NO177756B

NO177756B - Genmodifisert E. coli-celle for foröket fremstilling av biotin, samt fremgangsmåte for omdannelse av desthiobiotin til biotin

Info

Publication number: NO177756B
Application number: NO871723A
Authority: NO
Inventors: Eric F Fisher
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 1985-08-26
Filing date: 1987-04-24
Publication date: 1995-08-07
Also published as: IL79834A; DE3688248T2; DK173842B1; AU6229786A; WO1987001391A1; FI93657B; PT83256A; NZ217336A; EP0236429A4; EP0236429B1; NO871723L; NO871723D0; DK197487A; KR880700072A; NO177756C; GR862197B; AU599046B2; ATE87975T1; DE3688248D1; IL79834A0

Description

Bakgrunn

Foreliggende oppfinnelse vedrører genmodifisert E. coli-celle for forøket fremstilling av biotin, og fremgangsmåte for omdannelse av desthiobiotin til biotin.

Biotin, også kjent som vitamin H, er sannsynligvis

en vesentlig bestanddel i alle celler. Noen mikroorganismer, deriblant bakergjær, og alle dyr (bortsett fra protozoen Tetrahymena), er ikke i stand til å syntetisere biotin effek-tivt, og må derfor få biotin fra omgivelsene for å overleve.

Til tross for dets anvendbarhet når det gjelder å fremme veksten av bakergjær og som et matvareadditiv for mennesker og dyr, er biotin svært kostbart å produsere ved hjelp av for tiden tilgjengelige kjemiske syntetiske frem-gangsmåter. Selv om melasse fra sukkerroe (som inneholder 0,015 - 0,15 ug biotin pr. gram) eller andre naturlige kilder for biotin kan brukes for å supplere syntetisk biotin, fore-ligger det dessuten et behov for andre kilder.

På grunn av den lette tilgjengelighet av informasjon vedrørende den genetiske konstitusjon til visse mikroorganismer som er blitt rapportert å inneholde forholdsvis høye konsentrasjoner av biotin, har det fremkommet en mulighet for å utføre genetiske manipulasjoner på disse mikroorga-nismene. Det er f.eks. blitt angitt at visse kromosomgener som koder for enzymer i sporet for biotinsyntese, kan iso-leres, forsterkes og på nytt innføres i vertceller av bakterien Escherichia coli ( E. coli).

Nærmere bstemt rapporterte Mukherjee et al., i "Plas-mids and Transposons", Stuttard et al., utg. Academic Press, New York (1980), 379-386 isolering av biotinoperonet til

E. coli K-12-stammen fra en transduksjonsbakteriofag ved

hjelp av enzymspalting med EcoRI. Et restriksjonsfragment ble'innført i et DNA-plasmid (pMB8). som ble brukt til å transformere E. coli vertceller, hvorved man fikk flere "ekstra" kopier av biotinoperongenene i disse vertene. Mukherjee et al. beskriver imidlertid ikke, og foreslår heller ikke bruken av en vertcelle av en mutant genotype som er mangel-

full med hensyn til biotinretensjon. Selv om det ble rapportert om økning av utskillelse i forhold til en biotinproto-trof ("villtype"), er dette rekombinante systemet ikke blitt anvendt til kommersiell produksjon av biotin i stor skala ved fermentering av transformerte vertceller.

Oppfinnelsens hovedinnhold

En genmodifisert E. coli-celle for forøket fremstilling av biotin ifølge foreliggende oppfinnelse er kjennetegnet ved at den omfatter en E. coli-celle som har en bioR"-genotype, og som, på grunn av mutasjon i birA-genet, har en biotin-retens jon-mangelf ull mutant genotype birA", og ikke-lytisk, ekstrakromosomal DNA i cellen som koder for minst ett genprodukt av biotinoperonet til E. coli eller en funksjonell homolog derav, og som har en uvrB"-genotype.

Et annet aspekt ved foreliggende oppfinnelse omfatter en fremgangsmåte for omdannelse av desthiobiotin til biotin, kjennetegnet ved at en E. coli-celle som har en bioR"-genotype og en biotinretensjon-mangelfull mutant genotype, og som har ikke-lytisk, ekstrakromosomal DNA med en uvrB~-genotype og som koder for et bioB-genprodukt av biotinoperonet til E. coli eller en funksjonell homolog derav, dyrkes i et medium som inneholder desthiobiotin.

Kort beskrivelse av tegningene

Fig. 1 er et prossesskjema over det biosyntetiske

spor for biotin.

