DE3688248T2

DE3688248T2 - Herstellungsverfahren fuer biotin.

Info

Publication number: DE3688248T2
Application number: DE8686905574T
Authority: DE
Inventors: F Fisher
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 1985-08-26
Filing date: 1986-08-26
Publication date: 1993-07-15
Anticipated expiration: 2006-08-27
Also published as: IL79834A; DK173842B1; AU6229786A; WO1987001391A1; FI93657B; PT83256A; NZ217336A; EP0236429A4; EP0236429B1; NO871723L; NO871723D0; DK197487A; KR880700072A; NO177756C; GR862197B; AU599046B2; NO177756B; ATE87975T1; DE3688248D1; IL79834A0

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen Systeme für die mikrobielle Produktion von Biotin und insbesondere Systeme, in denen wenigstens ein Teil des Biotin-Operons auf einem Plasmid in einer mutanten Wirtszelle mit Biotin- Retentionsdefekt, vorliegt.
Biotin, auch bekannt als Vitamin H, ist möglicherweise eine wesentliche Komponente aller Zelle. Einige Mikroorganismen, einschließlich Bäckerhefe, und alle Tiere (mit Ausnahme des Einzellers Tetrahymena) sind nicht in der Lage, Biotin effektiv zu synthetisieren, und müssen daher Biotin aus ihrer Umgebung erhalten, um zu überleben.
Trotz seiner Nützlichkeit bei der Förderung des Wachstums von Bäckerhefe und als ein Zusatzstoff für die menschliche und tierische Ernährung ist Biotin durch gegenwärtig verfügbare, chemisch-synthetische Methoden sehr teuer herzustellen. Obgleich Rübenmelassen (die 0,015-0,15 ug Biotin pro Gramm enthalten) oder andere natürliche Quellen für Biotin verwendet werden können, um synthetisches Biotin zu ergänzen, besteht weiterhin ein Bedürfnis nach anderen Quellen.
Wegen der leichten Verfügbarkeit von Information im Hinblick auf den genetischen Aufbau bestimmter Mikroorganismen, von denen berichtet worden ist, daß sie relativ hohe Konzentrationen an Biotin enthalten, hat sich eine Fähigkeit zur Durchführung genetischer Manipulationen auf solchen Mikroorganismen entwickelt worden. Es ist zum Beispiel berichtet worden, daß bestimmte chromosomale Gene, die Enzyme des Biotin-Syntheseweges codieren, isoliert, amplifiziert und in Wirtszellen des Bakteriums Escherichia coli (E. coli) re-inseriert werden können.
Genauer gesagt berichteten Mukherjee et al. in "Plasmids and Transposons" Stuttard et al., Hrg., Academic Press, New York (1980), 379-386, über die Isolierung des Biotin-Operons des E. coli K-12-Stammes aus einer transduzierenden Bakteriophage mit Hilfe einer EcoRI-Enzymverdauung. Ein Restriktionsfragment wurde in ein DNA-Plasmid (pMB8) induziert, das verwendet wurde, um E. coli-Wirtszellen zu transformieren, um multiple "Extra"-Kopien der Biotin- Operongene in diesen Wirten bereitzustellen. Mukherjee et al. lehren jedoch nicht die Verwendung einer Wirtszelle mit mutantem Genotyp mit Biotin-Retentionsdefekt, oder legen diese auch nur nahe. Obgleich die Steigerung der Exkretion gegenüber einem Biotin-Prototroph ("Wildtyp") berichtet wurde, ist dieses rekombinante System nicht auf kommerzielle Produktion von Biotin im Großmaßstab durch Fermentation transformierter Wirtszellen angewendet worden.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein System für die Produktion von Biotin zur Verfügung gestellt, welches umfaßt: einen Mikroorganismus mit einem birA&supmin;-Genotyp und Plasmid-DNA, in besagter Zelle, die wenigstens ein Genprodukt des Biotin-Operons oder ein funktionelles Homolog desselben codiert.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung umfaßt ein System für die Produktion von Biotin, welches umfaßt: einen Mikroorganismus mit einem (bio&supmin;, birA&supmin;, bioR&supmin;)-Genotyp; und Plasmid-DNA, in besagter Zelle, wobei besagte Plasmid- DNA das Biotin-Operon codiert und besagte Plasmid-DNA uvrB&supmin; ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein System für die Produktion von Biotin, welches umfaßt: einen Mikroorganismus mit einem (bio&supmin;, birATS, bioR&supmin;)-Genotyp; und Plasmid-DNA codiert das Biotin-Operon und wobei besagte Plasmid-DNA uvrB&supmin; ist.
Weiter wird von der vorliegenden Erfindung ein Verfahren für die gesteigerte Produktion von Biotin zur Verfügung gestellt, welches umfaßt, daß ein Mikroorganismus mit einem birA&supmin;-Genotyp mit einer Plasmid-DNA transformiert wird, die ein Genprodukt des Biotin-Operons oder ein funktionelles Homolog desselben codiert.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird außerdem noch ein Verfahren zur Umwandlung von Desthiobiotin zu Biotin zur Verfügung gestellt, welches die Schritte umfaßt: Kultivieren eines Wirtsmikroorganismus, der einen mutanten Genotyp mit Biotin-Retention defekt aufweist, und der Plasmid-DNA aufweist, die ein bioB-Genprodukt des Biotin-Operons oder ein funktionelles Homolog desselben codiert, in einem Medium, das Desthiobiotin enthält.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 ist ein Flußdiagramm des Biotin-Biosyntheseweges;
Fig. 2 ist eine schematische Darstellung der bioR- und birA-Genfunktionen;
Fig. 3 ist eine partielle Restriktionskarte des bio(A, B, F, C, D)-Operons und des benachbarten uvrB-Locus auf dem E. coli-Chromosom;
Fig. 4 ist eine schematische Darstellung der Konstruktion des Zwischenplasmids 322PstI gemäß der vorliegenden Erfindung;
Fig. 5 ist eine schematische Darstellung der Konstruktion eines bioD-Gen-Restriktionsfragments gemäß der vorliegenden Erfindung;
Fig. 6 ist eine schematische Darstellung der Konstruktion des Zwischenplasmids pBAL4 gemäß der vorliegenden Erfindung;
Fig. 7 ist eine schematische Darstellung der Konstruktion des das Biotin-Operon enthaltenden Plasmids pBP5 gemäß der vorliegenden Erfindung;
Fig. 8 ist eine schematische Darstellung der Konstruktion der Plasmide pKA5 und pKH4 gemäß der vorliegenden Erfindung; und
Fig. 9 ist eine schematische Darstellung der Konstruktion des Plasmids pBF1 gemäß der vorliegenden Erfindung.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG

