CN1353192A - 生产目的发酵产物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供生产目的发酵产物的方法。该方法包括提供含有重组产生的微生物的发酵培养基,所述微生物超量产生发酵产品并含有引起该微生物营养缺陷型生长的突变,其中该微生物中的所述营养缺陷并不损害该微生物产生所述发酵产品的能力。然后给所述培养基提供过量的对于所述发酵产品的产生所必需的所有底物,以及生长限制量的补充所述营养缺陷的底物。本发明还提供在此方法中使用的宿主细胞、载体和多核苷酸序列。

Description

生产目的发酵产物的方法
本发明涉及生产目的发酵产物的方法。更具体地，本发明涉及用于在微生物中超量产生目的发酵产物的方法，其中所述微生物含有导致该微生物营养缺陷型生长，但不损害该微生物超量表达所述目的发酵产物的突变。本发明还提供在该方法中使用的宿主细胞和多核苷酸序列。
许多商业上有价值的产品可以通过发酵反应制备。例如，核黄素是一种所有细菌、动物和植物所必需的基本维生素，植物和细菌可以合成核黄素，然而高等动物却不能，它们必须从其饮食中获取核黄素。
商业上用作食品和饲料添加剂的核黄素可以例如采用棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)、阿舒假囊酵母(Eremothecium ashbyii)或Candidaflareri细胞通过发酵反应制备。见例如Ainsworth，G.C.和Sussman，A.S.，真菌(The Fungi)，Academic Press，纽约(1965)；Heefner，D.L.等，WO88/09822；Hickey，R.J.，通过发酵制备核黄素(Productionof Riboflavin by Fermentation)，工业发酵(IndustrialFermentation)(Underkofler，L.A.和Hickey，R.J.编)第157-190页，Chemical Publishing公司，纽约(1954)；和Perlman，D.等，FermentationInd.Eng.Chem.44：1996-2001(1952)。
在枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中，催化从鸟苷三磷酸(GTP)和5-磷酸核酮糖生物合成核黄素所必需的酶由4个基因(ribG，ribB，ribA和ribH)编码。见图1A。这些基因位于一个操纵子中，其中的基因顺序不同于由这些酶催化的酶反应顺序。例如，GTP环化水解酶II催化核黄素生物合成的第一步，其由该操纵子中的第三个基因ribA编码。见图2。该ribA蛋白质还编码第二种酶活性，即DHB合成酶，该酶催化5-磷酸核酮糖转化成四碳单元DHB。脱氨酶和还原酶由该操纵子的第一个基因ribG编码。ribA和ribG基因产物的双功能性可能便于形成一个协同的核黄素前体流。核黄素生物合成的倒数第二步由最后的rib基因ribH的产物2，4-二氧四氢喋啶合成酶催化。控制该途径最后步骤的核黄素合成酶由该操纵子的第二个基因ribB编码。位于该rib操纵子3’末端的基因X(图1)的功能目前尚不清楚，然而其基因产物对于核黄素的合成是非必需的。
从ribP1启动子起始的该核黄素操纵子的转录通过衰减机制控制，该机制涉及到位于ribPl和ribG之间的调节前导区。该前导区中的ribO突变导致该核黄素操纵子的下调表达。在含有ribC基因的错义突变的菌株中也观察到下调表达。最近显示在枯草芽孢杆菌中该ribC基因编码黄素激酶/FAD合成酶。见Mack，M.等，细菌杂志(J.Bact.)180：950-55(1998)。下调突变降低了ribC基因产物的黄素激酶活性，导致降低的黄素单核苷酸(FMN)细胞内浓度，FMN是核黄素调节系统的效应分子。
最近，对枯草芽孢杆菌微生物进行遗传工程操作以在短发酵周期中产生高产量的核黄素。见Perkins，J.B.，美国专利5,837,528(“Perkins的528”)，该文献特此完整地以参考文献方式并入本文。该方法将经典遗传突变筛选以及发酵改良与核黄素生物合成基因的遗传工程操作结合起来，其中所述遗传工程操作通过下调和增加基因表达水平进行。在该系统中，通过突变编码黄素激酶的ribC基因、将rib基因与强组成型启动子连接以及增加rib基因的拷贝数，增加rib基因的表达。
例如，存在于Perkins的528所公开的质粒pRF69中的改造rib操纵子缺失了完整的ribP1启动子和大部分调节前导区，并替换成组成型噬菌体SPO1启动子P15。见图1B。此外，在ribB和ribA基因之间引入该噬菌体启动子以进一步增强相应下游基因的转录。最后，在pRF69中rib基因下游提供了氯霉素抗性基因。通过单交换型转化将pFR69靶向宿主微生物RB50的rib操纵子中，其中所述微生物宿主RB50含有下调嘌呤生物合成的突变并在ribC基因中含有下调核黄素生物合成的突变。
通过pRF69对RB50进行的单交换型转化所产生的基因组结构包括一个氯霉素抗性基因，在该基因的两侧，一端是野生型rib操纵子，另一端是pRF69的改造rib操纵子。当对具有增强的氯霉素抗性的pRF69转化细菌进行筛选时，该结构中的这些重复元件引起该抗性基因和侧翼rib操纵子的拷贝数增加。
在含有多拷贝(n)的pRF69修饰rib操纵子(即RB50：：[pRF69]n)的RB50中，rib基因的增强转录已通过Northern印迹分析获得证实。野生型枯草芽孢杆菌积累非常少量的包括整个rib操纵子的RNA转录本，与此不同，RB50：：[pRF69]n积累大量的主要包括该操纵子头两个基因的较短转录本。ribA上游改造的第二个P15启动子导致包括该rib操纵子三个下游基因的RNA转录本的显著积累。见Perkins，J.B.等，J.Ind.Mierobiol.Biotechnol.，22：8-18(1999)。
在含有例如枯草芽孢杆菌RB50：：[pRF69]n的核黄素补料分批发酵反应器中，从共同的发酵底物葡萄糖产生生物质和核黄素。将葡萄糖抽入反应器的速率(“葡萄糖进料速率”)对于葡萄糖分别应用于生物质和核黄素的产生是关键的。快葡萄糖进料速率允许培养物以提高的速率生长，导致过量的生物质形成以及核黄素产率的降低。然而，过慢的葡萄糖进料速率尽管降低了生物质的产生，但也导致低的核黄素生产力。由于低产率、低的生产力或两者兼有的情况增加了核黄素的生产成本，所以必须仔细调节商业核黄素发酵反应器中的葡萄糖进料速率以在生物质和核黄素的产生之间建立一个平衡。
鉴于上述缺点，在维持对于所用反应器的大小和类型而言最为有效的生物质生产水平的同时，对目的发酵产物例如核黄素的生产进行优化将是人们所期望的。
