JP3081901B2 - γ−ポリグルタミン酸の製造法 - Google Patents

γ−ポリグルタミン酸の製造法

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JP3081901B2
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polyglutamic acid
acid
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淳夫 五嶋
正雄 国岡
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Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、食品、化粧品、医薬等
の分野で、増粘剤、バインダー、保湿剤、担体、徐放性
材料等に利用が期待されるγ−ポリグルタミン酸の、ビ
オチン要求性株のバチルス(Bacillus)属微生
物を用いた発酵による製造法に関する。
【0002】
【従来の技術】微生物を用いたγ−ポリグルタミン酸の
製造法として、特公昭43−24472号公報に記載の
方法等が知られている。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】ビオチン要求性株のバ
チルス(Bacillus)属微生物を培養してγ−ポ
リグルタミン酸を製造する方法に関して、ビオチンの他
にグルタミン酸およびグルコースが必須因子であるとい
う報告がある[日本農芸化学会誌,36巻,1000頁
(1962)等]。しかし、発酵液中のγ−ポリグルタ
ミン酸の蓄積量が少ないこと(数g/l)、さらにレバ
ン(フルクトースの重合体)を生成する等の問題点があ
った。
【0004】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ビオチン
要求性株のバチルス属(Bacillus)微生物を培
養してγ−ポリグルタミン酸を発酵生産する際に、培地
中にグルタミン酸、クエン酸および硫酸アンモニウムを
含有させることによって、レバンの生成を抑え、高収率
でγ−ポリグルタミン酸を生産できることを見いだし
た。以下に本発明を詳細に説明する。なお、以下で示さ
れる%は、wt/v%のことである。
【0005】本発明に使用できる微生物は、ビオチン要
求性のバチルス属(Bacillus)微生物でγ−ポ
リグルタミン酸を発酵液中に蓄積する菌株であればいず
れも使用可能である。代表的なものとしてバチルス・ズ
ブチリス(Bacillussubtilis)が挙げ
られ、その具体例としてIFO3009株、同3013
株、同3335株、同3336株、同3936株、同1
3169株、ATCC15245株等が挙げられるがこ
れらに限定されない。
【0006】本発明に使用するグルタミン酸の含有量
は、好ましくは1〜10%、更に好ましくは2〜5%で
ある。含有量が少ないと、γ−ポリグルタミン酸の生産
量が少なかったり、あるいは全く生産しない。また、含
有量が多いと菌が増殖しない場合があり、増殖しても発
酵液中に多量のグルタミン酸が残存し効率が良くない。
用いられるグルタミン酸は、アルカリ金属塩(例えば、
ナトリウム塩)の形でも差し支えない。
【0007】本発明に使用するクエン酸の含有量は、好
ましくは1〜10%、更に好ましくは2〜5%である。
含有量が少ないと、γ−ポリグルタミン酸の生産量が少
ないばかりでなく、レバンの生成比率が高くなる。ま
た、含有量が多いと菌が増殖しない場合があり、増殖し
ても発酵液中に多量のクエン酸が残存し効率が良くな
い。用いられるクエン酸は、アルカリ金属塩(例えば、
ナトリウム塩)の形でも差し支えない。
【0008】本発明に使用する硫酸アンモニウムの含有
量は、好ましくは0.1〜2%、更に好ましくは0.2
〜1%である。硫酸アンモニウムを含有させなくともγ
−ポリグルタミン酸を生産するが、少量であり、レバン
の生成比率が高い。含有量が多いと、菌が増殖せずγ−
ポリグルタミン酸を生産しない。
【0009】本発明に使用する培地には、上記のグルタ
ミン酸、クエン酸、硫酸アンモニウムの他に、適量のビ
オチンおよび無機物が用いられる。無機物としてはリン
酸イオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネ
シウムイオン、カルシウムイオン、鉄イオン、マンガン
イオン等が挙げられ、これらは0.001〜1%の範囲
で含有される。
【0010】培養は、好気的条件下で、振とう培養、攪
拌培養などで行う。培養温度は、25〜45℃が好まし
く、30〜40℃が更に好ましい。培養液は中性付近が
好ましく、pH6〜8が適当である。pHの調整には、
水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、塩酸、硫酸などを
用いて行う。通常、1〜5日間の培養でγ−ポリグルタ
ミン酸は発酵液中に蓄積される。
【0011】上記発酵液からのγ−ポリグルタミン酸の
単離は、公知の方法により行うことができる。すなわ
ち、遠心沈降、自然沈降、微細孔を有するフィルター濾
過等により菌体を除去した後、3〜4倍容のエタノー
ル、メタノール、アセトン等の親水性有機溶媒を添加し
て得た沈澱物を水に溶解し不溶物を除去し、低分子化合
物を透析、限外濾過等により除去して単離する方法や、
菌体を除去した発酵液をpH6.5付近に調整し、飽和
硫酸銅水溶液を添加して沈澱させる方法により行うこと
ができる。
【0012】