Wie hier verwendet, bezeichnet der Ausdruck "mutanter Genotyp mit Biotin-Retentionsdefekt" eine Lesion im birA-Gen, die eine Veränderung im birA-Gen hervorruft, die zu einem Anstieg in der Aktivität des birA-Genproduktes führt, das heißt eine Mutation am birA-Locus, die zu einer verringerten Fähigkeit zur Adenylierung von Biotin führt und im weiteren als birA bezeichnet wird. Eine Klasse bevorzugter Lesionen in birA umfaßt Lesionen, die die Aktivität des Enzyms temperaturabhängig machen, das heißt ein temperaturempfindliches birA-Gen (birATS). Solche birATS-Mutanten verringern die birA-Funktion, wenn die Temperatur des Systems ansteigt.
Bevorzugte Wirtszellen schließen Biotin benötigende Stämme (Genotyp: bio&supmin;), Stämme mit Defekt im Repressor des Biotin- Operons (Genotyp: bio®&supmin;), und Biotin benötigende Stämme mit Defekt in der Repressor-Funktion (Genotyp: bio&supmin;, bioR&supmin;). Die bevorzugten Wirtszellen sind bioR&supmin;-Stämme.
Der Ausdruck "funktionelles Homolog eines Genprodukts des Biotin-Operons" bezeichnet ein Polypeptid, das dieselbe Funktion hat wie das Genprodukt, aber das dieselbe Aminosäuresequenz haben kann oder eine davon unterschiedliche Aminosäuresequenz. Solche funktionellen Homologe schließen z. B. Polypeptidprodukte allelischer Variationen der Gene des Biotin-Operons; Analoge und Fragmente dieser Polypeptide; und synthetische Polypeptide ein, die in der Primärstruktur (Aminosäuresequenz) verschieden sein können, aber die die Sekundärstrukturen teilen, die ihnen erlauben, biologische und immunologische Aktivitäten von Genprodukten des Biotin-Operons zu besitzen [Kaiser et al., Science, 223, 249-255, (1984)].
Ein Flußdiagramm der Biotin-Biosynthese ist in Fig. 1 dargestellt. Sechs Enzyme, die in der Biotin-Biosynthese involviert sind, sind sechs genetischen Loci zugeordnet worden: bioA, bioB, bioC, bioD, bioF, bioH. Spezifische Reaktionen, die von bioA-, bioB-, bioD- und bioF-Produkten katalysiert werden, sind charakterisiert worden. Co-Faktoren und Substrate für jede dieser Reaktionen sind identifiziert worden, mit der Ausnahme eines Schwefelatomdonors im letzten enzymatischen Schritt. Obgleich die Funktionen der bioC- und bioH-Genprodukte wegen Beschränkungen von Kreuzfütterungsstudien charakterisiert worden sind (wobei Stämme mit Biotin-Defekt fehlt, nur durch Einsatz von Biotin oder durch Einsatz biosynthetischer Vorläufer von Biotin, die von Zellen ausgeschieden, mit denen sie zusammen kultiviert werden, überleben), sind diese Loci durch genetische Komplementation als wesentlich identifiziert worden.
Die sechs Gene, die für Biotin-Syntheseenzyme codieren, sind in zwei Regionen des E. coli-Chromosoms lokalisiert. Fünf der sechs Gene (bioA, bioG, bioC, bioD und bioF) sind in einem bidirektional transkribierten Operon enthalten, das bei 17 Minuten kartiert ist. BioH ist bei 74 Minuten lokalisiert. Die Lokalisierungen der Gene auf dem Biotin- Operon und zweier anderer genetischer Funktionen, die auf den Biotin-Biosyntheseweg einwirken, bioR und bioA, sind in Tabelle I angegeben. Tabelle I Genetischer Lokus Lokalisierung auf E. coli-Chromosom vorgeschlagene Funktion bioA 17 min. Syntheseenzym Transkriptionsrepressor Verwendung von Biotin
Die Steuerung der Biotin-Synthese in E. coli wird auf dem transkriptionalen Niveau bewirkt. Nachdem Biotin synthetisiert ist, wird es durch ein Produkt eines Gens an einem Locus, der mit birA bezeichnet ist, adenyliert, um Biotinyl-5'-adenylat zu bilden, wie in Fig. 2 angegeben. Ein Biotin-Repressorprotein, identifiziert als ein Produkt des bioR-Locus, kann sich auch an Biotinyl-5'-adenylat binden, um die Affinität des bioR-Genproduktes für einen bio-Operator 25fach zu erhöhen. Howard et al. Gene, 35, 321-331, (1985), haben offenbart, daß die birA-Funktion und die bioR-Funktion vom selben Protein bewirkt werden.
