.
Kannan SA291 bakteereja transformoitiin tuotteilla, jotka saatiin ligoinnista pBR329:n suuremman palasen kanssa. Selektoitiin esiin tetrasykliiniresistenssin omaavia 30 pesäkkeitä, seulottiin esiin ampisilliiniherkkyyden omaavia ja seulottiin esiin kloramfenikoliherkkyyden omaavia. Eri plasmideissa olevien lisättyjen pätkien pituudet määritettiin restriktioendonukleaasianalyysin avulla.
Kuten kuviossa 7 on esitetty, pilkottiin plasmideja 35 322PstI ja pBAL4 erikseen PstI:llä. Näiden pilkkomisten * 93657 10 tulokset yhdistettiin ligointireaktiossa käyttäen T4-DNA-ligaasia. Saatua seosta käytettiin kannan SA291 solujen transformointiin. Selektoitiin esiin ne pesäkkeet, joilla oli yhdistelmänä kyky kasvaa, kun läsnä ei ollut biotii-5 nia, ja kyky kasvaa, kun läsnä oli 12 mg/ml tetrasykliiniä.
Täydellisen bio-operonin läsnäolo varmistettiin uudelleentransformoimalla plasmiditon SA291 ja suorittamalla restriktioendonukleaasilla pilkkomisanalyysi. Eräs 10 muodostunut plasmidi, jolle on annettu nimi pBP5, sisälsi kaikki biotiinioperonin geenit: geenit bioA, bioB. bioF, bioC ja 322PstI:stä peräisin olevan PstI -kohdasta vastavirtaan sijaitsevan osan bioD -geenistä ja pBAL4:stä peräisin olevan, myötävirtaan PstI -kohdasta sijaitsevan 15 osan bioD -geenistä.
Seuraavaksi pilkottiin kopioiden lukumäärän suhteen lämpötilaherkkää plasmidia pCFM 526 EcoRI:llä ja yhdistettiin uudelleen ligaasin avulla, jolloin saatiin pCFM 526ΔΕ4, josta puuttui pCFM 526:n sisältämä PL -promoottori.
20 Plasmidi pCFM526 oli rakennettu, kuten on kuvattu julkaisussa Morris, julkaistu EP-patenttihakemus nro 136 490, plasmidista pCFM414 (ATCC nro 40 076).
Kuten on esitetty kuviossa 8, pilkottiin plasmidia pCFM526AE4 ja plasmidia pBP5 erikseen Hindlll:11a. Pala-25 set ligoitiin ja käytettiin SA291:n transformointiin. Selektoitiin esiin ampisilliiniresistenssin omaavat ja bio-tiinin poissa ollessa kasvamaan kykenevät pesäkkeet. Eristettiin plasmidi, jolle on annettu nimi pKA5. Tämä plasmidi sisälsi bio-operonin viisi geeniä liittyneenä lämpöti-30 lan vaikutuksesta indusoituvaan replikaation aloituskohtaan.
Esimerkki 2
Kuten on edelleen esitetty kuviossa 8, rakennettiin myös toinen plasmidi vastaavalla tavalla kuin on suoritet-35 tu esimerkissä 1 kuvattu pKA5:n rakentaminen, mutta korvaamalla pCFM526AE4 plasmidilla, jolle on annettu nimi n > -5 ό 5 7 pCFM1036NS ja joka sisältää kanamysiiniresistenssikappa-leen. Selektoitiin sen vuoksi esiin kanamysiiniresistens-sin omaavat pesäkkeet ampisilliiniresistenssin omaavien asemesta, jotta saataisiin plasmidin pKH4 sisältäviä solu-5 ja.
Esimerkki 3 pBP5:stä peräisin olevaa Hindlll -palasta käsiteltiin BAL31:llä ja seos ligoitiin Hpal:llä katkottuun pCFM526 E4:ään. Selektoitiin esiin pesäkkeitä, jotka tuot-10 tivat biotiinia, omasivat ampisilliiniresistenssin ja tet rasykli iniherkkyyden. Tästä selektiosta saatiin kolme plasmidia, pBA2, pBA4 ja pBA6.
Esimerkki 4
Kuten on esitetty kuviossa 9, katkottiin plasmidit 15 pBP5 ja pCFM526 Ncol:llä ja Hindlll:11a. Nämä pilkotut valmisteet ligoimalla saatu tuote transformoitiin E. coli-kantaan AM7, joka sisälsi plasmidin pMWl (A.T.C.C. nro 39933), jossa plasmidissa oli lämpötilaherkän repressorin Cl857 geeni. Tässä rakennelmassa, jolle on annettu nimi 20 pBFl, bioB -geeni on PL -promoottorin säädön alaisena. Sen vuoksi tämä rakennelma on hyödyllinen muutettaessa destio-biotiinia biotiiniksi bioB -geenin tuotteen, biotiinisyn-tetaasin, avulla.
