CN1076487A - 新的微生物和用所述微生物制备d-生物素的方法 - Google Patents
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Abstract
一种通过导入掺有生物素基因的重组质粒并进
一步将外源生物素基因整合到染色体中,从能生产d
—生物素的宿产微生物中衍生而来的微生物,所述的
生物素基因是从能生产d—生物素的沙雷氏菌属的
微生物中克隆的,以及一种制备d—生物素的方法,
包括在培养基中培养微生物以便在培养基中形成和
积累d—生物素,并收集d—生物素。本发明的微生
物有极高的d—生物素生产能力,并因此,通过培养
发明的微生物可以大量生产d—生物素。
Description
本发明涉及一种新的微生物和用所述微生物制备d-生物素的方法。
d-生物素是一种人类或其它动物必需的维生素,并用作药物的原料或作为饲料添加剂。作为一种传统发酵介质通过发酵方法制备d-生物素的方法,已经知道用来源于埃希氏杆菌属(Escherichia)或沙雷氏菌属(Serratia)的基因工程微生物制备d-生物素的方法。(参见日本专利公开(Kohyo)No.500081/1989,日本专利第一次公开(Kokai)No.155081/1987和日本专利第一次公开(Kokai)No.27980/1990。
然而,使用基因工程微生物的这些方法生产d-生物素的效率不高,因此,需要构建一种有高d-生物素生产能力的新微生物,并且需要发展一种改进的能用所述微生物高效率生产d-生物素的工业发酵方法。
作为多种研究结果,本发明人已经发现(Ⅰ)通过突变放线噻唑酸抗性突变体以便获得抗乙基硫氨酸或S-氨乙基半胱氨酸抗性,得到的突变型微生物表现出提高了d-生物素生产能力;(Ⅱ)能够生产d-生物素的沙雷氏菌属的一种微生物(其中将从沙雷氏菌属微生物克隆的负责生产d-生物素的染色体脱氧核糖核酸片段(下文称之为“DNA”)利用转座子整合到染色体中)表现出极高的d-生物素生产能力;(Ⅲ)当有较高d-生物素生产能力的这些微生物得到附加的抗乙酸类似物如氯乙酸抗性时,上述的微生物可以进一步表现出极高的d-生物素生产能力;且另外(Ⅳ)当将上述的微生物(Ⅱ)或(Ⅲ)与含有载体和生物素基因片段(从放线噻唑酸抗生突变型克隆的)的重组质粒结合时,所得的微生物表现出明显提高的d-生物素生产能力,并且用这种微生物(Ⅳ)有利于工业规模生产d-生物素。
本发明的目的是提供一种从能够生产d-生物素的宿主微生物衍生的微生物,通过导入与能够生产d-生物素的沙雷氏菌属微生物克隆的生物素基因混合的重组质粒,并通过将外源的生物素基因整合到所述宿主微生物的染色体中得到上述的微生物。
本发明的另一目的是提供一种制备d-生物素的方法,该方法包括在培养基中培养所述的微生物以便d-生物素在培养基中形成并积累,然后收集生产的d-生物素。
图1.说明本发明的新微生物粘质沙雷杆菌TA5026和TA5027的构建。
图2.说明重组质粒pLGM201PHcA的构建。
图3.表明在重组质粒pCHR81中转座子Tn5的位置。
图4.说明重组质粒pCHRM304的构建。
[A]生物素基因的来源:
本文涉及的生物素基因是指在体内参与d-生物素生产的任何基因,如编码7.8-二氨基壬酸氨基转移酶(bioA)的基因,编码生物素合成酶(bioB)的基因,编码7-氧代-8-氨基壬酸合成酶的基因(bioF),编码庚二酰-CoA合成酶的基因(bioC)和编码去硫代生物素合成酶的基团(bioD),或这些基因的部分。上述基因的来源包括能生产d-生物素的属于沙雷氏菌属的微生物[参见Bergey′s Manual of Systematic Bacteriology,Vol.1,p477(1984)]。本发明所用的生物素基因最好是从表现抗生物素类似物如放线噻唑酸,5-(2-噻吩基)-戊酸,脱氢生物素等抗性的沙雷氏菌属的微生物衍生的。
上述微生物包括表现放线噻唑酸抗生的微生物,如粘质沙雷杆菌SB303(FERM P-10119)和粘质沙雷杆菌SB411[参见日本专利第一次公开(Kokai)No.27980/1990]。另外,通过如日本专利第一次公开(Kokai)No.27980/1990中描述的已知方法,使对生物素类似物没有任何抗性的微生物例如野生型粘质沙雷杆菌菌株Sr41 8000(FERM BP-487)获得抗生物素类似物的抗性后,也适于作为生物素基因源使用。