本发明的一个实施方案是用于生产目的发酵产物的方法。该方法包括提供含有重组产生的如下微生物的发酵培养基，所述微生物超量产生目的发酵产物，并含有导致该微生物营养缺陷型生长的突变，其中所述微生物中的所述营养缺陷并不损害该微生物产生所述目的发酵产物的能力。然后，给所述培养基提供对于发酵产物的产生所必需的所有底物、目的发酵产物的底物以及补充所述营养缺陷的底物。前一种或多种底物过量提供，以确保最大的生产力。后一种底物(即，补充所述营养缺陷的底物)限量提供以保持低速率的生物质形成。
本发明的另一个实施方案是用于使发酵培养基中目的发酵产物的产生与生物质的产生脱偶联的方法。该方法包括提供重组产生的微生物，所述微生物已被改造而含有编码目的发酵产物生物合成酶的多核苷酸序列。在该方法中，所述目的发酵产物的最大产生取决于给所述微生物非限制地提供目的发酵产物的底物。接着，将营养缺陷引入该微生物中，以便通过限制发酵培养基中补充该营养缺陷的底物的浓度来控制生物质的产生。本发明还提供通过上述方法制备的发酵生产微生物。
作为一个进一步的实施方案，本发明还包括多核苷酸，其选自SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：1的引入营养缺陷的同系物或片段、或SEQ ID NO：1的含有插入、缺失或替代并保留了在宿主细胞中引起营养缺陷的能力的多核苷酸序列。
本发明的另一个实施方案是用如下多核苷酸序列转化的宿主细胞，所述多核苷酸序列是包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：1的保留了其在宿主细胞中引起营养缺陷的能力的同系物或片断的多核苷酸序列，或SEQ IDNO：1中含有插入、缺失或替代但保留了在宿主细胞中引起营养缺陷的能力的多核苷酸序列。
在另一个实施方案中，本发明还提供含有多拷贝的改造rib操纵子pRF69并已用SEQ ID NO：1多核苷酸序列转化的核黄素生产微生物RB50。
本发明包括用于生产目的发酵产物的方法。在该方法中，提供含有超量产生目的发酵产物的重组产生微生物的发酵培养基。所述微生物还含有引起该微生物营养缺陷型生长的突变，其中该营养缺陷并不损害该微生物产生所述发酵产品的能力。
本文所用短语“重组产生的微生物”是指经重组DNA技术修饰以产生商业上有用的目的发酵产物例如核黄素的任何微生物。例如，根据本发明的微生物可以包括细菌细胞。该微生物可以选自埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、蓝细菌属(Cyanobacter)、链霉菌属(Streptomyces)和棒杆菌属(Corynebacteria)细胞。优选地，该微生物选自大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)或产氨芽孢杆菌(B.ammoniagenes)。
在本发明中，采用重组DNA技术对所述微生物进行修饰以增加所述目的发酵产物的生产，使其高于野生型的生产水平，实施例中将对此有更详细的说明。本文所用“目的发酵产物”是指通过发酵产生的化合物，例如核黄素、泛酸、生物素、硫胺素、叶酸、吡哆醇和氨基酸。
例如，当所述目的发酵产物是核黄素时，该重组产生的微生物是枯草芽孢杆菌细胞，例如命名为RB50：：[pRF69]n的枯草芽孢杆菌生产微生物，该微生物含有多拷贝(如大约5-20个拷贝)编码rib操纵子的pRF69，该rib操纵子已用强噬菌体SPO1启动子(P15)修饰增强了该rib基因的表达。该重组产生的微生物所产生的核黄素显著多于野生型微生物。见Perkins的528。
用于本发明的枯草芽孢杆菌微生物RB50于1989年5月23日根据布达佩斯条约保藏在农业研究机构培养物保藏中心(NRRL)，Peoria，IL，保藏号为B 18502。用于本发明的质粒pRF69于1990年6月6日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Rockville，MD，保藏号为ATCC 68338。
在本发明中，所述重组产生的微生物含有引起营养缺陷型生长的突变。本文所用“突变”是指所述微生物的基因组序列中的改变，这种改变可以通过任何方便的方法引入，这些方法包括例如：化学或UV诱变，之后对期望表型进行选择或筛选；通过重组技术体外构建功能异常的基因，用于通过单和双交换重组取代该微生物基因组中该基因的完整对应基因；以及其它熟知的技术。见，Sambrook等，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第2版，Cold SpringHarbor Laboratory Press(1989)，和Harwood和Cutting，用于芽孢杆菌的分子生物学方法(Molecular Biology Methods For Bacillus)，John Wiley and Sons(1990)，第27-74页。
术语“营养缺陷型/体”、“营养缺陷型的”和“营养缺陷”在本文中可以互换使用，是指通过例如突变修饰需要添加外源化合物才能生长的微生物，在突变之前该化合物可由该微生物自身产生。因此，“营养缺陷型生长”是指被造成对特定底物具有营养缺陷的微生物在已知成分发酵培养基中生长的能力。
营养缺陷型生长所必须的外源化合物在本文中称作“补充营养缺陷的底物”或“补充底物”。在本发明中补充营养缺陷的底物的例子包括氨基酸、核苷酸和维生素。在本发明中，微生物可以是生物素、色氨酸、赖氨酸和/或腺嘌呤营养缺陷体。该微生物也可改造成含有一个以上这种营养缺陷。特定营养缺陷的筛选对于本发明并不是关键的，只要该营养缺陷使目的发酵产物的产生与生物质的产生脱偶联并且该营养缺陷不损害所述微生物产生该目的发酵产物的能力即可。
在用于发酵反应器的某些微生物例如枯草芽孢杆菌中，使用各种底物作为碳、氮和氧的来源。这些底物是产生所述目的发酵产物和生物质所必需的。如上所述，营养缺陷型微生物还要求提供“补充”底物。
本文所用短语“最大生产力”是指当对于目的发酵产物的形成所必需或有益的所有底物过量存在时，在指定的理化参数例如pH和温度下，微生物能够产生的目的发酵产物的最大量。最大生产力的计算方式是：gm所产生的产物/gm生物质/小时。
本文所用短语“最大生长速率”是指当提供过量的生长必需的所有底物时，在指定的理化参数例如pH和温度下，微生物所达到的最高生长速率。因此，微生物的最大生长速率是每一段时间所述微生物生物质的相对增加量。微生物的最大生长速率和最大生产力可以由本领域的技术人员采用例如连续培养发酵来确定。