Fig. 2 er en skjematisk illustrasjon av funksjonene «til bioR-og birA-genene. Fig. 3 er et partielt restriksjonskart over bio (A-, B-, F-, C-, D-) operonet og det tilgrensende uvrB-sted på

E. coli kromosomet.

Fig. 4 er en skjematisk illustrasjon av konstruksjonen av mellomproduktplasmidet 322PstI. Fig. 5 er en skjematisk illustrasjon av konstruksjonen av et bioD gen-restriksjonsfragment. Fig. 6 er en skjematisk illustrasjon av konstruksjonen av mellomproduktplasmidet pBAL4. Fig. 7 er en skjematisk illustrasjon av konstruksjonen av det biotinoperonholdige plasmid pBP5. Fig. 8 er en skjematisk illustrasjon av konstruksjonen av plasmidene pKA5 og pKH4. Fig. 9 er en skjematisk illustrasjon av konstruksjonen av plasmidet pBFl.

Nærmere beskrivelse

Slik det her er brukt, henviser uttrykket "mutant genotype som gir mangelfull biotinretensjon" til en skade i birA-genet som gir en endring i birA-genet som resulterer i en nedsettelse i aktiviteten til produktet av birA-genet, dvs. en mutasjon i birA-.stedet som gir opphav til en redu-sert kapasitet for adenylering av biotin, og refereres heretter til som birA . En sort foretrukne skader i birA omfatter skader som gjør enzymaktiviteten avhengig av temperatur, dvs. et temperatursensitivt birA-gen birA TS. Slike birA TS-mutanter nedsetter birA-funksjonen etterhvert som temperaturen i systemet Øker.

Foretrukne vertceller omfatter biotinkrevende stammer (genotype: bio ), stammer som mangler repressoren for biotinoperonet (genotype; bioR ), og biotinkrevende stammer som mangler repressorfunksjonen (genotype: bio", bioR~). De mest foretrukne vertceller er bioR -stammer.

Uttrykket "funksjonell homolog av et genprodukt av biotinoperonet" henviser til et polypeptid som har den samme funksjon som genproduktet, men som kan ha den samme aminosyresekvens som, eller være forskjellig med hensyn til aminosyre-isekvens fra, genproduktet. Slike funksjonelle homologer.omfatter f.eks. polypeptidprodukter av alleliske variasjoner

av genene i biotinoperonet, analoger og fragmenter av disse polypeptidene, og syntetiske polypeptider som kan være forskjellig med hensyn til primær struktur (aminosyresekvens), =men som har til felles sekundære strukturer som gjør det mulig for dem å ha biologiske og immunologiske virkninger

til genprodukter av biotinoperonet [Kaiser et al., Science, 223, 249-255 (1984)].

I fig. 1 er det vist et prosesskjema for biosyntese

av biotin. Seks enzymer som er involvert i biosyntese av biotin er blitt tilskrevet seks genetiske steder: bioA, bioB, bioC, bioD, bioF og bioH. Bestemte reaksjoner som katalyseres av bioA-, bioB-, bioD- og bioF-genprodukter, er blitt karakterisert. Kofaktorer og substrater for hver av disse reak-sjonene, bortsett fra en svovelatomdonor i det siste enzyma-tiske trinn, er blitt identifisert. Selv om funksjonene til bioC- og bioH-genproduktene ikke er blitt karakterisert på grunn av begrensninger i undersøkelser med kryssforing (hvor biotinmangelende stammer oppnår overlevelse bare ved å utnytte biotin eller ved å utnytte biosyntetiske forløpere for biotin utskilt av celler som de dyrkes sammen med), er disse stedene blitt identifisert som vesentlige ved hjelp av genetisk komplementering.

De seks genene som koder for biotinsynteseenzymer befinner seg i to områder av E. coli kromosomet. Fem av de seks genene,( bioA, bioB, bioC, bioD og bioF), befinner seg i et toveis transkribert operon kartlagt til 17 minutter. BioH befinner seg ved 74 minutter. Beliggenhetene til genene i biotinoperonet og de to øvrige genetiske funksjonene som man støter på i biosyntesesporet for biotin, bioR og birA, er angitt i tabell I.

Kontroll av biotinsyntese i E. coli utføres på tran-skripsjonsnivået. Etter at biotin er syntetisert, adenyleres det av et produkt av et gen på et sted som betegnes birA, hvorved det dannes biotinyl-5<1->adenylat slik som vist i fig. 2. Et repressorprotein for biotin, identifisert som et produkt av bioR-stedet, kan også bindes til biotinyl-5'-andeny-lat for å øke affiniteten til bioR-genproduktet for en bio-operator 25 ganger. Howard et al., Gene, 35, 321-331 (1985) har beskrevet at birA-produksjonen og bioR-funksjonen ut-øves av det samme protein.