Esimerkki 5 25 Plasmidia pLC2523 pilkottiin Hindlll:11a ja
Ncol:llä. Plasmidia pCFM526 katkottiin samoin. Nämä kaksi pilkottua valmistetta ligoimalla saatu tuote, jolle on annettu nimi pAHN203, transformoitiin sellaisen bakteerikannan soluihin, joka sisälsi bakteriofaagin A lämpötila-30 herkän repressorin (CI 57). Plasmidi pCFM526 sisältää A-bakteriofaagin PL -promoottorin. Geeniä tai geenejä, jotka on lisätty tästä lokuksesta myötävirtaan, kontrolloi tämä promoottori. Promoottorin aktiivisuutta säätelee represso-ri CI857. Sitten kun kohotetaan lämpötilaa, repressorifunk-35 tio eliminoituu, promoottori aktivoituu ja halutut geenin 12 >3057 » tuotteet ilmenevät. Katso esim. Morris, supra. pAHN203:ssa bioA -geeni on PL:n kontrollin alaisena. Plasmidi pAHN203 on yhdistetty pBFl:n kanssa, jotta saataisiin plasmidi, joka tuottaa biotiinia PL:n kontrolloimana.
5 Esimerkeissä käytettiin seuraavia puskureita. Suu ren suolapitoisuuden omaava puskuriliuos, jonka muodostivat: 75 mM NaCl; 50 mM Tris-HCl, pH 7,6; 10 mM MgCl2; ja 5 mM ditiotreitoli. Keskisuuren suolapitoisuuden omaava puskuriliuos, jonka muodostivat: 37,5 mM NaCl; 30 mM Tris-10 HC1, pH 7,6; 10 mM MgCl2; ja 5 mM ditiotreitoli. Alhaisen suolapitoisuuden omaava puskuriliuos, jonka muodostivat:
10 mM Tris-HCl, pH 7,6; 10 mM MgCl2; 20 mM KC1, ja 5 mM ditiotreitoli. Ligaasipuskuri, jonka muodostivat: 50 mM
Hepes, pH 7,5; 10 mM MgCl2; 5 mM ditiotreitoli; ja 0,4 mM 15 adenosiinitrifosfaatti. Polynukleotidikinaasipuskuri, jonka muodostivat: 50 mM Tris-HCl, pH 7,6; 10 mM MgCl2; 1 mM spermidiini; 5 mM ditiotreitoli; ja 0,1 mM etyleenidiamii-nitetraetikkahappo (EDTA). BAL31 -nukleaasipuskuri, jonka muodostivat 12 mM CaCl2; 12 mM MgCl2; 200 mM NaCl; 20 mM 20 Tris-HCl, pH, 8,0; ja 1 mM EDTA.
Restriktioentsyymejä EcoRI ja Ncol käytettiin suuren suolapitoisuuden omaavassa puskuriliuoksessa ja ne oli hankittu toiminimeltä New England Biolabs, Beverly, Massachusetts. Restriktioentsyymejä Bglll, BamHI. HindiII ja 25 PstI käytettiin keskisuuren suolapitoisuuden omaavassa puskuriliuoksessa ja ne oli hankittu toiminimeltä New England Biolabs, Beverly, Massachusetts. Restriktioentsyymiä Hpal käytettiin alhaisen suolapitoisuuden omaavassa puskuriliuoksessa. DNA-ligaasia käytettiin ligaasipuskurissa ja 30 se oli hankittu toiminimeltä New England Biolabs, Beverly, Massachusetts. Nukleaasia BAL31 käytettiin BAL31 -nukleaa-sipuskurissa ja se oli hankittu toiminimeltä Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Maryland. Naudan seerumin albumiini oli myös hankittu toiminimeltä Bethesda Re-35 search Laboratories.
13 ^ "7 ''ΓΗ y · j do/
Ampisilliini, kanamysiinisulfaatti, kloramfenikoli ja tetrasykliini oli hankittu toiminimeltä Sigma Chemical Company (Sigma), St. Louis, Missouri. Destiobiotiini oli myös hankittu toiminimeltä Sigma Chemical Company. Biotii-5 ni oli hankittu joko Sigmalta tai toiminimeltä J. T. Baker Chemical Company, Phillipsburg, New Jersey. Kannalla BM4062, joka on tallennettu (23. elokuuta, 1985) kokoelmaan the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland numerolla A.T.C.C. 53238, oli 10 vaurioita bioR -funktiossa ja bioA -funktiossa. birA -mu-tantit olivat lämpötilaherkkiä siten, että ne olivat elinkykyisiä alhaisissa lämpötiloissa (n. 28°C), mutta kykenemättömiä kasvamaan korkeissa lämpötiloissa (n. 43°C). Riippuen kysymyksessä olevasta erityisestä mutantista voi-15 tiin korkean lämpötilan kuolettava vaikutus kumota lisäämällä ulkoa saatavaa biotiinia. Muista esimerkeissä käytetyistä plasmideista ja kannoista on yhteenveto taulukossa II. Lukuunottamatta SA291:tä on kaikki taulukossa II luetellut birA' -kannat esitetty julkaisussa Barker et ai., 20 J. Bacteriol., 143, 789 - 800 (1980) tai julkaisussa Campbell et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 69, 676 - 680 (1972), joissa ne kaikki on kuvattu biotiinia vaativiksi kannoiksi. Kanta SA291 on selostettu julkaisussa Cleary et ai., J. Bacteriol., 112, 830 - 839 (1972). Taulukossa II • 25 tulisi myös huomata, että BioRp tarkoittaa genotyyppiä, joka aikaansaa "osittain puutteellisen" BioR -geenin tuotteen.
