JP2658716B2 - 新規微生物及びそれを用いるｄ−ビオチンの製法 - Google Patents

新規微生物及びそれを用いるｄ−ビオチンの製法

Info

Publication number
JP2658716B2
JP2658716B2 JP4051071A JP5107192A JP2658716B2 JP 2658716 B2 JP2658716 B2 JP 2658716B2 JP 4051071 A JP4051071 A JP 4051071A JP 5107192 A JP5107192 A JP 5107192A JP 2658716 B2 JP2658716 B2 JP 2658716B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
biotin
microorganism
gene
plasmid
resistance
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP4051071A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH05199867A (ja
Inventor
三郎 小松原
祐二 今井
誠 ▲桝▼田
直樹 櫻井
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tanabe Seiyaku Co Ltd
Original Assignee
Tanabe Seiyaku Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tanabe Seiyaku Co Ltd filed Critical Tanabe Seiyaku Co Ltd
Priority to JP4051071A priority Critical patent/JP2658716B2/ja
Priority to US08/004,111 priority patent/US5374554A/en
Priority to TW082100375A priority patent/TW262489B/zh
Priority to CN93102377A priority patent/CN1076487A/zh
Priority to KR1019930000838A priority patent/KR100192024B1/ko
Publication of JPH05199867A publication Critical patent/JPH05199867A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP2658716B2 publication Critical patent/JP2658716B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/185—Heterocyclic compounds containing sulfur atoms as ring hetero atoms in the condensed system
    • C12P17/186—Heterocyclic compounds containing sulfur atoms as ring hetero atoms in the condensed system containing a 2-oxo-thieno[3,4-d]imidazol nucleus, e.g. Biotin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/425—Serratia
    • C12R2001/43—Serratia marcescens