如果所述发酵产品的产生所必需的一种底物未过量提供，则该底物将成为生产限速底物，而该底物的供给将决定所述目的发酵产物的生产速率(即，该方法的生产力)。同样，如果不过量提供所述生物质生长所必需的一种底物，则该底物将成为生长限制底物，而其供给将决定生长速率。
如果一个底物的限制供应同时决定了生物质的生长速率和目的发酵产物的生产力，则称该生物质和目的发酵产物的产生是偶联的。在偶联的方法中，生长和生产的限制底物是相同底物。对于核黄素发酵系统，葡萄糖是微生物使用的主要碳源，其对于生物质和产物的形成是必需的。葡萄糖限制将导致一个“偶联”过程。向发酵罐(也即是向微生物)中提供葡萄糖的速率的增加或降低分别决定了核黄素和生物质的产生是上调或下调。
如果一个底物(底物1)的限制供应决定所述微生物的生长速率，而另一个底物(底物2)的供应决定目的发酵产物的生产力，则称生物质和目的发酵产物的产生是“脱偶联的”。在“脱偶联”的方法中，底物2的非限制供应将导致所述微生物的最大生产力。因此，在脱偶联的方法中，例如在使用本发明营养缺陷型微生物的方法中，可以以非限制速率向发酵反应器提供葡萄糖(底物2)，以达到目的发酵产物的最大生产力，而以防止生物质以其最大生长速率增加并由此限制生物质产生的速率向发酵反应器提供补充该营养缺陷的底物(底物1)。
根据本发明微生物中营养缺陷的存在以及补充该营养缺陷的相应底物的生长限制供应均不得损害该微生物产生所述目的发酵产物的能力。在本发明中，如果补充该营养缺陷的底物的限制供应导致了不足50％的所述目的发酵产物的最大生产力，则该营养缺陷“损害了”该微生物产生目的发酵产物的能力。如果携带该营养缺陷的生产微生物的最大生产力低于没有该营养缺陷的相同微生物的最大生产力的50％，则也称该目的发酵产物的生产力受到所述营养缺陷的“损害”。
在本发明中，微生物中营养缺陷的存在通过在有或无此补充营养缺陷的相应底物的情况下于适合的发酵培养基中测定生物质的产生来确定。见实施例1。本文所用“生物质的产生”或“生物质的生长”是指特定微生物的生长和分裂能力。在本发明中，生物质的产生通过标准微生物方法测定，例如称重总的细胞干重或在特定波长例如550-660nm之间测量发酵样品的浑浊度。见实施例3。或者，可以通过琼脂平板上菌落的形成评价微生物的生长和分裂，即产生生物质的能力。
如果适合的话，微生物基因组中所存在的导致营养缺陷的突变可以通过标准分子生物学技术例如Southern杂交、PCR(见实施例1)或DNA测序来证实。这些技术对于本领域的技术人员是易于获得的。见例如Sambrook等，分子克隆：实验室手册，第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press(1989)，第8-14章；和Ausubel等编，当代分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wileyand Sons公司(1998)，第15章。
正如以上提及的，根据本发明的微生物优选是生物素营养缺陷型。生物素或维生素B8作为一种辅基对于许多酶包括丙酮酸羧化酶和乙酰辅酶A羧化酶是必需的。生物素是从庚二酸生物合成的，涉及多个酶反应步骤。见图3。在枯草芽孢杆菌中用于生物素生物合成的基因聚集在单个操纵子中。见图4。生物素营养缺陷型微生物在不补加生物素，即补充该营养缺陷的底物的情况下不能生长。类似地，赖氨酸、色氨酸和腺嘌呤营养缺陷型细胞在发酵培养基不补加相应补充该营养缺陷的底物时同样不能生长。
在商业发酵方法中，期望限制生物质的生长速率，以例如降低昂贵的发酵底物的消耗，并保持需氧量和代谢活跃的生物质的热量产生在发酵反应器的氧传递和冷却能力的极限范围内。在“偶联”方法中，通过限制目的发酵底物的供应限制生物质的产生可以降低所述微生物的目的发酵产物的生产力。在采用根据本发明的营养缺陷型微生物的“脱偶联”方法中，可以通过限制补充该营养缺陷型的底物的供应来限制生物质的产生，而目的发酵产物则以对于该产物而言微生物最大的生产力产生，这是因为产物形成所需求的所有底物均被过量提供。
在本发明中，目的发酵产物的产生与生物质的产生的脱偶联可以通过在已经经过修饰超量表达目的发酵产物例如核黄素的微生物中引入营养缺陷来实现。因此，在本发明中，所述目的发酵产物的最大产生在所述微生物以其最大生产力合成该目的发酵产物的时候到达。
因此，本发明的营养缺陷型微生物在含有补充该营养缺陷的如下浓度底物的发酵培养基中培养，其中该底物的浓度足以维持生物质以规定生长速率生长。向该发酵培养基提供所述微生物所需要的所有其它底物，这些底物的浓度将不限制该微生物以其最大生产力产生所述目的发酵产物的能力。
存在于或补加给发酵培养基的补充该营养缺陷的底物和实现目的发酵产物的最大生产力所需要的其它底物的具体浓度将随着所选择的具体营养缺陷、目的发酵产物、所用反应器、生产微生物和其它熟知的发酵变量而改变。例如，在含有生物素营养缺陷型生产微生物的核黄素生产培养物中，向该发酵培养基添加的葡萄糖(即目的发酵底物)的量必须足以进行核黄素(即目的发酵产物)的超量产生。本文所用术语“超量产生”是指所述微生物以高于至少0.1％(w/w)的产率，优选高于1％(w/w)的产率，例如高于4％(w/w)的产率从用作碳源的底物产生所述目的发酵产物。
在本发明中，发酵培养基中所述目的发酵产物的底物的浓度与补充所述营养缺陷的底物的浓度之比是从约1∶10,000,000至约1∶10，优选从约1∶1,000,000至约1∶100。
在本发明中，可以从所述微生物和/或所述培养基中分离所述目的发酵产物。本文所用术语“分离的”是指所述目的发酵产物是纯的，或至少部分纯的。所述发酵产品可以通过本领域已知的方法纯化。这些方法包括例如过滤、离心和/或提取。所述目的发酵产物可以通过从水性或有机溶剂中重结晶或应用本领域已知的其它方法例如离子交换层析、大小排阻层析或疏水相互作用层析进行进一步纯化。对于从发酵培养液中分离和纯化核黄素的操作的详细描述，见Kupfer E.，欧洲专利申请EP 0730034 Al。
在一个优选的实施方案中，制备了超量产生核黄素的重组产生的微生物。对该微生物进一步修饰使其含有使核黄素的产生与生物质的产生脱偶联的生物素营养缺陷。因此，补充该营养缺陷的底物是生物素，而发酵产物的底物是葡萄糖。例如，根据本发明的微生物是枯草芽孢杆菌核黄素生产微生物RB50，该微生物含有多拷贝的改造rib操纵子pRF69。见Perkins的528。在该实施方案中，向含有改造rib操纵子pRF69的RB50细胞引入生物素营养缺陷，该营养缺陷使得核黄素的产生与生物质的产生脱偶联。该生物素营养缺陷型核黄素生产微生物命名为RB50：：[pRF69]Bio-。当以生物素作为生长限制底物进行培养时，与葡萄糖限制的培养相比，该菌株的具体核黄素生产力增加了大约3倍。见实施例3。