Bio-operatoren ligger mellom det strukturelle gen bioA og det strukturelle gen bioB, slik som vist i fig. 3. Bio-operatoren overlapper både promoteren for bioA-genet og promoteren for bioD-genet. Produktet av bioR-genet kan avslutte transkripsjon ved binding til bio-operatoren og utelukke RNA-polymerase fra disse to divergente promoterer.

Biotinyl-5'-adenylat er også et substrat for .det som antas å være en tredje funksjon av birA-genproduktet, biotin-holoenzym-syntetase. Biotin-holoenzym-syntetase overfører biotin til acetyl-CoA-carboxylase. Acetyl-CoA-carboxylase katalyserer et kritisk trinn i fettsyresyntese som er vesentlig levedyktighet. Dette medfører at en fullstendig elimi-nering av birA-aktivitet ved oppstartingen av fermenteringen ville være dødelig. Ved oppstartingen av fermenteringen er det derfor nødvendig at det er tilstede tilstrekkelig birA-aktivitet til å understøtte cellenes vekst. Slik birA-aktivitet sikres lett av en person med gjennomsnittlig innsikt i teknikken. Etter fullførelse av fermenteringen er det foretrukket at birA-aktiviteten reduseres vesentlig og aller helst fjernes. Ved å anvende et birA TS-gen er det mulig å regulere birA-funksjonen ved å kontrollere temperaturen i fermenteringssystemet. Etterhvert som temperaturen i systemet økes, reduseres derfor birA-funksjonen i cellen.

Et genetisk sted som befinner seg i umiddelbar nær-het av bioD-stedet, betegnes uvrB. uvrB-genet har ingen funksjon i biotinfysiologien, men virker på en eller annen måte til å beskytte E. coli celler mot ultrafiolett stråling ifølge Sancar et al., Cell, 28, 523-530 (1982). Tre RNA-molekyler transkriberes fra urvB-stedet, hvorav én kan rea-gere med RNA polymerase A. Dersom uvrB-genet ble mangfoldig-gjort, kan derfor denne reaksjon være dødelig for en E. coli celle. Av denne grunn bør derfor uvrB-funksjonene fortrinnsvis fjernes før kopiantallet av et plasmid som inneholder et stykke DNA fra det område i E. coli kromosomet som omfatter biotinoperonet, økes.

I tillegg til fortrinnsvis å anvende et birA <TS->gen er det foretrukket å anvende et plasmid med et høyt kopiantall, og aller helst et plasmid som oppviser en middels økning i kopiantall (40 til 200), etter temperaturinduksjon. Slike plasmider er beskrevet i europeisk patentsøknad nr. 136.490 og refereres heretter til som temperatursensitive plasmider. Når det anvendes slike temperatursensitive plasmider, er det derfor mulig, etter økning av reaksjonstemperaturen, å øke kopiantallet og gendoseringen moderat mens cellens levedyktighet opprettholdes og birA-funksjonen reduseres, hvorved man får et system som er i stand til å produsere overraskende høye utbytter av biotin. Følgende eksempler tjener til å illustrere utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse ytterligere. Selv om birA -stammene til Barker et al., J. Bacteriol., 143, 789-800 (1980) og Campbell et al., Proe. Nati. Acad. Sei. ( USA), 69, 767-680 (1972) anvendes i eksemplene, kan det også anvendes andre stammer som er mangelfulle med hensyn til biotinretensjon, slik som f.eks. E. coli stamme P48 omtalt i Pai, J. Bacteriol., 112, 1280-1287 (1972).