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は新規微生物及びそれを用
いるｄ−ビオチンの製法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ｄ−ビオチンはヒトや動物にとって不可
欠なビタミンであり、医薬品原料或いは飼料添加物とし
て重要な化合物であり、通常の発酵培地を用いて、発酵
法によりｄ−ビオチンを製造する方法として、エシェリ
シア属やセラチア属から誘導した遺伝子組換え菌株を用
いる方法（特表昭６４−５０００８１、特開昭６２−１
５５０８１、特開平２−２７９８０）が知られている。
しかしながら、これらの遺伝子組換え菌株の発酵生産性
は、高いものとは言えず、より高いｄ−ビオチン生産性
を有する菌株の取得とそれを用いる十分高い製造効率を
可能にする工業的な発酵法の開発が望まれていた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ｄ−ビオチ
ン高生産能を有する新規微生物ならびに該微生物を用い
る工業的に有利なｄ−ビオチンの製法を提供するもので
ある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は上記の課題を解
決したものであって、本発明者らは鋭意研究を重ねた結
果、（１）アクチチアジン酸耐性変異株から変異誘導し
てエチオニンやＳ−アミノエチルシステイン等に対する
耐性変異を付与した微生物は、ｄ−ビオチンの生産能が
増大すること、（２）セラチア属微生物からクローン化
したｄ−ビオチン生産を司る染色体デオキシリボ核酸
（以下、ＤＮＡと略称する）断片をトランスポゾンを利
用して、ｄ−ビオチン生産能を有するセラチア属微生物
の染色体上に組み込んだ微生物は、ｄ−ビオチン生産能
が顕著に増大すること、（３）これら高ｄ−ビオチン生
産能をもつ微生物に、更にクロロ酢酸等の酢酸類似物質
に対する耐性変異を付与した微生物は、ｄ−ビオチン生
産能がより顕著に増大すること、及び（４）アクチチア
ジン酸耐性変異株からクローン化したｄ−ビオチン遺伝
子断片とベクターとから構成される組換えプラスミド
を、上記（２）もしくは（３）の微生物に導入して得ら
れる微生物は、ｄ−ビオチン生産能が飛躍的に増大する
ことを見出すと共に、この微生物を用いることによって
ｄ−ビオチンを工業的に有利に製造し得ることを見出
し、本発明を完成するに至った。
【０００５】即ち、本発明は、ｄ−ビオチン生産能を有
するセラチア属微生物からクローン化されたビオチン遺
伝子を組み込んだ組換えプラスミドを、ｄ−ビオチン生
産能を有するセラチア属宿主微生物に導入して得られる
微生物であって、該宿主微生物が、（１）ビオチン類似
物質耐性、メチオニン類似物質耐性およびリジン類似物
質耐性を有し、かつ（２）該宿主微生物の染色体上に外
来のビオチン遺伝子が組み込まれてなることを特徴とす
る微生物、ならびに該微生物を培地で培養することによ
って、培地中にｄ−ビオチンを生成蓄積せしめ、これを
採取することを特徴とするｄ−ビオチンの製法である。
【０００６】〔ビオチン遺伝子の供給源〕本発明におい
て、ビオチン遺伝子は、ｄ−ビオチンの生産に係わる
７、８−ジアミノペラルゴン酸アミノトランスフェラー
ゼ遺伝子（ｂｉｏＡ）、ビオチンシンセターゼ遺伝子
（ｂｉｏＢ）、７−ケト−８−アミノペラルゴン酸シン
セターゼ遺伝子（ｂｉｏＦ）、ピメロイル−ＣｏＡシン
セターゼ遺伝子（ｂｉｏＣ）及びデチオビオチンシンセ
ターゼ遺伝子（ｂｉｏＤ）の全遺伝子或いはその一部遺
伝子を意味し、かかる遺伝子の供給源としては、セラチ
ア属〔バージーズ・マニュアル・オブ・システマティッ
ク・バクテリオロジー、第１巻、４７７頁、（１９８４
年）〕に属しｄ−ビオチン生産能を有する微生物があげ
られ、とりわけアクチチアジン酸、５−（２−チエニ
ル）吉草酸、デヒドロビオチン等のビオチン類似物質に
対する耐性を有する微生物由来の遺伝子が好ましい。
【０００７】かかる微生物としては、具体的には例えば
セラチア・マルセッセンスＳＢ３０３（微工研菌寄第１
０１１９号）、セラチア・マルセッセンスＳＢ４１１
（特開平２−２７９８０）などのアクチチアジン酸耐性
を有する微生物の他、セラチア・マルセッセンスＳｒ４
１（微工研条寄第４８７号）（野生株）などのビオチン
類似物質耐性を有しない微生物に公知方法（特開平２−
２７９８０）でビオチン類似物質耐性を付与したもの
も、ビオチン遺伝子供給源として好適に使用することが
できる。また、ビオチン類似物質耐性に加え、エチオニ
ン等のメチオニン類似物質、Ｓ−アミノエチルシステイ
ン等のリジン類似物質、クロロ酢酸等の酢酸類似物質な
どに対する耐性を有する微生物も、ビオチン遺伝子の供
給源として、好適に使用することができる。
【０００８】〔ベクタープラスミド〕 また、上記ビオチン遺伝子と組換えプラスミドを構成す
るベクタープラスミドとしては、移入細胞中で複製可能
なプラスミドであれば特に限定されないが、例えばコピ
ー数が１〜数百であり、アンピシリン、カナマイシン、
クロラムフェニコールなどの薬剤に耐性なマーカーを有
し、かつｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｐなど適当なプロモータ
ーを有するものが好ましい。更に、ｐａｒ及びｐａｒＢ
などのプラスミド安定化因子を含んでいるものであって
もよい。
【０００９】かかるプラスミドとしては、例えばｐＬＧ
３３９〔ジーン、１８巻、３３５頁（１９８２年）〕、
ｐＢＲ３２２〔ジーン、２巻、９５頁（１９７７
年）〕、ｐＵＣ１８〔ジーン、３３巻、１０３頁（１９
８５年）〕、ｐＵＣ１９〔ジーン、３３巻、１０３頁
（１９８５年）〕、ｐＨＳＧ２９８〔ジーン、６１巻、
６３頁（１９８７年）〕、ｐＨＳＧ２９９〔ジーン、６
１巻、６３頁（１９８７年）〕、ｐＫＧ１０２２〔バイ
オテクノロジー、６巻、１４０２頁（１９８８年）〕、
ｐＫＴ２４０〔ジーン、２６巻、２７３頁（１９８３
年）〕などが挙げられる。更には、接合伝達性プラスミ
ドＲ３８８由来の温度感受性複製プラスミドであり、ト
ランスポゾンとしてＴｎ５が組み込まれ、カナマイシン
耐性遺伝子とトリメトプリム耐性遺伝子を選択マーカー
として持つプラスミドｐＣＨＲ８１〔ジーン、５６巻、
２８３頁（１９８７年）〕などもベクタープラスミドと
して、好適に使用することができる。
【００１０】上記のベクタープラスミドは、市販のもの
を好適に使用し得る他、これらを保持する微生物菌体か
ら、例えばクリアード・ライセイト法〔遺伝子操作実験
法１２５頁（高木康敬著，講談社、１９８０年）〕、ア
ルカリ リシス法〔モレキュラー クローニング マニ
アティス等 ３６８頁（コールド・スプリング・ハーバ
ー・ラボラトリー、米国、１９８２年）〕等の常法によ
って調製することもできる。
【００１１】〔宿主微生物〕 本発明において、宿主微生物は、ｄ−ビオチン生産能を
有するセラチア属微生物に、（１）アクチチアジン酸、
５−（２−チエニル）吉草酸、デヒドロビオチン等のビ
オチン類似物質に対する耐性、エチオニン等のメチオニ
ン類似物質に対する耐性およびＳ−アミノエチルシステ
イン等のリジン類似物質に対する耐性を付与し、かつ
（２）その染色体上に外来のビオチン遺伝子を組み込む
ことにより得られる。また、かかる宿主微生物として
は、さらにクロロ酢酸等の酢酸類似物質に対する耐性を
有するセラチア属微生物が好ましく、アクチチアジン
酸、エチオニンおよびＳ−アミノエチルシステインに耐
性なセラチア・マルセッセンスあるいは更にクロロ酢酸
に対する耐性を有するセラチア・マルセッセンスが最も
好ましい。
【００１２】かかる宿主微生物としては、具体的には例
えば、アクチチアジン酸に対する耐性を有し、且つｄ−
ビオチン生産能を有するセラチア・マルセッセンスＳＢ
３０３（微工研菌寄第１０１１９号）、セラチア・マル
セッセンスＳＢ４１１（特開平２−２７９８０）、ビオ
チン遺伝子がベクターｐＬＧ３３９に挿入された組換え
プラスミドｐＬＧＭ２０１を含有するセラチア・マルセ
ッセンスＴＡ５０２３（微工研条寄第４１０１号）が挙
げられる。その他、セラチア・マルセッセンスＳｒ４１
（微工研条寄第４８７号）（野生株）に、上記各物質に