本发明还包括RB50：：[pRF69]Bio-的衍生物。本文所用RB50：：[pRF69]Bio-的“衍生物”是含有pRF69之改造rib操纵子或与pRF69之改造rib操纵子有至少25％一致性、优选至少50％一致性的多核苷酸序列、并是生物素营养缺陷体的任何枯草芽孢杆菌细胞，例如具有重组改造rib操纵子的、核黄素产生与生物质产生脱偶联的其它芽孢杆菌属微生物。在本发明中，该多核苷酸序列的一致性百分数采用BLAST程序和国家生物技术信息中心(Bethesda，MD，美国)的服务器来确定。
在本发明中，所述微生物可以首先含有编码一或多个具有产生核黄素之酶活性的多肽的多核苷酸序列，以及一或多个天然情况下不与该多核苷酸序列相关但现在与该多核苷酸序列在转录上相连的转录元件。
本文所用“转录元件”包括本领域技术人员所已知的增强子、启动子、天然或合成的核糖体结合位点和/或终止子。见Perkins的528。在本发明中，该多核苷酸序列可以含有一种以上的上述转录元件。优选地，该多核苷酸序列包括至少一个启动子。
本发明还包括在发酵培养基中使目的发酵产物的产生与生物质的产生脱偶联的方法。该方法包括提供重组产生的如下微生物，所述微生物经改造含有编码目的发酵产物的生物合成酶的多核苷酸序列，其中该目的发酵产物的最大生产取决于非限制地供应该目的发酵产物的底物。然后在该微生物中引入营养缺陷以便通过限制发酵培养基中补充该营养缺陷的底物的浓度控制生物质的产生。
对于本发明，所述营养缺陷向微生物的“引入”可以采用任何方便的方法进行。例如，可以采用经典诱变技术以及重组生物学技术将该营养缺陷引入至所述微生物中。优选地，通过转化将编码缺陷基因或一组缺陷基因的多核苷酸序列引入该微生物中，其中所述基因在该微生物中的完整对应部分是产生用于生物质生产的必需化合物所必需的。
本文所用术语“转化”是指向微生物引入所述多核苷酸序列，以及所述多核苷酸序列与该微生物的基因组DNA通过单或双交换机制发生重组并由此取代相应的该完整基因或一组基因。见Harwood和Cutting，用于芽孢杆菌的分子生物学方法，John Wiley and Sons(1990)，第27-74页。向所述微生物引入所述多核苷酸序列可以通过本领域技术人员熟知的任何方便的方法来实现，这些方法例如用线形化或环状多核苷酸序列转化天然感受态受体细胞或原生质体、普遍性转导、转染、脂转染、电穿孔、微粒轰击等等。见，同上和Sambrook等，分子克隆：实验室手册(第2版)，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)。
本发明的多核苷酸序列可以在枯草芽孢杆菌的bioFDB基因盒中含有缺失-插入突变，详见实施例。优选地，该多核苷酸序列是SEQ ID NO：1。在本发明中，可以用各长几百个碱基对的突出序列对SEQ ID NO：1的3’-和5’-末端进行修饰，以增加SEQ ID NO：1的转化效率。该突出序列是随机序列，其与所述受体细胞的DNA序列的同源性应当少于80％，以防止在非期望座位发生重组。然后将这些多核苷酸序列用于转化能够超量产生目的发酵产物的微生物。
采用标准筛选方法选择该缺失-插入突变的阳性转化体，即现在是营养缺陷的转化体。见，同上。例如，用于转化所述微生物的多核苷酸序列可以含有各种选择标记，包括例如抗生素抗性标记、生色标记等。优选地，该标记是新霉素抗性标记，而且对于期望转化的选择包括鉴定能够在补加了新霉素的发酵培养基上生长并且超量产生所述目的发酵产物例如核黄素的微生物，详见实施例1。
在本发明的另一个实施方案中，提供多核苷酸序列。当用该多核苷酸序列进行转化时可以制备生物素营养缺陷型的枯草芽孢杆菌或其近缘种例如解淀粉芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。优选地，该多核苷酸序列是SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：1的引入营养缺陷的同系物。优选地，用SEQ ID NO：1或其引入营养缺陷的同系物转化芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述同系物保留了SEQ ID NO：1在宿主细胞中引起营养缺陷的能力。
在本发明中，如果根据BLAST测定多核苷酸含有与SEQ ID NO：1中所存在的部分bioF和bioB序列具有大于70％一致性的序列，则该多核苷酸被认为是SEQ ID NO：1的“引入营养缺陷的同系物”。
本发明还包括用含有SEQ ID NO：1或其在宿主细胞中引起营养缺陷的同系物的多核苷酸序列转化的宿主细胞；或者是用SEQ ID NO：1中含有一或多个插入、缺失和/或替换的多核苷酸序列转化的宿主细胞，其中该序列保留了在该宿主细胞中引起营养缺陷的能力。
根据本发明，所述宿主细胞可以是能够产生目的发酵产物的任何微生物。例如，该宿主细胞可以选自埃希氏菌属、芽孢杆菌属、蓝细菌属、链霉菌属和棒杆菌属的细胞。优选地，该微生物选自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌或产氨芽孢杆菌。更优选地，该宿主细胞是枯草芽孢杆菌细胞，例如含有多拷贝的改造rib操纵子pRF69的RB50。
本发明最重要的一些结果总结在附图中。
图1显示了根据本发明的枯草芽孢杆菌野生型核黄素操纵子和pRF69的改造rib操纵子。(A)显示了rib0调节位点和结构基因ribG、ribB、ribA和ribH，以及基因X的位置。标出了上游σA启动子ribP1和推测的内部启动子ribP2。并指示了基因X下游的不依赖于ρ的转录终止子和ribG上游的转录衰减子。(B)显示了pRF69之改造rib操纵子的结构，标出了含有组成型噬菌体SPO1启动子P15的该DNA序列的位置。
图2显示了枯草芽孢杆菌中核黄素的生物合成途径。
图3显示了芽孢杆菌属的生物素生物合成途径。
图4显示了枯草芽孢杆菌的生物素(bio)生物合成操纵子。
给出以下实施例用以阐述本发明的方法和组合物。这些实施例仅是说明性的，而不旨在以任何方式限制本发明的范围。例如，可以按如下方式对本发明进行变更：在大规模工业发酵罐中实施脱偶联方法、将稀释速率从0.3l/h变成0.001l/h、增加所述发酵培养基中的成分浓度、将葡萄糖浓度增加至高达400g/l、和在分批或补料分批发酵反应器中实施根据本发明的脱偶联方法。对于所有这些变化，所述培养基成分，包括生物素，可以由本领域技术人员确定和调整。
实施例实施例1.枯草芽孢杆菌营养缺陷型突变的构建
