JP2004024275A - プレニル二リン酸合成酵素遺伝子 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 プレニル二リン酸合成酵素のサブユニット(A)及び(B)のポリペプチドから選ぶポリペプチド、該ポリペプチドをコードするDNA、該DNAを含む組換えベクター、該組換えベクターで形質転換された形質転換体並びに由来の生物を異にしその一方が特異な性質を有する二つのサブユニットのポリペプチドを混合して特異な性質が付与された活性型酵素を製造することを特徴とする活性型酵素の製造方法。
【選択図】 なし
Description
(i)ゲラニル二リン酸(GPP)合成酵素(Sagami,H. et al.,(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun., 85,575.) (C5 →C10)
ここで、「C5 →C10」とは、炭素数5の化合物から炭素数10の化合物への合成を触媒することを意味する(以下同様である)。
(ii)ファルネシル二リン酸(FPP)合成酵素 (Takahashi,I.and Ogura,K.(1981) J.Biochem.,89,1581; Fujisaki,S.et al.,(1986) J.Biochem.,99,1327.)(C5 →C15)
(iii)ゲラニルゲラニル二リン酸(GGPP)合成酵素(Takahashi,I.and Ogura,K.(1982) J.Biochem.,92,1527. ; Sagami,H.and Ogura,K.(1981) J.Biochem.,89,1573.) (C5 →C20)
(i)ヘキサプレニル二リン酸(HexPP)合成酵素(Fujii,H.,et al.,(1982)J.Biol.Chem.,257,14610.) (C15→C30)
(ii)ヘプタプレニル二リン酸(HepPP)合成酵素(Takahashi,I.et al.,(1980) J.Biochem.,255,4539.) (C15→C35)
(i)オクタプレニル二リン酸(OctPP)合成酵素(Fujisaki,S.et al.,(1986) J.Biochem.,99,1327.)(C15→C40)
(ii)ノナプレニル二リン酸(NonPP)合成酵素(Sagami,H. et al.,(1977)Biochemistry,16,4616.)(C10→C45)
デカプレニル二リン酸(DecPP)合成酵素(Ishii,K. et al.,(1983) Biochem.Biophys.Res.Commun.,116,500.)(C15→C50)
(i)Z−ノナプレニル二リン酸合成酵素 (Ishii,K. et al.,(1986) Biochem,J.,233,773.) (C15⇒C45)
(ii)ウンデカプレニル二リン酸(UPP)合成酵素 (Takahashi,I.and Ogura,K.(1982) J.Biochem.,92,1527.; Keenman,M.V. and Allen,C.M.(1974) Arch.Biochem.Biophys.,161,375.)(C15⇒C55)
(iii)デヒドロドリキル二リン酸(deDolPP)合成酵素 (Sagami,H. et al.,(1989) Biochem.Biophys.Acta,1002,218.) (C15⇒C85〜105)
b)成分Aと成分Iには互換性がない。即ち、成分Aと成分IIとの組合せや成分Iと成分Bとの組み合わせでは酵素活性を発現しない(Fujii,H.et al.,(1983) FEBS Lett.,161,257. )。
c)成分Bと成分IIは、SH試薬及びアルギニン特異的試薬によって酵素活性が著しく低下するが、成分Aと成分Iはこれらの試薬の影響を受けない (Yoshida,I.,et al.,(1989)Biochem.Biophys.Acta,995,138.)。
従って、プレニル二リン酸合成酵素IIに属する2つのタンパク質をコードする遺伝子を単離し、別個に発現させることにより、タンパク質を大量生産することが望まれる。
さらに、本発明は、前記組換えベクターで宿主生物を形質転換して得られる形質転換体である。
プレニル二リン酸合成酵素には、生物種間、酵素の種類によらず、アミノ酸配列の比較的保存された7つの領域がある。これらの領域はミクロコッカス・ルテウス(Micrococcus luteus) B-P 26(Dr.L.Jeffries, Walton Oaks Experimental Station Vitamins, Ltd.より入手;以下「M.luteusB-P 26」という) のヘキサプレニル二リン酸合成酵素にも保存されていることが予想される。