Seuraavia analyysejä käytettiin biotiinin konsent-raation määrittämiseen seuraavien esimerkkien näytteistä. 30 Mikrobiologinen määritys
Biotiinikonsentraatio määritettiin "ristiin-syöttä-mällä" SA291 -soluja nimetyn kannan tuottamalla biotiinil-la. Aluksi viljeltiin SA291:tä yli yön GMH-liemessä (9 g/litra vitamiinimäärityksen kasaminohappoja (Difco, 35 Detroit, Michigan); 4 g/litra glukoosia; 20 pg/litra 14 C: -J 0 vj / 1-histidiiniä; 40 yg/litra tiamiinia; 1 mM MgS04; 6 g/litra Na2HP04; 3 g/litra KH2P04; 0,5 g/litra NaCl; ja 1 g/litra NH4C1), johon oli lisätty 300 pM d-biotiinia, (tilavuus 50 ml), 37 °C:ssa. Yli yön kasvatettu viljelmä laimennettiin 5 400-kertaisesti GMH-liemellä. 2 ml:n näytteitä laimennetusta viljelmästä siirrettiin koeputkiin. Vaihtelevia konsentraatioita analysoitavaa näytettä lisättiin putkiin. Määritys standardisoitiin lisäämällä seuraavat konsentraa-tiot d-biotiinia (Sigma Chemical Company, St. Louis, Mis-10 souri) kuuteen yksittäiseen putkeen: 30 pM, 100 pM, 300 pM, 1000 pM, 3000 pM lisättyä d-biotiinia. Kaikkia putkia viljeltiin yli yön 37 °C:ssa. Määritettiin saatujen viljelmien optinen tiheys ja tuntemattomien pitoisuus määritettiin vertaamalla standardeihin.
15 Spektrofotometrinen määritys
Biotiinikonsentraatio määritettiin biotiinin spekt-rofotometrisen määrityksen avulla, joka on peräisin McCormickilta et ai., Analytical Biochemistry, 34, 226 -236 (1970). Tarkemmin esittäen, 100 mikrolitraa näytettä 20 siirrettiin koeputkeen, johon lisättiin 900 mikrolitraa vettä. Lisättiin väkevää H2S04 (5 mikrolitraa), jotta saataisiin liuoksen pH alennettua vähemmäksi kuin 2. Liuokseen lisättiin 1 ml n-butanolia ja saatua liuosta sekoitettiin vortex-sekoittimen avulla yhden minuutin ajan ja 25 sentrifugoitiin sitten yhden minuutin ajan nopeudella 3200 kierrosta minuutissa. Liuoksen ylempi, butanolifaasi siirrettiin sitten 1,5 ml:n Eppendorf-putkeen. Liuotin haihdutettiin kuivaksi ennen kuin lisättiin 100 mikrolitraa 2 % (tilavuus/tilavuus) rikkihappoa ja 100 mikrolitraa 0,2 % 30 (paino/tilavuus) 4-dimetyyliaminokanelialdehydiä. Saatua liuosta sekoitettiin vortex-sekoittajalla ja sen annettiin sitten seistä häiritsemättä 5-10 minuutin ajan ennen kuin lisättiin 800 μΐ etanolia. Määritettiin liuoksen ab-sorbanssi (A) aallonpituudella 532 nm Gilford Response-35 spektrofotometrin avulla. Absorbanssin avulla saatiin bio- 93657 15 tiinikonsentraatio (C) mooleina/litra 1 cm:n kulkutien pituudelle yhtälöstä.
C = (5,7 x 10'5)A 5
Esimerkki 5
Esimerkeissä 6 ja 7 käytetyt eri viljelmät saatiin aikaan transformoimalla sopiva isäntäkanta plasmidilla, joka oli saatu esimerkistä 1 tai 2, Hanahanin, supra, 10 kuvaamien menetelmien mukaan. Käytetyt isäntäkannat ja plasmidit on lueteltu taulukossa II.