在以下实施例中，首先在大肠杆菌中构建引入生物素营养缺陷的多核苷酸序列。用此多核苷酸序列转化天然枯草芽孢杆菌感受态微生物，导致生物素营养缺陷型枯草芽孢杆菌突变体。然后，使用从该突变体制备的PBS1噬菌体裂解物，通过普遍性转导将该营养缺陷引入含有多拷贝改造rib操纵子pRF69的生产微生物RB50中。对于该多核苷酸序列和该枯草芽孢杆菌突变体的构建，均采用标准重组DNA技术。见例如Sambrook等，分子克隆：实验室手册(第2版)，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989)；和Harwood和Cutting，用于芽孢杆菌的分子生物学方法，John Wiley and Sons(1990)。
为了构建bioFDB的缺失-插入突变，采用枯草芽孢杆菌微生物1012(Saito等，分子普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)170：117-122(1979))的基因组DNA作为模板以及以下引物，通过PCR扩增含有完整bioF、bioD和bioB基因的2938bp DNA片段：BioF+1(5’-GAGAGGATCCACGAGGTTACGAGC-3’)(SEQ ID NO：2)BioB-1(5’-GCGACGAATTCGACATCATACCGATTGC-3’)(SEQ ID NO：3)。
该PCR反应的反应条件由25个循环构成，每个循环是95℃变性1分钟、55℃退火1分钟和72℃延伸3分钟。采用Wizard PCR纯化试剂盒(Promega公司)纯化该PCR产物，然后用BamHI和EcoRI进行双酶切。将此消化的PCR产物克隆至(1)BamHI-EcoRI消化的pUC19中，获得质粒pNMR3；以及克隆至(2)BamHI-EcoRI消化的pBluescriptII SK+中，获得质粒pNMR4。
采用下列引物在PCR反应中扩增质粒pBEST501(Itaya等，核酸研究(Nucleic Acid Res.)17：4410(1989))的1.2kb新霉素抗性盒，该PCR反应由25个循环构成，每个循环是95℃变性1分钟、55℃退火1分钟和72℃延伸3分钟：pBESTBstBI+1(5’-GCGCTTCGAAGCTTGGGCAGCAGGTCG-3’)(SEQ ID NO：4)pBESTBstBI-1(5’-GCGCTTCGAATTCAAAATGGTATGCG-3’)(SEQ ID NO：5)
用BstBI消化pNMR3和pNMR4，除去包括部分bioF和bioB基因以及完整的bioD基因的1019bp片段。纯化该扩增的新霉素抗性盒，并用BstBI消化，之后将其克隆至BstBI消化的pNMR3和pNMR4中。
然后构建以下质粒：含有新霉素抗性盒的pNMR5，该新霉素抗性盒插入在bioFDB基因中，取向与pUC19中bio转录方向相同；含有新霉素抗性盒的pNMR6，该新霉素抗性盒插入在bioFDB基因中，取向与pUC19中bio转录方向相反；以及含有新霉素抗性盒的pNMR7，该新霉素抗性盒插入在bioFDB基因中，取向与pBluescriptII SK+中bio转录方向相反。所有这三个质粒均采用XbaI线性化，并转化天然感受态枯草芽孢杆菌1012细胞。在含有终浓度为5μg/ml的新霉素的TBAB平板上筛选转化体。观察到大约250个转化体，从其中挑取30个接种在含有或不含有0.1mg/m1生物素的Spizen氏基本培养基(SMM)上。30个菌落中有23个是生物素营养缺陷体。通过对融合接点的PCR检验分析6个菌落，并为之后的应用保留2个菌落(分别命名为枯草芽孢杆菌NM1和NM2)。
枯草芽孢杆菌微生物NM2用作制备PBS1噬菌体裂解物的供体微生物。使用该裂解物转导已具有修饰的核黄素操纵子pRF69的核黄素生产微生物RB50。RB50是枯草芽孢杆菌宿主微生物，其含有引入以改良了核苷酸和核黄素的产生的几个突变。pRF69是指通过引入强噬菌体启动子修饰的rib操纵子，其中该启动子被引入至pRF50的rib座位中。扩增该修饰操纵子pRF69以产生高拷贝数。Perkins的528中给出了微生物RB50和该修饰rib操纵子pRF69的详细说明。获得许多在没有外源生物素时不能在SMM上生长的新霉素抗性菌落。通过PCR和Southern杂交分析其中的3个克隆，它们表现出含有bioFDB：：neo突变。挑选命名为NM9的一个克隆，重新命名为RB50：：[pRF69]Bio-。Southern印迹杂交揭示了pRF69的存在。
在补加了10μg/ml氯霉素的丰富复杂培养基(VY培养基，DSMZ培养基577)中培养RB50：：[pRF69]Bio-至光密度0D660＝1。将1ml该培养物转移至补加了30μg/ml氯霉素的20ml VY培养基中，在0D值达到1后，再将1ml培养物转移至补加了60μg/ml氯霉素的20ml VY培养基中。采用含有80μg/ml氯霉素的VY培养基重复相同的传代。在0D值达到1后，向该培养物补加15％(体积/体积)甘油并将1ml等分试样贮存在-80℃。抗生素浓度的逐步增加被用于筛选具有增加拷贝数的修饰rib操纵子pRF69的细菌。见Perkins的528。
实施例2.连续培养发酵
按以下详细描述采用连续恒化培养实现生长和生产的脱偶联，并产生对RB50：：[pRF69]Bio-的核黄素生产力的期望正向影响。根据标准教科书，见例如Neidhardt等，细菌细胞的生理学(Physiology of TheBacterial Cell)，Sinauer Associates公司(1990)，在连续发酵培养中已经达到稳态状况(恒化)的细胞生长速率与操作发酵罐的稀释速率相等。在此发酵罐中生物质的浓度与限速底物的浓度相关联。
在装备了叶片式搅拌器的Bioflow 3000型New Brunswick生物反应器(3升总体积)中进行发酵。采用带有入口泵和溢流管的连续恒化器培养，该入口泵控制流速，而该溢流管控制反应器中的液体水平面。发酵变量如下：
液体体积：1200ml
稀释速率：0.15
温度：37℃
pH：6.75
通气：每分钟1升压缩空气
搅拌器速度：1000rpm
在培养的每一个阶段溶解氧浓度均在20％的空气饱和度之上。
用于间歇期的发酵培养基和作为补料培养基的发酵培养基含有具有指定终浓度的下列成分：0.25g/l谷氨酸钠、1.57g/l KH2PO4、1.57g/lK2HPO4、2.74g/l Na2HPO4×12H2O、4.00g/l NH4Cl、0.1g/l柠檬酸、6.80g/l(NH4)2SO4、22g/l葡萄糖×H2O、0.2ml/l(基于硅的)消泡剂、14.1mg/lFeSO4×7H2O；10.5mg/l CaCl2×2H2O、9.4mg/l MnSO4×1H2O、2.7mg/lCoCl2×6H2O、1.0mg/l(NH4)6HMo7O24×4H2O、0.67mg/l AlCl3×6H2O、0.50mg/lCuCl2×2H2O；6.7g/l MgSO4×7H2O、2.68mg/l ZnSO4×7H2O。