対する耐性を付与した微生物も、好適に使用することが
できる。
【００１３】耐性付与は、公知の方法により行うことが
でき、例えば適当な微生物を、通常の突然変異誘起処理
した後、ビオチン類似物質、酢酸類似物質などの上記耐
性付与対象物質を約１〜５０ｍｇ／ｍｌ程度含有する最
少寒天培地、例えば、デービス−ミンギオリの最少培地
〔ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、６０巻、１７
頁（１９５０年）〕或いはその炭素源を各種の糖、有機
酸類又はアミノ酸に代えた培地で２７〜３７℃で３〜７
日間培養し、生じた大きなコロニーを釣菌分離する。つ
いで分離した微生物の内、発酵培地でのｄ−ビオチン生
産能をラクトバチルス・プランタラムによる微生物定量
法（生化学実験講座、第１３巻、３５５頁）に従って調
べることによって、目的の耐性を有する微生物を取得す
ることができる。宿主微生物におけるこれらの耐性は、
組換えプラスミドの導入や外来のビオチン遺伝子を宿主
微生物の染色体上に組み込んだ後に付与してもよく、或
いは組換えプラスミドの導入前や外来のビオチン遺伝子
を宿主の染色体上に組み込む前に付与してもよい。
【００１４】〔組換えプラスミドの製法〕ビオチン遺伝
子は、上記のビオチン遺伝子供給源たる微生物からクリ
ヤード・ライセイト法〔遺伝子操作実験法１２５頁（高
木康敬著，講談社）；モレキュラー・クローニング８６
頁（マニアティスら編，コールド・スプリング・ハーバ
ー・ラボラトリー，１９８２年）〕等の方法によって調
製することができ、例えばビオチン遺伝子を含む染色体
を適当な制限酵素で切断した後、アガロース電気泳動を
行い、アガロース電気泳動ゲルから、ビオチン遺伝子断
片を含む部分を切り出した後、透析チューブを用いる電
気泳動溶出法〔モレキュラー・クローニング１６４頁〕
によって調製することが出来る。
【００１５】ついで、ベクタープラスミドを制限酵素
（例えば、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ、
ＳａｌＩ等）を用いて部分分解した後、ＤＮＡリガーゼ
（例えば、Ｔ４リガーゼや大腸菌ＤＮＡリガーゼ等）を
作用させて、ビオチン遺伝子断片と結合させることによ
り組換えプラスミドを調製することが出来る。このとき
ベクタープラスミドとして、ｐａｒＢ〔ジャーナル・オ
ブ・モレキュラー・バイオロジー、２０３巻、１１９頁
（１９８８年）〕等のプラスミド保持安定化遺伝子を司
るＤＮＡ断片を挿入連結したプラスミド或いは選択マー
カーを適宜置換したプラスミドを用いてもよい。つい
で、得られる組換えプラスミドＤＮＡで制限酵素欠損性
でかつｄ−ビオチン要求性変異株〔例えば、エシェリシ
ア・コリχ１７７６株（ＡＴＣＣ３１２４４）：モレキ
ュラー・クローニング・オブ・リコンビナントＤＮＡ、
２４８頁，スコットとウェーナー編，アカデミック・プ
レス、（１９７７年）等〕を形質転換し、得られる微生
物のうち、カナマイシン耐性で、かつ７−ケト−８−ア
ミノペラルゴン酸添加培地でｄ−ビオチン非要求性のも
のを分離し、得られたクローンからプラスミドＤＮＡを
抽出することにより、目的の組換えプラスミドを得るこ
とが出来る。
【００１６】〔ビオチン遺伝子が染色体上に組み込まれ
た宿主微生物〕トランスポゾンとマーカーを有するプラ
スミドに外来のビオチン遺伝子を連結しこれを宿主微生
物に導入することにより、ビオチン遺伝子が染色体上に
組み込まれた宿主微生物を調製することができる。プラ
スミドとしては、トランスポゾンを染色体上に組み込む
ために構築されたｐＣＨＲ８１プラスミド〔ジーン、５
６巻、２８３頁（１９８７年）〕があげられる。ｐＣＨ
Ｒ８１はトランスポゾンＴｎ５が組み込まれ、カナマイ
シン耐性遺伝子とトリメトプリム耐性遺伝子を選択マー
カーとして持つので、Ｔｎ５の適当な部位に、Ｓｍａ
ｌ、ＳａｌＩ、ＢａｍＨＩ等の制限酵素部位を利用して
外来遺伝子断片を連結し、これを宿主微生物に導入すれ
ばよい。
【００１７】宿主微生物への組換えプラスミドの導入に
際しては、外来遺伝子を連結したプラスミドをセラチア
属微生物の修飾系により修飾させることが好ましく、例
えばセラチア・マルセッセンスＳｒ４１のＴＴ３９２株
〔ジャーナル オブ バクテリオロジー、１６１巻、１
頁（１９８５年）〕に、外来遺伝子を連結したプラスミ
ドを、タカギとキスミの方法〔ジャーナル オブ バク
テリオロジー、１６１巻、１頁（１９８５年）〕で取り
込ませ、得られる形質転換株からクリヤードライセイト
法によりプラスミドを単離・精製することによりプラス
ミドの修飾を行うことが出来る。
【００１８】ついで、修飾したプラスミドを目的の宿主
微生物に、タカギとキスミの方法により取り込ませ、約
３７℃で数時間培養し、得られる培養液を適宜希釈して
栄養寒天培地に塗布する。ついで、３０℃で一夜培養し
てコロニーを出現させ、カナマイシン耐性かつトリメト
プリム感受性のコロニーを選択する。コロニーを釣菌分
離した後、微生物細胞から染色体ＤＮＡについて、Ｔｎ
５のＤＮＡ内の適当な領域をプローブとするサザンブロ
ット解析を行い、予想される塩基数の位置にＤＮＡのバ
ンドが確認される菌株を目的の外来ビオチン遺伝子が染
色体上に組み込まれたセラチア属の宿主微生物として得
ることができる。
【００１９】〔クローン化したビオチン遺伝子断片を含
む組換えプラスミドを保持するセラチア属微生物の製
法〕 ビオチン遺伝子をベクタープラスミドに組み込んだ組換
えプラスミドは、例えば、タカギとキスミの方法によっ
て、ビオチン遺伝子が染色体上に組み込まれた宿主微生
物中に導入することができる。ついで、組換えプラスミ
ドが有する薬剤耐性マーカーの利用によって、形質転換
株を選択すればよい。かくして得られる組換え菌株の例
としては、アクチチアジン酸、エチオニン、Ｓ−アミノ
エチルシステインおよびクロロ酢酸の各物質に対する耐
性を有し、かつその染色体上に外来のｄ−ビオチン遺伝
子断片を含む宿主微生物セラチア・マルセッセンスＫ８
ＣＬ４８に、ｄ−ビオチン遺伝子断片を含有せしめた組
換えプラスミドｐＬＧＭ２０１ＰＨｃＡを導入させたセ
ラチア・マルセッセンスＴＡ５０２７（微工研条寄第４
１０３号）、或いはアクチチアジン酸、エチオニンおよ
びＳ−アミノエチルシステインの各物質に対する耐性を
有し、かつその染色体上に外来のｄ−ビオチン遺伝子断
片を含む宿主微生物セラチア・マルセッセンスＥＴＡ２
３−Ｋ８に、ｄ−ビオチン遺伝子断片を含有せしめた組
換えプラスミドｐＬＧＭ２０１ＰＨｃＡが導入されたセ
ラチア・マルセッセンスＴＡ５０２６（微工研条寄第４
１０２号）などが挙げられる。
【００２０】〔培養〕かくして得られたｄ−ビオチン生
産能を有する微生物を培養することによって、培地中に
ｄ−ビオチンを高濃度に生成・蓄積せしめることができ
る。本発明において使用されるｄ−ビオチン生産用培地
としては、炭素源として、ブドウ糖、ショ糖、糖蜜の如
き糖類、フマル酸やクエン酸の如き有機酸又はグリセロ
ールの如きアルコール類等を１０〜３０％、窒素源とし
て酢酸アンモニウムや塩化アンモニウムの如き無機アン
モニウム又は尿素を１〜３％、さらに有機栄養物として
コーン・スティープ・リカー、ペプトン、酵母エキス、
カゼイン加水分解物等を０〜１％の範囲でそれぞれ適当
量含有する培地を好適に用いることができる。これらの
他にリン酸カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、
モリブデン酸ナトリウム等を少量加え、更に培地のｐＨ
を６〜８に保つために、炭酸カルシウム或いはアンモニ
ア等を必要に応じて添加する。本発明によれば、上記培
地に本発明の微生物を接種し、２５〜３７℃にて振盪培
養或いは通気攪拌の如き好気的条件下で３〜７日間培養
することによって培地中にｄ−ビオチンを著量生成・蓄
積せしめることができる。なお、培養期間中に、上述の
培地成分を適宜途中添加或いは連続添加することによっ
て、さらに著量のｄ−ビオチンを生成・蓄積させること
ができる。
【００２１】〔培養液からのｄ−ビオチンの単離精製〕
かくして得られたｄ−ビオチンを含有する培養液から下
記の方法によって、ｄ−ビオチンを単離・精製すること