除表现对生物素类似物的抗性外,还表现出对蛋氨酸类似物如乙基硫氨酸的抗性,对赖氨酸类似物如S-氨乙基半脱氨酸的抗性,和对乙酸类似物如氯乙酸的抗性的这些微生物也可以作为生物素基因源使用。
[B]载体质粒:
用于与上述的生物素基因一起构建重组质粒的载体质粒可以是任何在转化细胞中可复制的质粒,但比较好地是有1到数千拷贝数并含对抗生素如氨苄青霉素,卡那霉素、氯霉素等抗性标记,此外还包含适当启动子如lac,tac,或trp的质粒。此外,载体质粒还可包含质粒稳定基因如par和par B。
这些载体质粒包括,如pLG339[参见Gene,Vol.18,page335(1982)],pBR322[参见,Gene,Vol.2,page 95(1977)],pUC18[参见,Gene,Vol.33,page 103(1985)],pUC19[参见,Gene,Vol.33,page 103(1985)],pHSG298,[参见.Gene,Vol.61,page 63(1987)],pHSG299[参见,Gene,Vol.61,page 63(1987)],pKG1022[参见,Biotechnology,Vol.6,page1402(1988)],pKT240[参见,Gene,Vol.26,page 273(1983)等质粒。另一个载体质粒的适宜的实例是质粒pCHR81,该质粒是从共轭的质粒R388得到的温度敏感型复制质粒,其中将Tn5作为转座子掺入并包含卡那霉素抗性基因和三甲氧苄二氨嘧啶抗性基因作为选择标记[参见,Gene,Vol.56,page 283(1987)]。
上述的质粒可从市场购买,或可以通过传统方法,如“澄清溶胞产物法”(参见,Yasuyuki Takagi,"Procedure for Experiment in Genetic Engineering"page 125,published by Kodansha,1980),或通过碱溶解法“[参见,Maniatis et al,"Molecular Cloning",page368,Cold Spring Harbor Laboratory,U.S.A(1982)]由含这些质粒的微生物细胞来制备。
[C]宿主微生物:
本发明的宿主微生物可以是任何能够生产d-生物素的微生物。
具体说来,优选的宿主微生物是对全部或任何一种生物素类似物如放线噻唑酸,5-(2-噻吩基)戊酸,脱氢生物素等,乙酸类似物如氯乙酸等,蛋氨酸或蛋氨酸类似物如乙基硫氨酸等,如赖氨酸类似物如S-氨乙基半胱氨酸等有抗性的沙雷代菌属的微生物。最优选的一种是对放线噻唑酸,乙基硫氨酸和S-氨乙基半胱氨酸有抗性的粘质沙雷菌或进一步还对氯乙酸有抗性的粘质沙雷杆菌。
上述宿主微生物包括,如对放线噻唑酸有抗性并能生产d-生物素的粘质沙雷杆菌,如,粘质沙雷杆菌SB303(FERM P-10119)和粘质沙雷杆菌SB411[日本专利第一次公开(Kokai)No.27980/1990],包含将生物素基因插入到载体pLG339中而构建的重组质粒pLGM201的粘质沙雷杆菌TA5023(FERM BP-4101)等等。另外,在使野生型粘质沙杆菌菌株Sr41 8000(FERM BP-487)得到对上述物质的抗性后也是适用的。
可以通过已知方法使宿主微生物得到上述抗性。例如,将适宜的微生物经传统的诱变处理,然后在27℃到37℃,在基本琼脂培养基上培养3到7天,该培养基补充有可使所述微生物得到所需要的上述物质(如生物素类似物,乙酸类似物等)抗性的所述物质,该基本琼脂培养基例如是Davis-Mingioli基本培养基[Journal of Bacteriology,Vol.60.page17(1950)]或其改良的培养基,其中用各种糖,有机酸或氨基酸代替碳源,然后分离形成的大量菌落,然后,用胚芽乳酸杆菌(参见,Seikaguku Jikken Koza,Vol.13,page 355)通过微生物定量法在发酵培养基中检测分离出的微生物的d-生物素生产能力,以选择具有所需抗性的微生物。
可以在将重组质粒导入或将外源生物素基团整合到宿主微生物染色体中之后或之前,处理宿主微生物,使其获得抗性。
[D]制备重组质粒:
可以通过传统方法,如通过“澄清溶胞产物法”[参见,Yasu yuki Takagi,"Procedure for Experiment in Genetic Engineering",page125,published by Kodansha,1980,Maniatiset al,"Molecular Cloning",page86,Cold Spring Harbor Laboratory,U.S.A(1982)]从上述含生物素基因的微生物中制备生物素基因。例如,用适当的限制酶消化含生物素基因的染色体并经琼脂糖凝胶电泳得到的基因片段。然后,从琼脂糖凝胶上分离含生物素基因片段的部分并用渗析管将其经电泳洗脱法处理[参见,Maniatis et al,"Molecular Cloning",page164,Cold Spring Harbor Laboratory(1982)]。
此后,用适当的限制酶(如,EcoRⅠ,HindⅢ,BamHⅠ,SalⅠ等)部分消化载体质粒并通过DNA连接酶(例如T4连接酶,E.ColiDNA连接酶等)将得到的部分消化片段与上述的生物素基因片段相连以制备重组质粒。载体质粒可以是一种与负责质粒稳定基因如parB[Journal of Molecular Biology,Vol 203,page119(1988)]的DNA片段掺合的质粒或一种含适当选择标记基因的质粒。然后,用上面得到的重组质粒DNA转化限制酶缺陷型d-生物素需要突变体[如,大肠杆菌x1776菌株(ATCC31244);Molecular Cloning of Recombinant DNA,page 248,ed by Scott and Werner,Academic Press(1977)etc]并分离具卡那霉素抗性的并在用7-氧代-8-氨基壬酸补充的培养基上不需要d-生物素的那些微生物,接着从得到的克隆中提取质粒DNA,得到所需的重组质粒。
[E]将生物素基因掺入到染色体中的宿主微生物:
通过将外源生物素基因连接到含一个转座子和一个标记基因的质粒中,并将所述质粒导入宿主微生物中来制备染色体中掺有生物素基因的宿主微生物。
该质粒包括为了将转座子整合到染色体中而构建的pCHR81质粒[Gene,Vol.56,page 283(1987)]。质粒pCHR81包含一个掺入的转座子Tn5,并有作为选择标记基因的卡那霉素抗性基因和三甲氧苄二氨嘧啶抗性基因。用一个限制酶位点如SmaⅠ.SalⅠ,BamHⅠ等将外源基因连接到Tn5的适当部分,然后将所得的重组质粒导入到宿主微生物中。
在将重组质粒导入到宿主微生物之前,最好通过沙雷氏菌属的微生物的修饰系统修饰连接有外源基因的质粒。例如,用Takagi和Kisumi的方法[Journal of Bacteriology,Vol.161,page 1(1985)]通过导入外源基因连接到粘质沙雷杆菌TT392(粘质沙雷杆菌Sr41的突变菌株)的质粒来完成上述修饰,并通过澄清溶胞产物法从所得的转化微生物中分离质粒。
通过Takagi和Kisumi的方法将修饰好的质粒导入到宿主微生物中,并在约37℃将宿主微生物培养数小时,然后适当稀释后,将得到的培养溶液铺在营养琼脂平皿上。然后在30℃培养过夜使形成菌落,并挑选表现卡那霉素和三甲氧苄二氨嘧啶敏感性的菌落。将菌落分离后,用相应于Tn5DNA中适当部分的探针,将来自微生物细胞的染色体DNA,进行Southern印迹分析,并由此可以将在预定核苷酸数的位点表现DNA带的菌株鉴定为染色体中整合有外源生物素基因的沙雷氏菌属的宿主微生物。
[F]制备含重组质粒的沙雷氏菌属微生物,所述的重组质粒包含一个克隆的生物素基因片段。
可以将生物素基因掺入载体质粒中而构建的重组质粒导入到染色体内掺有生物素基因的宿主微生物中,例如,通过Takagi和Kisumi的方法。通过重组质粒的药物抗性标记可以选择转化的微生物。因此得到的重组微生物包括如粘质沙雷氏菌TA5027(FERM BP-4103)(通过将含d-生物素基因片段的重组质粒pLGM201PHCA)导入到有对放线噻唑酸,乙基硫氨酸,S-氨乙基半胱氨酸和氯乙酸抗性,并在染色体中含外源d-生物基因片段的宿主微生物粘质沙雷杆菌K8CL48中而制备的);如粘质沙雷杆菌TA5026(FERM BP-4102)(通过将含d-生物素基因片段的重组质粒pLGM2019HCA导入到有放线噻唑酸,乙基硫氨酸和S-氨乙基半胱氨酸抗性并在染色体中含外源d-生物素基因片段的宿主微生物粘质沙雷杆菌ETA23K-8而制备的)等等。
[G]培养:
培养由此制备的能够生产d-生物素的微生物以便在培养基中以高浓度形成并积累d-生物素。