谷氨酸钠盐、KH2PO4、K2HPO4、Na2HPO4×12H2O、NH4Cl、柠檬酸和(NH4)2SO4均溶解在85％的终体积中，通过加入盐酸将pH调节至pH4，并对该溶液进行高压灭菌。将葡萄糖溶解在10％的终体积中并单独高压灭菌。消泡剂以浓缩液形式单独高压灭菌。对于每一批培养基新鲜制备500倍浓缩的FeSO4×7H2O溶液，并过滤除菌。其它盐制备成500倍浓缩液，并在以下组合中过滤除菌：组1：CaCl2×2H2O；组2：MgSO4×7H2O、CoCl2×6H2O、(NH4)6HMo7O24×4H2O、AlCl3×6H2O、CuCl2×2H2O；组3：MgO4×TH2O、ZnSO4×7H2O。在无菌条件下将这些分别除菌的溶液合并在一起，并加入无菌水以达到终体积。
用按以下方法制备的40ml种子培养物接种发酵罐：将实施例1冻存的一份RB50：：[pRF69]Bio-细菌悬液融化，并转移至补加了60μg/ml氯霉素的100ml VY培养基中。在37℃孵育该培养物直到0D值达到1(典型地在12-15个小时之后)。
发酵的间歇期(batch phase)，即发酵培养基中的葡萄糖被生长细菌耗尽的时间段，持续大约24小时。在达到葡萄糖耗竭之后，这可通过溶解氧值的急剧升高来指示，将发酵转换成以每小时0.15稀释率进行的连续模式(启动进口和出口泵)。施加于发酵罐的发酵培养基是补充了10μg/l生物素(实施例3的发酵A)或3ug/l生物素(实施例3的发酵B)的上述培养基(含有20g/l葡萄糖)。在培养物达到稳态后，即在已对发酵罐体积进行过5次以上的交换之后，采取发酵样品并进行分析。实施例3.在偶联和脱偶联方法中生物质和核黄素的产生
在从发酵反应器进行收集之后，立即在实施例2的1ml发酵样品中加入20μl40％NaOH溶液。在室温孵育该样品20秒，以溶解样品中的核黄素晶体。对1份该悬浮液进行稀释并用0.1摩尔磷酸钾缓冲液(pH7.0)中和。该悬浮液中生物质的含量通过测量660tm处的浑浊度确定。调节该样品的稀释度以使读数达到0.05-0.3个吸光度单位之间。
作为一种验证，通过称重干细胞质量确定该悬浮液中生物质的含量。取1ml从以上获得的该悬浮液，将其转移至预先称重的Eppendorf管中，并通过离心收集细菌(14,000rpm，5分钟)。用1ml去离子水洗涤该细菌一次，于80℃真空干燥直到达到恒定重量。通过重量分析确定该干细胞质量。
通过HPLC分析确定上述获得的悬浮液的无细胞上清液中核黄素的浓度。使用装备了双向泵、柱恒温器和二极管阵列检测器的Hewlett-Packard1100系统。通过不锈钢Supelcosil LC-8-DB柱(150×4.6mm，颗粒大小3μm)进行该样品的分级分离。使用根据以下时间表的溶剂A(4mmol/l硫酸水溶液)和溶剂B(甲醇)的梯度洗脱：
时间[分钟]    ％A    ％B
   0          94      6
   2          94      6
   15         50      50
   20         50      50
柱体温度设定在20℃，而流速为1.0ml/分钟。记录280nm处的UV吸光值，在大约11分钟时(总的过柱时间为20分钟)检测核黄素峰。通过比较样品与核黄素标准品(Sigma，St.Lous，MO，美国)的积分峰值，计算该核黄素浓度。
实施例2中所述的发酵过程的结果总结在表1中(数值代表从连续模式开始后在第45-71小时之间采取的3个样品获得的平均值)。
                              表1
    发酵A     发酵B
    偶联方法(10μg/l生物素，20g/l葡萄糖)    脱偶联方法(3μg/l生物素，20g/l葡萄糖)
 生物质浓度g/l     5.87+/-0.19     3.36+/-0.18
 核黄素浓度g/l     0.608+/-0.033     0.802+/-0.044
 基于葡萄糖的生物质产率％     29.4+/-1.0     17.0+/-0.9
 基于葡萄糖的核黄素产率％     3.04+/-0.17     4.05+/-0.16
 生物质生产力核黄素g/生物质g×小时     0.0154+/-0.0009     0.0354+/-0.0030
在发酵B(表1)中发酵培养基中含有3μg/l生物素和20g/l葡萄糖，产生3.36g/l生物质。当生物素增加至10μg/l而保持20g/l的葡萄糖时，生物质的产率增加至5.87g/l生物质(发酵A，表1)。生物素供应的进一步增加并没有导致更高的生物质产量。因此，在发酵A中葡萄糖(发酵底物)是生长限速底物。在发酵B中，葡萄糖是以非生长限制速率供应的。相反地，生物素(补充底物)限制生物质的生长。因此，表1的发酵A和B分别代表了本文所定义的偶联和脱偶联方法。
该实施例的结果显示了，在脱偶联方法中生物素作为生长限制底物而葡萄糖作为发酵底物(发酵B)，生物质的生产力比偶联方法(发酵A)极大地增加(3倍)。此外，产物产率即基于消耗的葡萄糖所产生的核黄素的量在脱偶联方法中比在偶联方法中高了33％。
基于以上对本发明进行的描述，明显地，本发明可以以多种方式进行改变。这些改变并不被认为偏离了本发明的范围和精神，而且所有这些修改都包括在以下权利要求的范围内。
                  序列表<110>F.Hoffmann-La Roche AG<120>生产目的发酵产物的方法<130>Case 20606<140><141><150>USSN 09/633,927<151>2000-08-08<160>5<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>3156<212>DNA<213>枯草芽孢杆菌<400> 1ggatccacga ggttacgagc cttgaagatt gattcctggt taaacgagcg gttagacaga 60atgaaagaag ccggcgtaca tcgtaacctg cggtcaatgg atggagcgcc ggttccagag 120aggaatattg atggcgaaaa tcaaacggtc tggtcctcaa acaattattt agggctcgca 180agcgatagac gtttgatcga tgcagcccaa acagcattgc agcaatttgg gacaggaagc 240agcggttcac gtttaacgac aggcaattcg