ができる。先ず、発酵終了液に塩酸を添加し、酸性にし
た後、ホローファイバー型のミクロフィルターを用いて
菌体を取り除くことによって、ろ液を得る。このろ液を
ハイポーラス型合成吸着剤のカラムに導通することによ
って、ろ液中のｄ−ビオチンを吸着させ、更に希塩酸溶
液によって洗浄した後に、メタノール−アンモニア水
（１：９）等を導通することによって、ｄ−ビオチンを
溶出する。
【００２２】次に、溶出液を減圧濃縮した後、強塩基性
陰イオン交換樹脂のカラムに導通・吸着し、水で洗浄し
た後、アンモニア水等によってｄ−ビオチンを溶出す
る。この溶出液を減圧濃縮した後、濃縮液のｐＨを塩酸
等によって３．０付近に調整し、５〜１０℃に冷却、一
夜放置する。かくすることによって、ｄ−ビオチンが結
晶として析出する。この結晶をろ取し、乾燥することに
よってｄ−ビオチンの結晶を高収率で得ることができ
る。以下に実施例をあげて本発明を説明するが、実施例
中のｄ−ビオチンの定量はラクトバチラス・プランタラ
ムによる微生物定量法〔生化学実験講座、第１３巻、３
５５頁（能勢善嗣ら編，東京化学同人（１９７５
年））〕によって行った。
【００２３】
【実施例】
実施例 １ （１）アクチチアジン酸、エチオニン、Ｓ−アミノエチ
ルシステインに対して耐性を有する宿主微生物の調製 （Ａ） アクチチアジン酸耐性を有し、かつｄ−ビオチ
ン生産能を有するセラチア・マルセッセンスＳＢ４１１
（特開平２−２７９８０）の細胞をエーデルバーグらの
方法〔バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リ
サーチ・コミュニケーションズ、１８巻、７８８頁（１
９６５年）〕によって変異誘起処理し、栄養培地（ブド
ウ糖０．５％、ペプトン１．０％、肉エキス０．３％、
酵母エキス１．０％、塩化ナトリウム０．５％）で１時
間培養する。この培養液を遠心分離し、得られる細胞を
生理食塩水で遠心分離法で３回洗浄する。この細胞を生
理食塩水に懸濁し、ＤＬ−エチオニン６０ｍＭを含む最
少寒天培地（ブドウ糖０．５％、リン酸一カリウム０．
３％、リン酸二カリウム０．７％、硫酸マグネシウム７
水和物０．０１％、寒天１．５％）に１平板当たり１〜
１０×１０５個の細胞を塗布する。３０℃で５日間培養
した後、生じた大きなコロニーを釣菌分離することによ
ってエチオニン耐性株を得る。
【００２４】（Ｂ） 次に、取得した耐性株について、
発酵培地（ショ糖１０％、尿素１％、リン酸二カリウム
０．１％、硫酸マグネシウム７水和物０．１％、硫酸第
一鉄７水和物０．０１％、炭酸カルシウム２％）におけ
るｄ−ビオチン生産能を特開平２−２７９８０に記載の
方法に従って調べることにより、親株に比べ生産量が有
意に増大した菌株の一株として、セラチア・マルセッセ
ンスＥＴ２株を得る。なお、本菌株のｄ−ビオチン生産
量は２４ｍｇ／ｌであるのに対して、親株のそれは１６
ｍｇ／ｌであった。 （Ｃ） セラチア・マルセッセンスＥＴ２株の細胞を、
上記（Ａ）と同様に、変異誘起した後、Ｓ−アミノエチ
ルシステイン５０ｍＭを含む最少寒天平板培地に、１平
板当たり１〜１０×１０５個の細胞を塗布する。３０℃
で５日間培養した後、生じた大きなコロニーを釣菌分離
することによって、Ｓ−アミノエチルシステイン耐性株
を得る。これらの耐性株について、上記（Ｂ）と同様な
発酵培地におけるｄ−ビオチン生産能を調べることによ
って、親株に比べ、生産量が有意に増大した菌株の一株
として、セラチア・マルセッセンスＥＴＡ２３を得る。
なお、本菌株のｄ−ビオチン生産量は３３ｍｇ／ｌであ
るのに対して、親株のそれは２３ｍｇ／ｌであった。
【００２５】（２）宿主微生物の染色体上への外来ビオ
チン遺伝子の組み込み （Ａ） ｐＣＨＲ８１を保持するエシェリシア・コリＭ
Ｃ１０６１〔ジーン、５６巻、２８３頁（１９８７
年）〕を０．２％ブドウ糖を含むＬ−ブロス８００ｍｌ
に接種し、３０℃で１６時間振盪培養した後、遠心分離
により集菌し、菌体をリゾチーム処理及びラウリル硫酸
ナトリウムで処理して溶菌した後、最終濃度が１Ｍとな
るように塩化ナトリウムを加えて遠心分離（１００，０
００×ｇ、３０分間）する。上清を採取しフェノール処
理した後、エタノールを加え、遠心分離する。沈澱を１
０ｍＭトリス塩酸−１ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナ
トリウム（ｐＨ７．５）に溶解し、塩化セシウム−エチ
ジウムブロマイド平衡密度勾配遠心法（２００，０００
×ｇ、１６時間）によりプラスミドＤＮＡを分離精製す
ることにより、ｐＣＨＲ８１のＤＮＡ（図３参照）０．
３ｍｇを得た。
【００２６】（Ｂ） セラチア・マルセッセンスＳＢ３
０３から単離した染色体ＤＮＡと、ｐＢＲ３２２のベク
タープラスミドを、ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで処理
した後、結合させた組換えプラスミドｐＢＭ２０１（特
開平２−２７９８０号、実施例２）を、（２）−（Ａ）
と同様の方法によって単離し、そのＤＮＡ０．５ｍｇを
制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで完全分解した後、
アガロース電気泳動を行い、６ｋｂのＤＮＡ断片が位置
するゲルの部分を切り出す。このゲルを透析チューブに
入れた後、電気溶出法によって、ｄ−ビオチン生産を司
る遺伝子群の内、ｂｉｏＢＦＣＤの４個の遺伝子がコー
ドされた６ｋｂのＤＮＡ断片１００μｇを得た。
【００２７】（Ｃ） （２）−Ａで得られたｐＣＨＲ８
１のＤＮＡ１μｇを制限酵素ＢａｍＨＩで部分分解す
る。１０分間の熱処理後、上記（Ｂ）のビオチン遺伝子
断片１μｇを混合し、該混合物にＴ４ファージ由来のＤ
ＮＡリガーゼを通常の条件で作用させ、ＤＮＡ鎖を連結
することによって組換えプラスミドを得る。この組換え
プラスミドのＤＮＡを用いて、制限酵素欠損性でかつｄ
−ビオチン要求性のエシェリシア・コリχ１７７６（Ａ
ＴＣＣ３１２４４）の細胞を形質転換する。得られる形
質転換細胞を硫酸カナマイシン１００μｇ／ｍｌとｄ１
−デチオビオチン０．２μｇ／ｍｌ含有のχ１７７６株
用最少寒天培地（グルコース０．５％、硫酸アンモニウ
ム０．１％、リン酸二カリウム０．７％、リン酸一カリ
ウム０．３％、硫酸マグネシウム７水和物０．０１％、
ジアミノピメリン酸０．０１％、チミジン０．００４
％、ビタミンフリーカザミノ酸０．２％、寒天１．５
％）上に塗布し、３０℃で１日間培養し、生じるカナマ
イシン耐性でかつｄ−ビオチン非要求性のコロニーを釣
菌分離する。さらに、こうしたクローン１０個から抽出
したプラスミドＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩによって切
断した後、断片をアガロース電気泳動法によって解析し
た結果に基づいて、ｐＣＨＲ８１のＴｎ５内のＢａｍＨ
Ｉ切断部位にｄ−ビオチン遺伝子断片６ｋｂが挿入され
た組換えプラスミドｐＣＨＲＭ３０４を取得した（図４
参照）。なお、本組換えプラスミドでは、Ｔｎ５断片は
ｒＣＨＲ８１における方向と同方向に連結されている。
【００２８】（Ｄ） 上記（Ｃ）で得た組換えプラスミ
ドｐＣＨＲＭ３０４のＤＮＡを、セラチア・マルセッセ
ンスの制限酵素欠損株であるＴＴ３９２株の細胞にタカ
ギとキスミの方法によって取り込ませ、形質転換株を得
る。この形質転換株を培養した後、得られる細胞からク
リヤード・ライセイト法によってプラスミドＤＮＡを単
離精製して、セラチア・マルセッセンスの修飾系によっ
て修飾された組換えプラスミドＤＮＡ２５０μｇを得
る。次いで、この組換えプラスミドＤＮＡを、ｄ−ビオ
チン生産能を有するセラチア・マルセッセンスＥＴＡ２
３の細胞にタカギとキスミの方法によって取り込ませた
後、３７℃で７時間培養する。得られた培養液を適当に
希釈した後、硫酸カナマイシン５０μｇ／ｍｌ含有の栄
養寒天平板培地に塗布し、３０℃で一夜培養し、コロニ
ーを出現させる。かくして得られるコロニー１５００個
ついて、カナマイシン耐性とトリメトプリム耐性の有無
を調べ、カナマイシン耐性・トリメトプリム感受性のコ
ロニーを８個を見出した。
【００２９】これらの形質転換株を釣菌分離した後、細