Esimerkki 6
Pullomenetelmä
Pulloon, joka sisälsi 30 ml GMH-lientä, siirros-15 tettiin tilavuus taulukossa II lueteltua viljelmää. Saatuja viljelmiä inkuboitiin ravistellen 37 eC:ssa. Ajankohtina 0 tuntia, 6 tuntia, 21 tuntia, 30 tuntia ja 45 tuntia poistettiin osa ja steriloitiin suodattamalla. (Ajankohtana 0 tuntia poistettiin 2,5 ml:n tilavuus, kun taas muina 20 ajankohtina poistettiin 1 ml:n näytteet). Steriloidut näytteet analysoitiin aikaisemmin kuvatun mikrobiologisen määrityksen mukaan ja tulokset (kokeet nro 1 - 7) on esitetty taulukossa II.
Esimerkki 7 25 Fermentorimenetelmä
Sopivaa plasmideja sisältävää isäntää kasvatettiin yli yön GMH-liemessä. 10 ml:n näyte viljelmää lisättiin 1000 ml:aan GMH-lientä, johon oli lisätty 20 ml 1 % ala-niinia, 20 ml 1 % metioniinia, 20 ml 0,7 % kysteiiniä ja 30 sopivaa antibioottia (käytettiin lopullista konsentraatio-ta 50 mg/litra ampisilliinia, kun oli kysymyksessä plasmi-di pKA5, ja 25 mg/litra kanamysiinisulfaattia käytettiin, kun oli kysymyksessä plasmidi pKH4). Fermentaatiokasvatus suoritettiin New Brunswick Bio-Flo -fermentorissa käyttäen 35 seuraavia erikoispiirteitä: 1) jatkuvaa sekoittamista no- 93657 16 peudella 600 kierrosta minuutissa; 2) ilman pirskottamista; 3) pH;n säätämistä välille 6,8 - 7,2 lisäämällä automaattisesti väkevää ammoniumhydroksidia; 4) lämpötilan kontrollointia ja 5) hidasta syöttöä fermentaation aikana.
5 Liuennutta happea ja hiilidioksidin kehitystä ei tarkkailtu.
Syötetty ravinto sisälsi: 12 % glukoosia; 0,6 % vitamiinimäärityksen kasaminohappoja; 35 μΜ magnesiumsulfaattia, 0,2 % alaniinia, 0,2 % metioniinia, 0,12 % kyste-10 iiniä, 7 μΜ natriummolybdaattia ja puolet vahvuudesta M9-vähimmäissuoloja. Syöttö aloitettiin kahdeksan tuntia siirrostamisen jälkeen jatkuvalla nopeudella 14 ml/tunti. Lämpötila oli siirrostamisen hetkellä 30 °C. Kun viljelmän optinen tiheys saavutti suurin piirtein arvon 10, mitattu-15 na 600 nm tn aallonpituudella, lämpötila nostettiin vähitellen lisäten 40 eC:een. Taulukossa II ilmoitetut bio-tiinikonsentraatiot määritettiin 24 tuntia siirrostamisen jälkeen käyttäen joko mikrobiologista määritystä (kokeet nro 8, 9 ja 10) tai spektrofotometristä määritystä (kokeet 20 nro 10 ja 12).
17 >0057 J j \ \ \ O' o' o> e ~ s---e e m ~ jc j j j in m - —- j —»
\ \ \ \ ► ► N J \ J J
0'0^»0'0'0'<-t«H I \ O' \ \ n a. O J a a. a I | in O' E O' O'
H O \ ι/Ί in *- E EE
•Ρ o .-/ σ' o in in - ·- r-t o Q in a n cn r- o o o m <n o
HR — I _ — _ (N —- (M
c i o X — — —
Sc xxmxxxxxa x
-HO) CCCNCCCaa X a X X
-P CO I O a a a Q C ooooooiovof^ in g oomoooi I lomoo w ^ ΡΜθ^-ΐΡ^ι-ifnrMrMiaaorHinao
*H
"2 -Η ·Η Ή -Η Ή -h :m y y y y y o e q q q q q
(O+Jpl +J U 4J +3-P
l! §+! oo oooooSSSSS
ι-t fc Ci r—| rH rHrHi—I rH rH £ C £ £ £ P H C »“H i“I rHi—ΙγΗγΗι-ΗμΗΜΗΗ > δω ρ o ρρρρραιωωαιω Π} pl|E & P. 0(15(1(51¾¾¾¾¾¾
S -H
ω ä
>1 S
3 sf c 3 § 5 g O' + + ** + + *· + + +..* ί ο jg oo ooo oi oi o oi o o o *3 *5 ·'i Ή ·#* ·Η ‘^j ·** I Ή I ·** '«Η Ή Λ WO Δ Δ Δ jD Δ ΔΙ ΔΙ Δ ΔΙ Δ Δ Δ < Ή
:c0 C
>Ί .