まず、プレニル二リン酸合成酵素の産生菌、例えばM.luteus B-P 26 の培養細胞からゲノムDNAを調製する。次に、プレニル二リン酸合成酵素の種類、生物種間をこえてアミノ酸配列が比較的保存された7つの領域をもとにDNAプローブを合成し、それを用いて、コロニーハイブリダイゼーション等を行うことにより、遺伝子全長のクローニングを行う。
M.luteus B-P 26 の培養は常法により行うことができる。例えば、イーストエキス0.5 %、ポリペプチド1%、塩化ナトリウム1%を含む培地にM.luteus B-P26 を植菌し、30〜37℃で1〜3日培養する。M.luteus B-P 26 の培養細胞からプレニル二リン酸合成酵素のポリペプチドをコードするゲノムDNAを調製するには、公知のいずれの手法を用いても行うことができる。例えば、微生物菌体をリゾチームで処理し、さらにラウリル硫酸ナトリウム等の界面活性剤で処理した後、フェノール、クロロホルム、エーテル等の有機溶媒で除タンパクし、エタノールで沈殿させる方法など、常法により容易に調製することができる(J.Mol.Biol.,3,208,1961) 。
まず、前記ゲノムDNAをハイブリダイゼーションによりスクリーニングするためのプローブを作製する。より選択性の高いプローブを作製するためには、各生物種間でアミノ酸残基の保存性の高い領域をコードするオリゴヌクレオチドを作製するのが適当と考えられる。なお、プローブは、通常の化学合成により作製することができる。この条件に合うものとして、以下の保存アミノ酸配列を選択する(下線を付したアミノ酸は、生物種間(下記参照)で50%以上保存されたアミノ酸である)(図2)。
領域IIの「Ser Leu Ile His Asp Asp」配列(配列番号8)及び「Asp Leu Arg Arg Gly Arg Pro」配列(配列番号9)
領域IIIの「Leu Ala Gly Asp Gly Leu Leu」配列(配列番号10)
領域VIの「Phe Gln Ile Arg Asp Asp Ile Leu Asp」配列(配列番号11)及び「Gly Lys Pro Val Gly Ser Asp」配列(配列番号12)
P1 : 配列番号13
P2 : 配列番号14
P3 : 配列番号15
N1 : 配列番号16
N2 : 配列番号17
N3 : 配列番号18
N4 : 配列番号19
N5 : 配列番号20
前記ゲノムDNAを鋳型として、また前記オリゴヌクレオチドをプローブとしてハイブリダイゼーションを行う。
M. luteus B-P 26のゲノムDNAからのヘキサプレニル二リン酸合成酵素遺伝子のスクリーニングは、公知の手法、例えばサザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等によって行うことができる。
すなわち、M.luteus B-P 26 のゲノムDNAを適当な制限酵素(EcoRI, HindIII, Pst I )で別々に消化する。得られる制限断片をアガロースゲル中に電気泳動し、そのゲルをアルカリ処理し、DNAを一本鎖に変性させた後、ナイロン膜に転写する。このナイロン膜に紫外線を照射して、DNAをナイロン膜に固定させる。次に、標識したプローブ又はB500 をプローブとして用いてハイブリダイゼーション及び洗浄を行い、バイオイメージアナライザーを用いてオートラジオグラフィーを行う。そして、プローブに相同性のあるDNAバンドの位置をオートラジオグラフィーで確認する。
プローブB500 は、前述のようにM.luteus B-P 26 のFPS遺伝子の一部を含むDNA断片である。従って、FPS遺伝子とは強くハイブリダイズする。また、B500 はプレニル二リン酸合成酵素に保存されたアミノ酸配列をコードするDNA配列を有する。さらに、HexPS遺伝子にプレニル二リン酸合成酵素に保存されたアミノ酸配列をコードするDNA配列が存在するのであれば、B500 ともハイブリダイズする。
こうしてプレニル二リン酸合成酵素遺伝子を含むクローンを得、以後、塩基配列の解析に用いる。
前記のようにして得られたクローンを適当な制限酵素で消化してアガロースゲル中で電気泳動し、その泳動パターンと泳動距離から制限酵素地図を作成する。
この制限酵素地図を基にDNA断片のデリーション(小断片化)を行い、活性を示す最小のクローンを得、活性を示すDNAについて塩基配列の解析を行う。
塩基配列は、インサートの片側から欠失させたデリーションクローンを正逆両方向について作製したものを用いて決定すればよい。