胞から抽出した染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ
とＢａｍＨＩの各々で切断し、アガロース電気泳動を行
った後、ｐＣＨＲ８１中に存在するＴｎ５のＢａｍＨＩ
−ＳｍａＩ断片（５４０ｂｐ）をプローブとしてサザン
ブロット解析を行い、カナマイシン耐性・トリメトプリ
ム感受性の形質転換体では、ビオチン遺伝子断片（ｂｉ
ｏＢ、ｂｉｏＦ、ｂｉｏＣ、ｂｉｏＤの各遺伝子）を含
むＴｎ５が染色体上に挿入されていることを確認した。
その後、発酵培地（ショ糖１０％、尿素１％、リン酸二
カリウム０．１％、硫酸マグネシウム７水和物０．１
％、硫酸第一鉄７水和物０．０１％、炭酸カルシウム２
％）におけるｄ−ビオチン生産能を特開平２−２７９８
０に記載の方法に従って調べることによって、親株に比
べ生産能が最も増大した菌株、セラチア・マルセッセン
スＥＴＡ２３−Ｋ８を得た。なお、サザンブロット解析
の結果では、上記のカナマイシン耐性・トリメトプリム
感受性の形質転換株では、対照であるｐＣＨＲ３０４の
ＨｉｎｄＩＩＩ断片と同じ位置にＤＮＡバンドを認める
一方、親株のＥＴＡ２３の染色体では、プローブに反応
するバンドは認められなかった。また、ＢａｍＨＩ分解
のカナマイシン耐性・トリメトプリム感受性の形質転換
株では、対照であるｐＣＨＲＭ３０４のＢａｍＨＩ断片
とは大きさの異なるバンドを１本認め、親株のＥＴＡ２
３の染色体では、プローブに反応するバンドは認められ
なかった。
【００３０】（３）染色体上に外来ｄ−ビオチン遺伝子
が組み込まれた宿主微生物へのクロロ酢酸耐性の付与 上記で得られたセラチア・マルセッセンスＥＴＡ２３−
Ｋ８をエーデルバーグらの方法によって変異誘起処理
し、栄養培地で１時間培養する。この培養液を遠心分離
し、得られる細胞を生理食塩水で遠心分離法で３回洗浄
する。この細胞を生理食塩水に懸濁し、１ｍｇ／ｍｌの
クロロ酢酸を含有する最少寒天培地（Ｌ−プロリン０．
１％、硫酸アンモニウム０．１％、リン酸一カリウム
０．３％、リン酸二カリウム０．７％、硫酸マグネシウ
ム７水和物０．０１％、寒天１．５％）に１平板当たり
１〜１０×１０５個の細胞を塗布する。３０℃で５日間
培養した後、生じた大きなコロニーを釣菌分離すること
によってクロロ酢酸耐性株セラチア・マルセッセンスＫ
８ＣＬ４８を得た。取得した耐性株の、発酵培地（ブド
ウ糖５％、尿素１％、リン酸一カリウム０．１％、硫酸
マグネシウム７水和物０．１％、硫酸第一鉄７水和物
０．０１％、コーン・スチープ・リカー０．６％、炭酸
カルシウム２％）におけるｄ−ビオチン生産能を調べた
ところ、４８時間培養における本菌株のｄ−ビオチン生
産量は２６ｍｇ／ｌであり、親株のそれは１３ｍｇ／ｌ
であった。
【００３１】（４）ｄ−ビオチン遺伝子断片を含む組換
えプラスミドの調製 セラチア・マルセッセンスＴＡ５０２３株（微工研条寄
第４１０１号）を（２）−（Ａ）と同様に処理して、セ
ラチア・マルセッセンスＳＢ３０３株由来のｄ−ビオチ
ン遺伝子断片（ｂｉｏＡ、ｂｉｏＢ、ｂｉｏＣ、ｂｉｏ
Ｄの各遺伝子）がベクターｐＬＧ３３９のＥｃｏＲＩ−
ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位に挿入され選択マーカーとして
カナマイシン耐性遺伝子を有するｐＬＧＭ２０１のＤＮ
Ａを得る。
【００３２】これとは別に、プラスミド保持安定化遺伝
子ｐａｒＢを有するプラスミドｐＫＧ１０２２を保持す
るエシェリシア・コリＨＢ１０１の細胞から、（２）−
（Ａ）と同様の方法でｐＫＧ１０２２のＤＮＡ０．３ｍ
ｇを得た後、これを制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ
−ＢａｍＨＩで切断する。アガロース電気泳動を行った
後、５８０ｂｐのＤＮＡバンドをゲルから切り出し、電
気溶出法によってｐａｒＢ領域を含むＤＮＡ断片を得
る。ベクターｐＬＧ３３９を保持するエシェリシア・コ
リＣ６００ｒ−ｍ−（ＡＴＣＣ ３３５２５）の細胞か
ら、（２）−Ａと同様の方法でｐＬＧ３３９のＤＮＡ
０．３ｍｇを得た。これを制限酵素ＨｉｎｃＩＩで切断
し、クレノウ酵素で末端を平滑化した上記ｐａｒＢ領域
を含むＤＮＡ断片とＤＮＡリガーゼを用いて結合させた
後、エシェリシア・コリＨＢ１０１を形質転換した。得
られるカナマイシン耐性かつテトラサイクリン感受性の
クローンについて、プラスミドＤＮＡの制限酵素切断地
図を解析し、ｐＬＧ３３９のＨｉｎｃＩＩ部位にｐａｒ
Ｂが挿入された組換えプラスミドｐＬＧ３３９Ｐを得
た。
【００３３】組換えプラスミドｐＢＭ２０１のＤＮＡ
を、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで完全切断する。一
方、上記で得たｐＬＧ３３９ＰをＥｃｏＲＩで完全切断
した後、ＨｉｎｄＩＩＩで部分切断する。両ＤＮＡを結
合し、エシェリシア・コリχ１７７６株（ＡＴＣＣ ３
１２４４）を形質転換する。この形質転換株の中からカ
ナマイシン耐性でかつｄ−ビオチン非要求性のクローン
を選択することによって、ｐＬＧＭ２０１のＨｉｎｃＩ
Ｉ部位にｐａｒＢが挿入され、かつセラチア・マルセッ
センスＳＢ３０３由来のｄ−ビオチン遺伝子断片、プラ
スミド保持安定化遺伝子及びカナマイシン耐性遺伝子を
有するプラスミドｐＬＧＭ２０１ＰＨｃを得た。アンピ
シリン耐性遺伝子を有するプラスミドｐＫＴ２４０を保
持するエシェリシア・コリＨＢ１０１の細胞から、
（２）−（Ａ）と同様の方法でｐＫＴ２４０のＤＮＡを
得た後、ＢａｍＨＩ−ＢｓｔＰＩ切断を行う。ついでア
ガロース電気泳動を行った後、３ｋｂのＤＮＡバンドを
ゲルから切り出すことにより、電気溶出法によってアン
ピシリン耐性遺伝子領域を含むＤＮＡ断片を得た。この
断片をクレノウ酵素で末端を平滑化した。
【００３４】一方、上記で得たｐＬＧＭ２０１ＰＨｃの
ＤＮＡもＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩで切断し、クレノウ酵素
で末端を平滑化する。このＤＮＡと上記の平滑化アンピ
シリン耐性遺伝子領域を含むＤＮＡ断片とをＤＮＡリガ
ーゼで結合した後、エシェリシア・コリＣ６００ｒ−ｍ
−株の細胞を形質転換することによって、ｐＬＧＭ２０
１ＰＨｃのカナマイシン耐性遺伝子がｐＫＴ２４０１由
来のアンピシリン耐性遺伝子に置換された、組換えプラ
スミドｐＬＧＭ２０１ＰＨｃＡを得た（図２参照）。
【００３５】（５）目的微生物の取得 上記で得られる組換えプラスミドｐＬＧＭ２０１ＰＨｃ
Ａを、セラチア・マルセッセンスの制限酵素欠損株であ
るＴＴ３９２株にタカギとキスミの方法によって取り込
ませ、形質転換株を得る。この形質転換株を培養した
後、得られる細胞からクリヤード・ライセイト法によっ
てプラスミドＤＮＡを単離精製することにより、セラチ
ア・マルセッセンスの修飾系によって修飾されたプラス
ミド３００μｇを得た。ついで、このプラスミドを前記
で得たセラチア・マルセッセンスＥＴＡ２３Ｋ−８の細
胞にタカギとキスミの方法によって取り込ませた後、ア
ンピシリン５００μｇ／ｍｌ含有の栄養寒天平板培地に
塗布して、３０℃で一夜培養し、出現したコロニーを釣
菌分離することによって、セラチア・マルセッセンスＥ
ＴＡ２３Ｋ−８を宿主とし、組換えプラスミドｐＬＧＭ
２０１ＰＨｃＡを含有するセラチア・マルセッセンスＴ
Ａ５０２６（微工研条寄第４１０２号）を得た（図１参
照）。なお、本菌株が含有するプラスミドＤＮＡはｐＬ
ＧＭ２０１ＰＨｃＡのＤＮＡと同一であることは制限酵
素切断地図の解析によって確認した。
【００３６】また、ｐＬＧＭ２０１ＰＨｃＡを前記で得
たセラチア・マルセッセンスＫ８ＣＬ４８の細胞にタカ
ギとキスミの方法によって取り込ませた後、アンピシリ
ン５００μｇ／ｍｌ含有の栄養寒天平板培地に塗布し
て、３０℃で一夜培養し、出現したコロニーを釣菌分離
することによって、セラチア・マルセッセンスＫ８ＣＬ
４８を宿主とし、ｐＬＧＭ２０１ＰＨｃＡを含有するセ
ラチア・マルセッセンスＴＡ５０２７（微工研条寄第４
１０３号）を得た（図１参照）。なお、本菌株が含有す
るプラスミドＤＮＡがｐＬＧＭ２０１ＰＨｃＡのＤＮＡ
と同一であることは、制限酵素切断地図の解析によって