Μ -Ρ 3 Η -Ρ 2 ω c in in ιηιηιηνιηιηιπιη<τ<ί ο -ρ η ο.α. ο.ο.α.χ<α.4<χχ λ; ·η ω m m οαωοοχχαιχχχχ ρ ^ α ο. ο. ο. ο. ο. ο. ο. ο. ο. ο. ο.
ο :π3 w I ϊπ3 ο Ε Ρ ι tn tn ui tn ui υι ι/ι ω c-ι O Ö * Ε* + + + 4J S < < <
J-. X U | l-<| u| u u u u u| U U W 1-. I
-- ^ ·Ή I 1 ·** I -«* .*4 .H .fH -f* k .jj g -QI -Qi ΛΙ J3 Λ Δ Δ .ΟΙ Δ Δ Δ .ol 2 o + a ι ι ι ι ι α. ι ι ι ι n -d a a ccceaecencceasaccea ^ 3 oo oooo οι ο οι ooo ri ·Η ·Η ·Η ·Η ·Η Ι ·Η ΉI ·Η ·Η ·Η £ Έ-Μ -Ο Δ ΔΑΑΧίΑΐ Δ ΔΙΔΔΔ "1 § & y ra & ι·*· •j 'so οι οι ο ο ο ο οι οι ο ο οι 01
K1 *^| '^ I ·Η ·Η ·Η ·Η I ·HI ·Η *^| I
+J *$-*-> XJ| ΛΙ Λ Δ Δ Δ Δ\ Δ\ Δ Δ -Ω| .ai Ο Ή m
ο «ΐ « n n mmmcN
ι η co a ιβ o vo mmm :(3_, σιιη ^ooooinoooo
t-ljj CN lO
:c3c < σ' χχχχχσιχχχχ ra ij cnc/3 oaaasiAQiiiaa M A*
8 SI r-c pm m^Tinvor-ooOiOrscN
Ui cl r-t ί-t 18 Q 7 C C 7 ✓ j 0 3/
Vaikkakin biotiinin määritysten väliset erot tekevät suoran vertaamisen vaikeaksi, taulukossa II ilmoitettujen tulosten vertaaminen keskimääräisiin luonnonvaraisella tyypillä ja E. coli -mutantilla saaduiksi ilmoitet-5 tuihin biotiinikonsentraatioihin valaisee tämän keksinnön aikaansaamaa parannusta biotiinin tuottamisessa. Esimerkiksi Campbellin et ai. mukaan, Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 69, 676 - 680 (1972) on luonnonvaraisella E. coli-tyypillä saatu kasvuliuoksen biotiinikonsentraatio alle 10 0,05 nM ja kannalla S942 (birA~ -kanta) saatu 30 - 90 nM.
Pain mukaan, J. Bacteriol., 112, 1280 - 1287 (1972), on kannalla P48, jota voidaan käyttää tämän keksinnön mukaan biotiinia puutteellisesti säilyttävänä mutanttikantana, saatu kasvuliuoksen biotiinikonsentraatio 1000-kertainen 15 verrattuna luonnonvaraisella tyypillä saatuun.
Esimerkki 7 Tässä esimerkissä käytetyt viljelmät on kuvattu taulukossa III.
20 Taulukko III
Kanta Genotyyppi_Plasmidi_Genotyyppi FM6 bio+, bioR*, birA* ei ollenkaan FM6 bio*, bioR*, birA* pKA5 bio* S965 bio*, bioRp, birATS ei ollenkaan 25 S965 bio*, bioRp, birATS pKA5 bio* BM4062 bio', bioR', birATS ei ollenkaan BM4062 bio", bioR', birATS pKA5 bio*
Kukin viljelmä siirrostettiin Luria-liemeen (1,0 % 30 casaminohappoja, 0,5 % hiivauutteita, 0,5 % natriumklori-dia) ja inkuboitiin yön ajan 30 °C:ssa. Kunkin viljelmän optinen tiheys määritettiin ja on esitetty taulukossa IV. Kymmenkertainen laimentaminen oli välttämätöntä viljelmän tiheyden johdosta.