gtctggcatg aaaagctaga aaagaagatt 300gcgagcttta aactgacaga agcggccctg ctgttttcga gcggttactt ggccaatgtc 360ggtgtccttt catccttgcc agaaaaggaa gatgtcattt taagtgacca gctcaatcat 420gcaagtatga tcgacggctg ccgactttct aaggctgata cagttgttta tcggcatatt 480gatatgaatg atcttgaaaa caagctgaat gaaacacagc gttatcagcg ccgttttatc 540gtaacagacg gagtattcag catggatggc acaatcgccc ctcttgatca gatcatctca 600cttgcgaaac gctatcatgc cttcgtggtc gttgatgatg cccacgcaac aggagttttg 660ggcgattcgg gacaaggaac gagtgaatac tttggtgttt gtcccgacat tgttatcggc 720accttaagca aagctgttgg cgcggaagga ggttttgcgg caggatcagc ggtcttcatc 780gactttttgc tgaaccatgc cagaacattt atctttcaaa ccgctattcc gccagccagc 840tgtgcggctg ctcacgaggc tttcaacatc attgaagcca gcagggaaaa acgacagctt 900ttattttctt atatcagcat gatcagaacc agtctgaaga atatgggtta tgtggtgaaa 960ggagatcaca caccgattat tcctgtagtc attggcgatg cccataaaac ggtcctattt 1020gctgaaaaac tgcagggcaa gggaatttat gctcctgcca ttcggccgcc aaccgttgcg 1080ccgggtgaaa gccggattcg aagcttgggc agcaggtcga gatcagggaa tgagtttata 1140aaataaaaaa agcacctgaa aaggtgtctt tttttgatgg ttttgaactt gttctttctt 1200atcttgatac atatagaaat aacgtcattt ttatttttat tttagttgct gaaaggtgcg 1260ttgaagtgtt ggtatgtatg tgttttaaag tattgaaaac ccttaaaatt ggttgcacag 1320aaaaacccca tctgttaaag ttataagtga ctaaacaaat aactaaatag atgggggttt 1380cttttaatat tatgtgtcct aatagtagca tttattcaga tgaaaaatca agggttttag 1440tggacaagac aaaaagtgga aaagtgagac catgtgctta ggaagacgag ttattaatag 1500ctgaataaga acggtgctct ccaaatattc ttatttagaa aagcaaatct aaaattatct 1560gaaaagggaa tgagaatagt gaatggacca ataataatga ctagagaaga aagaatgaag 1620attgttcatg aaattaagga acgaatattg gataaatatg gggatgatgt taaggctatt 1680ggtgtttatg gctctcttgg tcgtcagact gatgggccct attcggatat tgagatgatg 1740tgtgtcatgt caacagagga agcagagttc agccatgaat ggacaaccgg tgagtggaag 1800gtggaagtga attttgatag cgaagagatt ctactagatt atgcatctca ggtggaatca 1860gattggccgc ttacacatgg tcaatttttc tctattttgc cgatttatga ttcaggtgga 1920tacttagaga aagtgtatca aactgctaaa tcggtagaag cccaaacgtt ccacgatgcg 1980atttgtgccc ttatcgtaga agagctgttt gaatatgcag gcaaatggcg taatattcgt 2040gtgcaaggac cgacaacatt tctaccatcc ttgactgtac aggtagcaat ggcaggtgcc 2100atgttgattg gtctgcatca tcgcatctgt tatacgacga gcgcttcggt cttaactgaa 2160gcagttaagc aatcagatct tccttcaggt tatgaccatc tgtgccagtt cgtaatgtct 2220ggtcaacttt ccgactctga gaaacttctg gaatcgctag agaatttctg gaatgggatt 2280caggagtgga cagaacgaca cggatatata gtggatgtgt caaaacgcat accattttga 2340attcgaaagc gccgattgag tcttaccgga tggtgaataa ggaaacgctg cttgaaggcg 2400cgaagcgggc gcacgatctg aatatcggca catattgtat cgtggcaagc ggcagaggtc 2460cgtctaacag agaagtggat caggtcgtag atgcggttca ggaaattaaa gagacgtatg 2520gactgaagat ttgtgcatgt cttggactgt tgaagccaga gcaggcgaag cggctcaaag 2580atgcaggagt agaccgctat aatcataatt tgaatacgtc acagagaaac cattcaaaca 2640tcacaacctc acatacatac gatgacagag tcaatacggt tgaaatcgca aaagaatcgg 2700ggctgtctcc gtgttcaggc gccattatcg