Eksempel 1

Som vist i fig. 4, ble et første plasmid betegnet pLC2523 (deponert 23. august 1985) med deponeringsnummer A.T.C.C. 53237 ved American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland) og som er kjent for å inneholde biotinoperonet (se f.eks. Sancar et al., J. Mol. Biol., 148, 63-76 (1981)), og et andre plasmid betegnet pBR322 (A.T.C.C. nr. 37017), kuttet opp med Pstl og bundet sammen ved hjelp av T4 DNA-ligase. Blandingen ble deretter transformert ifølge fremgangsmåten til Hanahan, J. Mol. Biol., 166, 557-580 (1983) inn i bakterieceller av den biotin-auxotrope stamme SA291 (bio<->, bioR<+>, birA<+>) (deponert 23. august 1985 ved American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, med deponeringsnummer A.T.C.C. 53236) . Det ble selektert for kolonier på plater med L-agar inneholdende tetracyklin (12 mg/liter), som drepte alle celler som ikke inneholdt plasmider med tetracyklinresistensseg-mentet i pBR322. De utvalgte kolonier ble undersøkt med hensyn på ampicillinsensitivitet, en indikasjon på at et Pstl-oppkuttingsfragment fra pLC2523 var blitt innført i Pstl-stedet i det ampicillinresistente segment i pBR322, og derved gjort det ute av stand til å gi resistens.

Restriksjonsfragmenter av plasmider som gir tetracyklinresistens, ble fraskilt ved hjelp av gelelektroforese og undersøkt med hensyn på tilstedeværelsen av fragmenter med de forventede lengder til biotinoperonet. På denne måte ble det bestemt at et plasmid betegnet 322PST1 inneholdt biotinoperonet bundet til en tetracyklinresistensmarkør. I dette plasmidet ble imidlertid bioD-genet funnet ikke å være intakt ettersom det ikke ville komplementere biotinauxotrop E. coli stamme SA291 under dyrking i fravær av biotin.

For å oppnå det gjenværende av bioD-genet ble, som vist i fig. 5, pLC2523 spaltet med Ncol for å fremstille et større fragment og et mindre fragment (4,4 kilobaser i lengde) som ble separert ved hjelp av gelelektroforese. Det mindre fragment ble ekstrahert fra gelen og begge endene i det mindre fragment ble nedbrudt med exonukleasen BAL31.

I BAL31-nedbrytningen ble 30 ug av restriksjonsfrag-mentet oppløst i 450 ul BAL31 nukleasebuffer som inneholdt 0,25 mg/ml bovint serumalbumin. En 200 ul porsjon ble behandlet med 2 enheter/pl BAL31 ved 30°C. Prøver ble tatt ut og ekstrahert med fenol etter 2,5 minutter, 5,5 minutter og 10 minutter. Etter etherekstraksjon og ethanolutfelling ble en aliquot av hver tidspunktprøve analysert ved hjelp av elektro-forese gjennom en 0,5% (vekt/volum) agarosegel. De tre tids-punktprøvene ble slått sammen. De således erholdte forkortede fragmenter ble spaltet ytterligere med Bglll og Pstl♦ På grunn av tilstedeværelsen av to Bglll-steder og et Pstl-sted i Ncol-fragmentet fra pLC2523, var det forventet fire frag-menttyper. Blant disse fire fragmenttypene var én forventet å inneholde det gjenværende av bioD-genet og å ha både en stump BAL31-nedbrudt ende og en kohesiv Pstl-nedbrudt ende.

Plasmidet pBR329, [den fullstendige nukleotidsekvens er publisert i Covarrubias et al., Gene, 17, 79 (1982)] ble kuttet opp med både PvuII (som spalter pBR329 i et kloramfenicol-resistent segment, slik at det fåes en stump ende) og med Pstl (som spalter pBR329 på et sted i et ampicillinresistent segment), hvorved man fikk to stykker som ble separert ved hjelp av gelelektroforese. Det største av stykkene (som inneholder et tetracyklinresistent segment og et opprinnelsessted for replikasjon) ble blandet med de fire fragmenttypene produsert ved hjelp av Bglll- og Pstl-oppkuttingene av det 4,4 kp Ncol-fragment beskrevet ovenfor i nærvær av T4 DNA-ligase. Som vist i fig. 6, hadde bare de fragmentene som inneholder det gjenværende av bioD-genet, kombinasjonen av butte og Pstl-nedbrudte ender som kreves for å binde til det større PvuII/ Psti-fragment fra pBR329 slik at det dannes et ring-formet plasmid betegnet pBAL4.

Bakterier av stamme SA2 91 ble transformert med produktene fra ligeringen til det større fragment av pBR329. Kolonier ble -selektert med hensyn på tetracyklinresistens, undersøkt med hensyn på ampicillinsensitivitet og undersøkt med hensyn på kloramfenicolsensitivitet. Lengdene av inn-skuddene i forskjellige plasmider ble bestemt ved hjelp av restriksjonsendonukleaseanalyse.