93657 19
Taulukko IV
Viljelmä
Kanta Plasmldi a600/10 Siirros FM6 ei ollenkaan 0,6205 6,205 5 μΐ 5 FM6 pKA5 0,6056 6,056 5 μΐ BM4062 ei ollenkaan 0,2919 2,919 10 μΐ BM4062 pKA5 0,5768 5,768 5 μΐ 10 S965 ei ollenkaan 0,4920 4,920 6 μΐ S965 pKA5 0,4379 4,379 7 μΐ
Yllä olevassa taulukossa IV ilmoitettu tilavuus lueteltuja kuutta viljelmää siirrostettiin 30 ml GMH-15 lientä sisältävään pulloon. Saatuja viljelmiä inkuboitiin ravistellen 37 °C:ssa. Ajankohtina 0 tuntia, 6 tuntia, 21 tuntia, 30 tuntia ja 45 tuntia poistettiin osa ja steriloitiin suodattamalla. (Ajankohtana 0 tuntia poistettiin 2,5 ml:n näyte, kun taas muina ajankohtina poistettiin 20 1 ml:n näytteet). Steriloidut näytteet analysoitiin aikai semmin kuvatun mikrobiologisen määrityksen mukaan ja tulokset on esitetty taulukossa V.
Taulukko V
, 25 Viljelmä 0 tuntia 6 tuntia 21 tuntia 30 tuntia 45 tuntia
Kanta/Plasmidi
FM6 <0,5 nM (1) <1,6 nM <1,6 nM <1,6 nM
FM6/pKA5 <0,5 nM <1 nM 12 nM 17 nM 6,7 nM
30 S965 <1,6 nM 13 nM 133 nM 140 nM 137 nM
S965/pKA5 <1,6 nM 43 nM 150 nM 173 nM 143 nM
BM4062 <0,5 nM <1,6 nM <1,6 nM <1,6 nM <1,6 nM
BM4062/pKA5 <1,6 nM (2) 3,1 μΜ 3,2 μΜ 1,5 μΜ 35 (1) Ajankohdan näyte oli saastunut; arvoa ei voitu saada.
(2) Ei tulosta määrityksen lineaarisella alueella.
93657 20
Vaikka tämä keksintö on kuvattu erityisen hyvinä pidettyjen suoritusmuotojen avulla, on selvää, että alan asiantuntijoille tulee mieleen muunnelmia ja parannuksia. Sen vuoksi on tarkoitus, että mukaan liitetyt patenttivaa-5 timukset kattavat kaikki sellaiset täysin vastaavat muunnelmat, jotka sisältyvät patenttivaatimusten määrittelemään keksinnön suojapiiriin.
Claims (2)
1. Mikrobinen tuotantosysteemi biotiinin tuottamista varten, tunnettu siitä, että se käsittää
5 Escherichia coli-solun, jolla on genotyyppi (bio', birATS, bioR"), ja mainitun solun sisäisen plasmidin, joka koodaa E. colin biotiinioperonin geenituotteet bioA, bioB. bioF, bioC ja bioD tai niiden funktionaaliset homologit, ja jol-10 la on genotyyppi uvrB~.
2. Menetelmä Escherichia colin, jolla on biotiinia puuttellisesti säilyttävän mutantin genotyyppi, muuttamiseksi E. coliksi, jolla on lisääntynyt biotiinin tuotanto, tunnettu siitä, että E. coli-solu, jolla on geno- 15 tyyppi (bio', birATS, bioR'), transformoidaan plasmidilla, joka koodaa E. colin biotiinioperonin geenituotteet bioA, bioB. bioF, bioC ja bioD tai niiden funktionaaliset homologit, ja jolla on genotyyppi uvrB'. 93657
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US76984985A | 1985-08-26 | 1985-08-26 | |
| US76984985 | 1985-08-26 | ||
| US89304286A | 1986-08-12 | 1986-08-12 | |
| US89304286 | 1986-08-12 | ||
| PCT/US1986/001759 WO1987001391A1 (en) | 1985-08-26 | 1986-08-26 | System for biotin synthesis |
| US8601759 | 1986-08-26 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI871689A FI871689A (fi) | 1987-04-16 |
| FI871689A0 FI871689A0 (fi) | 1987-04-16 |
| FI93657B FI93657B (fi) | 1995-01-31 |
| FI93657C true FI93657C (fi) | 1995-05-10 |
Family
ID=27118229
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI871689A FI93657C (fi) | 1985-08-26 | 1987-04-16 | Mikrobinen biotiinin tuotantosysteemi ja menetelmä biotiinituotannon lisäämiseksi |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0236429B1 (fi) |
| KR (1) | KR880700072A (fi) |
| AT (1) | ATE87975T1 (fi) |
| AU (1) | AU599046B2 (fi) |
| CA (1) | CA1317245C (fi) |
| DE (1) | DE3688248T2 (fi) |
| DK (1) | DK173842B1 (fi) |
| ES (1) | ES2001398A6 (fi) |
| FI (1) | FI93657C (fi) |
| GR (1) | GR862197B (fi) |
| IL (1) | IL79834A (fi) |
| NO (1) | NO177756C (fi) |
| NZ (1) | NZ217336A (fi) |
| PT (1) | PT83256B (fi) |
| WO (1) | WO1987001391A1 (fi) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3786578T2 (de) * | 1986-03-25 | 1994-02-03 | Nippon Zeon Co | Biotin-Synthetase kodierendes Gen und dessen Verwendung. |