Der bio-Operator ist zwischen dem bioA-Strukturgen und dem bioB-Strukturgen gelegen, wie in Fig. 3 dargestellt. Der bio-Operator überlappt sowohl den bioA-Genpromotor als auch den bioB-Genpromotor. Das bioR-Genprodukt kann Transkription beenden, indem es sich an den u-Operator bindet und RNA-Polymerase von diesen zwei divergenten Promotoren ausschließt.
Biotinyl-5'-adenylat ist auch ein Substrat für etwas, von dem man glaubt, daß es eine dritte Funktion des birA-Genproduktes ist, Biotin-Holoenzymsynthetase. Biotin- Holoenzymsynthetase überführt Biotin in Acetyl-CoA-Carboxylase. Acetyl-CoA-Carboxylase katalysiert einen kritischen Schritt in der Fettsäuresynthese, der für die Lebensfähigkeit wesentlich ist. Dies impliziert, daß eine vollständige Eliminierung von birA-Aktivität bei der Initiierung der Fermentation, tödlich wäre. Daher ist es bei der Initiation der Fermentation notwendig, daß genügend birA-Aktivität vorhanden ist, um das Wachstum der Zellen zu unterstützen. Solche birA-Aktivität wird leicht von einem Fachmann auf diesem Gebiet sichergestellt. Nach Beendigung der Fermentation ist es bevorzugt, daß die birA-Aktivität wesentlich verringert und am bevorzugtesten eliminiert wird. Durch Einsatz eines birATS-Gens ist es möglich, die birA-Funktion durch Steuerung der Temperatur des Fermentationssystems zu regulieren. Wenn daher die Temperatur des Systems erhöht wird, wird die birA-Funktion der Zelle verringert.
Ein genetischer Locus, der benachbart zum bioD-Locus kartiert, wird als uvrB bezeichnet. Das uvrB-Gen hat keine Funktion in der Biotin-Physiologie, aber wirkt in bestimmter Weise, um E. coli-Zellen vor ultravioletter Strahlung zu schützen, wie von Sancar et al., Cell, 28, 523-530 (1982), berichtet. Drei RNA-Moleküle werden vom urvB-Lokus trankribiert, von denen eines mit RNA-Polymerase in Wechselwirkung treten kann. Wenn daher das uvrB-Gen vervielfältigt wird, kann diese Wechselwirkung für eine E. coli-Zelle tödlich sein. Aus diesem Grund sollten uvrB-Funktionen eliminiert werden, bevor die Kopienzahl eines Plasmids erhöht wird, das ein DNA-Stück aus der Region des E. coli-Chromosoms enthält, das den Biotin-Operon einschließt.
Zusätzlich dazu, daß ein birATS-Gen vorzugsweise eingesetzt wird, ist es bevorzugt, ein Plasmid mit einer hohen Kopienzahl zu verwenden und am bevorzugtesten ein Plasmid, das einen mäßigen Anstieg in der Kopienzahl (40 bis 200) bei Temperatur-Induktion zeigt. Solche Plasmide sind in der europäischen Patentanmeldung Nr. 136 490 beschrieben und werden hier im weiteren als temperaturempfindliche Plasmide bezeichnet. Daher ist es, wenn solche temperaturempfindlichen Plasmide verwendet werden, bei Erhöhung der Temperatur der Reaktion möglich, die Kopienzahl und Gendosierung mäßig zu erhöhen, während die Zellvitalität erhalten und die birA-Funktion verringert wird, was zu einem System führt, was in der Lage ist, überraschend hohe Ausbeuten an Biotin zu produzieren. Die folgenden Beispiele dienen dazu, Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung weiter zu veranschaulichen. Obgleich die birA&supmin;-Stämme von Barker et al., J. Bacteriol., 143, 789-800 (1980) und Campbell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 69, 676-680 (1972) in den Beispielen verwendet werden, können auch andere Stämme mit Biotin-Retentiondefekt, wie etwa zum Beispiel der E.coli-Stamm P48, von dem bei Pai, J.Bacteriol, 112, 1280-1287 (1972), berichtet wird, verwendet werden.