このようにして決定されるプレニル二リン酸合成酵素のサブユニットのポリペプチドをコードするDNAの塩基配列として、例えば配列番号21で示される塩基配列が挙げられ、これらの塩基配列には、3つのオープンリーディングフレーム(ORF)が含まれる。各オープンリーディングフレームをhex1、hex2、hex3と命名し、各ORFは、それぞれ配列番号21で示される塩基配列の第216 〜644 番目(配列番号3)、第622 〜1359番目(配列番号29)および第1368〜2342番目(配列番号4)である。
上記のようにして得られた3つの遺伝子が発現することにより得られるポリペプチドが活性を有するか否かを調べるため、各ORFをそれぞれ別個に含むプラスミドを作製し、それらを用いて宿主を形質転換する。形質転換体を培養して粗酵素抽出液を調製し、プレニル二リン酸合成酵素活性を調べる。
複製起源としては、SV40、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、VSV等の由来のものを用いることができ、選択マーカーとしては、チミジンキナーゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いることができる。
以上のごとき宿主−ベクター系を用いて培養物中にプレニル二リン酸合成酵素のサブユニット(A)のポリペプチドおよび/またはサブユニット(B)のポリペプチドを蓄積せしめ、該ポリペプチドを採取するには、ベクターの適当な部位に該遺伝子を組み込んだ組換えDNAにより宿主細胞を形質転換させた後、得られる形質転換体を培養すればよい。さらに細胞内又は培養液からポリペプチドを分離、精製するには、公知の手法を用いることができる。例えば、塩析、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等を単独又は適宜組み合わせることにより精製することができる。精製されたポリペプチドが目的のものか否かは、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動、ウエスタンブロッティング等により確認することができる。
本発明においては、ヘテロダイマー型プレニル二リン酸合成酵素において、該プレニル二リン酸合成酵素の各サブユニットのペプチドを遺伝子組み換えの手法により調製し、得られる各サブユニットのペプチドを混合することにより活性型プレニル二リン酸合成酵素を製造することができる。
このような例としては、実質的に配列番号5のアミノ酸配列を表すバチルス・ズブチリス(ATCC 6633 ) 由来のサブユニットのポリペプチドと、実質的に配列番号6のアミノ酸配列を表すバチルス・ステアロサーモフィラス(ATCC 10149)由来のサブユニットのポリペプチド(耐熱性を有する)とを等量混合することにより、耐熱性が付与され、かつ活性が高められたヘテロダイマー型の活性型プレニル二リン酸合成酵素が挙げられる。
〔実施例1〕ミクロコッカス・ルテウス由来ゲノムDNAの調製
M.luteus B-P 26 を6LのL-broth (Bacto Tryptone 10g, Bacto Yeast extract 5g,NaCl 5g,Glucose 1g/1L )中、30℃で24時間培養した。培養液を7,000rpm、4℃で15分間遠心分離し、細胞をSaline-EDTA (0.15M NaCl,0.1MEDTA, pH8.0)に懸濁して洗浄し、再度7,000rpm、4℃で10分間遠心分離した。
こうして得た湿重量約17gの菌体を17mLのSaline-EDTA に懸濁した後、1gのリゾチームを加えて、37℃で30分間インキュベートした。
吸光度の測定から、収量は4.95mgであった。
種々の生物種間におけるプレニル二リン酸合成酵素のアミノ酸の保存領域Iの「Gly Gly Lys Arg Ile Arg Pro Leu 」配列(配列番号7)、領域IIの「Ser Leu Ile His Asp Asp 」配列(配列番号8)及び「Asp Leu Arg Arg Gly Arg Pro」配列(配列番号9)、領域III の「Leu Ala Gly Asp Gly Leu Leu 」配列(配列番号10)、並びに領域VIの「Phe Gln Ile Arg Asp Asp Ile Leu Asp 」配列(配列番号11)及び「Gly Lys Pro Val Gly Ser Asp 」配列(配列番号12)で示されるアミノ酸配列を基にして以下のプライマーを合成した。
P1 : 配列番号13
P2 : 配列番号14
P3 : 配列番号15
アンチセンスプライマー
N1 : 配列番号16
N2 : 配列番号17
N3 : 配列番号18
N4 : 配列番号19
N5 : 配列番号20