| AU616380B2 (en) * | 1986-09-30 | 1991-10-31 | Transgene S.A. | Cloning of the bioA, bioD, bioF, bioC, and bioH genes of Bacillus sphaericus, vectors and transformed cells and method for preparing biotin |
| FR2615514B2 (fr) * | 1987-05-18 | 1991-01-11 | Transgene Sa | Clonage des genes bioc et bioh de bacillus sphaericus, vecteurs et cellules transformees et procede de preparation de la biotine |
| FR2604436B1 (fr) * | 1986-09-30 | 1989-07-21 | Transgene Sa | Clonage des genes bioa, biod, biof de bacillus sphaericus, vecteurs et cellules transformes et procede de preparation de la biotine |
| GB2216530B (en) * | 1988-03-22 | 1992-07-08 | Mini Agriculture & Fisheries | Genetic material for expression of biotin synthetase enzymes |
| US5252466A (en) * | 1989-05-19 | 1993-10-12 | Biotechnology Research And Development Corporation | Fusion proteins having a site for in vivo post-translation modification and methods of making and purifying them |
| FR2657622B1 (fr) | 1990-01-31 | 1994-11-25 | Rhone Poulenc Sante | Polypeptides impliques dans la biosynthese des cobalamines et/ou des cobamides, sequences d'adn codant pour ces polypeptides, procede de preparation, et leur utilisation. |
| DE4013522A1 (de) * | 1990-04-27 | 1991-10-31 | Bayer Ag | Verwendung von alkylcarbonsaeure-dimethylamiden als kristallisationsinhibitoren |
| KR100250692B1 (ko) * | 1991-09-13 | 2000-04-01 | 후쿠하라 요시하루 | 바이오틴 오페론 |
| JP2658716B2 (ja) * | 1992-01-24 | 1997-09-30 | 田辺製薬株式会社 | 新規微生物及びそれを用いるｄ−ビオチンの製法 |
| JP3566287B2 (ja) * | 1992-10-02 | 2004-09-15 | ロンザ ア−ゲ− | ビオチンの生物工学的製造方法 |
| EP0635572A3 (en) * | 1993-06-25 | 1995-03-08 | Hoffmann La Roche | Biosynthesis of biotin in bacillus subtilis. |
| DK0806479T3 (da) | 1996-05-06 | 2003-10-06 | Hoffmann La Roche | Produktion af biotin ved fermentering |
| DK0853127T3 (da) | 1996-09-27 | 2005-03-07 | Dsm Ip Assets Bv | Biotin-biosyntese-gener II |
| DE19731274A1 (de) | 1997-07-22 | 1999-01-28 | Basf Ag | Verfahren zur Herstellung von Biotin |
| US6432686B1 (en) | 1998-05-12 | 2002-08-13 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Method for the production of 1,3-propanediol by recombinant organisms comprising genes for vitamin B12 transport |
| US7074608B1 (en) | 1998-05-12 | 2006-07-11 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Method for the production of 1,3-propanediol by recombinant organisms comprising genes for coenzyme B12 synthesis |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56160998A (en) * | 1980-05-15 | 1981-12-11 | Nippon Zeon Co Ltd | Production of biotin active substance biotin vitamer |
| JPS60996A (ja) * | 1983-06-18 | 1985-01-07 | 山田機械工業株式会社 | 折丁供給装置 |
-
1986
- 1986-08-22 CA CA000516630A patent/CA1317245C/en not_active Expired - Fee Related
- 1986-08-22 NZ NZ217336A patent/NZ217336A/xx unknown
- 1986-08-25 IL IL79834A patent/IL79834A/xx not_active IP Right Cessation
- 1986-08-25 GR GR862197A patent/GR862197B/el unknown
- 1986-08-26 WO PCT/US1986/001759 patent/WO1987001391A1/en active IP Right Grant
- 1986-08-26 AT AT86905574T patent/ATE87975T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-08-26 DE DE8686905574T patent/DE3688248T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-08-26 ES ES8601369A patent/ES2001398A6/es not_active Expired
- 1986-08-26 PT PT83256A patent/PT83256B/pt not_active IP Right Cessation
- 1986-08-26 KR KR870700359A patent/KR880700072A/ko not_active Application Discontinuation
- 1986-08-26 EP EP86905574A patent/EP0236429B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-08-26 AU AU62297/86A patent/AU599046B2/en not_active Expired
-
1987
- 1987-04-15 DK DK198701974A patent/DK173842B1/da not_active IP Right Cessation