確認した。
【００３７】実施例 ２ 実施例１で得られたセラチア・マルセッセンスＴＡ５０
２６をアンピシリン５００μｇ／ｍｌ含有するＬ−ブロ
スの平斜面培地で一夜培養した後、発酵培地（ショ糖１
５％、尿素１．５％、リン酸二カリウム０．１％、硫酸
マグネシウム７水和物０．２％、硫酸第一鉄７水和物
０．０１％、コーン・スティープ・リカー０．１％、及
び炭酸カルシウム１％を含む溶液１５ｍｌを５００ｍｌ
容振盪フラスコに注入し、滅菌したもの。但し、ショ糖
は加熱滅菌した後添加した。）にそれぞれ一白金耳を植
菌する。次いで往復振盪培養（振幅７ｃｍ、１２０回転
／分）する。１２０時間後のｄ−ビオチンの生産量は下
記第１表の通りである。なお、対照株としては、セラチ
ア・マルセッセンスＳＢ４１１（特開平２−２７９８
０）とセラチア・マルセッセンスＴＡ５０２４（特開平
２−２７９８０）を用いた。
【００３８】
【表１】
【００３９】実施例 ３ セラチア・マルセッセンスＴＡ５０２６及びセラチア・
マルセッセンスＴＡ５０２７のそれぞれをアンピシリン
５００μｇ／ｍｌもしくは硫酸カナマイシン１００μｇ
／ｍｌ含有のＬ−ブロス或いはそれらを含有しないＬ−
ブロスの平斜面培地で一夜培養した後、発酵培地（ブド
ウ糖７％、尿素１％、リン酸二カリウム０．１％、硫酸
マグネシウム７水和物０．１％、硫酸第一鉄水和物０．
０１％、コーン・スティープ・リカー０．１％、及び炭
酸カルシウム４％を含む溶液１５ｍｌを５００ｍｌ容振
盪フラスコに注入し、滅菌したもの。但し、ブドウ糖は
加熱滅菌した後添加した。）にそれぞれ一白金耳を植菌
する。次いで往復振盪培養（振幅７ｃｍ、１２０回転／
分）する。１２０時間後のｄ−ビオチンの生産量は下記
第２表の通りである。なお、対照株としては、セラチア
・マルセッセンスＳＢ４１１とセラチア・マルセッセン
スＴＡ５０２４を用いた。
【００４０】
【表２】
【００４１】実施例 ４ 実施例１で得られたセラチア・マルセッセンスＴＡ５０
２６をアンピシリン５００μｇ／ｍｌ含有のＬ−ブロス
斜面培地で一夜培養した後、前培養培地（ショ糖１０
％、尿素１％、リン酸二カリウム０．１％、硫酸マグネ
シウム７水和物０．２％、硫酸第一鉄水和物０．０１
％、コーン・スティープ・リカー０．６％、及び炭酸カ
ルシウム１％、を含む溶液３０ｍｌを５００ｍｌ容振盪
フラスコに注入し、滅菌したもの。但し、ショ糖は加熱
滅菌した後添加した。）に１白金耳を植菌する。次い
で、３０℃にて24時間、往復振盪培養 (振幅７ｃｍ、１
２０回転／分) する。かくして得られる前培養液１４ｍ
ｌを発酵培地〔ショ糖１５％、尿素１．５％、リン酸二
カリウム０．０８％、硫酸マグネシウム７水和物０．２
％、硫酸第一鉄水和物０．０１％、コーン・スティープ
・リカー０．１％、炭酸カルシウム４．２％、及びディ
スホームＣＡ２２０（日本油脂（株）製消泡剤）０．２
８％〕１．０リットルに接種し、１．８リットル容ジャ
ーファーメンター中で３０℃、通気量０．５リットル／
分、溶存酸素濃度が飽和濃度の１０％に保つように撹拌
数を制御しつつ、培養する。培養４８時間から１２０時
間までは、別途調製した添加培地（ショ糖６７．５％、
尿素５％、リン酸二カリウム０．１５％、コーン・ステ
ィープ・リカー０．１％) を５．６ｍｌ／ｈの流速で連
続添加する。また、別途４８時間から１２０時間まで２
４時間毎に２０％、硫酸マグネシウム７水和物０．６７
ｍｌ及び２％硫酸第一鉄７水和物０．９７ｍｌを添加す
る。かくして１４４時間培養することによって、ｄ−ビ
オチン５４０ｍｇ／ｌを含む培養液約１．３リットルを
得ることができる。
【００４２】実施例 ５ 実施例１で得られたセラチア・マルセッセンスＴＡ５０
２７をアンピシリン５００μｇ／ｍｌ含有のＬ−ブロス
斜面培地で一夜培養した後、前培養培地（ブドウ糖５
％、尿素１％、リン酸二カリウム０．１％、硫酸マグネ
シウム７水和物０．２％、硫酸第二鉄０．０１％、コー
ン・スティープ・リカー０．６％及び炭酸カルシウム１
％を含む溶液３０ｍｌを５００ｍｌ容振とうフラスコに
注入し、滅菌したもの。但し、ブドウ糖は加熱滅菌した
後添加した。）に１白金耳を植菌する。次いで、３０℃
にて２４時間、往復振とう培養（振幅７ｃｍ、１２０回
転／分）する。かくして得られる前培養液１４ｍｌを発
酵培地〔ブドウ糖５％、硫酸アンモニウム０．５％、リ
ン酸二カリウム０．２％、硫酸マグネシウム７水和物
０．２％、硫酸第二鉄０．００１％、コーン・スティー
プ・リカー０．７％、およびディスホームＣＡ２２０
（日本油脂（株）製消泡剤）０．２８％（ｐＨ７．
０）〕１．０リットルに接種し、１．８リットル容ジャ
ーファーメンター中で３０℃、通気量０．５リットル／
分、溶存酸素濃度が飽和濃度の１０％を保つように攪拌
数を制御しつつ、培養する。また、培養液のｐＨを水酸
化カリウム−アンモニア混合液を用いて、７．４以下に
低下しないように制御する。培養１日目から３日目まで
は、別途調製した添加培地（ブドウ糖５７．５％、硫酸
アンモニウム０．５％、リン酸二カリウム０．３４％、
硫酸マグネシウム７水和物０．２％、硫酸第二鉄０．０
１％、コーン・スティープ・リカー２．７５％）を３ｍ
ｌ／ｈから１５ｍｌ／ｈの流速で連続添加する。かくし
て３日間培養することによって、ｄ−ビオチン２６０ｍ
ｇ／ｌを含む培養液約１．３リットルを得ることができ
る。
【００４３】実施例 ６ 実施例４に従って得た培養液６．０リットルを集め、塩
酸の添加によってｐＨを２．７に調整した後、ミクロフ
ィルター（旭化成（株）製マイクローザＳＰ１１３型）
を用いて除菌し、７．６リットルのろ液を得る。このろ
液をハイポーラス型合成吸着剤（三菱化成（株）製ＳＰ
２０７）のカラム（樹脂量１０００ｍｌ、直径４０ｍ
ｍ）にＳＶ＝２の流速で導通することによって、ろ液中
のｄ−ビオチンを吸着させ、１リットルの希塩酸溶液
（ｐＨ３．０）をＳＶ＝２で導通することによって洗浄
する。その後に、メタノール−アンモニア水（１：９）
をＳＶ＝２で導通することによって、ｄ−ビオチンを溶
出する。
【００４４】上記によって得た溶出液１．８リットルを
ロータリーエバポレーターによって減圧濃縮し、９００
ｍｌの濃縮液を得た後、強塩基性陰イオン交換樹脂（三
菱化成（株）製ダイアイオンＳＡ−１１Ａ）のカラム
（樹脂量１００ｍｌ，直径２０ｍｍ）に導通・吸着し、
水２００ｍｌで洗浄した後、９００ｍｌの０．２Ｎ塩化
アンモニウム−０．２Ｎアンモニア（１：１）をＳＶ＝
２で導通することによってｄ−ビオチンを溶出する。さ
らに、この溶出液９００ｍｌを減圧濃縮によって、６０
ｍｌに濃縮した後、濃塩酸を加えることによって、ｐＨ
を２．７に調整し、１０℃以下で一夜放置する。かくす
ることによって、ｄ−ビオチンが結晶として析出する。
生じた結晶をろ取・乾燥することに粗結晶４．５ｇを得
た後、水から再結晶することによって、ｄ−ビオチン
２．３ｇを得る。
【００４５】
【発明の効果】本発明の微生物、即ち、ｄ−ビオチン生
産能を有するセラチア属微生物からクローン化されたビ
オチン遺伝子を組み込んだプラスミドがｄ−ビオチン生
産能を有する宿主微生物に導入され、かつ該宿主微生物
の染色体上に外来のビオチン遺伝子が組み込まれた微生
物は、飛躍的に高いｄ−ビオチン生産能を有しており、
この微生物を培養することにより、ｄ−ビオチンを容易
に大量生産することができる。
【００４６】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の微生物であるセラチア・マルセッセン
スＴＡ５０２６およびＴＡ５０２７の構築手順を示す略
図である。
【図２】組換えプラスミドｐＬＧＭ２０１ＰＨｃＡの構
築手順を示す略図である。
【図３】組換えプラスミドｐＣＨＲ８１におけるトラン
スポゾンＴｎ５の位置を示す略図である。
【図４】組換えプラスミドｐＣＨＲＭ３０４の構築手順
を示す略図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:43） (56)参考文献 特開 平２−27980（ＪＰ，Ａ) 特表 昭64−500081（ＪＰ，Ａ) 発酵と工業 46〜２！（1988） Ｐ. 102−111 ＧＥＮＥ 56（1987） Ｐ．283−288