Beispiel 1

Wie in Fig. 4 dargestellt, wurden ein erstes Plasmid, das mit pLC2523 bezeichnet ist (hinterlegt am 23. August 1985 als Hinterlegungsnummer A.T.C.C. 53237 bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland) und von dem bekannt ist, daß es das Biotin-Operon enthält (siehe z. B. Sancar et al., J. Mol. Biol., 148, 63-76, (1981)), und ein zweites Plasmid, das als pBR322 (ATCC Nr. 37017) bezeichnet ist, mit PstI verdaut und durch T4-DNA-Ligase verknüpft. Die Mischung wurde dann gemäß dem Verfahren von Hanahan, J. Mol. Biol., 166, 557-580 (1983), in Bakterienzellen des Biotin-auxotrophen Stammes SA291 (bio&supmin;, bioR&spplus;, birA&spplus;) (hinterlegt am 23. August 1985 bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, als Hinterlegungsnummer ATCC 52236) transformiert. Kolonien wurden selektiert auf L-Agarplatten, die Tetracyclin (12 mg/l) enthielten, die alle Zellen abtöteten, die keine Plasmide mit dem Tetracyclin- Resistenzsegment von pBR322 besaßen. Die selektierten Kolonien wurden auf Ampicillinempfindlichkeit gescreent, ein Zeichen, daß ein PstI-Verdauungsfragment aus pLC2523 in die PstI-Stelle des Ampicillin-Resistenzsegments von pBR322 inseriert worden war, wodurch es diesem unmöglich gemacht wurde, Resistenz zu verleihen.
Restriktionsfragmente von Plasmiden, die Tetracyclinresistenz verleihen, wurden durch Gelelektrophorese abgetrennt und auf das Vorhandensein von Fragmenten mit den erwarteten Längen des Biotin-Operons untersucht. Auf diese Weise wurde festgestellt, daß ein Plasmid, das als 322PSTI bezeichnet wurde, ein Biotin-Operon verbunden mit einem Tetracyclinresistenzmarker enthielt. Es wurde jedoch festgestellt, daß das bioD-Gen in diesem Plasmid nicht intakt war, weil es den Biotin-auxotrophen E.coli-Stamm SA291 nicht komplementierte, wenn er in Abwesenheit von Biotin gezüchtet wurde.
Wie in Fig. 5 dargestellt, wurde pLC2523, um den Rest des bioD-Gens zu erhalten, mit NcoI gespalten, um ein größeres Fragment und ein kleineres Fragment (4,4 Kilobasen in der Länge) herzustellen, die durch Gelelektrophorese getrennt wurden. Das kleinere Fragment wurde aus dem Gel extrahiert und beide Enden des kleineren Fragments wurden mit der Exonuclease BAL31 verdaut.
In der BAL31-Verdauung wurden 30 ug des Restriktionsfragments in 450 ul BAL31-Nucleasepuffer, der 0,25 mg/ml Rinderserumalbumin enthielt, gelöst. Eine 200 u-Portion wurde mit 2 Einheiten/ul BAL31 bei 30ºC behandelt. Bei 2,5 min., 5,5 min. und 10 min. wurden Proben gezogen und phenolextrahiert. Nach Etherextraktion und Ethanolausfällung wurde ein aliquoter Teil jeder Probe zu jedem Zeitpunkt durch Elektrophorese durch ein 0,5% (w/v) Agarosegel analysiert. Die drei Proben aus den entsprechenden Zeitpunkten wurden gepoolt. Die so erhaltenen gekürzten Fragmente wurden weiter mit BglII und PstI gespalten. Wegen des Vorhandensein von zwei BglII-Stellen und einer PstI-Stelle im NcoI-Fragment von pLC2523 wurden vier Fragmenttypen erwartet. Von diesen vier Fragmenttypen wurde von einem erwartet, daß er den Rest des bioD-Gens enthielt und sowohl ein stumpfes, BAL31-verdautes Ende als auch ein kohäsives, PstI-verdautes Ende besaß.
Das Plasinid pBR329 (dessen vollständige Nukleotidsequenz in Covarrubias et al., Gene, 17, 79 (1982), veröffentlicht ist, die durch Bezugnahme hier einbezogen wir), wurde mit sowohl PvuII (das pBR329 in einem Chloramphenicol-Resistenzsegment spaltet, uni ein stumpfes Ende zu produzieren) und mit PstI (das pBR329 an einer Stelle in einem Ampicillin-Resistenzsegment spaltet) verdaut, um zwei Stücke zu erhalten, die durch Gelelektrophorese getrennt wurden. Das größere der Stücke (das ein Tetracyclin-Resistenzsegment und einen Replikationsursprung enthielt) wurde mit den vier Fragmenttypen, die durch die BglII- und PstI-Verdauung des oben beschriebenen 4,4 kb NcoI-Fragments produziert worden waren, in Gegenwart von T4-DNA-Ligase vermischt. Wie in Fig. 6 gezeigt besaßen nur diejenigen Fragmente, die den Rest des bioD-Gens enthielten, die Kombination von stumpfen und PstI-verdauten Enden, die erforderlich waren, um sich mit dem größeren PvuII/PstI-Fragment aus pBR329 zu verbinden, um ein zyklisches Plasmid zu bilden, das als pBAL4 bezeichnet wurde.
Bakterien vom Stamm SA291 wurden mit den Produkten der Ligation mit dem größeren Fragment von pBR329 transformiert. Kolonien wurden auf Tetracyclinresistenz selektiert, auf Amipicillinempfindlichkeit gescreent und auf Chloramphenicolempfindlichkeit gescreent. Die Längen der Inserts in verschiedenen Plasmiden wurden durch Restriktionsendonukleaseanalyse bestimmt.
Wie in Fig. 7 gezeigt, wurden die Plasmid 322PstI und pBAL4 getrennt mit PstI verdaut. Diese Verdauungsgemische wurden in einer Ligationsreaktion unter Verwendung von T4-DNA-Ligase kombiniert. Die resultierende Mischung wurde verwendet, um die Zellen aus Stamm SA391 zu transformieren. Kolonien wurden auf eine Kombination von Wachstum in Abwesenheit von Biotin und Wachstum in Anwesenheit von 12 mg/ml Tetracyclin selektiert. Anwesenheit des vollständigen bio-Operons wurde durch Retransformation von plasmidfreiem SA291 in Verbindung mit Restriktionsendonukleaseverdauungsanalyse bestätigt. Ein resultierendes Plasmid, das als pBP5 bezeichnet wird, enthielt alle Gene des Biotin-Operons: Gene bioA, bioB, bioF, bioC und den Teil des bioD-Gens stromaufwärts der PstI-Stelle, gewonnen aus 322PstI, und den Teil des bioD-Gens stromabwärts der PstI-Stelle, gewonnen aus pBAL4.
Als nächstes wurde das Plasmid pCFM 526 mit temperaturempfindlicher Kopienzahl mit EcoRI verdaut und mit Ligase wieder zusammengefügt, um pCFM 526AE4 zu produzieren, dem der in pCFM 526 enthaltene PL-Promotor fehlte. Plasmid pCFM526 war konstruiert worden, wie in der veröffentlichten europäischen Patentanmeldung Nr. 136,490 (Morris) beschrieben, aus Plasmid pCFM414 (ATCC Nr. 40076).
Wie in Fig. 8 gezeigt, wurden Plasmid pCFM 526ΔE4 und das Plasmid pBP5 getrennt mit HindIII verdaut. Die Fragmente wurden ligiert und verwendet, um SA291 zu transformieren. Kolonien wurden auf Ampicillinresistenz und die Fähigkeit, in Abwesenheit von Biotin zu wachsen, selektiert. Ein als pKA5 bezeichnetes Plasmid wurde isoliert. Dieses Plasmid enthielt die fünf Gene des Bio-Operons, verknüpft mit einem temperaturinduzierbaren Replikationsursprung.