ggatgaagga gacgaaacag gatgtcattg 2760acatcgccaa aagcttgaag gctcttgacg cggattccat tcctgtgaat tttttgcatg 2820caattgatgg cacgccgtta gaaggcgtca acgaattaaa cccgctgtat tgtttaaaag 2880tgctggcgct gttccgtttt atcaatccat caaaagaaat tcgcatttcc ggaggaagag 2940aggtcaatct ccgcacattg cagccattag ggctttacgc cgcaaactcc atttttgtcg 3000gagactactt aacaactgcc gggcaagagg agacggagga tcataaaatg ctgagtgatt 3060taggctttga agttgaatca gtcgaagaaa tgaaggctag tttaagtgcg aaaagctgaa 3120agaatcaata aaagcaatcg gtatgatgtc gaattc                           3156<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物序列
  BioF+1<400>2gagaggatcc acgaggttac gagc    24<210>3<211>28<2 12>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物序列
  BioB-1<400>3gcgacgaatt cgacatcata ccgattgc    28<210>4<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物序列
pBESTstB I+1<400>4gcgcttcgaa gcttgggcag caggtcg    27<210>5<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物序列
  pBESTstBI-1<400>5gcgcttcgaa ttcaaaatgg tatgcg    26

Claims (22)

1.用于生产目的发酵产物的方法，包括：
(a)提供含有重组产生的如下微生物的发酵培养基，所述微生物超量产生目的发酵产物并含有引起该微生物营养缺陷型生长的突变，其中该微生物中的所述营养缺陷并不损害该微生物产生所述目的发酵产物的能力；和
(b)给所述培养基提供对于所述目的发酵产物的产生所必需的所有底物、该目的发酵产物的底物、和补充所述营养缺陷的底物。
2.根据权利要求1的方法，还包括从所述微生物和/或所述发酵培养基分离所述目的发酵产物。
3.根据权利要求1或2的方法，其中以足以维持生物质以一定生长速率生长的浓度向所述发酵培养基提供补充所述营养缺陷的底物，而以不限制所述微生物产生所述发酵产物的能力的浓度向该发酵培养基提供对于该发酵产物的产生所必需的底物。
4.根据权利要求3的方法，其中所述靶发酵底物与补充所述营养缺陷的底物之比是从1∶10,000,000至1∶10，尤其是从1∶1,000,000至1∶100。
5.根据权利要求1-4之任意一项的方法，其中所述目的发酵产物选自核黄素、泛酸、硫胺素、叶酸、吡哆醇和氨基酸。
6.根据权利要求1-4之任意一项的方法，其中所述微生物含有一个或多个拷贝的编码具有产生核黄素之酶活性的多肽的多核苷酸序列，并含有一个或多个天然情况下不与所述微生物中的所述多核苷酸序列相关、但现在与所述微生物中的所述多核苷酸序列在转录上相连的转录元件。
7.根据权利要求6的方法，其中所述转录元件包含至少一个启动子。
8.根据权利要求1-7之任意一项的方法，其中所述微生物中的所述营养缺陷选自生物素、腺嘌呤、色氨酸、赖氨酸和其组合的缺陷。
9.根据前述权利要求之任意一项的方法，其中所述补充所述营养缺陷的底物是生物素，而所述发酵产物的底物之一是葡萄糖。
10.根据权利要求9的方法，其中所述微生物是生物素营养缺陷体，而所述目的发酵产物是核黄素。
11.权利要求1-10之任意一项的方法，其中所述微生物选自埃希氏菌属、芽孢杆菌属、蓝细菌属、链霉菌属和棒杆菌属，尤其是选自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌和产氨芽孢杆菌。
12.根据权利要求1-10之任意一项的方法，其中所述微生物是枯草芽孢杆菌，尤其是RB50：：[pRF69]Bio-或其保留了超量产生核黄素的能力的衍生物。
13.在发酵培养基中使目的发酵产物的产生与生物质的产生脱偶联的方法，包括：
(a)提供重组产生的微生物，所述微生物经改造含有编码目的发酵产物生物合成酶的多核苷酸序列，所述目的发酵产物的最大取决于非限制地供应目的发酵产物的底物；和
(b)将营养缺陷引入所述微生物中，以便通过限制发酵培养基中补充该营养缺陷的底物的浓度来控制生物质的产生。
14.根据权利要求13的方法，其中步骤(b)包括将含有缺失-插入突变的多核苷酸引入所述微生物的基因组中，以破坏所述微生物产生对于生物质产生所必需的化合物的能力。
15.根据权利要求14的方法，其中所述多核苷酸在bioFDB基因盒中含有缺失-插入突变。
16.根据权利要求13-15之任意一项的方法，包括用含有bioFDB缺失-插入突变的多核苷酸序列或含有SEQ ID NO：1的多核苷酸序列转化所述微生物。
17.根据权利要求13-16的方法，其中所述目的发酵产物是核黄素。
18.通过权利要求13-16之任意一项的方法提供的微生物。
19.多核苷酸序列，其选自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：1的引入营养缺陷的同系物，和SEQ ID NO：1的含有插入、缺失和替换并保留了在宿主细胞中引起营养缺陷的能力的多核苷酸序列。
20.用如下多核苷酸序列转化的宿主细胞，所述多核苷酸序列是含有SEQID NO：1或其片段或保留了SEQ ID NO：1在宿主细胞中引起营养缺陷的能力的SEQ ID NO：1之同系物的多核苷酸序列，或者SEQ IDNO：1中含有插入、缺失和替换但保留了在宿主细胞中引起营养缺陷的能力的多核苷酸序列。
21.根据权利要求20的宿主细胞，其中该宿主细胞是枯草芽孢杆菌细胞。
22.含有多个拷贝的改造rib操纵子pRF69、并已用SEQ ID NO：1的多核苷酸序列转化的核黄素生产微生物RB50。
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