PCRは以下の組成を有するPCR反応液中で、97℃で90秒、40℃で90秒、72℃で120 秒を1サイクルとしてこれを5サイクル行なった後、96℃で90秒、55℃で90秒、72℃で120 秒を1サイクルとしてこれを20サイクル行なった。
(1) ゲノムDNAのナイロン膜へのブロッティング
実施例1で調製した M.luteus B-P 26のゲノムDNAをサザンブロッティングに用いた。
こうして得られたナイロンメイブレンをサザンハイブリダイゼーションに用いた。
FPS遺伝子のDNA断片であるB500 は、ランダムプライマー(9mer)と[α−35S]dCTP(アマシャム社)を用いてラベルした。また、プローブに用いた合成オリゴヌクレオチドについては、以下の組成に含まれるT4 ポリヌクレオチドキナーゼにより、その5'末端に[γ−32P]ATP(アマシャム社)からγ位のリン酸基を酵素的に転移する方法でラベルした。
次に、標識したプローブを用いてハイブリダイゼーション及び洗浄を行い、富士写真フィルム社製バイオイメージアナライザーを用いてオートラジオグラフィーを行った。
そこで、この約4.2kbpのDNA断片をクローニングすることにした。
EcoRIで消化したゲノムDNAの4〜6kbp の画分をアガロースゲルより切り出し、DNA断片をBIO 101 社のThe GEANCLEAN II Kitを用いて回収した。
このDNA断片をpUC119に挿入後大腸菌JM109株を形質転換し、コロニーハイブリダイゼーションを行った。
ポジティブコロニーを50mLのL培地で一晩培養し、4℃、3,000rpm、20分の遠心分離により集菌し、菌体を3mLのTEに懸濁した。これに超音波処理を施し菌体を破砕した後、4℃、3,000rpm、20分の遠心分離により上清を得、更に15,000rpm 、5分間遠心分離した上清を粗酵素抽出液とした。超音波処理は、出力40W、30%のパルスで5分間行った。
これより、生成物はHexPPであることが分かった。
こうしてHexPP遺伝子を含むクローンを得たので、これをpHX00 と命名し、以後、塩基配列の解析に用いた。
(1) pHX00 のデリーションクローンの作製
pHX00 の制限酵素地図を作製し、これを基にしてデリーションクローンの作製を行い、長さの異なるDNA断片を得た(図6)。図6に示すように、pHX01 〜pHX05 及びpEcoRV-Lは、pHX00 をXbaIで切断した後、それぞれの断片に示されるサイト(例えば、pHX02 についてはMluI、pHX05 についてはNruI) で切断し、アガロースゲル中で電気泳動し、目的の長さのDNA断片をBIO 101 社製 The GENECLEAN II Kit を用いた方法で回収した。次に、DNA断片の末端をT4 DNAPolymerase で平滑化し、セルフライゲーションにより目的のデリーションクローンを作製した。
以上のデリーションを行った各クローンについてプレニル二リン酸合成酵素の活性を測定した。その結果、活性を示す最小の長さのクローンpHX05 を得た(図6)。
塩基配列の決定は、以下の手法により行った。
アルカリ−SDS法で調製したデリーションクローンを、以下に示すように、アルカリ変性を行って鋳型DNAを作製した。
解析した塩基配列を配列番号21に示した。
その結果、pHX05 にはタンパク質をコードする3つの読み枠が存在することが明らかとなった。上流からそれぞれ、hex1、hex2、hex3とした(図7)。
(i)HexPP合成酵素遺伝子の同定
hex1のみを含むプラスミドを作製するため、pdel 2-5をHincIIとNruIで切断し、セルフライゲーションさせた(図8,9)。これがpREG1 である。同様に、hex2のみを含むプラスミドを作製するため、pdel 1-1のSacI-SacI 断片を切り出し、pUC119のSacI部位に挿入したのがpREG2 である(図8,9)。
こうしてpHX05 のインサートDNAにある3つの領域(hex1,hex2,hex3)をそれぞれ別個に含むプラスミドを作製した(図9)。
これらを用いて大腸菌JM109 株を形質転換し、前記と同様の方法で酵素活性の測定を行なった。
得られたクローンの粗酵素抽出液を調製し、表1に示す組み合わせでHexPP合成酵素活性を調べた。
結果を表1および図10に示す。
(i)バチルス・ズブチリス由来HepPS遺伝子を持つプラスミドの構築
データベース検索により、バチルス・ステアロサーモフィラスのHepPS遺伝子であるhep1、hep2と高い相同性を示す遺伝子がバチルス・ズブチリスに存在することがわかった。hep1に対応するのがgerC1、hep2に対応するのがgerC3である。GenBank M80245に登録されたDNA配列を基に以下のオリゴヌクレオチドを合成し、PCRプライマーとした。