Som vist vist i fig. 7, ble plasmidene 322PstI og pBAL4 hver for seg kuttet opp med Pstl. Produktene fra disse oppkuttingene ble ført sammen i en ligeringsreaksjon under anvendelse av T4 DNA-ligase. Den resulterende blanding ble brukt til å transformere cellene av stamme SA291. Kolonier ble selektert med hensyn på en kombinasjon av vekst i fravær av biotin og vekst i nærvær av 12 mg/ml tetracyklin. Til-stedeværelse av det fullstendige bio-operon ble bekreftet ved retransformasjon av plasmid-fri SA291, sammen med oppkuttings-analyse med restriksjonsendonuklease. Et resulterende plasmid, betegnet pBP5, inneholdt alle genene i biotinoperonet: genene bioA, bioB, bioF og bioC, og den delen av bioD-genet som befinner seg oppstrøms fra Pstl-stedet avledet fra 322PstI, og den delen av bioD-genet som befinner seg ned-strøms fra Pstl-stedet avledet fra pBAL4.

Deretter ble det temperatursensitive ; kopiantållsplas-mid pCFM 526 kuttet opp med EcoRI og på nytt bundet sammen med ligase, hvorved man fikk pCFM 526AE4, som manglet P-promoteren som finnes i PCFM 52 6. Plasmid pCFM 52 6 var blitt konstruert som beskrevet i'publisert europeisk patent-søknad nr. 136.490 fra plasmid pCFM414 (ATCC nr. 40.076).

Som vist i fig. 8, ble plasmid pCFM 526AE4 og plasmid pBP5 hver for seg kuttet opp med Hindlll. Fragmentene ble ligert og brukt til å transformere SA291. Kolonier ble selektert med hensyn på ampicillinresistens og evne til å vokse i fravær av biotin. Et plasmid betegnet pKA5 ble isolert. Dette plasmidet inneholdt de fem genene fra bio-operonet bundet til et temperaturinduserbart opprinnelsessted for replikasjon.

Eksempel 2

Videre som vist i fig. 8, ble et annet plasmid også konstruert på en måte som er analog med konstruksjonen av pKA5 beskrevet i eksempel 1, men med et plasmid betegnet pCFM1036NS, som inneholdt et kanamycinresistenssegment, i stedet for pCFM526AE4. Kolonier ble derfor selektert med hensyn på kanamycinresistens i stedet for ampicillinresistens, hvorved man fikk celler som bar et plasmid pKH4.

Eksempel 3

Et HindiII-fragment fra pBP5 ble behandlet med BAL31 og blandingen ble ligert inn i Hpal-kuttet pCFM5264E4. Kolonier ble selektert med hensyn på biotinproduksjon, ampicillinresistens og tetracyklinsensitivitet. Fra denne utvelgelse ble det erholdt tre plasmider, pBA2, pBA4 og pBA6.

Eksempel 4

Som vist i fig. 9, ble plasmidene pBP5 og pCFM526 kuttet med Ncol og Hindlll. Ligeringsproduktet av disse oppkuttingsstykkene ble transformert inn i en E. coli stamme

AM7 som inneholdt plasmid pMWi (ATCC nr. 39933) som igjen inneholder et gen for den temperatursensitive repressor

857

CI . I denne konstruksjonen, betegnet pBFi, er bio B-genet plassert under kontroll av PL~promoteren. Denne konstruksjon er derfor anvendbar når det gjelder å omdanne desthiobiotin til biotin ved hjelp av produktet fra bioB-genet, biotinsyntetase.

Eksempel 5

Plasmidet pLC2523 ble oppkuttet med Hindlll og Ncol. Plasmidet pCFM52 6 ble kuttet på lignende måte. Et ligerings-produkt av disse to oppkuttingsstykkene, betegnet pAHN203, ble transformert inn i celler av en bakteriestamme som inneholder den temperatursensitive repressor fra bakteriofag A.

(CI 857). Plasmidet pCFM526 inneholder PL~promoteren fra bakteriofagX . Et gen eller gener innført nedstrøms fra dette sted ble kontrollert av denne promoter. Promoteraktiviteten reguleres ved hjelp av repressor CI 857. Når temperaturen økes, elimineres derfor repressorvirkningen, promoteren aktiveres og de ønskede genprodukter uttrykkes. Se f.eks. Morris, supra. I pAHN203 er bioA-genet under PL~kontroll. Plasmidet pAHN203 ble kombinert med pBFl, hvorved man fikk et plasmid som produserer biotin under PT-kontroll.