BEISPIEL 2

Wie weiter in Fig. 8 gezeigt, wurde auch ein anderes Plasmid in analoger Weise zur Konstruktion von pKA5, die in Beispiel 1 beschrieben ist, aber unter Ersatz von pCFM526ΔE4 durch ein als pCFM1036NS bezeichnetes Plasmid, das ein Kanamycinresistenz-Segment enthält kontinuiert. Kolonien wurden daher auf Kanamycinresistenz statt auf Ampicillinresistenz selektiert, um Zellen zu erhalten, die ein Plasmid pKH4 trugen.

BEISPIEL 3

Ein HindIII-Fragment auf pBP5 wurde mit BAL31 behandelt und die Mischung wurde in HpaI-geschnittenes pCFM526ΔE4 ligiert. Kolonien wurden auf Biotinproduktion, Ampicillinresistenz und Tetracyclinempfindlichkeit selektiert. Aus dieser Selektion wurden drei Plasmide, pBA2, pBA4 und pBA6 erhalten.

BEISPIEL 4

Wie in Fig. 9 dargestellt, wurden die Plasmide pBP5 und pCFM526 mit NcoI und HindIII geschnitten. Das Ligationsprodukt dieser Verdauungsgemische wurde in einen E.coli-Stamm AM7 transformiert, der Plasmid pMW1 (A.T.C.C. Nr. 39933) enthielt, das ein Gen für den temperaturempfindlichen Repressor CI&sup8;&sup5;&sup7; aufwies.
In dieser Konstruktion, bezeichnet als pBF1, steht das bioB-Gen unter der Kontrolle des PL-Promotors. Daher ist diese Konstruktion nützlich für die Umwandlung von Desthiobiotin in Biotin mit Hilfe des bioB-Genprodukts, Biotin-Synthetase