Claims (8)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ｄ−ビオチン生産能を有するセラチア属
    微生物からクローン化されたビオチン遺伝子を組み込ん
    だ組換えプラスミドを、ｄ−ビオチン生産能を有するセ
    ラチア属宿主微生物に導入して得られる微生物であっ
    て、該宿主微生物が、（１）ビオチン類似物質耐性、メ
    チオニン類似物質耐性およびリジン類似物質耐性を有
    し、かつ（２）該宿主微生物の染色体上に外来のビオチ
    ン遺伝子が組み込まれてなることを特徴とする微生物。
  2. 【請求項２】 ビオチン遺伝子がビオチン類似物質耐性
    を有するセラチア属微生物からクローン化されたもので
    ある請求項１記載の微生物。
  3. 【請求項３】 宿主微生物が、更に酢酸類似物質耐性を
    有するセラチア属微生物である請求項１記載の微生物。
  4. 【請求項４】 ビオチン類似物質がアクチチアジン酸、
    ５−（２−チエニル）吉草酸またはデヒドロビオチンで
    あり、メチオニン類似物質がエチオニンであり、リジン
    類似物質がＳ−アミノエチルシステインである請求項１
    記載の微生物。
  5. 【請求項５】 酢酸類似物質がクロロ酢酸である請求項
    ３記載の微生物。
  6. 【請求項６】 セラチア・マルセッセンスＴＡ５０２６
    （微工研条寄第４１０２号）である請求項１記載の微生
    物。
  7. 【請求項７】 セラチア・マルセッセンスＴＡ５０２７
    （微工研条寄第４１０３号）である請求項３記載の微生
    物。
  8. 【請求項８】 請求項１、２、３、４、５、６または７
    記載の微生物を、培地中で培養することによって、該培
    地中にｄ−ビオチンを生成蓄積せしめ、これを採取する
    ことを特徴とするｄ−ビオチンの製法。
JP4051071A 1992-01-24 1992-01-24 新規微生物及びそれを用いるｄ−ビオチンの製法 Expired - Lifetime JP2658716B2 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP4051071A JP2658716B2 (ja) 1992-01-24 1992-01-24 新規微生物及びそれを用いるｄ−ビオチンの製法
US08/004,111 US5374554A (en) 1992-01-24 1993-01-13 Microorganism and process for preparing D-biotin using the same
TW082100375A TW262489B (ja) 1992-01-24 1993-01-20
CN93102377A CN1076487A (zh) 1992-01-24 1993-01-21 新的微生物和用所述微生物制备d-生物素的方法
KR1019930000838A KR100192024B1 (ko) 1992-01-24 1993-01-21 신규의 미생물 및 이를 사용한 d-비오틴의 제조방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP4051071A JP2658716B2 (ja) 1992-01-24 1992-01-24 新規微生物及びそれを用いるｄ−ビオチンの製法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH05199867A JPH05199867A (ja) 1993-08-10
JP2658716B2 true JP2658716B2 (ja) 1997-09-30