Følgende buffere ble anvendt i eksemplene. En buffer med høyt saltinnhold som omfatter: 75mM NaCl, 50mM Tris-HCl, pH 7,6, lOmM MgCl2 og 5mM dithiothreitol. En buffer med middels saltinnhold som omfatter: 37,5mM NaCl, 30mM Tris-HCl, pH 7,6, lOmM MgCl2 og 5mM dithiothreitol. En buffer med lavt saltinnhold som omfatter: lOmM Tris-HCl, pH 7,6, lOmM MgCl2,

20mM KC1 og 5mM dithiothreitol. En ligasebuffer som omfatter: 50mM Hepes, pH 7,5, lOmM MgCl2, 5mM dithiothreitol og 0,4 itiM adenosintrifosfat. En polynukleotidkinasebuffer som omfatter: 50mM Tris-HCl, pH 7,6, lOmM MgCl2, ImM spermidin, 5mM dithiothreitol og 0,lmM ethylendiamintetraeddiksyre (EDTA). En BAL31-nukleasebuffer som omfatter: 12mM CaCl2, 12mM MgCl2, 20mM NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 8,0 og ImM EDTA.

Restriksjonsenzymene EcoRI og Ncol ble brukt i bufferen med høyt saltinnhold og ble erholdt fra New England Biolabs,

Beverly, Massachusetts. Restriksjonsenzymene Bglll, BamHi, Hindlll og Pstl ble brukt i bufferen med middels saltinn-

hold og ble erholdt fra New England Biolabs, Beverly, Massachusetts. Restriksjonsenzymet Hpal ble brukt i bufferen med lavt saltinnhold. DNA-ligasen ble brukt i ligasebuffer og ble erholdt fra New England Biolabs, Beverly, Massachusetts. Nukleasen BAL31 ble brukt i BAL31-nukleasebuffer og ble erholdt fra Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Maryland. Bovint serumalbumin ble også erholdt fra Bethesda Research Laboratories.

Ampicillin, kanamycinsulfat, kloramfenicol og tetracyklin ble erholdt fra Sigma Chemical Company (Sigma), St. Louis, Missouri. Desthiobiotin ble også erholdt fra Sigma Chemical Company. Biotin ble erholdt enten fra Sigma eller

fra J.T. Baker Chemical Company, Phillipsburg, New Jersey. Stamme BM40 62 som er blitt deponert (23. august 19 84) ved American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland som ATCC 53238, hadde skader i bioR-funksjonen og birA-funksjonen. BirA-mutantene var temperatursensitive på den måte at de var levedyktige ved lave tem-peraturer (ca. 28°C), men dyrkningsudyktige ved høye tempera-turer (ca. 43°C). Avhengig av den aktuelle bestemte mutant kunne den dødelige virkning av høy temperatur oppheves ved tilsetning av eksogen biotin. De andre plasmidene og stammene som ble anvendt i eksemplene, er oppsummert i tabell II: Bortsett fra SA291 er alle birA<->-stammene angitt i tabell II omtalt i Barker et al., J. Bacteriol., 143, 789-800 (1980) eller Campbell et al., Proe. Nati. Acad. Sei ( USA), 69, 676-680 (1972), hvor de alle er beskrevet som biotinkrevende stammer. Stamme SA291 er omtalt i Cleary et al., J. Bacteriol., 112, 830-839 (1972). I tabell II bør det også legges merke til at bioR p henviser til en genotype som gir opphav til et "delvis deffekt" bioR-genprodukt.

De følgende analyser ble benyttet for å bestemme biotinkonsentrasjonen i prøvene i de følgende eksempler.

Mikrobiologisk analyse

Biotinkonsentrasjonen ble bestemt ved "kryssforing"

av SA291-celler med biotinet produsert av den utpekte stamme. Først ble SA291 dyrket over natten i GMH-dyrkningsvæske

(9 g/liter "vitamin assay Casamino Acids" (Difco, Detroit, Michigan), 4 g/liter glukose, 20 ug/liter 1-histidin, 40 ug/ liter thiamin, ImM MgS04, 6 g/liter Na2HP04, 3 g/liter KH2P04, 0,5 g/liter NaCl og 1 g/liter NH4C1) supplert med 30 0 pM d-biotin (50 ml volum) ved 37°C. Kulturen etter dyrking over natten ble fortynnet 400 ganger i GMH-dyrkningsvæske. 2 ml prøver av fortynnet kultur ble fylt i prøverør. Varierende konsentrasjoner av prøven som skulle analyseres, ble tilsatt til rørene. Analysen ble analysert ved tilsetning av en av de følgende konsentrasjoner av d-biotin (Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri) til seks individuelle rør: 30 pM, 100 pM, 300 pM, 1000 pM og 3000 pM tilsatt d-biotin. Alle rørene ble dyrket over natten ved 37°C. Den optiske tetthet i resulterende kulturer ble bestemt og de ukjente prøvene ble korrelert med standardprøvene.