BEISPIEL 5

Das Plasmid pLC2523 wurde mit HindIII und NcoI verdaut. Das Plasmid pCFM526 wurde in ähnlicher Weise geschnitten. Ein Ligationsprodukt dieser zwei Verdauungsgemische, bezeichnet als pAHN203, wurde in Zellen eines Bakterienstamms transformiert, die den temperaturempfindlichen Repressor der Bakteriophage λ (CI&sup8;&sup5;&sup7;) enthielten. Das Plasmid pCFM526 enthält den PL-Promotor der Bakteriophage λ. Ein Gen oder Gene, das (die) stromabwärts von diesem Locus inseriert werden, werden von diesem Promotor kontrolliert. Die Promotoraktivität wird von Repressor CI&sup8;&sup5;&sup7; reguliert. Daher wird, wenn die Temperatur angehoben wird, die Repressorfunktion eliminiert, der Promotor wird aktiviert und die gewünschten Genprodukte werden exprimiert. Siehe z. B. Morris, aaO. In pAHN203 steht das bioA-Gen unter PL-Kontrolle. Das Plasmid pAHN203 wird mit pBF1 kombiniert, um ein Plasmid herzustellen, das Biotin unter PL-Kontrolle produziert.
Die folgenden Puffer wurden in den Beispielen verwendet. Puffer mit hohen Salzgehalt, der folgendes umfaßt: 75 mM NaCl; 50 mM Tris-HCl, pH 7,6; 10 mM MgCl&sub2;; und 5 mM Dithiothreit. Ein Puffer mit mittlerem Salzgehalt, der folgendes umfaßt 37,5 mM NaCl, 30 mM Tris-HCl, pH 7,6; 10 mM MgCl&sub2;; und 5 mM Dithriothreit. Ein Puffer mit niedrigem Salzgehalt, der folgendes umfaßt: 10 mM Tris-HCl, pH 7,6; 10 mM MgCl&sub2;; 20 mM KCl; und 5 mM Dithiothreit. Ein Ligasepuffer, der folgendes umfaßt: 50 mM Hepes, pH 7,5; 10 mM MgCl&sub2;; 5 mM Dithiothreit; und 0,4 mM Adenosintriphosphat. Ein Polynucleotidkinasepuffer, der folgendes umfaßt: 50 mM Tris- HCl, pH 7,6; 10 mM MgCl&sub2;; 1 mM Spermidin; 5 mM Dithiothreit; und 0,1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA). Ein BAL31-Nucleasepuffer, der 12 mM CaCl&sub2;; 12 mM MgCl&sub2;; 200 mM NaCl; 20 mM Tris-HC, pH 8,0; und 1 mM EDTA umfaßt.
Die Restriktionsenzyme EcoRI und NcoI wurden im Puffer mit hohem Salzgehalt verwendet und wurden erhalten von New England Biolabs, Beverly, Massachusetts. Die Restriktionsenzyme BglII, BamHI, HindIII und PstI wurde in Puffer mit mittlerem Salzgehalt verwendet und wurden erhalten von New England Biolabs, Beverly, Massachusetts. Das Restriktionsenzym HpaI wurde verwendet im Puffer mit niedrigem Salzgehalt. Die DNA-Ligase wurde in Ligasepuffer verwendet und wurde erhalten von New England Biolabs, Beverly, Massachusetts. Die Nuklease BAL31 wurde in BAL31- Nucleasepuffer verwendet und wurde erhalten von Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Maryland. Rinderserumalbumin wurde auch von Bethesda Research Laboratories erhalten.
Ampicillin, Kanamycinsulfat, Chloramphenicol und Tetracyclin wurden erhalten von Sigma Chemical Company (Sigma), St. Louis, Nissouri. Desthiobiotin wurden ebenfalls erhalten von Sigma Chemical Company. Biotin wurde erhalten entweder von Sigma oder von J.T. Baker Chemical Company, Phillipsburg, New Jersey. Stamm 4062, der bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland als A.T.C.C. 53238 hinterlegt worden ist (23. August 1985), besaß Lesionen in der bioR-Funktion und der birA-Funktion.
Die birA-Mutanten waren temperaturempfindlich, insofern als sie bei niedrigen Temperaturen (28ºC) lebensfähig waren, aber bei hohen Temperaturen (43ºC) nicht in der Lage waren zu wachsen. In Abhängigkeit vom fraglichen spezifischen Mutanten konnte die letale Wirkung von hoher Temperatur durch Zugeben von exogenem Biotin umgekehrt werden. Die anderen Plasmide und Stämme, die in den Beispielen verwendet wurden, sind in Tabelle II zusammengefaßt. Mit Ausnahme von SA291 ist über alle birA- Stämme, die in Tabelle II aufgelistet sind, in Barker et al., J. Bacteriol., 112, 830-839 (1980) oder Campbell, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 69, 676-680 (1972) berichtet, in denen sie alle als Biotin benötigende Stämme beschrieben werden. Über Stamm SA291 ist in Cleary et al., J. Bacteriol., 112, 830-839 (1972) berichtet. In Tabelle II sollte auch angemerkt werden, daß bioRP einen Genotyp bezeichnet, der zu einem "partiell defekten" BioR-Genprodukt führt.
Die folgenden Tests wurden verwendet, um die Biotinkonzentration der Proben in den folgenden Beispielen zu bestimmen.

Mikrobiologischer Test

Die Biotinkonzentration wurde durch "Kreuzfütterung" von SA291-Zellen mit dem vom angegebenen Stamm produzierten Biotin bestimmt. Zu Beginn wurde SA291 über Nacht in GMH- Brühe kultiviert (9 g/l Vitamintest-Casaminosäuren (Difco, Detroit, Michigan); 4 g/l Glucose; 20 ug/l L-Histidin; 40 ug/l Thiamin; 1 mM MgSO&sub4;; 6 g/l Na&sub2;HPO&sub4;; 3 g/l KH&sub2;PO&sub4;; 0,5 g/l NaCl; und 1 g/l NH&sub4;CI), ergänzt mit 300 pM D-Biotin (50 ml Volumen) bei 37ºC. Die Übernachtkultur wurde 400fach in GMH-Brühe verdünnt. 2 ml-Proben verdünnter Kultur wurden in Teströhrchen verteilt. Variierende Konzentrationen der zu analysierenden Probe wurden zu den Röhrchen zugegeben. Der Test wurde standardisiert, indem jeweils eine der folgenden Konzentrationen von D-Biotin (Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri) zu sechs einzelnen Röhrchen zugegeben wurde: 30 pM, 100 pM, 300 pM, 1000 pM, 3000 pM zugegebenes D-Biotin. Alle Röhrchen wurden über Nacht bei 37ºC kultiviert. Die optische Dichte der resultierenden Kulturen wurde bestimmt und die Unbekannten wurden mit den Standards korreliert.