用于生产d-生物素的培养基包括任何微生物能生长于其中的传统培养基。适宜的培养基包含碳源如糖类(如,葡萄糖,蔗糖,糖蜜等),有机酸(如,富马酸,柠檬酸等),或醇(如,甘油等);氮源如无机铵盐(如,硫酸铵,氯化铵等)或尿素;和有机营养物如玉米浸浆,胨醇母提取物,或酪蛋白水解产物等。碳源的含量通常为全部培养基重的10到30%,氮源的含量通常为全部培养基重的1到3%,有机营养物的含量通常为全部培养基重量的0到1%。另外培养基还任意含有少量的磷酸钾,硫酸镁,硫酸铁,钼酸钠等。另外为了将培养基的PH调至6到8,培养基还可任意含有碳酸钙,铵等。
将本发明的微生物接种到上述培养基中,在25°-37℃振动培养或在需氧条件(如通气培养)下,培养3到7天并由此在培养基中形成并积累了显著量的d-生物素。另外通过在培养期间适当的时间或连续加入上述培养基成份还可进一步提高培养基中形成并积累d-生物素量。
[H]从培养基溶液中分离并纯化d-生物素:
从由此得到的含培养基溶液的d-生物素中,可以按下列方法分离并纯化d生物素。
首先,用盐酸酸化发酵后溶液,然后用中空纤维型的微孔滤器除去微生物细胞。使所得的过滤液通过用高多孔型合成吸收剂充填的柱子以便将滤液中的d-生物素吸附到吸收剂上。
用稀释的盐酸溶液洗涤柱子后,使甲醇-氨溶液(1∶9)和类似物流过柱子,洗脱所需的d-生物素。
然后,在减压下浓缩含d-生物素的洗脱液,并让浓缩物通过用强碱阴离子交换树脂充填的柱子以便将d-生物素吸附到树脂上。用水冲洗柱子并然后用氨水和类似物质洗脱d-生物素。在减压下再浓缩洗脱液并用盐酸和类似物质将其PH调至3.0左右。在5°到10℃冷却浓缩液并放置过夜,由此结晶出d-生物素。然后通过过滤和干燥分离得到的晶体,得到高产率的晶体形式的d-生物素。
实施例
通过下列实施例说明本发明,但不应构成对本发明的限制。
在实施例中,用胚芽乳酸杆菌的微生物定量方法[参见,Seikagaku Jikken Koza,Vol.13 page 355;ed.by Zenji Nose et al,Published by Tokyo Kagaku Dojin(1975)]测定d-生物素。
实施例1
(1)制备有放线噻唑酸,乙基硫氨酸和S-氨乙基半脱氨酸抗性的宿主微生物:
(A):通过Edelberg等人的方法[Biochemical and Biophgsical Research Communications,Vol.18,page 788(1965)]使具有放线噻唑酸抗性并能生产d-生物素[日本专利第一次公开(Kokai)No.27980/1990]的粘质沙雷杆菌SB411细胞经诱变处理,并将其在营养培养基(葡萄糖0.5%,胨1.0%,肉提取物0.3%,酵母提取物1.0%,氯化钠0.5%)中培养1小时。将培养溶液离心(1000xg)并通过离心处理用生理盐水将得到的细胞洗涤3次。将细胞悬浮在生理盐水中,并将其以每盘1到10×105个细胞铺于含60mMDL-乙基硫氨酸的基本琼脂培养平盘(葡萄糖0.5%,磷酸二氢钾0.3%,磷酸氢二钾0.7%,7水合硫酸镁0.01%,琼脂1.5%)上。在30℃培养5天后,分离形成的大量菌落以得到乙基硫氨酸抗性菌株。
(B):通过在日本专利第一次公开No.27980/1990中描述的方法在发酵培养基,(蔗糖10%,尿素1%,磷酸氢二钾0.1%,7水合硫酸镁0.1%,7水合硫酸铁0.01%,碳酸钙2%)中检测所得的抗性菌株生产d-生物素的能力,以得到与母本相比表现出d-生物素生产能力显著提高的粘质沙雷杆菌ET2菌株。
由该菌株生产的d-生物素量是24mg/l而由其母本生产的d-生物素量是16mg/l。
(C):以上述步骤(A)中相同的方法使得到的粘质沙雷杆菌ET2细胞经诱变处理,然后按1到10×105个细胞/每盘将其铺于含50mM S-氨乙基半胱氨酸的基本琼脂培养平盘上。在30℃培养5天后,分离形成的大量菌落以得到S-氨乙基半胱氨酸抗性菌株。按照步骤(B)中描述的方法,在发酵培养基中检测这些菌株生产d-生物素的能力以便得到与其母体相比,生产d-生物素能力显著提高的粘质沙雷杆菌ETA23菌株。
该菌株生产d-生物素的量是33mg/l而其母本生产d-生物素的量是23mg/l。
(2)将外源生物素基因整合到宿主微生物的染色体上:
(A):将含pCHR81[Gene,Vol.56,page 283(1987)]的大肠杆菌MC1061接种到含0.2%葡萄糖的L-液体培养基中,并在30℃振荡培养16小时。通过离心收集细胞并用溶菌酶和十二烷基磺酸钠溶解细胞。然后将氯化钠加到溶胞产物中使最后浓度为1M,并将所得的溶胞产物离心(100,000xg,30分钟)。分离上清液用酚处理,用乙醇补充并离心。将沉淀溶解在10mM Tris Hcl-1mM乙二胺四乙酸二钠(PH7.5)中,并使溶液经用氯化铯-溴化3.8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓平衡的密度梯度离心(200,000xg,16小时)以分离并纯化质粒DNA从而得到pCHR81 DNA(0.3mg)(图3)。