Spektrofotometrisk analyse

Biotinkonsentrasjonen ble bestemt ved hjelp av en spektrofotometrisk biotinanalyse avledet fra McCormick et al., Analytical Biochemistry, 34, 226-236 (1970). Nærmere bestemt ble 100 ul prøve overført til et prøverør hvor 900 ul vann ble tilsatt. Konsentrert H2S04 (5 ul) ble tilsatt for å redu-sere pH i oppløsningen til mindre enn 2. Til oppløsningen ble det tilsatt 1 ml n-butanol og den resulterende oppløs-ning ble vortex-behandlet i 1 minutt og deretter sentrifu-gert i 1 minutt ved 3200 rpm. Den øvre fasen, butanolfasen,

av oppløsningen ble deretter overført til et 1,5 ml Eppendorf-rør. Oppløsningsmidlet ble avdampet inntil tørrhet før tilsetning av 100 ul 2% (volum/volum) svovelsyre og 100 ul 0,2%

(vekt/volum) 4-dimethylaminocinnamaldehyd. Den resulterende oppløsning ble vortexbehandlet og deretter hensatt uforstyrret i 5 - 10 minutter før tilsetning av 800 ul ethanol. Absorbansen (A) i oppløsningen ved 532 nm ble bestemt på et Gilford Response spektrofotometer. Fra absorbansen ble biotinkonsen-

trasjonen (C) i mol/liter oppnådd for 1 cm sporlengde fra ligningen:

Eksempel 5

De forskjellige kulturene som ble benyttet i eksemplene 6 og 7, ble konstruert ved å transformere en passende vert-stamme med et plasmid avledet fra eksemplene 1 eller 2 ifølge fremgangsmåten beskrevet av Hanahan, supra. Vert-stammene og plasmidene som ble benyttet, er angitt i tabell

II.

Eksempel 6

Kolbemetode

En kolbe som inneholdt 30 ml GMH-dyrkningsvæske ble inokulert med et volum av en kultur angitt i tabell II. De resulterende kulturer ble inkubert med rysting ved 37°C. Aliquoter ble fjernet og filtersterilisert etter 0, 6, 21, 30 og 45 timer. (En 2,5 ml aliquot ble fjernet etter 0 timer, mens 1 ml aliquoter ble fjernet etter de øvrige tidspunkter). De steriliserte prøver ble analysert i overensstemmelse med den mikrobiologiske analyse som tidligere er beskrevet, og resultatene (forsøk nr. 1-7) er vist i tabell II.

Eksempel 7

Fermentormetode

Den passende vert som bærer plasmider, ble dyrket over natten i GMH-dyrkningsvæske. En 10 ml aliquot av kulturen ble tilsatt til 1000 ml GMH-dyrkningsvæske supplert med 20 ml 1% alanin, 20 ml 1% methionin, 20 ml 0,7% cystein og passende antibiotikum (sluttkonsentrasjon på 50 mg/liter ampicillin ble brukt når plasmid pKA5 ble anvendt, og 25 mg/liter kanamycinsulfat ble brukt når plasmid pKH4 ble anvendt). Fermenteringen ble utført i en New Brunswick Bio-Flo fermentor under følgende fremgangsmåtetrekk: 1) konstant omrøring ved 600 rpm, 2) gjennomblåsing av luft, 3) pH-kontroll mellom 6,8 og 7,2 ved hjelp av automatisk tilsetning av konsentrert ammoniumhydroxyd, 4) temperaturkontroll og 5) en sakte til-førsel i løpet av fermenteringen. Utviklingen av oppløst oxygen og carbondioxyd ble ikke overvåket. Tilførselen besto av: 12% glukose, 0,6% casaminosyrer for vitaminanalyse, 35 ym magnesiumsulfat, 02% alanin, 0,2% methionin, 0,12% cystein,

7 um natriummolybdat og M9 minimalsalter i halv styrke. Til-førselen ble startet opp 8 timer etter inokulering ved en kontinuerlig hastighet på 14 ml/time. Temperaturen på inoku-leringstidspunktet var 30°C. Etter at den optiske tetthet i kulturen hadde nådd omtrent 10 målt ved 600 nanometer, ble temperaturen trinnvis økt til 40°C. Biotinkonsentrasjonene angitt i tabell II ble bestemt 24 timer etter inokulering under anvendelse av enten den mikrobiologiske analyse (for-søk nr. 8, 9 og 10), eller den spektrofotometriske analyse (forsøk nr. 10 og 12) .