Spektrophotometrischer Test

Die Biotinkonzentration wurde durch einen spektrophotometrischen Biotin-Test bestimmt, der von McCormick et al., Analytical Biochemistry, 34, 226-236, entwickelt wurde. Genauer gesagt wurden 100 ul Probe in ein Teströhrchen überführt, zu dem 900 ul Wasser zugegeben wurden. Konzentrierte H&sub2;SO&sub4; (5 Mikroliter) wurde zugegeben, um den pH der Lösung auf weniger als 2 abzusenken. Zur Lösung wurden 1 ml n-Butanol zugegeben und die resultierende Lösung wurde für eine Minute verwirbelt und dann für eine Minute bei 3200 UPM zentrifugiert. Die obere Butanolphase der Lösung wurde dann in ein 1,5 ml-Eppendorf-Röhrchen überführt. Das Lösungsmittel wurde vor der Zugabe von 100 Mikrolitern 2%iger (v/v) Schwefelsäure und 100 Mikrolitern 0,2%igem (w/v) 4-Dimethylaminozimtaldehyd bis zur Trockne verdampft. Die resultierende Lösung wurde verwirbelt und man ließ sie für 5-10 Minuten vor der Zugabe von 800 ul Ethanol ungestört stehen. Die Extinktion (A) der Lösung bei 532 mM wurde auf einem Gilford-Response-Spektrophotometer bestimmt. Aus der Extinktion wurde die Biotinkonzentration (C) in Mol/Liter für die 1 cm-Weglänge aus der Gleichung erhalten:
C = (5,7·10&supmin;&sup5;)A

BEISPIEL 5

Die verschiedenen in den Beispielen 6 und 7 verwendeten Kulturen wurden konstruiert, indem ein geeigneter Wirtsstamm mit einem aus den Beispielen 1 oder 2 gemäß den von Hanahan, aaO, beschriebenen Verfahren gewonnenen Plasmid transformiert wurde. Die verwendeten Wirtsstämme und Plasmide sind in Tabelle II aufgelistet.

BEISPIEL 6

Kolbenmethode

Ein Kolben, der 30 ml GMH-Brühe enthielt, wurde mit einem Volumen einer Kultur (aufgelistet in Tabelle II) beimpft. Die resultierenden Kulturen wurden unter Schütteln bei 37ºC inkubiert, bei 0 h, 6 h, 21 h, 30 h und 45 h wurde ein aliquoter Teil entnommen und filtersterilisiert. (Ein aliquoter Teil von 2,5 ml wurde bei 0 h entnommen, während aliquote Teile von 1 ml zu den anderen Zeitpunkten entnommen wurden). Die sterilisierten Proben wurden gemäß dem zuvor beschriebenen mikrobiologischen Test untersucht und die Ergebnisse (Durchlauf 1-7) sind in Tabelle II dargestellt.

BEISPIEL 7

Fermentermethode

Die von einem geeigneten Wirt getragenen Plasmide wurde über Nacht in GMH-Brühe kultiviert. Ein aliquoter Teil von 10 ml der Kultur wurde zu 1000 ml GMH-Brühe zugegeben, die mit 20 ml 1%igem Alanin, 20 ml 1%igem Methionin, 20 ml 0,7%igem Cystein und geeignetem Antibiotikum ergänzt war (Endkonzentration von 50 mg/l Ampicillin wurde verwendet, wenn Plasmid pKA5 verwendet wurde, und 25 mg/l Kanamycinsulfat wurde verwendet, wenn Plasmid pKH4 verwendet wurde). Die Fermentation wurde in einem New Brunswick Bio- Flo-Fermenter mit den folgenden Merkmalen durchgeführt: 1) konstante Bewegung bei 600 UPM; 2) Anschwänzen mit Luft; 3) pH-Kontrolle zwischen 6,8 und 7,2 durch automatische Zugabe von konzentriertem Ammoniakhydrat; 4) Temperaturkontrolle und 5) langsame Beschickung während des Verlaufs der Fermentation. Entwicklung von gelöstem Sauerstoff und Kohlendioxid wurde nicht überwacht. Die Beschickung bestand aus: 12% Glucose; 0,6% Vitamintest-Casaminosäuren, 35 uM Magnesiumsulfat 0,2% Alanin, 0,2% Methionin, 0,12% Cystein 7 uM Natriummolybdat und M9-Minimalsalze mit halber Stärke. Die Beschickung wurde 8 Stunden nach Beimpfung mit einer kontinuierlichen Geschwindigkeit von 14 ml/h begonnen. Die Temperatur zum Zeitpunkt der Beimpfung betrug 30ºC. Als die optische Dichte der Kultur etwa 10 erreichte, gemessen bei 600 Nanometern, wurde die Temperatur schrittweise auf 40ºC angehoben. Die Biotinkonzentrationen, die in Tabelle 11 angegeben sind, wurden 24 Stunden nach Beimpfung unter Verwendung entweder des mikrobiologischen Tests (Durchlauf Nr. 8, 9 und 10) oder des spektrophotometrischen Tests (Durchlauf Nr. 10 und 12) bestimmt. TABELLE II Biotin-Produktion, bestimmt durch Biotest Durchlauf Nr. Wirtsstamm Relevanter Genotyp Plasmid Relevanter Genotype Fermentations-Methode Biotin-Konzentration Kolben Fermenter
Obgleich Unterschiede unter Tests auf Biotin einen direkten Vergleich schwierig machen, dient ein Vergleich der Ergebnisse, die in Tabelle II angegeben sind, mit Mediumkonzentrationen von Biotin, die für Wildtyp- und mutante E.coli angegeben sind, dazu, die Verbesserung in der Biotin- Produktion zu veranschaulichen, die von der vorliegenden Erfindung erreicht wird. Zum Beispiel ist die Medienkonzentration von Biotin für Wildtyp-E.coli gemäß Campbell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 69, geringer als 0,05 MM und ist für Stamm 5942 (ein birA- -Stamm) 30-90 MM. Gemäß Pai, J. Bacteriol., 112, 1280-1287 ist die Medienkonzentration von Biotin für einen Stamm P48, der als ein mutanter Stamm mit Biotin-Retetionseffekt gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, 1000 mal derjenige des Wildtyps.