P6’:配列番号22
P5’:配列番号23
アンチセンスプライマー
P2’:配列番号24
P4’:配列番号25
バチルス・ズブチリス由来のゲノムDNAはバチルス・ステアロサーモフィラスのゲノムDNA調製の方法に従って調製し(Koike-Takeshita, A.,et al.,(1995)J.Biol.Chem.,270,18396)、PCRの鋳型とした。
PCRは以下の組成を有するPCR反応液中で、74℃で30秒、55℃で60秒、72℃で60秒を1サイクルとしてこれを24サイクル行なった後、72℃で7分反応した。
gerC3を持つクローンはP5’/P2’の組み合わせでPCRを行ない、増幅されたDNA断片をNcoIとBglIIで消化した後、NcoIとBamHIで消化したpTrc99A にライゲーションして作製し、pEHA3 とした。
hep1を持つクローンは、Koike-Takeshita, A.,et al.,(1995)J.Biol.Chem.,270,18396 に示されたpTLD7 を使用した。
hep2を持つクローンはKoike-Takeshita, A.,et al.,(1995)J.Biol.Chem.,270,18396 に示されたpTL6を鋳型にして下記のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてPCRを行った後、増幅されたDNA断片をBspHI とHind IIIで消化して、NcoIとHind IIIで消化したpTrc99A にライゲーションして作製し、pHE5とした。
HPP10:配列番号26
アンチセンスプライマー
HPP12:配列番号27
上記4種のプラスミド(pEHA1, pEHA3, pTLD7, pHE5)を用い大腸菌JM109 株を形質転換した。pEHA1 、pEHA3 の形質転換体はM9YG培地(1×M9 salt, 0.2% glycerol, 0.2% Yeast extract)で、pTLD7 、pHE5の形質転換体はLBで培養し、対数増殖期の後半で1mMのIPTGを添加後3時間培養して、5,000rpm,20分の遠心分離で集菌した。各菌体約0.2 gを1mL Lysis buffer(25mM Tris-HCl,1mM EDTA, 10mM 2−メルカプトエタノール)に懸濁後、超音波処理により菌体を破砕し、15,000rpm ,5分間遠心分離した上清を、pTLD7 、pHE5の形質転換体についてのみ55℃、15分間熱処理し、粗酵素液とした。
表2に示す組み合わせで等量混合し、HepPS活性を調べた。
下記の組成で37℃、1時間反応を行ない、前述と同様に生成物をブタノールで抽出後、放射能量の測定および逆相TLCによる生成物の分析に用いた。
ポリペプチドGERC1、GERC3は常温菌バチルス・ズブチリス由来であり、Hep2は中等度好熱菌バチルス・ステアロサーモフィラス由来である。そこで、pEHA1 (GERC1)+pEHA3 (GERC3)の組合せ、およびpEHA1 (GERC1)+pHE5(Hep2)の組み合わせで得たHepPSの至適反応温度および熱安定性を比較した。
Claims (4)
- 由来の生物を異にしその一方が特異な性質を有するヘテロダイマー型酵素の二つのサブユニットのポリペプチドをそれぞれ調製し、これらのサブユニットのポリペプチドを混合して特異な性質が付与された活性型酵素を製造することを特徴とする活性型酵素の製造方法。
- 特異な性質が耐熱性であることを特徴とする請求項1記載の活性型酵素の製造方法。
- 二つのサブユニットのポリペプチドの一方がバチルス・ズブチリス由来であって実質的に配列番号5のアミノ酸配列を表すものであり、他方がバチルス・ステアロサーモフィラス由来であって実質的に配列番号6のアミノ酸配列を表すものであり、そして特異な性質が付与された活性型酵素が耐熱性の活性型プレニル二リン酸合成酵素であることを特徴とする請求項2記載の活性型酵素の製造方法。
- バチルス・ズブチリス由来であって実質的に配列番号5のアミノ酸配列を表すプレニル二リン酸合成酵素のサブユニットのポリペプチドと、バチルス・ステアロサーモフィラス由来であって実質的に配列番号6のアミノ酸配列を表す耐熱性プレニル二リン酸合成酵素のサブユニットのポリペプチドとを混合することにより、耐熱性が付与され、かつ活性が高められたヘテロダイマー型の活性型プレニル二リン酸合成酵素を製造することを特徴とする活性型プレニル二リン酸合成酵素の製造方法。
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