Selv om forskjeller mellom analyser for biotin gjør

en direkte sammenligning vanskelig, tjener en sammenligning mellom resultatene rapportert i tabell II og mediumkonsentra-sjoner av biotin rapportert for villtype og mutant E. coli til å illustrere forbedringen i biotinproduksjon som foreliggende oppfinnelse gir. F.eks. er mediumkonsentrasjonen av biotin for villtype E. coli mindre enn 0,05nM og for stamme S942 (en birA -stamme) 30 - 90nM ifølge Campbell et al., Proe. Nati. Acad. Sei. ( USA), 69, 676-680 (1972). Ifølge Pai, J. Bacteriol., 112, 1280-1287 (1972) er mediumkonsentrasjonen av biotin for en stamme P48 som kan anvendes som en mutant-stamme med mangelfull biotinretensjon, 100 ganger større enn for villtypen.

Eksempel 7

Kulturer brukt i dette eksemplet er beskrevet i

tabell III

Hver kultur ble inokulert i Luria-dyrkningsvæske (0,1% casaminosyrer, 0,5% gjærekstrakter, 0,5% natriumklorid) og inkubert over natten ved 3 0°C. Den optiske tetthet i hver kultur ble bestemt og er vist i tabell IV. En 10 ganger for-tynning var nødvendig på grunn av tettheten i kulturen.

En kolbe som inneholdt 30 ml GMH-dyrkningsvæske ble inokulert med volumet av de seks kulturene angitt i tabell IV ovenfor. De resulterende kulturer ble inkubert med rysting ved 37°C. Ved 0, 6, 21, 30 og 45 timer ble en aliquot fjernet og filtersterilisert. (En 2,5 ml aliquot ble fjernet ved 0 timer, mens 1 ml aliquoter ble fjernet ved de øvrige tidspunkter) . De steriliserte prøver ble analysert i henhold til den mikrobiologiske analyse som tidligere er beskrevet, og resultatene er vist i tabell V.

Claims

1. Genmodifisert E. coli-celle for forøket fremstilling av biotin, karakterisert ved at den omfatter en E. coli-celle som har en bioR"-genotype, og som, på grunn av mutasjon i birA-genet, har en biotinretensjon-mangelfull mutant genotype birA', og ikke-lytisk, ekstrakromosomal DNA i cellen som koder for minst ett genprodukt av biotinoperonet til E. coli eller en funksjonell homolog derav, og som har en uvrB"-genotype.

2. E. coli-celle ifølge krav 1, karakterisert ved at den biotinretensjon-mangelf ulle mutante genotype er birA<TS>.

3. E. coli-celle ifølge krav 2, karakterisert ved at den ekstrakromosomale DNA utkoder biotinoperonet til E. coli.

4. E. coli-celle ifølge krav 3, karakterisert ved at cellen har en bio"-qeno-type.

5. E. coli-celle ifølge krav 1, karakterisert ved at den ekstrakromosomale DNA koder for biotinsyntetase eller en funksjonell homolog derav.

6. E. coli-celle ifølge krav 5, karakterisert ved at cellen har en birA'-genotype.

7. E. coli-celle ifølge krav 6, karakterisert ved at cellen har en bio~-qeno-type.

8. E. coli-celle ifølge krav 7, karakterisert ved at birA"-qenotypen er birA<TS>.

9. E. coli-celle for fremstilling av biotin ifølge krav 1, karakterisert ved at den omfatter: en E. coli-celle med en (bio"-, birA"-, bioR"-)genotype og ekstrakromosomal DNA i cellen som utkoder biotinoperonet og har en uyrB"-genotype.

10. E. coli-celle ifølge krav 9, karakterisert ved at cellen har en (bio"-, birA<TS->, bioR"- )genotype.

11. Fremgangsmåte for omdannelse av desthiobiotin til biotin, karakterisert ved at en E. coli-celle som har en bioR'-genotype og en biotinretensjon-mangelfull mutant genotype, og som har ikke-lytisk, ekstrakromosomal DNA med en uvrB"-genotype og som koder for et bioB-genprodukt av biotinoperonet til E. coli eller en funksjonell homolog derav, dyrkes i et medium som inneholder desthiobiotin.