【実施例】次に、本発明を実施例により更に詳細に説明
する。
【0013】実施例1 グルタミン酸3g、クエン酸2g、硫酸アンモニウム
0.5g、KH2 PO40.1g、Na2 HPO4 ・1
2H2 O0.1g、MgSO4 ・7H2 O0.05g、
MnSO4 ・nH2 O0.002g、FeCl3 ・6H
2 O0.005g、ビオチン50μgを蒸留水に溶かし
たpH7.5(水酸化ナトリウムで調整)の培地100
mlを調製し、500ml坂口フラスコに入れ、121℃、
15分間蒸気殺菌後、バチルス・ズブチリスIFO33
35株(Bacillus subtilis)を接種
し、37℃、72時間、120回/分で好気的振とう培
養を行った。
【0014】発酵液を遠心沈降によって除菌した後、4
倍容のメタノールを加え、生じた沈澱物を回収した。こ
の沈澱物を蒸留水100mlに溶解し、不溶物を遠心分離
によって除いた後、透析を行い、凍結乾燥してγ−ポリ
グルタミン酸の白色粉末1.06gを得た。また、ゲル
濾過クロマトグラフィーにより、分子量は約110万、
γ−ポリグルタミン酸/レバン比は99/1(示差屈折
計で検出したピーク面積より算出した)であった。
【0015】実施例2 グルタミン酸量を5gとしたこと以外は実施例1と同様
に培養を行い、γ−ポリグルタミン酸の白色粉末0.8
0gを得た。分子量は約80万、γ−ポリグルタミン酸
/レバン比は99/1であった。
【0016】実施例3 グルタミン酸量を2gとしたこと以外は実施例1と同様
に培養を行い、γ−ポリグルタミン酸の白色粉末0.7
8gを得た。分子量は約105万、γ−ポリグルタミン
酸/レバン比は99/1であった。
【0017】実施例4 クエン酸量を5gとしたこと以外は実施例1と同様に培
養を行い、γ−ポリグルタミン酸の白色粉末0.75g
を得た。分子量は約150万、γ−ポリグルタミン酸/
レバン比は99/1であった。
【0018】実施例5 硫酸アンモニウム量を0.2gとしたこと以外は実施例
1と同様に培養を行い、γ−ポリグルタミン酸の白色粉
末0.80gを得た。分子量は約30万、γ−ポリグル
タミン酸/レバン比は94/6であった。
【0019】実施例6 硫酸アンモニウム量を1gとしたこと以外は実施例1と
同様に培養を行い、γ−ポリグルタミン酸の白色粉末
1.12gを得た。分子量は約200万、γ−ポリグル
タミン酸/レバン比は100/0であった。
【0020】実施例7 バチルス・ズブチリスIFO3335株(Bacill
us subtilis)の代わりにバチルス・ズブチ
リスIFO13169株を用いたこと以外は実施例1と
同様に培養を行い、γ−ポリグルタミン酸の白色粉末
1.03gを得た。分子量は約120万、γ−ポリグル
タミン酸/レバン比は97/3であった。
【0021】比較例1 グルタミン酸3g、硫酸アンモニウム0.5g、KH2
PO4 0.1g、Na 2 HPO4 ・12H2 O0.1
g、MgSO4 ・7H2 O0.05g、MnSO 4 ・n
2 O0.002g、FeCl3 ・6H2 O0.005
g、ビオチン50μgを蒸留水に溶かしたpH7.5
(水酸化ナトリウムで調整)の溶液50mlを調製し、5
00ml坂口フラスコに入れ、121℃、15分間蒸気殺
菌を行った。さらにグルコース2gを蒸留水に溶かした
pH7.5(水酸化ナトリウムで調整)の液50mlを調
製し、ろ過滅菌を行ない、前記溶液に加え培地とした。
以下は実施例1と同様に培養を行い、γ−ポリグルタミ
ン酸の白色粉末0.15gを得た。分子量は約140
万、ポリグルタミン酸/レバン比は77/23であっ
た。
【0022】比較例2 グルタミン酸を添加しないこと以外は実施例1と同様に
培養を行ったが、γ−ポリグルタミン酸は得られなかっ
た。
【0023】比較例3 クエン酸を添加しないこと以外は実施例1と同様に培養
を行ったが、γ−ポリグルタミン酸は得られなかった。
【0024】比較例4 硫酸アンモニウムを添加しないこと以外は実施例1と同
様に培養を行い、γ−ポリグルタミン酸の白色粉末0.
09gを得た。分子量は約10万、γ−ポリグルタミン
酸/レバン比は76/24であった。
【0025】比較例5 バチルス・ズプチリスIFO3335株(Bacill
us subtilis)の代わりにバチルス・ズブチ
リスIFO13169株を用いたこと以外は比較例1と
同様に培養を行い、γ−ポリグルタミン酸の白色粉末
0.10gを得た。分子量は約110万、γ−ポリグル
タミン酸/レバン比は81/19であった。
【0026】
【発明の効果】実施例から明らかなように、本発明の製
造法により、γ−ポリグルタミン酸の収率が向上し、さ
らにレバンの副生を大幅に抑制できた。

Claims (2)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 ビオチン要求性株のバチルス(Baci
    llus)属微生物を培地に接種し、好気的培養を行
    い、γ−ポリグルタミン酸を発酵生産する方法におい
    て、該培地が、グルタミン酸、クエン酸および硫酸アン
    モニウムを含有していることを特徴とするγ−ポリグル
    タミン酸の製造法。
  2. 【請求項2】 グルタミン酸、クエン酸および硫酸アン
    モニウムの培地中の含有量がそれぞれ1〜10wt/v
    %、1〜10wt/v%および0.1〜2wt/v%で
    あることを特徴とする請求項1記載のγ−ポリグルタミ
    ン酸の製造法。
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