(B):按照方法(2)(A)中同样的方法分离重组质粒pBM201,该质粒是用Hind Ⅲ和EcoRⅠ处理从粘质沙雷杆菌SB303中分离的染色体DNA和载体质粒pBR322,然后将它们连接在一起而构建的(参见,日本专利第一次公开No,27980/1990;实施例2)。用限制内切酶BamHⅠ完全消化该质粒的DNA(0.5mg)然后经琼脂糖凝胶电泳并分离含6Kb DNA片段的凝胶。把该凝胶放到渗析管中并进行电洗脱以得到包含4个负责d-生物素生产的基因(即bioB,bioF,bioC,bioD,基因)的6kb DNA片段(100μg)。
(C):用限制酶BamHⅠ部分消化方法(2)(A)中得到的pCHR81 DNA(1μg)。热处理10分钟后,将消化的DNA与方法(B)的生物素基因片段(1μg)混和,并在通常条件下用从T4噬菌体得到的DNA连接酶处理混和物以连接DNA链制备重组质粒。用得到的重组质粒DNA转化限制酶缺陷d-生物素需要型大肠杆菌x1776(ATCC31244)将得到的转化细胞铺到含硫酸卡那霉素(100μg/ml)和dl-脱硫生物素(0.2μg/ml)的基本琼脂(葡萄糖0.5%,硫酸铵0.1%,磷酸氢二钾0.7%,磷酸二氢钾0.3%,7水合硫酸镁0.01%,二氨基庚二酸0.01%,胸苷0.004%,无维生素酪氨酸水解物0.2%,琼脂1.5%)平盘上,并在30℃培养一天。分离形成的对卡那霉素有抗性的,并不需要d-生物素的菌落。用限制酶BamHⅠ消化从10个菌落中提取的质粒DNA,并使得到的片段经琼脂糖凝胶电泳分析得到重组质粒pCHRM304,该重组质粒中,6Kb的生物素基因片段插入在pCHR81的Tn5内的BamHⅠ位点(图4)。在该重组质粒中,以pCHR81中同样的方向连接Tn5片段。
(D):通过Takagi和Kisumi的方法将在方法(C)中得到的重组质粒pCHRM304的DNA与粘质沙雷杆菌的限制酶缺陷型菌株TT392细胞混合以得到转化细胞。培养得到的转化细胞后,通过澄清溶胞产物法从该处分离并纯化质粒DNA以得到由粘质沙雷杆菌的修饰系统修饰的重组质粒的DNA(250μg)。然后通过Takagi和Kisumi的方法将该重组质粒DNA掺入到能生产d-生物素的粘质沙雷菌ETA23中,并在37℃将细胞培养7小时。适当稀释后,将培养溶液铺到用硫酸卡那霉素(50μg/ml)补充的营养琼脂平盘上,并在30℃过夜培养以便形成菌落。检测得到的1500个菌落是否存在卡那霉素抗性和三甲氧苄二氨嘧啶抗性以选择8个具有卡那霉素抗性并对三甲氧苄二氨嘧啶敏感的菌落。
分离转化的菌株并从细胞中提取染色体DNA,并分别用限制酶HindⅢ和BamHⅠ消化。使得到的DNA片段经琼脂糖凝胶电泳,然后用在pCHR81中的Tn5的BamHⅠ-SmaⅠ片段(540bp)作为探针完成Southern印迹分析,以确定含生物素基因片段(bioB,bioF,bioC,bioD基因)的Tn5已被插入到表达卡那霉素抗性和三甲氧苄二氨嘧啶敏感性的转化细胞中的染色体上。然后,通过日本专利第一次公开No.279980/1990中描述的方法,在发酵培养基(蔗糖10%,尿素1%,磷酸氢二钾0.1%),7水合硫酸镁0.1%,7水合硫酸铁0.01%,碳酸钙2%)中检验这些转化细胞生产d-生物素的能力,由此得到与母本相比表现d-生物素生产能力提高最大的菌株,粘质沙雷杆菌ETA23-K8。
上述的Southern印迹分析进一步证实在HindⅢ消化的情况下,表达卡那霉素抗性和三甲氧苄二氨嘧啶敏感性的转化细胞,在与对照的pCHRM304的HindⅢ片段同样的位点处表现一个DNA带,另一方面,母本菌株ETA23的染色体不显示与该探针反应的DNA带。该分析还证实,在BamHⅠ消化的情况下,表达卡那霉素抗性和三甲氧苄二氨嘧啶敏感性的转化细胞表现出一个与对照pCHRM304的BamHI片段大小不同的DNA带,另一方面,母本菌株ETA23的染色体不显示与探针反应的DNA带。
(3)通过将外源生物素基因整合到染色体上的宿主微生物得到对氯乙酸的抗性:
用Ederberg等人的方法,使上面方法中得到的粘质沙雷杆菌ETA23-K8细胞经诱变处理,并在营养培养基中培养1小时。离心处理培养溶液并通过离心用生理盐水将得到的细胞洗涤3次。将细胞悬浮在生理盐水中,并按每盘1到10×105个细胞将其铺到用氯乙酸(1mg/ml)补充的基本琼脂平盘(L-脯氨酸0.1%,硫酸铵0.1%,磷酸二氢钾0.3%,磷酸氢二钾0.7%,7水合硫酸镁0.01%,琼脂1.5%)上。在30℃培养5天后,分离形成的大量的菌落以得到氯乙酸抗性菌株,粘质沙雷杆菌K8CL48。
在发酵培养基(葡萄糖5%,尿素1%,磷酸二氢钾0.1%,7水合硫酸镁0.1%,7水合硫酸铁0.01%,玉米浸浆0.6%,碳酸钙2%)中检测得到的药物抗性菌株生产d-生物素的能力,结果,该菌株在48小时培养期间生产26mg/l d-生物素,而母本菌株生产13mg/l d-生物素。
(4)制备含生物素基因片段的重组质粒:
按与方法(2)(A)中一样的方法处理粘质沙雷杆菌TA5023(FERM BP-4101)以得到有卡那霉素抗性基因作为选择标记的pLGM201的DNA,其中将从粘质沙雷杆菌SB303得到的生物素基因片段(bioA,bioB,bioC,bioD基因)掺入到载体pLG339的EcoRⅠ-HindⅢ消化住点。
另外,按照与方法(2)(A)同样的方法从包含有质粒稳定基因parB的质粒pKG1022的大肠杆菌HB101得到pKG1022的DNA(0.3mg),并用限制内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ消化它。将得到的DNA片段经琼脂糖凝胶电泳,从凝胶上分割出一个580bp的DNA带,并使其经电洗脱法以得到一个含parB区的DNA片段。
按与方法(2)(A)同样的方法从含载体pLG339的大肠杆菌C600r-m-(ATCC33525)得到载体pLG339DNA(0.3mg)。用限制酶HincⅡ消化得到的DNA,并用DNA连接酶将经消化的DNA与用Klenow酶切成平整末端的上述含parB区的DNA片段连接。用连接的DNA转化大肠杆菌HB101。筛选表达卡那霉素抗性和四环素敏感性的克隆并分析其质粒DNA的限制酶图谱,并由此得到parB插入到pLG339的HincⅡ位点的重组质粒pLG339P。
用EcoRⅠ和HindⅢ完全消化重组质粒pLGM201 DNA。另一方面,先用EcoRⅠ完全消化,然后用HindⅢ部分消化上面得到的pLG339P。结合pLGM201和pLG339P的消化DNA,并将其用于转化大肠杆菌x1776(ATCC31244)。从转化的细胞中,筛选既有卡那霉素抗性又不需要生物素的克隆以得到含有从粘质沙雷杆菌SB303得到的生物素基因片段,质粒稳定基因和卡那霉素抗性基因(其中parB插入pLGM201的HincⅡ位点)的质粒pLGM201PHc。
按与方法(2)(A)同样的方法,从包含具有氨苄青霉素抗性基因的质粒pKT240的大肠杆菌HB101中得到pKT240DNA,并用BamHⅠ和BstPⅠ消化。将得到的DNA片段经琼脂糖凝胶电泳并从凝胶中切下一个3Kb的DNA带,使该DNA带经电洗脱法得到一个含氨苄青霉素抗性基因区的DNA片段。用Klenov酶将该片段切成平整末端。
另一方面,也用EcoRⅠ和xhoⅠ消化上面得到的pLGM201PHc DNA,并用Klenow酶切成平整末端。用DNA连接酶将该DNA与上面含氨苄青霉素抗性基因区的平整末端DNA片段连在一起。用连接的DNA转化大肠杆菌C600r-m-得到一个重组质粒pLGM201PHcA,其中用从pKT2401中得到的氨苄青霉素抗性基因取代pLGM201PHc的卡那霉素抗性基因(参见图2)。
(5)制备所需的微生物:
通过Takagi和Kisumi的方法,将上面方法(4)中得到的重组质粒pLGM201PHcA导入到限制酶缺陷型菌株粘质沙雷杆菌TT392菌株中得到转化的细胞。将所得的转化细胞培养后,通过澄清溶胞产物法,从细胞中分离并纯化质粒DNA,得到由粘质沙雷杆菌修饰系统修饰的质粒(300μg)。
然后,将该质粒导入到上面通过Takagi和Kisumi的方法得到的粘质沙雷杆菌ETA23 K-8细胞中并将该细胞铺到用氨苄青霉素(500μg/ml)补充的营养琼脂平盘上,并在30℃过夜培养。从培养基中分离形成的菌落,得到含重组质粒pLGM201PHcA的粘质沙雷杆菌TA5026(FEKM BP-4102),其中宿主微生物是粘质沙雷杆菌ETA23K-8(参见图1)。
通过分析限制酶消化图谱,确信该菌株中所含的质粒DNA是pLGM201PHcA DNA。