Family

ID=12876579

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP4051071A Expired - Lifetime JP2658716B2 (ja) 1992-01-24 1992-01-24 新規微生物及びそれを用いるｄ−ビオチンの製法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US5374554A (ja)
JP (1) JP2658716B2 (ja)
KR (1) KR100192024B1 (ja)
CN (1) CN1076487A (ja)
TW (1) TW262489B (ja)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3629290B2 (ja) * 1993-10-01 2005-03-16 協和醗酵工業株式会社 物質の製造法
US5693504A (en) * 1994-12-15 1997-12-02 Takeda Chemical Industries, Ltd. Microorganism resistant to nicotinic acid analogue and production of biotin
US5529929A (en) * 1995-06-07 1996-06-25 Seprachem, Inc. Optical resolution of alkyl 1,4-benzodioxan-2-carboxylates using esterase from serratia marcescens
US5658796A (en) * 1995-06-07 1997-08-19 Seprachem, Inc. Optical resolution of alkyl chroman-2-carboxylates
AU7338096A (en) 1995-11-02 1997-05-22 Shiseido Company Ltd. Microorganism resistant to threonine analogue and production of biotin
US6737256B2 (en) * 1997-07-14 2004-05-18 Roche Vitamins Inc. Overcoming DAPA aminotransferase bottlenecks in biotin vitamers biosynthesis
KR101023788B1 (ko) * 2008-04-18 2011-03-21 주식회사 콧데 재조합 플라스미드, 이 재조합 플라스미드에 의해형질전환된 바이오틴 생산균 및 이 형질전환된 바이오틴생산균을 이용한 바이오틴 생산방법

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ217336A (en) * 1985-08-26 1988-06-30 Amgen Production of biotin from microorganisms
JPS62155081A (ja) * 1985-12-27 1987-07-10 Shiseido Co Ltd 新規微生物およびそれを用いる醗酵法によるビオチンの製造法
JP2722504B2 (ja) * 1988-07-14 1998-03-04 田辺製薬株式会社 新規微生物及びそれを用いるｄ−ビオチンの製法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ＧＥＮＥ ５６（１９８７） Ｐ．２８３−２８８
発酵と工業 ４６〜２！（１９８８） Ｐ．１０２−１１１

Also Published As

Publication number Publication date
US5374554A (en) 1994-12-20
KR930016540A (ko) 1993-08-26
TW262489B (ja) 1995-11-11
JPH05199867A (ja) 1993-08-10
CN1076487A (zh) 1993-09-22
KR100192024B1 (ko) 1999-06-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5304472A (en) Method of controlling polypeptide production in bacterial cells
DE19907567B4 (de) Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von L-Valin
Frost et al. Dehydroquinate synthetase from Escherichia coli: purification, cloning, and construction of overproducers of the enzyme
JPH0665305B2 (ja) 組換えｄｎａ含有宿主細胞の安定化法
EP1067192A1 (de) L-Lysin produzierende coryneforme Bakterien und Verfahren zur Herstellung von L-Lysin
JP2763119B2 (ja) 低い酢酸産生能を有する微生物、及びこれを用いる有用物質の製造方法
JPS63233798A (ja) ５′−グアニル酸の製造法
KR100511734B1 (ko) 광학활성화합물의제조방법
EP0236429B1 (en) System for biotin synthesis
JP2658716B2 (ja) 新規微生物及びそれを用いるｄ−ビオチンの製法
EP0798384A1 (de) Biotechnologisches Verfahren zur Herstellung von Biotin
Yim et al. High-level secretory production of human granulocyte-colony stimulating factor by fed-batch culture of recombinant Escherichia coli
US6617130B1 (en) DNA construct for regulating the expression of a polypeptide coding sequence in a transformed bacterial host cell
KR101461408B1 (ko) 신규 선택 시스템
CN114540399B (zh) 一种制备l-缬氨酸的方法及其所用基因突变体和生物材料
JP2722504B2 (ja) 新規微生物及びそれを用いるｄ−ビオチンの製法
IE53607B1 (en) Expression vectors
CN114181288A (zh) 制备l-缬氨酸的方法及其所用的基因与该基因编码的蛋白质
US6020173A (en) Microorganism resistant to threonine analogue and production of biotin
US4988622A (en) Recombinant plasmid DNA pVN 22 coding biosynthesis of human leukocyte interferon alpha-I1 and strain Pseudomonas sp. 31 (pVN 22) - producer of human leukocyte interferon alpha-I1 containing same
KR100207951B1 (ko) 대장균의 과발현 재조합 벡터 및 이를 이용한 인 과립구 콜로니 자극인자의 제조방법
JP3739843B2 (ja) ニコチン酸アナログ耐性微生物およびビオチンの製造法
JPH09220093A (ja) イノシトール−１−リン酸合成酵素をコードするｄｎａ、それを含む組換えｄｎａ、形質転換体およびそれを用いたイノシトールの製造方法
US5693504A (en) Microorganism resistant to nicotinic acid analogue and production of biotin
US20060286631A1 (en) Method for preparating t-20 peptide by high cell density cultivation of recombinant e. coli containing t-20 peptide coding gene

Legal Events

Date Code Title Description
S111 Request for change of ownership or part of ownership

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080606

Year of fee payment: 11

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090606

Year of fee payment: 12

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100606

Year of fee payment: 13

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110606

Year of fee payment: 14

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110606

Year of fee payment: 14

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120606

Year of fee payment: 15

EXPY Cancellation because of completion of term
FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120606

Year of fee payment: 15