BEISPIEL 7

In diesem Beispiel verwendete Kulturen sind in Tabelle III beschrieben. Tabelle III Kultur Stamm Genotyp Plasmid keines
Jede Kultur wurde in Luria-Brühe (1,0% Casaminosäuren, 0,5% Hefeextrakte, 0,5% Natriumchlorid) eingeimpft und über Nacht bei 30ºC inkubiert. Die optische Dichte jeder Kultur wurde bestimmt sind in Tabelle IV dargestellt. Eine zehnfache Verdünnung war wegen der Dichte der Kultur notwendig. Tabelle IV Kultur Stamm Plasmid A&sup6;&sup0;&sup0;/10 Inoculum keines
Ein Kolben, der 30 ml GMH-Brühe enthielt, wurde mit dem Volumen der sechs Kulturen, die in Tabelle IV oben aufgelistet sind, beimpft. Die resultierenden Kulturen wurden unter Schütteln bei 37ºC inkubiert. Bei 0 h, 6 h, 21 h, 30 h und 45 h wurde ein aliquoter Teil entnommen und filtersterilisiert. (Ein aliquoter Teil von 2,5 ml wurde bei 0 h entnommen, während aliquote Teile von 1 ml zu den anderen Zeitpunkten entnommen wurden). Die sterilisierten Proben wurden gemäß dem zuvor beschriebenen mikrobiologischen Test untersucht und die Ergebnisse sind in Tabelle V dargestellt. Tabelle V Biotinkonzentration Zeitabhängigkeit der Biotinakkumulation Kultur Kulturstamm/Plasmid (1) Zeitpunkt war kontaminiert; kein Wert erzielbar. (2) Kein Datenpunkt im linearen Bereich des Tests.
Während die vorliegende Erfindung im Hinblick auf bevorzugte Ausführungsformen beschrieben worden ist, versteht es sich, daß Variationen und Verbesserungen den Fachleuten auf diesem Gebiet einfallen werden. Daher ist es beabsichtigt, daß die beigefügten Ansprüche alle solche äquivalenten Variationen abdecken, die in den Schutzumfang der Erfindung, wie beansprucht, fallen.

Claims

1. System für die Produktion von Biotin, welches umfaßt: einen Mikroorganismus mit einem birA -Genotyp und Plasmid- DNA, in besagter Zelle, die wenigstens ein Genprodukt des Biotin-Operons oder ein funktionelles Homolog desselben codiert.

2. System nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß besagter Mikroorganismus einen birATS-Genotyp hat.

3. System nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Plasmid-DNA das Biotin-Operon codiert.

4. System nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß besagter Mikroorganismus einen bioR&supmin;-Genotyp hat,

5. System nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß besagter Mikroorganismus einen bio&supmin;-Genotyp hat.

6. System nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Plasmid-DNA uvrB&supmin; ist.

7. System nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Plasmid-DNA Biotin-Synthetase oder ein funktionelles Homolog derselben codiert.

8. System für die Produktion von Biotin, welches umfaßt: einen Mikroorganismus mit einem (bio&supmin;, birA&supmin;, bioR&supmin;)-Genotyp; und Plasmid-DNA, in besagter Zelle, wobei besagte Plasmid- DNA das Biotin-Operon codiert und wobei besagte Plasmid-DNA uvrB&supmin; ist.

9. System für die Produktion von Biotin, welches umfaßt: einen Mikroorganismus mit einem (bio&supmin;, birATS, bioR&supmin;)-Genotyp; und Plasmid-DNA, in besagten Zellen, wobei besagte Plasmid-DNA das Biotin-Operon codiert und wobei besagte Plasmid-DNA uvrB&supmin; ist.

10. Verfahren zur gesteigerten Produktion von Biotin, welches umfaßt, daß ein Mikroorganismus mit einem birA&supmin;-Genotyp mit einer Plasmid-DNA, die ein Genprodukt des Biotin-Operons oder ein funktionelles Homolog desselben codiert, transformiert wird.

11. Verfahren zur Umwandlung von Desthiobiotin zu Biotin, welches die Schritte umfaßt: Kultivieren eines Wirtsmikroorganismus, mit einem birA&supmin;-Genotyp und mit Plasmid-DNA, die ein bioB-Genprodukt des Biotin-Operons oder eines funktionelles Homolog desselben codiert, in einem Medium, das Desthiobiotin enthält.