另外,将质粒pLGM201PHcA导入到由Takagi和Kisumi的方法得到的上述粘质沙雷杆菌K8CL48细胞中,并将该细胞铺在用氨苄青霉素(500μg/ml)补充的营养琼脂平盘上并在30℃过夜培养。从盘上分离形成的菌落以得到含pLGM201PHcA的粘质沙雷杆菌TA5027(FERM BP-4103),其中宿主微生物是粘质沙雷杆菌K8CL48(参见图1)。
通过分析限制酶消化图谱,确定该菌株中所含的质粒DNA是pLGM201PHcA DNA。
实施例2
在含氨苄青霉素(500μg/ml)的L-液体培养基的琼脂斜面上过夜培养实施例1中得到的粘质沙雷杆菌TA5026,然后将培养细胞菌环接种到在500ml振荡瓶中的发酵培养基中,该发酵培养基含有蔗糖15%,尿素1.5%,磷酸氢二钾0.1%,7水合硫酸镁0.2%,7水合硫酸铁0.01%,玉米浸浆0.1%和碳酸钙1%(其中灭菌后加入蔗糖)的无菌溶液(15ml)。在30℃往复振荡培养(7cm冲程,120r.p.m)120小时。
测量上述培养物中生产的d-生物素量。在表1中列出其结果,其中对照菌株是粘质沙雷杆菌SB411(日本专利第一次公开(Kokai)No.27980/1990)和粘质沙雷杆菌TA5024(日本专利第一次公开(Kokai)No.27980/1990),粘质沙雷杆菌TA5024是将重组质粒pLGM201导入到SB411中得到的。
表1
微生物名称 生产并积累的
(粘质沙雷杆菌) d-生物素量
对照 SB411 30
TA5024 150
本发明 TA5026 250
实施例3
在含氨苄青霉素(500μg/ml)或硫酸卡那霉素(100μg/ml)的L-液体培养基的琼脂斜面,或既不含氨苄青霉素又不含硫酸卡那霉素的同样的L-液体培养基的琼脂斜面上,分别过夜培养粘质沙雷杆菌TA5026和粘质沙雷杆菌TA5027,然后将培养细胞菌环接种到500ml振荡瓶中含无菌溶液(15ml)的发酵培养基中,该无菌溶液培养基含葡萄糖7%,尿素1%,磷酸氢二钾0.1%,7水合硫酸镁0.1%,7水合硫酸铁0.01%,玉米浸浆0.1%和碳酸钙4%(其中灭菌后将葡萄糖加到溶液中)。在30℃往复振荡培养(7cm冲程,120r.p.m)120小时。
测量上述培养物中生产的d-生物素量。在表2中列出其结果,其中对照菌株是粘质沙雷杆菌SB411和粘质沙雷杆菌TA5024。
表2
微生物的名称 生产和积累的
(粘质沙雷杆菌) d-生物素量(mg/l)
对照 SB411 10
TA5024 54
本发明 TA5026 70
TA5027 96
实施例4
在含氨苄青霉素(500μg/ml)的L-液体培养基的琼脂斜面上过夜培养在实施例1中得到的粘质沙雷杆菌TA5026,然后将培养细胞的菌环接种到500ml振荡瓶中含无菌溶液(30ml)的预培养基中,该无菌溶液培养基含蔗糖10%,尿素1%,磷酸氢二钾0.1%,7水合硫酸镁0.2%,7水合硫酸铁0.01%,玉米浸浆0.6%和碳酸钙1%(其中在灭菌后将蔗糖加到溶液中)。然后,在30℃往复振荡培养(7cm冲程,120r.p.m)24小时。将得到的预培养溶液(14ml)接种到发酵培养基中[蔗糖15%,尿素1.5%,磷酸氢二钾0.08%,7水合硫酸镁0.2%,7水合硫酸铁0.01%,玉米浸浆0.1%,碳酸钙4.2%和Disfoam CA220(消泡剂,由Nippon Yushi K.K,Japan制造)0.28%;1.0升]并在30℃,1.8升的发酵罐中以0.5升/分钟的通气速度培养,同时调整搅拌速度以便溶解的氧气浓度保持在10%的饱和浓度。从开始培养48到120小时后,将分开制备的附加培养基(蔗糖67.5%,尿素5%,磷酸氢二钾0.15%和玉米浸浆0.1%)以5.6ml/小时的流速连续加到培养基中。另外,从开始培养48到120小时后,每24小时向培养基中加入0.67ml 20%7水合硫酸镁和0.97ml2%7水合硫酸铁。培养144小时得到含540mg/l d-生物素的培养溶液(约1.3升)。
实施例5