- 1987-04-16 FI FI871689A patent/FI93657C/fi not_active IP Right Cessation
- 1987-04-24 NO NO871723A patent/NO177756C/no not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU599046B2 (en) | 1990-07-12 |
| GR862197B (en) | 1986-12-31 |
| DK197487A (da) | 1987-06-24 |
| IL79834A (en) | 1992-08-18 |
| DK173842B1 (da) | 2001-12-10 |
| FI93657B (fi) | 1995-01-31 |
| KR880700072A (ko) | 1988-02-15 |
| NO871723D0 (no) | 1987-04-24 |
| DE3688248D1 (de) | 1993-05-13 |
| NO871723L (no) | 1987-04-24 |
| NO177756C (no) | 1995-11-15 |
| IL79834A0 (en) | 1986-11-30 |
| ATE87975T1 (de) | 1993-04-15 |
| DK197487D0 (da) | 1987-04-15 |
| ES2001398A6 (es) | 1988-05-16 |
| EP0236429A1 (en) | 1987-09-16 |
| DE3688248T2 (de) | 1993-07-15 |
| WO1987001391A1 (en) | 1987-03-12 |
| EP0236429B1 (en) | 1993-04-07 |
| PT83256B (pt) | 1988-07-01 |
| FI871689A (fi) | 1987-04-16 |
| NZ217336A (en) | 1988-06-30 |
| FI871689A0 (fi) | 1987-04-16 |
| CA1317245C (en) | 1993-05-04 |
| AU6229786A (en) | 1987-03-24 |
| NO177756B (no) | 1995-08-07 |
| PT83256A (en) | 1986-09-01 |
| EP0236429A4 (en) | 1988-02-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI93657C (fi) | Mikrobinen biotiinin tuotantosysteemi ja menetelmä biotiinituotannon lisäämiseksi | |
| KR100275287B1 (ko) | O-아세틸세린,l-시스테인및l-시스테인 유도생성물의 제조방법 | |
| RU2447146C2 (ru) | Рекомбинантные микроорганизмы, продуцирующие метионин | |
| JP5797742B2 (ja) | 細胞内代謝産物の検出のためのセンサー | |
| EP0593792A1 (en) | Novel L-threonine-producing microbacteria and a method for the production of L-threonine | |
| Ulrich et al. | Genetic and biochemical analyses of Escherichia coli mutants altered in the temperature-dependent regulation of membrane lipid composition | |
| Chen et al. | Nitrogen-fixation genes and nitrogenase activity in Clostridium acetobutylicum and Clostridium beijerinckii | |
| US20050181490A1 (en) | Fermentation process for preparing coenzyme Q10 by the recombinant Agrobacterium tumefaciens | |
| Petersen et al. | Identification and characterization of an operon in Salmonella typhimurium involved in thiamine biosynthesis | |
| TWI243206B (en) | Decoupled fermentation process for producing riboflavin and microorganism and polynucleotide sequence used therein | |
| CN107058323B (zh) | 基于ilv衰减子的工程菌及其在生产异亮氨酸中的应用 | |
| Rizzino et al. | Derepressed levels of the isoleucine-valine and leucine enzymes in hisT1504, a strain of Salmonella typhimurium with altered leucine transfer ribonucleic acid | |
| KR20200010285A (ko) | 증가된 nadph를 유도하는 생합성 경로의 게놈 공학 | |
| US5110731A (en) | System for biotin synthesis | |
| CN1333074C (zh) | 反式－4－羟基－l－脯氨酸的制造方法 | |
| EP2053128A1 (en) | Novel method for utilization of microbial mutant | |
| EP1510582A1 (en) | Method for producing L-amino acid using bacterium of Enterobacteriaceae family, having nir operon inactivated | |
| WO2008007914A1 (en) | A nucleotide sequence of a mutant argf with increased activity and a method for producing l-arginine using a transformed cell containing the same | |
| CN107287256B (zh) | 全细胞催化合成l-2-哌啶甲酸的方法 | |
| CN109929853B (zh) | 嗜热菌来源的热激蛋白基因的应用 | |
| Nair et al. | Yeast extract mediated autoinduction of lacUV5 promoter: an insight | |
| KR101863239B1 (ko) | 아세트산을 유일 탄소원으로 이용할 수 있는 미생물 | |
| KR102013741B1 (ko) | 메티오닌 생합성능이 향상된 변이세포 | |
| CN107287196B (zh) | ilv衰减子的突变体、相关工程菌及其在生产缬氨酸中的应用 | |
| Bubnov et al. | Glutamyl-and Glutaminyl-tRNA synthetases are a promising target for the design of an L-Threonine–producing strain |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FD | Application lapsed | ||
| BB | Publication of examined application | ||
| PC | Transfer of assignment of patent |
Owner name: GENENCOR INTERNATIONAL, INC. |
|
| FG | Patent granted |
Owner name: ARCHER DANIELS MIDLAND COMPANY |
|
| MA | Patent expired |