在含氨苄青霉素(500μg/ml)的L-液体培养基的琼脂斜面上过夜培养实施例1中得到的粘质沙雷杆菌TA5027,然后将培养细胞的菌环接种到500ml振荡瓶中的含无菌溶液30ml的预培养基中,该无菌溶液培养基含葡萄糖5%,尿素1%,磷酸氢二钾0.1%,7水合硫酸镁0.2%,硫酸铁0.01%,玉米浸浆0.6%和碳酸钙1%(其中灭菌后将葡萄糖加到溶液中)。然后在30℃往复振荡培养(7cm冲程,120r.p.m)24小时。将得到的预培养液(14ml)接种到发酵培养基(葡萄糖5%,硫酸铵0.5%,磷酸氢二钾0.2%,7水合硫酸镁0.2%,硫酸铁0.001%,玉米浸浆0.7%和Disfoam CA220(消泡剂,由Nippon Yushi K.K,Japan制造)0.28%(PH7.0);1.0升]中并在30℃,1.8升的发酵缸中,以0.5升/分钟的通气速率培养,同时调整搅拌速率以便溶解的氧气浓度保持在10%的饱和浓度。将培养溶液的PH值用氢氧化钾-氨水的混和物调整到7.4或更高。从培养开始后1到3天,以3ml/小时到15ml/小时的流速将另外制备的培养基(葡萄糖57.5%,硫酸铵0.5%,磷酸氢二钾0.34%,7水合硫酸镁0.2%,硫酸铁0.01%和玉米浸浆2.75%)连续加到培养基中。培养3天得到含260mg/ld-生物素的培养溶液(约1.3升)。
实施例6
将按实施例4中的方法得到的培养溶液(6.0升)用盐酸酸化到PH2.7,然后用微孔滤器(Microza SP113,由Asahi Chemical Industry Co.Ltd.Japan制造)除去细胞得到滤液(7.6升)。使得到的滤液以SV=2的流速通过高多孔型合成吸附剂(SP207,由Mitsubishi Kasei Corporation,Japan制造)(树脂量1000ml;柱直径40mm)填充柱,以便将滤液中的d-生物素吸附到吸附剂上,然后将1升稀释的盐酸(PH3.0)以SV=2的流速通过柱子以冲洗吸附剂。然后将甲醇-氨溶液(1∶9)以SV=2的速率通过柱子洗脱d-生物素。
用旋转蒸发器减压浓缩上面得到的洗脱液(1.8升)以得到浓缩物(900ml)。将得到的浓缩液以SV=2的流速通过用强碱阴离子交换树脂(Diaion SA-11A,由Mitsubishi Kasei Corporation,Japan制造)(树脂量100ml,柱直径20mm)填充的柱子以便将d-生物素吸附到树脂上。用水(200ml)冲洗柱子,并将900ml 0.2N氯化铵-0.2N氨水(1∶1)以及SV=2的流速通过柱子来洗脱d-生物素。在减压下浓缩得到的洗脱液(900ml)到60ml体积并用浓盐酸将浓缩液稠到PH2.7,并使其在10℃或10℃以下放置过夜,由此,d-生物素结晶出。过滤分离形成的晶体并干燥得到的粗晶体(4.5g),然后使其从水溶液中再结晶以得到2.3g纯d-生物素。
本发明的微生物有极高的d-生物素生产能力,该微生物即通过导入掺有生物素基因(从能生产生物素的沙雷氏菌属微生物克隆)的重组质粒,能生产d-生物素的宿主微生物中衍生而来,并进一步将外源生物素基因整合到所说宿主微生物的染色体中。因此通过培养本发明微生物可以大量生产d-生物素。
Claims (11)
1、一种通过导入掺有生物素基因的重组质粒和将外源生物素基因整合到染色体中的,从能生产d-生物素的宿主微生物衍生而来的微生物,所述的生物素基因是从能生产d-生物素的沙雷氏菌属的微生物中克隆的。
2、权利要求1的微生物,其中所述的生物素基因是从具有抗生物素类似物抗性的沙雷氏菌属微生物中克隆的。
3、权利要求1的微生物,其中所述的宿主微生物是具有抗生物素类似物,蛋氨酸类似物和赖氨酸类似物抗性的微生物。
4、权利要求3的微生物,其中所述的生物素类似物选自由放线噻唑酸,5-(2-噻吩基)戊酸和脱氢生物素组成的一组成员之一,所述的蛋氨酸类似物是乙基硫氨酸而所述的赖氨酸类似物是S-氨乙基半胱氨酸。
5、权利要求1的微生物,其中所述的宿主微生物是具有抗生物素类似物,蛋氨酸类似物和赖氨酸类似物抗性的沙雷氏菌属的微生物。
6、权利要求1的微生物,其中所述的宿主微生物是具有抗生物素类似物,蛋氨酸类似物,赖氨酸类似物和乙酸类似物抗性的微生物。
7、权利要求6的微生物,其中所述的生物素类似物选自由放线噻唑酸,5-(2-噻吩基)戊酸和脱氢生物素组成的一组成员之一,所述的蛋氨酸类似物是乙基硫氨酸,所述赖氨酸类似物是S-氨乙基半胱氨酸且所述的乙酸类似物是氯乙酸。
8、权利要求1的微生物,其中所述的宿主微生物是具有抗生物素类似物、蛋氨酸类似物,赖氨酸类似物和乙酸类似物抗生的沙雷氏菌属微生物。
9、一种制备d-生物素的方法,包括在培养基中培养前述权利要求1到8中任一微生物以便在培养基中形成并积累d-生物素并收集d-生物素。
10、粘质沙雷杆菌TA5026(FERM BP-4102)。
11、粘质沙雷杆菌TA5027(FERM BP-4103)。
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